PTBP1

本文转载自“iNature”神经退行性疾病是老龄化社会中人­­群健康的主要威胁之一。以帕金森病（Parkinson’s disease）为例，全世界已有超过一千万的患者，而目前所采取的药物和手术治疗只能延缓疾病恶化而不能彻底治愈。若要从根本上恢复患者的生理功能，则需体外移植或原位再生新的神经元。然而，利用诱导型多能干细胞（iPSC）分化的神经元进行移植治疗存在整合难、癌变性和免疫原性等问题。因此，从胶质细胞直接进行神经元原位转分化（trans-differentiation）将可能是根治神经退行性疾病的有效策略。不同于在胶质细胞中过表达神经元特异转录因子以诱导神经原位再生的“加法”策略，付向东教授提出了“减法”策略，即通过在非神经元细胞中敲降一个在神经分化过程中自然下调的关键抑制因子—RNA结合蛋白PTB—来诱导生成神经元，该方法更为简便、安全、易操作。付向东教授是RNA功能基因组学领域的领军人物，而十年前一个偶然的发现将他引领到神经退行性疾病治疗方法研发。2009年，付教授的博士研究生薛愿超（现任中国科学院生物物理研究所研究员），在研究PTB在细胞内调控RNA剪切的位置效应和分子机制时无意中发现，稳定敲降PTB的HeLa细胞长出了类似神经元的突起；深入研究发现，PTB敲降后的小鼠成纤维细胞可以转变成功能性的成熟神经元，该项工作于2013年在《细胞》（Cell）杂志上发表。随后，薛愿超研究员与付实验室博士后钱浩博士通力合作，于2016年又在《自然-神经科学》（Nature Neuroscience）杂志上发表了人源成纤维细胞到神经元转分化的研究论文，阐明了人源细胞神经元转分化过程中需要以PTB和nPTB为主的两个调控环路。Nature封面文章（封面制作：苟兰涛／goandy@163.com）在此基础上，钱浩博士等人在北京大学周专教授和西南医科大学康新江教授的鼎力协助下，经过不懈努力，终于实现将小鼠星形胶质细胞（astrocyte）敲降PTB、原位转分化为功能性神经元，并证实了“减法”策略对帕金森病模型小鼠有显著疗效。这一激动人心的工作于2017年12月第一次投稿到《科学》，其后又根据多方建议补充了大量实验数据，并于2018年11月投稿到《自然》，在今年5月被正式接收。从2017年9月至今，付向东教授一直秉持开放的科学态度，在国内外多个研究机构和学术大会分享了该项研究的实验设计和研究成果。特别是在2018年6月，付教授受邀中国科学院上海神经科学研究所介绍这项研究工作，引起了国内神经科学领域的高度关注，并获得广泛好评。­封面制作：苟兰涛／goandy@163.com2020年6月24日，加州大学圣地亚哥分校付向东团队在Nature发表题为“Reversing a model of Parkinson’s disease with in situconverted nigral neurons”的研究论文，该研究发现在星形胶质细胞中敲降RNA结合蛋白PTB可将其直接转分化为功能性的神经元；这种仅需一步的转分化技术可在帕金森病小鼠模型中诱导产生新的多巴胺功能性神经元、重建受损的神经环路、恢复纹状体内多巴胺水平，并有效治疗帕金森综合征相关的运动障碍；更重要的是，使用抑制PTB的反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides，ASO）也能达到类似治疗效果。这项研究为帕金森病及其他神经退行性疾病提供了极具前景的治疗策略和方法，并获得了神经科学领域的广泛关注。­­该研究被选为Nature的封面文章。另外，2020年4月8日，中国科学院上海神经所杨辉及周海波共同通讯在Cell在线发表题为“Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice”的研究论文，该项研究通过运用最新开发的RNA靶向CRISPR系统CasRx特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。