RIPK2

作者｜小鱼  摘要： 诸多研究正在将与自免相关的炎症靶点和PROTAC两者相结合，比较热门的靶点是HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF，针对这些靶点设计开发用于自免治疗的PROTACs，在临床前阶段显示出良好的体外效力。 引言： 炎症可以是自身免疫性疾病的一个触发因素，也可以是其结果。例如，类风湿性关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病的发病机制中，炎症反应是关键的组成部分。此外，炎症性细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等在自身免疫性疾病的发展中起着重要作用。 图1 炎症信号通路 PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）是一种创新的蛋白质降解技术，其结构由三部分组成：一端是与目标蛋白（POI）结合的配体，另一端是与特定的E3泛素连接酶结合的配体，中间通过一个Linker（连接子）相连。这种设计使得PROTAC分子能够同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶，从而促进目标蛋白的泛素化，并通过泛素-蛋白酶体途径（UPS）实现目标蛋白的选择性降解。 图2 PROTAC结构及作用机制 通过设计特定的PROTAC分子，可以诱导与自身免疫性疾病相关的靶蛋白降解，从而为治疗这些疾病提供新的策略。在设计和评估PROTAC分子时，研究人员会关注其诱导靶蛋白降解的能力，这通常通过DC50（半最大降解浓度）和Dmax来量化。DC50是指能够导致目标蛋白降解50%的PROTAC浓度，而Dmax则表示在饱和浓度下PROTAC能实现的最大降解水平。现将HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF靶点的临床前PROTACs开发情况介绍如下： 1 HDAC VI（组蛋白去乙酰化酶6）组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类重要的酶，它们通过去除组蛋白上的乙酰基团来调控基因的表达。HDAC的功能异常与多种疾病的发生发展有关，尤其是癌症。阻断HDAC可导致细胞死亡和抗炎活性。用于癌症治疗的强效HDAC抑制剂，TSA（Trichostatin A）、SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）等，可以减少诱导关节炎大鼠的肿胀、血管形成和骨侵蚀。 HDAC VI是目前与自身免疫性疾病关联最大的HDAC家族成员，负责炎症的调节，阻断HDAC VI可治疗类风湿性关节炎，以改善滑膜炎症。以下是针对HDAC V1靶点的PROTAC开发情况： Compound2：Cao等人引入了“点击”化学的概念，合成了由不同连接子长度组成的PROTAC分子。其中化合物2的体外研究显示，DC50为108.9 nM，能够显著降解HDAC VI，以及减少 IL-1β（白细胞介素-1β）的释放和p20（caspase-1的中间体片段）的产生；体内研究表明，化合物2降低IL-1β水平，而不影响TNF- α（肿瘤坏死因子-α）水平。 Compound3：Yang等人合成的PROTAC分子，以来那度胺作为配体与CRBN（E3连接酶配体）结合，DC50为1.9 nM，显著降解HDAC VI。  图3 靶向HDAC VI的PROTACs 2 IRAK3/4（IL-1受体相关激酶） IRAK（Interleukin-1 receptor-associated kinase）是与IL-1R和Toll样受体（TLR）信号传导相关的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。IRAK家族成员通过激活下游的信号转导分子如NF-κB和MAPK途径，在调节炎症反应和免疫反应中起着关键作用。其中IRAK-4尤其重要，因为它是固有免疫系统中IL-1家族和TLR家族信号通路交汇的关键节点，参与全身炎症反应的调控。IRAK4蛋白涉及类风湿关节炎和化脓性汗腺炎（HS），是目前治疗免疫疾病的深入研究课题。由于IRAK1和IRAK4的ATP结合位点之间的高度相似性，IRAK4的选择性抑制剂或可治疗系统性红斑狼疮。 