PTBP1

【导读】 放疗是前列腺癌(PCa)的治疗手段，但放疗耐药严重影响其疗效。失调的RNA剪接因子广泛参与肿瘤进展。尽管如此，剪接因子在前列腺癌放射耐药中的作用在很大程度上仍未被探索。 9月17日，中山大学研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“PTBP1 Regulates DNMT3B Alternative Splicing by Interacting With RALY to Enhance the Radioresistance of Prostate Cancer”，本研究在多个公开的前列腺癌数据库中，识别出23个在前列腺癌和相邻正常组织之间表达差异显著的剪接因子。在这些基因中，PTBP1在前列腺癌中显著上调，与高级别临床病理特征和不良预后呈正相关。功能获得和丧失实验表明，PTBP1显著增强了基因组DNA的稳定性，从而使前列腺癌细胞在体外和体内对辐射产生耐药。机制上，PTBP1与RALY相关的异染色质核糖核蛋白（hnRNP）相互作用，并调节DNA甲基转移酶3b（DNMT3B）第5外显子的剪接，从DNMT3B-S剪接到DNMT3B-L。此外，DNMT3B-L的上调导致DUSP2的启动子甲基化，进而抑制DUSP2的表达，从而增强前列腺癌的辐射耐药性。这些发现强调了剪接因子在响应放疗时诱导异常剪接事件中的作用，并指出了PTBP1和DNMT3B-L在逆转前列腺癌辐射耐药性方面的潜在作用。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202405997 背景知识 01 电离辐射通过引起基因组DNA损伤有效地消除肿瘤细胞。因此，放疗已成为治疗各种癌症，特别是前列腺癌（PCa）的广泛使用的致突变细胞杀伤治疗方法，前列腺癌是男性第二大肿瘤相关死亡原因。值得注意的是，放疗是局限性PCa的治愈性治疗，也已获准作为手术后的辅助治疗、生物化学复发后的补救治疗，甚至在存在远处转移的情况下作为姑息治疗。不幸的是，尽管放疗在治疗PCa方面取得了成功，但由于辐射耐药的出现，仍有近30-50%的患者在原发或转移部位长期复发或短期内病情恶化。因此，迫切需要阐明辐射耐药的分子机制。 选择性剪接（AS）是真核细胞中一种受到严格调控的转录后细胞过程，它增加了真核生物的蛋白质多样性。统计数据显示，人类超过95%的基因会发生AS，癌症中的AS事件比正常组织多达30%，这有助于产生参与肿瘤发生的多种基因变异。一般来说，AS的调控主要依赖于跨膜剪接因子，它们能够特异性地识别和结合内在的CIS元件。在多种人类恶性肿瘤中异常表达这些剪接因子会导致剪接重编程，从而促进肿瘤进展和包括放射耐受在内的治疗耐药。因此，有针对性地靶向异常剪接因子可能会开辟癌症治疗的新途径。然而，目前尚不清楚异常剪接和相应的剪接因子是否参与了前列腺癌的辐射耐药。 PTBP1增强PCa细胞体外增殖和放疗耐受性 02 为了确定PTBP1在PCa细胞中的功能作用，研究人员通过PTBP1-靶向siRNAs或慢病毒转染建立DU145和PC-3细胞的PTBP1敲低（KD）或过表达（OE）模型。CCK-8实验结果表明，PTBP1敲低显著抑制PCa细胞的细胞活力，而PTBP1过表达则表现出相反的效果。此外，克隆形成实验进一步强化了PTBP1的促增殖作用。同时，实验结果还表明，PTBP1在调控细胞群体处于S期方面发挥着重要作用。这些结果表明，PTBP1可能有助于细胞周期中DNA复制阶段的正常进展。 据报道，PTBP1参与DNA损伤修复，这是放射治疗耐药的主要原因之一。为了研究PTBP1在辐射响应中的潜在作用，研究人员将PTBP1敲除或过表达的PCa细胞暴露于不同剂量的辐射。克隆形成试验表明，PTBP1敲除显著降低了PCa细胞在辐射后的克隆形成，而PTBP1过表达增加了PCa细胞对辐射治疗的耐药。此外，当暴露于4 Gy的辐射时，PTBP1敲除显著增加了PCa细胞的凋亡比例，而PTBP1过表达PCa细胞在4 Gy辐射后的生存潜力大于对照组细胞。为了进一步研究PTBP1是否影响辐射诱导的基因组不稳定性，研究人员对PTBP1敲除或过表达的PCa细胞在辐射后0、1、24小时的DNA损伤情况进行了彗星试验。与对照PCa细胞相比，PTBP1-KD PCa细胞在24小时后呈现出更长的彗星尾，而PTBP1-OE PCa细胞在24小时后呈现出较短的彗星尾。同时，蛋白质免疫印迹实验分析显示，在4 Gy IR治疗后不同时间点，PTBP1敲除的PCa细胞中γ-H2AX蛋白水平升高，而PTBP1过表达的PCa细胞中该蛋白水平降低，与各自的对照PCa细胞相比。