不过，在2021年9月27日，美国得克萨斯大学西南医学中心的张春立及王蕾蕾共同通讯在Cell上发表了题为“Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo”的研究论文，该研究在小鼠大脑中使用严格的谱系追踪，表明假定的星形胶质细胞转化神经元实际上是内源性神经元。AAV介导的 NEUROD1和报告基因的共表达特异性且有效地诱导报告基因标记的神经元。然而，这些神经元不能使用谱系映射策略追溯至静止或反应性星形胶质细胞。相反，通过逆行标记方法，该研究结果表明内源性神经元是这些病毒报告基因标记神经元的来源。类似地，尽管在体内有效敲低了PTBP1，但遗传追踪的常驻星形胶质细胞并未转化为神经元。总之，该研究结果强调了谱系追踪策略的要求，该策略应广泛应用于体内细胞命运转换的研究。该研究结果不支持那些惊人的说法，即驻留的星形胶质细胞可以直接有效地转化为成熟的神经元。2023年6月7日，美国霍普金斯大学Thanh Hoang、Dong Won Kim及Seth Blackshaw共同通讯在Nature在线发表题为“Ptbp1 deletion does not induce astrocyte-toneuron conversion”的质疑文章，该研究指出Ptbp1缺失不会诱导星形胶质细胞到神经元的转化。该研究观察到Ptbp1的高效和细胞特异性破坏，但在Ptbp1杂合或Ptbp1纯合小鼠中没有星形细胞到神经元的转化。scRNA-seq分析显示，杂合子和纯合子星形胶质细胞的基因表达有细微变化，但未诱导神经元特异性基因或神经元样电生理特性。这表明Ptbp1敲低后报道的星形胶质细胞-神经元转换并不反映Ptbp1功能丧失的影响。在同一时间，美国加州大学圣地亚哥分校付向东及电子科技大学钱浩共也在Nature对Thanh Hoang提出的疑问进行了回复，在对Thanh Hoang等人获得的相同的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据分析后得出了相反的结论。作者表明，正如先前在许多生物系统中记录的那样，Ptbp1敲除与Ptbp1敲低可能产生不同的表型。尽管尚不能排除观察到的星形胶质细胞向神经元的转化可能是由于现有神经元的渗漏造成的，但目前的scRNA-seq和免疫染色数据表明，星形胶质细胞或星形细胞样细胞亚类的存在比成熟星形胶质细胞更倾向于重定向到神经元谱系，这一可能性有待于未来的研究。责编|文竞择校对|文竞择End参考资料：[1]https://www.nature.com/articles/s41586-023-06067-8[2]https://www.nature.com/articles/s41586-023-06066-9 往期精选 围观把病毒困在“陷阱”里！海德堡大学探明病毒渗透最后一步，或将带来预防新手段！ 热文 基因振荡器：在两种衰老模式间来回切换，细胞寿命延长了82%！ 热文 用超声波突破皮肤屏障！MIT科学家为皮肤给药提供可穿戴解决方案 热文新发现：加速癌症发展的染色体外DNA，甚至出现在癌症之前，推动组织癌变！ 热文 在基因组中“跳来跳去”的转座子，有望成为免疫疗法抗击肿瘤的新靶点！ 点击“阅读原文”，了解更多~