Compound5、6：Kargbo等认为，PROTAC可以克服IRAK4蛋白的催化结构域高度保守的限制，开发的化合物5、6可有效降解IRAK4，IC50和DC50值低于30 nM。 Compound7、8：Nunes等人使用异喹啉弹头（IRAK4抑制剂）和各种E3配体，如VHL（VonHippel-Lindau）、CRBN或IAP（凋亡抑制剂蛋白）。其中，含有氟基团的化合物7的DC50为259 nM。进一步细化结构，化合物8采用螺旋环嘧啶连接子，比柔性的线性碳链更具刚性和极性，DC50为151 nM。 Compound9：Chen等人研究发现，采用更短长度连接子的PROTACs并没有观察到IRAK4的显著降解，而含有PEG（聚乙二醇）连接子的化合物9可以有效地降低IRAK4的水平。 Compound10：Zhang等人，将环丙基作为连接子偶联位点，化合物10抑制了IL-6的产生；接着改变连接子，合成一系列PROTACs，其中化合物10b和10d的DC50值为190 nM和405 nM。 Compound11、12：Degorce等人在研究IRAK4蛋白时，偶然发现IRAK3抑制剂治疗自免疾病的功效。POI配体采用吡咯三嗪的顺式异构体，E3连接酶配体采用VHL或CRBN。研究表明，含有PEG连接子的CRBN比VHL具有更好的降解能力，且在采用CRBN的情况下，连接子的长度与降解效果成正比。化合物11和12选择性降解IRAK3，DC50分别为0.052 μM和0.002 μM，Dmax分别为74%和98%。 Compound13：Rowley等人也做出了类似的努力，他们研究了IRAK3蛋白来控制树突状细胞介导的IL-12。采用克唑替尼作为POI配体，VHL作为E3连接酶配体，反式环己酰胺作为连接子，化合物13能够有效降解IRAK3，DC50为94 nM和 Dmax为95%。用化合物13处理树突状细胞后，无论LPS（脂多糖）存不存在，IRAK3均被降解，同时在LPS刺激下，IL-12p水平显著升高。 图4 靶向IRAK3/4的PROTACs 3 PCAF和GCN5（p300/cbp相关因子和组蛋白乙酰转移酶） PCAF和GCN5是密切相关的表观遗传蛋白，在多种细胞通路中调节免疫功能。阻断PCAF和GCN5治疗自身免疫性疾病的机制是通过，减少H3K18、H3K9乙酰化， 抑制NF-κB，IFN-β，TBK1过表达，调节炎症免疫信号。 Compound14：Bassi等人采用PCAF和GCN5的活性抑制剂GSK 4027作为POI配体，采用CRBN作为E3连接酶配体，化合物14能够有效降解PCAF和GCN5，DC50分别为1.5 nM，3 nM。在10 min内，浓度为30 nM的化合物14能使蛋白降解80%。  图5 靶向PCAF/GCN5的PROTACs 4 JAK/STAT（Janus激酶信号转导因子/转录激活因子） JAK/STAT通路是一种重要的细胞内信号传导途径，细胞因子与JAK受体结合，启动STAT转磷酸化，导致增殖和分化等活性的基因表达，引发多种疾病，如类风湿性关节炎（RA）、阿尔茨海默病（AD）、炎症性肠病（IBD）和多发性硬化症（MS）。JAK抑制剂，如Tofacitinib、Ruxolitinib、Baricitinib等，通过调节T细胞活化和自然杀伤（NK）细胞活性，改善类风湿性关节炎。 尽管JAK/STAT靶点已经发现了几十年，但其开发仍存在挑战，如药物半衰期短、血栓栓塞等副作用以及JAK/STAT通路和非典型信号转导之间的串扰。PROTACs可能是破局之选。 Compound21-26：Shah等人，以嘧啶和喹恶啉核作为POI配体。其中，喹恶啉基序的细胞渗透性优于嘧啶基序，且对JAK2具有更高的选择性，已证明6个PROTACs具有降解JAK1和JAK2的作用。 Compound28-30：Kargbo等人发现化合物28的EC50为0.0002 μM，进一步设计了含有Ruxolitinib、Baricitinib（强效JAK抑制剂）的化学物29和30，EC50分别为0.00054 μM和0.0039 μM。 图6 靶向JAK/STAT的PROTACs 5 RIPK2（受体相互作用蛋白激酶2） RIPK2是一种在细胞内信号传导中起关键作用的激酶，参与调节细胞的固有免疫、适应性免疫以及凋亡过程。RIPK2的过度激活和功能失调可导致多种炎症性疾病、自身免疫疾病、癌症以及神经系统疾病。到目前为止，由于泛抑制作用，还没有可用于临床的RIPK2抑制剂。 