这些结果表明，PTBP1在促进PCa细胞增殖和放疗耐药方面发挥着重要作用。 PTBP1通过维持遗传稳定性来促进前列腺癌细胞对放疗的耐药 为了进一步阐明DNMT3B-L如何调控DUSP2，研究人员首先基于TCGA数据评估了DUSP2启动子和5'-上游区域的CpG甲基化状态。此外，体外实验表明，5-aza-2'-脱氧胞苷(5-Aza)是一种DNA甲基化抑制剂，可剂量依赖性地显著增加DUSP2的mRNA和蛋白质水平，进一步证实DUSP2表达可通过DNA甲基化进行调控。研究人员通过在线软件设计了一对覆盖三个CpG位点的甲基化和非甲基化引物。MSP实验结果却表明，DNMT3B-L KD显著减少了使用甲基化引物时产生的PCR产物数量，但相反地增加了使用非甲基化引物时产生的PCR产物数量。为了调查DUSP2是否对PTBP1和DNMT3B-L介导的辐射耐药产生不可忽视的影响，研究人员进行了挽救实验。结果显示，DUSP2 siRNAs显著恢复了PTBP1或DNMT3B-L KD细胞的辐射耐药。同时，DUSP2 KD显著减少了PTBP1或DNMT3B-L KD细胞中由IR引起的DNA损伤。总之，这些数据表明，PTBP1通过DNMT3B-L介导的DUSP2启动子甲基化促进PCa的辐射耐药。 研究小结 03 总之，研究人员通过系统性分析PCa中的剪接因子，识别出PTBP1为一种致癌蛋白。在RALY的帮助下，PTBP1能够与DNMT3B的前mRNA结合，驱动DNMT3B的致癌剪接切换，产生DNMT3B-L，进而诱导DUSP2的启动子甲基化，从而增强癌细胞对放疗的耐药性。 本研究为异常剪接因子调节PCa的放疗耐药机制提供了新的见解，并发现PTBP1是前列腺癌放疗增敏的潜在治疗靶点。 【参考资料】 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202405997 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

国家纳米科学中心方英和田慧慧研究团队在基于生物编辑技术的脑机接口增强技术方面取得新进展，相关成果以Spatially Precise Genetic Engineering at the Electrode-Tissue Interface为题，发表在Advanced Materials上。  脑机接口是通过在大脑与外部电子设备之间创建直接的通讯通道，实现人与机器的高带宽信息交换，推动人工智能（AI）与人类智能（HI）的深度融合。神经电极是脑机接口中最底层的核心技术，通过将大脑中神经元的放电活动传输到体外的电子设备，从而读取大脑的意图；同时也可以通过神经电极调控神经元的放电活动，从而实现对大脑信息的写入。 神经电极和脑组织之间的界面是影响脑机接口性能的关键因素。该界面决定了信息传输效率，直接影响着脑机接口的灵敏度和精准性。近年来，大量的研究工作致力于提升神经界面性能，该领域的研究工作可分为两个方向，即非生物神经界面技术和生物神经界面技术两个方面。以往的研究主要集中在非生物神经界面技术，即通过改进电极结构或材料来提高神经电极的生物相容性，降低组织反应，从而提高脑机接口的长期稳定性。另一方面，生物神经界面技术通过生物工程技术来改善电极周围神经组织的性能，有望实现脑机接口增强。但目前为止，基于生物工程的神经界面研究在很大程度上尚未有报道。 国家纳米科学中心方英和田慧慧团队提出了一种新型生物神经界面技术。研究人员通过构建基于基因工程技术的多功能柔性神经电极，向神经电极周围的脑组织递送基因并对细胞进行特异性的基因编辑，从而实现增强型脑机接口技术。该研究通过基于核糖核酸干扰（RNAi）的基因沉默技术，成功敲低了神经界面附近神经元中的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTEN）和星形胶质细胞中的聚嘧啶束结合蛋白1（PTBP1）基因。PTEN的沉默能够显著提高神经元细胞的生长能力。另一方面，前期的研究表明PTBP1能够将星形胶质细胞转分化为神经元细胞。研究人员对神经退行性疾病模型小鼠在RNA干扰后的神经活动进行了长期检测，发现下调神经元中的PTEN基因序列可以显著改善神经元的电活动。该研究中设计的多功能柔性神经探针能够结合生物工程和非生物工程的技术优势，对神经界面的细胞进行精准转染，实现对特定基因的有效沉默，从而提高脑机接口技术的性能。该方法拓宽了基因工程技术在增强型脑机接口领域的应用，为推动再生神经电子学和下一代脑机接口领域的发展提供了一种前景广阔的工具。 图1. 基于基因工程的增强型脑机接口技术 图2. 负载shPTEN敲低基因的多功能柔性神经电极用于损伤模型小鼠的长期信号检测。(a)实验设计示意图；(b) PTEN基因敲低侧与对照侧记录到的神经元信号发放栅图；(c) MPTP用药两周后PTEN敲低侧和对照侧记录到的神经元动作电位和带通信号；(d) MPTP损伤模型造模前后记录到的神经元幅值的对比；(e) MPTP损伤模型小鼠不同周数下PTEN敲低侧和对照侧神经元幅值的对比。 上述工作中，国家纳米科学中心博士生许可和杨轶楠为文章的共同第一作者，国家纳米科学中心田慧慧副研究员、方英研究员为通讯作者。 转自：国家纳米科学中心 关于派真生物