补充因疾病而失去的细胞是再生医学领域的“圣杯”，然而，成年哺乳动物（包括人类）的中枢神经系统（CNS）在很大程度上已经失去了这种再生能力。 补充因疾病而失去的细胞是再生医学领域的“圣杯”，然而，成年哺乳动物（包括人类）的中枢神经系统（CNS）在很大程度上已经失去了这种再生能力。近年来，有一种新兴策略通过将体内的胶质细胞转化为神经元，这为治疗神经退行性疾病带来了巨大希望。但想实现这一点，不但复杂而且效率低下。 2020年，两篇分别发表于 Cell 和 Nature 的顶刊论文显示， 只需敲低Ptbp1，就能高效诱导胶质细胞向神经元的转化，挽救帕金森病小鼠模型的运动障碍。这为通过胶质细胞向神经元的转分化来治疗神经退行性疾病带来了巨大前景。然而，其他团队并没有能够重复出这两篇论文的结果，人们开始质疑，敲低Ptbp1后，胶质细胞向神经元的转化真的发生了吗？ 2020年4月，中科院神经所杨辉团队在 Cell 期刊发表了题为：Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice 的论文【1】。该研究发现，使用CRISPR-CasRx系统敲低Ptbp1，能够诱导胶质细胞转化为神经元。 2020年6月，加州大学圣地亚哥分校付向东团队在 Nature 发表了题为：Reversing a model of Parkinson's disease with in situconverted nigral neurons 的论文【2】。该研究发现，使用shRNA或反义寡核苷酸（ASO）敲低Ptbp1蛋白表达，能够诱导胶质细胞转化为神经元。 这两项研究提示了我们，Ptbp1基因可能是治疗包括帕金森病在内的因神经元损伤导致的神经退行性疾病的潜在靶点。 这两篇论文发表后，在业内引起广泛关注和争议。 2021年9月，德州大学西南医学中心张春立团队在 Cell 发表了题为：Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo 的论文【3】。该研究利用谱系追踪证明，无论是过表达NeuroD1，还是敲低Ptbp1，都不能在体内将胶质细胞转化为神经元，之前的研究中观察到的转分化而来的神经元实际上是大脑中原本就存在的内源性神经元。 2021年10月，约翰·霍普金斯大学医学院 Seth Blackshaw 团队在预印本 bioRxiv 发表了题为：Ptbp1 deletion does not induce glia-to-neuron conversion in adult mouse retina and brain 的论文【4】。该论文指出，在小鼠的视网膜和大脑中，Ptbp1的特异性缺失，都不会诱导胶质细胞向神经元的转化。2022年6月，Seth Blackshaw 团队将部分试验结果发表在了 Cell Reports 期刊【5】。 值得一提的是，2023年2月，杨辉团队在 Gene Therapy 期刊发表了题为：Ptbp1 knockdown failed to induce astrocytes to neurons in vivo 的论文【6】。该研究指出，Cas13x介导的Ptbp1的敲低在体内不能诱导胶质细胞向神经元的转化。从而否定了此前在 Cell 发表的结果，认为之前的结果是由于GFAP-AAV泄漏所致。 2023年6月7日，约翰·霍普金斯大学医学院 Seth Blackshaw 团队在 Nature 发表了题为：Ptbp1 deletion does not induce astrocyte-toneuron conversion 的文章【7】。 这项研究显示，Ptbp1功能缺失并不会诱导星形胶质细胞向神经元的分化，甚至并没有引起星型胶质细胞基因表达的实质性改变。 Seth Blackshaw 团队指出，付向东团队的这篇 Nature 论文中观察到的Ptbp1敲低所诱导的胶质细胞向神经元的转分化的结论缺乏一些必要的直接证据。通过对携带Ptbp1杂合或纯合突变的成熟星形胶质细胞的遗传谱系和单细胞RNA测序（scRNA-Seq）分析显示，Ptbp1缺失的星形胶质细胞并没有向神经元转化，也没有对其他基因表达产生实质性影响。 为了从基因上破坏星形胶质细胞中Ptbp1的功能，研究团队使用了星形胶质细胞特异性他莫昔芬诱导的Aldh1l1creERT2小鼠以及Sun1-GFPloxP/loxP和Ptbp1loxP/loxP细胞系，并使用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导星形胶质细胞产生杂合性或纯合型Ptbp1缺失，这些星形胶质细胞被SUN1-GFP不可逆标记用于谱系追踪。