Compound32-34：Mares等人开发了化合物32，pDC50（DC50的负对数）为9.4± 0.2，但溶解度较差。进一步，通过添加非亲脂性基团来提高溶解度，合成化合物33，pDC50为7.9。进一步，为了解决大剂量依赖性，所合成的化合物34，效力增加了10倍，pIC50为8.0。 Compound35：Bondeson等人开发的化合物35，DC50为1.4 nM，Dmax为95%。 图7 靶向RIPK2的PROTACs 6 STING（人体干扰素基因刺激因子） STING是一种在固有免疫反应中起关键作用的信号转导分子，被来自病原体和宿主细胞质DNA激活后，激活促炎介质，如细胞因子和IFNs的释放来对抗细菌感染。 Compound45-50：Liu等设计了PROTACs来靶向STING途径治疗各种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮。POI配体为C-170 STING抑制剂，E3连接酶配体为为CRBN，合成连接子长度不同的化合物45-50。其中，化合物47显示出最令人满意的结果，DC50值为3.2 μM。在小鼠肾脏组织中的体内研究表明，化合物47可以以剂量依赖的方式降低IFNβ、IL-6和CXCL-10的水平。  图8 靶向STING的PROTACs 7 MIF（巨噬细胞迁移抑制因子） 虽然MIF以其抗癌潜力而闻名，但它也与免疫反应有关。 Compound51-56：在Xiao等人开发的，以7-羟基香豆素和7-羟基-3,4-二氢苯并恶嗪-2-1核为POI配体，以CRBN为E3连接酶配体的化合物51-56中，化合物54表现最优，在2 μM时，与MIF的Ki值为71%，MIF在A549细胞中降解率为71%。 图9 靶向MIF的PROTACs 8 IKZF（Ikaros锌指转录因子） IKZF对免疫调节活性至关重要，其基因的多态性可导致系统性红斑狼疮。 Compound57、58：化合物57和58与CRBN-DDB1（DNA损伤结合蛋白-1）复合物属于强结合，KD值小于10 μM。 图10 靶向IKZF的PROTACs   小结   PROTACs在探索自身免疫性疾病等靶点方面具有良好的体外效力。在理想情况下，研究人员希望获得高Dmax值（例如大于90%的降解效率）和低DC50值，这意味着PROTAC分子在较低浓度下就能实现高效的蛋白降解，预示着更好的治疗效果和更低的副作用。通过优化PROTAC分子的设计，包括选择合适的靶蛋白（POI）配体、E3连接酶配体和连接子（linker），提高了PROTAC分子的疗效和选择性，有望成功将PROTACs带入自免治疗的临床阶段。 具体的设计有考虑到：①优化连接子长度以稳定三元配合物；②添加非亲脂性基团以增加溶解度；③POI配体只留下结合部位，其余修改为连接子，减少额外的毒性；④借助BioPROTACs和杂交PROTACs的研究进展，找到缺乏配体结合位点的POI的解决方案；⑤通过口服/静脉注射纳米制剂，持续递送药物，延长半衰期。 参考资料： https://doi.org/10.1039/D4MD00142G 10.12日，深圳；BiG第二届自免研讨会 8:50-8:55 领导致辞 8:55-9:00 联合主办方致辞 涂   欢：深圳医学科学院副院长、深圳湾实验室副主任 9:00-9:30 临床视角，创新药开发自免，如何选择适应症？ 徐沪济：海军军医大学长征医院大内科主任兼风湿科主任/清华大学医学院教授 9:30-10:00 药厂视角，自免布局和BD策略 10:00-10:30 MNC视角，AZ在肿瘤+自免的布局和开发策略 章   宇： 阿斯利康产品管线和项目管理副总裁 10:30-11:30 Panel：自免创新药如何立项？MNC&biotech的布局策略，BD合作背后的故事？ 肖昌春：赛诺菲中国研究负责人、赛诺菲研究院负责人 徐亚南：武田制药全球外部创新合作部中国区负责人 靳照宇：明济生物董事长兼CEO 朱向阳：华奥泰生物总经理 周潇薇：松禾资本董事总经理（主持） 11:30-12:30 Panel：从肿瘤转战自免，创新疗法（CAR-T/CAR- NK/双抗/ADC/PROTAC等）如何选择适应症，不同modality各自开发优势及挑战，在哪里？未来有哪些新靶标值得关注？ 范晓虎：湾岛细胞创始人/CEO 王立群：星奕昂生物创始人、董事长兼CEO 花海清：映恩生物研发副总裁 冯    焱：领泰生物创始人/CEO 张   雷：深圳湾实验室特聘研究员 卢宏韬：科望医药联合创始人/CSO、BiG总干事（主持） 12:30-14:00 午餐&参观&自由交流 ● 深圳医学科学院（SMART）、卫光生命科学园、湾有引力 14:00  论坛闭幕 报名入口  PS：免费席位有限，均为审核制 观众门票：0元 含12日自免会议&午餐；限biotech/Pharma、临床、院校科学家、投资机构代表 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？ ▼