导读：编码抗原或活性蛋白的体外转录（IVT）RNA在肿瘤免疫治疗和靶向治疗中具有潜力，如常规mRNA、环状RNA(circRNA)和自复制RNA(saRNA)等。随着递送系统的发展和成熟，通过脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物、聚合物纳米颗粒和富含精氨酸的鱼精蛋白等方式将IVT mRNA递送至癌细胞，在细胞内表达活性蛋白，发挥消除肿瘤的功能。2023年研究人员在Nature Cancer（影响因子22.7）发表《An in vitro-transcribed circular RNA targets the mitochondrial inner membrane cardiolipin to ablate EIF4G2+/PTBP1+ pan-adenocarcinoma》。为降低mRNA的免疫原性，研究人员基于GSDMDp.D275E/E295G-F1LCT 突变体设计了circRNA——GSDMDENG circRNA，其成功抑制EIF4G2＋/PTBP1＋泛腺癌异种移植物的生长，在KRASG12D突变引起的EIF4G2和PTBP1异常的自发性肿瘤模型中，GSDMDENG circRNA显著阻止胰腺、肺和结肠腺瘤的发生，提高存活率，并诱导持续的KRAS G12D肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应。01 GSDMDENGcircRNA的序列设计和环化制备circRNA可有效增强mRNA稳定性，尤其对IRES IVT-mRNA启动的翻译。circRNA序列设计：研究者基于内含子-外显子（PIE）剪接策略构建了GSDMD circRNA序列：利用T4噬菌体胸苷酸合酶基因的I型内含子将其从中间断开，内含子2和内含子1依次连接，HRV2 IRES、GSDMDc.825 T>A/c.884 A>G ORF、eGFP ORF和F1LCT依次插入内含子之间，5'和3'末端添加同源臂序列，3'PIE剪接内含子和HRV2 IRESs序列间添加间隔序列。circRNA的制备：首先通过体外转录（IVT）合成线性前体RNA，产物混合物用DNase1消化20min，加入2mM GTP在55℃孵育15min，柱层析提取RNA产物后用含2mM GTP和10mM MgCl2的Tris-Hcl缓冲液在70℃和4℃下分别孵育5min和3min。后加热至70℃处理5min进行柱纯化，将circRNA产物溶解在DEPC水中。用RNase R缓冲液处理circRNA产物，并在37℃下孵育15min，通过柱纯化提取以富集circRNA。耀海生物基于I型内含子自剪接的PIE结构，建立了成熟的circRNA合成服务平台，涵盖序列设计、质粒模板制备、体外转录与环化、circRNA纯化、LNP包封与circRNA质量控制。我们支持50-8000 nt RNA的体外环化，环化效率高达80%，全力推进circRNA高质量研究成果的发表及转化。研究结果显示，同源臂和间隔区将线性RNA环化效率提高到90%以上。测序结果证实产物为完整的环状RNA。图1 PIE剪接形成circRNA02 GSDMDENGcircRNA-LNPs消融肿瘤并呈递抗原静脉注射HRV2 IRES-GSDMDENG-F1LCT IVT circRNA-LNPs（GSDMDENG circRNA-LNPs）400μg/kg/周，持续6周未导致体重减轻或器官损伤，具有良好的安全性。在将人CD34祖细胞移植到免疫缺陷小鼠内建立具hCD免疫系统的人源化小鼠模型中，瘤周施用GSDMDENG circRNA-LNPs，诱导肿瘤线粒体自噬和肿瘤抗原呈递参与肿瘤消融，抑制胶质瘤和血液肿瘤生长，且GSDMDENG circRNA-LNPs驱动EIF4G2＋/PTBP1＋肿瘤中GSDMD的表达。线粒体自噬对溶酶体呈递线粒体抗原至关重要。