在4-OHT诱导后第2、4、8周，在任何基因型小鼠中都没有观察到大脑中新型胶质细胞向神经元的转化。 付向东团队的 Nature 论文显示，敲低Ptbp1诱导的胶质细胞转化而来的神经元可以分泌多巴胺，恢复6-羟多巴胺（6-OHDA）损伤多巴胺能神经元诱导的帕金森病小鼠模型的运动功能。 然而，这篇发表在 Nature 的质疑文章显示，6-OHDA损伤的Ptbp1杂合缺失或纯合缺失的小鼠都没有出现新生的神经元。因此，研究团队得出结论：无论是否有神经元损伤，Ptbp1功能缺失都不会导致星形胶质细胞向神经元的转化。 接下来，研究团队检查了Ptbp1缺失是否改变了星形胶质细胞的生理活动。膜片钳实验显示，Ptbp1杂合缺失或纯合缺失都不会诱导星形胶质细胞出现神经元样电生理特性。 为了全面分析Ptbp1缺失在新型胶质细胞中的分子效应，研究团队对4-OHT诱导2周后的野生型、杂合型和纯合型Ptbp1缺失小鼠的整个皮质、纹状体和黑质进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。结果显示，Ptbp1缺失后，大多数星形胶质细胞标志物的表达没有变化，且未观察到神经祖细胞或成熟神经元特异性基因的诱导。免疫染色实验证实Ptbp1缺失的星形胶质细胞保留了胶质细胞标志物SOX9的表达。研究团队得出结论：Ptbp1不会抑制星形胶质细胞中神经元基因的表达。 为了进一步研究Ptbp1功能缺失在稍后时间点诱导的基因表达变化，我们研究团队在4- OHT诱导野生型和纯合Ptbp1缺失小鼠4周后，对GFP阳性星形胶质细胞和荧光活化细胞分选富集的星形胶质细胞来源的细胞进行了进一步的scRNA-seq分析。结果显示，在Ptbp1缺失后，所有三个脑区中神经源性或其他细胞类型特异性标志基因的表达没有差异。大多数星形胶质细胞标志物的表达未发生变化，未观察到神经祖细胞或成熟神经元特异性基因的诱导。这些结果表明，Ptbp1缺失后的星形胶质细胞，没有出现胶质细胞特异性基因的表达，也没有星形胶质细胞特异性基因的表达下调。 总的来说，该研究实现了对Ptbp1的高效和细胞特异性敲除，但无论是Ptbp1杂合缺失还是纯合缺失小鼠中，都没有观察到星型胶质细胞向神经元的转化。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，杂合和纯合Ptbp1缺失的星形胶质细胞的基因表达有细微变化，但并未诱导神经元特异性基因表达或神经元样电生理特性。 结合最近发表的一系列论文均未能重复出敲低Ptbp1实现胶质细胞向神经元转化的结果，以及杨辉团队对自己此前 Cell 论文结果的否定，研究团队表示，此前的敲低Ptbp1后胶质细胞向神经元的转化的结果不太可能是Ptbp1功能缺失引起的。这也突出了在细胞类型转化的研究中使用遗传操作、谱系追踪和基因表达分析的重要性。 从论文的投稿记录来看，这篇论文于2021年9月就已投稿到 Nature，此后补充了大量实验和数据，从而更加严谨地论述了Ptbp1功能缺失不能诱导胶质细胞向神经元转化的观点。 而最早通过论文质疑Ptbp1作用的张春立教授直言不讳地表示：抑制Ptbp1就算有治疗潜力，那也不是源于胶质细胞向神经元的转化。 张春立教授在 Annual Review of Neuroscience 期刊发表了题为：Therapeutic Potential of PTBP1 Inhibition, If Any, Is Not Attributed to Glia-to-Neuron Conversion 的综述论文【7】。 张春立教授在这篇综述中回顾了基于Ptbp1的胶质细胞向神经元转化的研究争议，总结了对体内胶质细胞向神经元转化和Ptbp1未来研究的建议。 对于 Seth Blackshaw 团队在 Nature 发表的质疑文章，付向东团队同期在 Nature 发布了回应【8】。 付向东团队表示，在分析了 Seth Blackshaw 团队发布的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据后，得出了相反的结论。此外，之前在许多生物系统中的研究显示，敲除基因与敲低基因会产生不同的表型，因此，Ptbp1的敲除和敲低叶可能产生不同的表型。 虽然尚不能排除观察到的星形胶质细胞向神经元的转化可能是由于现有神经元泄漏造成的，但目前的scRNA-seq和免疫染色数据表明，存在一种星形胶质细胞或星形细胞样细胞亚类，其比成熟星形胶质细胞更倾向于重定向到神经元谱系，这一可能性有待于未来的研究。

GFAP微型启动子介导的AAV泄露表达并非是由于高病毒滴度所引起的, 而是由其携带表达的转化因子所决定 （与2021年Cell文章在大脑中的观察结果相类似）； 神经损伤或退行性病变，如阿尔茨海默病、帕金森病、视网膜黄斑变性等等，往往会引起神经元的丢失和神经环路的受损。与具有强大自我再生能力的物种不同，哺乳动物成年后其中枢神经系统几乎丧失了神经元再生的能力。因此，上述病症会引起神经元大量死亡，形成不可逆的严重的功能损伤。胶质细胞被报道具有一定的可塑性。 近年来，对体内的胶质细胞进行重编程并将其转分化为神经元，已成为热门的研究领域并具备了成为新型治疗策略的潜力。这些胶质细胞包括大脑中的星形胶质细胞 （astrocytes）、小胶质细胞（microglia），视网膜中的Müller胶质细胞（Müller glia）或脊髓中的NG2胶质细胞（NG2 glia）等。 研究人员往往运用病毒工具（例如腺相关病毒AAV或慢病毒Lentivirus）操控某一个或几个转化因子在胶质细胞内的表达，诱导成年体内的神经元原位再生。这些因子往往在神经发育过程中，对于神经干细胞（stem cell）、祖细胞（progenitor）或前体细胞（precursor）等的分化起到关键性作用，某些甚至被认为是细胞命运决定因子（cell fate determinants）。 其中，神经分化因子NeuroD1在转分化过程的作用被广泛研究和激烈争论【1-3】。最早于2014年，暨南大学陈功教授教授团队（回国前就职于美国宾夕法尼亚州立大学）就报道运用“胶质细胞特异性”GFAP微型启动子将NeuroD1通过病毒工具递送到星形胶质细胞中表达，即可在阿尔茨海默病小鼠模型的大脑内实现超高效率的神经元原位再生【4】。此后，该团队多次运用NeuroD1介导的转分化技术，成功恢复了多种疾病中的功能缺陷，包括小鼠中风模型【5】、亨廷顿病模型【6】、脊髓损伤模型【7】，大鼠颞叶癫痫模型【8】，甚至非人类灵长类动物缺血性中风模型【9】。 然而，2021年的发表在Cell上的一项研究则对NeuroD1的转分化的真实性提出了质疑【10】。该研究中，来自德州大学西南医学中心的张春立教授团队运用严格的遗传谱系追踪技术标记大脑中的星形胶质细胞，重新审视了NeuroD1介导的转分化过程。他们发现之前研究发现的“再生神经元”并非源于星形胶质细胞，而仅仅是由于GFAP微型启动子引起的AAV泄漏表达而被错误标记的内源性神经元。令人惊讶的是，当运用GFAP微型启动子来表达其他某些转分化因子时，该类泄漏表达也或多或少存在，并呈现无规律性。 此后, 陈功团队对于张春立团队在该Cell论文中所使用的病毒滴度提出了质疑, 认为造成错误标记的原因在于后者使用了过高滴度的病毒（1013 GC/mL）去感染星形胶质细胞，这会增加产生细胞毒性的风险并势必会导致NeuroD1在内源神经细胞中非特异表达【11、12】。 到目前为止，该研究领域内对这一争论还缺乏明确定论。并且，如果现有的胶质细胞AAV递送系统真的无法避免在内源神经元中的泄露表达，那么开发新型AAV体系用于高特异性感染胶质细胞也迫在眉睫。 