用慢病毒载体创建编码线粒体定位OVA和荧光mCherry的AsPCs-1细胞（AsPCs-mtOVA-mCherry），将携带OVA特异性转基因（由OT-I（CD8＋）和OT-II（CD4＋）亚群组成）的T细胞群转移到AsPC-1-mtOVA-mCherry荷瘤小鼠中，施用GSDMDENG circRNA-LNPs导致OT-I和OT-II细胞持续增殖及IFN-γ产生，线粒体自噬执行信号PINK1和内源性抗原呈递MHC-I的缺失减弱GSDMDENG circRNA-LNPs诱导的线粒体抗原的呈递。综上，GSDMDENGcircRNA-LNPs通过线粒体mtROS/mtDNA泄漏介导的内在抗肿瘤免疫和线粒体自噬抗原呈递介导的适应性免疫，在体内可安全有效地消融肿瘤。图2 GSDMDENG circRNA-LNPs的安全性和有效性03 GSDMDENGcircRNA-LNPs预防KRAS G12D腺癌约30%的人类肿瘤存在RAS基因突变，KRAS最常突变，基因相关性分析显示，KRAS与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、胰腺腺癌（PAAD）、结肠腺癌（COAD）、肺腺癌（LUAD）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）中EIF4G2/PTBP1高表达呈正相关。其G12位点有多个突变频率，KRASG12D突变小鼠的胰腺、肺和结肠中，EIF4G2和PTBP1的表达呈现年龄依赖性趋势，或与Raf-MEK-MAPK信号转导相关的KRAS异常激活有关。使用LSL-KRASG12D/p53R172H（KP）基因突变小鼠模型（具KRASG12D组成型表达和p53突变，成年后各种原发性实体腺癌自发发展），在16周观察期，每周预防性腹膜内注射GSDMDENG circRNA-LNPs，KP小鼠肿瘤（单个或多个）综合发病率从63.74%降至35.84%，12周生存率从38.4%增至57.9%。小鼠腺癌组织的免疫荧光切片结果表明KRAS G12D突变间接驱动GSDMD的表达。注射4周后，小鼠DLNs中抗原呈递DCs的细胞毒性T细胞免疫被持续激活，从治疗小鼠脾脏中分选的细胞毒性T淋巴细胞对KRASG12D AsPC-1细胞表现出强烈的体外特异性杀伤作用，但对其他类型的KRAS突变细胞系不敏感。综上，GSDMDENG circRNA通过动员抗肿瘤免疫来防止KRASG12D突变诱导的腺癌发生。图3 GSDMDENGcircRNA-LNPs用于KRAS突变引起的泛腺癌的预防性治疗04 总结编码GSDMD诱导膜毒性是相对安全且可逆的细胞死亡方法，本研究致力改善癌细胞中GSDMD的条件激活和特异性表达，利用单碱基突变和C末端线粒体信号肽连接赋予GSDMD条件激活模式和亚细胞器膜靶向。GSDMD的线粒体靶向具有几个优点：（1）癌细胞含代谢旺盛的线粒体；（2）心磷脂占线粒体内膜的20%，线粒体特异性能减轻肌醇磷酸为主的亚细胞器膜毒性；（3）线粒体去极化介导的线粒体自噬诱导抗原呈递和抗肿瘤免疫；（4）避免内源性ESCRT膜修复，降低有效剂量。用HRV2-IRES驱动GSDMD表达，在癌细胞中表现出良好的选择性表达。KRAS激活促进RAF-MAPK、PI3K和RALGDs的后续激活，调节控制细胞命运的信号通路，本研究开发的GSDMDENG circRNA的抗肿瘤作用机制如下：（1）GSDMD在线粒体膜上的成孔活性导致mtROS渗漏和坏死细胞死亡，缩小肿瘤大小，触发内在抗肿瘤免疫；（2）线粒体膜损伤诱导的线粒体自噬经位于溶酶体的MHC-I呈递线粒体抗原，介导适应性免疫反应；（3）细胞质mtDNA诱导胞质DNA感应通路cGAS-STING和I型干扰素反应。因此，GSDMDENG circRNA本质上是一种治疗性疫苗，旨在诱导肿瘤线粒体抗原的呈递以激活抗肿瘤免疫。参考文献 [1] Feng Z, Zhang X, Zhou J, Li Q, Chu L, Di G, Xu Z, Chen Q, Wang M, Jiang X, Xia H, Chen X. An in vitro-transcribed circular RNA targets the mitochondrial inner membrane cardiolipin to ablate EIF4G2+/PTBP1+ pan-adenocarcinoma. Nat Cancer. 2024 Jan;5(1):30-46. doi: 10.1038/s43018-023-00650-8.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。