美国纽约西奈山伊坎医学院眼科和神经科学系的陈波教授团队（博士后Ye Xie和Jing Zhou为共同第一作者）在 eBioMedicine 期刊发表了题为：New AAV tools fail to detect Neurod1-mediated neuronal conversion of Müller glia and astrocytes in vivo 的研究论文。 该论文中作者使用严格的遗传谱系追踪（特异性标记Müller胶质细胞）， 并通过使用GFAP微型启动子将NeuroD1、Math5、ASCL1或NeuroG2这四个被广泛研究的转化因子逐一递送到成年小鼠视网膜的Müller胶质细胞，针对上述争论给予了深入的系统性探究。 实验结果表明，GFAP微型启动子介导的AAV泄露表达并非是由于高病毒滴度所引起的, 而是由其携带表达的转化因子所决定 （与2021年Cell文章在大脑中的观察结果相类似）；相反，使用低病毒滴度（1011-1012GC/mL）无法消除泄露表达，却会造成感染效率的急剧下降；当使用不同血清型的AAV通过不同注射途径去感染Müller胶质细胞, 也无法消除泄露表达，却可以改变泄露表达的神经元类型；更有意思的是，当作者使用两套改造过的新型AAV体系将这四个转化因子导入到视网膜内，则可极大程度上降低甚至消除泄露表达。 新型AAV体系的结果进一步表明，即真正实现在Müller胶质细胞中高特异性的表达后，单一转化因子如NeuroD1也无法实现胶质细胞转分化为神经元。最后, 当使用新型AAV体系去测试大脑不同区域内的星形胶质细胞时，作者同样没有检测到NeuroD1介导的转分化（与2021年Cell文章的结论一致）。 值得一提的是，陈波团队曾于2022年在 Cell 子刊 Cell Reports 上报道称在Müller胶质细胞中下调Ptbp1（另一个颇有争议的转分化现象）的表达无法实现转分化为视网膜神经节细胞【13】。 该研究明确了病毒工具上的报告基因仅仅表明其当前的表达水平，并不能简单用作追溯细胞来源；对照报告基因如GFP、mCherry等的特异性表达并不足以说明该病毒工具会在携带表达其他重编程因子时也维持胶质细胞的高特异性；使用谱系追踪技术则是用来检验胶质细胞是否真正转分化为再生神经元的“金标准”；而在被严格谱系追踪的胶质细胞中高效表达相关因子则是进行胶质细胞重编程研究的关键。 另外，对于陈功团队之前提出的谱系追踪老鼠可能会阻碍Neurod1介导的转分化（相关机理不明）【12、14】，作者在文章的讨论中表示，到目前为止，有多个研究团队使用谱系追踪技术分别在大脑【15、16】、视网膜【17-19】、脊髓【20】等不同区域或组织内实现了胶质细胞重编程为再生神经元。因此谱系追踪老鼠会阻碍转分化的论断是不稳妥的。 有意思的是，陈功团队于2022年在 Neural Regeneration Research 上曾发表研究结果称视网膜内的Müller胶质细胞可以被NeuroD1转化为不同类型的神经元，包括感光细胞，水平细胞，无长突细胞和视网膜神经节细胞【14】。 就此，作者在文章的讨论中表示，陈功团队的上述结果恰好印证了文章中图4关于使用不同血清型AAV通过不同注射途径会引起泄漏到不同内源神经元的假象。最近，NeuroD1在视网膜上引起的类似假象同样被另外两个研究团队的结果所证实【21、22】。 此外，NeuroD1还于2019被报道可以将小胶质细胞转化为神经元【23】。有意思的是，同样运用遗传谱系追踪技术，复旦大学的彭勃团队于2021年在 Neuron 上发表文章表明NeuroD1不光无法诱导小胶质细胞转分化为神经元，反而会引起小胶质细胞的凋亡【24】。 至此，已经有至少三个独立团队对于三种不同类型的胶质细胞 （星形胶质细胞、Müller胶质细胞和小胶质细胞）的研究结果表明，NeuroD1在体内无法实现由胶质细胞到神经元的转分化。之前观察到的结果，极可能是病毒工具错误标记内源神经元的假象。