受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 (RIPK1，Receptor - interacting serine/ threonine- protein kinase 1) 作为协调细胞存活、炎症和免疫原性细胞死亡 (ICD，immunogenic cell death) 的关键应激哨兵发挥作用。尽管 RIPK1 的催化功能是触发细胞死亡所必需的，但其非催化支架功能可介导强的促生存信号传导。因此，癌细胞可以劫持 RIPK1 以阻止坏死性凋亡并逃避免疫检测。这里，开发了一种小分子蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，它可以选择性降解 RIPK1。PROTAC 介导的 RIPK1 耗竭会解除 TNFR1 和 TLR3/4 信号中枢的调节，从而增强 NF-κB、 MAPK和 IFN 信号传导。此外，RIPK1 降解同时促进 RIPK3 激活和坏死性凋亡诱导。RIPK1 降解通过使癌细胞对治疗诱导的 TNF 和干扰素敏感，增强了放射治疗和免疫治疗的免疫刺激作用。文章近期发表在《Immunity》杂志。 1. 背景介绍 细胞死亡和炎症是对抗感染和驱动抗肿瘤反应的先天免疫反应密切相关的部分。虽然感知危险的能力对于任何生物体维持组织功能都是不可或缺的，但不受控制或过度的炎症反应会损害组织并导致慢性炎症性疾病的发病，包括牛皮癣、神经退行性疾病、炎症性肠病和哮喘。 此外，肿瘤细胞经常通过抑制先天免疫反应来逃避免疫检测和消除。 细胞死亡不仅仅是一个终点；它促进垂死细胞与周围组织微环境之间的信息交换。重要的是，它会向受干扰的部位发出警报并招募免疫细胞。RIPK1是一种关键的应激哨兵，可以正向和负向调节细胞死亡、先天免疫和炎症。 RIPK1 位于许多细胞因子受体和模式识别受体 (PRR) 的下游，在确定促生存NF-κB 信号传导与细胞死亡之间的结果方面发挥着至关重要的作用。尽管 RIPK1 的催化功能是触发细胞死亡所必需的，但其非催化支架功能对于调节促炎症和促生存信号转导至关重要。因此，RIPK1 的受控激活有助于组织修复和免疫监视。然而，RIPK1 的过度激活可能导致许多自身免疫性疾病和炎症性疾病。因此，RIPK1 失调和随后的异常细胞死亡是慢性炎症性疾病的常见特征。因此，RIPK1 已成为一个有前途的治疗靶点。 尽管慢性RIPK1激活与炎症性疾病相关，数据表明癌细胞经常劫持 RIPK1，促进细胞存活、对肿瘤坏死因子(TNF) 不敏感以及对免疫治疗产生抵抗。这是因为 RIPK1 的支架功能驱动 NF-κB 信号传导和 NF-κB 依赖性促生存基因诱导。此外，慢性 RIPK1 介导的 NF-κB 信号传导可以促进免疫抑制趋化因子程序，导致浸润性自然杀伤 (NK) 和CD8 + T 细胞减少，减少局部 TNF 超家族配体和深度免疫检查点阻断 (ICB) 抵抗。此外，RIPK1 的支架功能可以亚致死性激活 caspase-8，进而水解并灭活RIPK3 、去泛素酶(CYLD) 和 RIPK1 本身，从而有效阻止坏死性凋亡。 因为 RIPK1 抑制 Toll 样受体 3/4 (TLR 3/4) 和ZBP1下游的坏死性凋亡信号传导,靶向 RIPK1 有潜力克服出现细胞凋亡抵抗，并引发更多免疫原性形式的细胞死亡。目前，大多数抗癌药物通过细胞凋亡杀死癌细胞，而细胞凋亡通常是免疫沉默的。坏死性凋亡是一种不依赖半胱天冬酶的细胞死亡裂解形式，可引发强烈的免疫反应。据认为，这种免疫原性源自死亡受体或 PRR 在细胞因坏死性凋亡而死亡时激活 NF-κB 和/或干扰素(IFN) 信号传导的能力。IFN 信号传导和 NF-κB 激活均驱动诱导性损伤相关分子模式 (iDAMP) 的产生，与组成型 DAMP 一起有效地向免疫系统发出危险警报，确保抗原呈递树突状细胞同时吸收死细胞来采样癌症表位并被激活以促进 CD8 + T 细胞交叉启动。因此，开发驱动坏死性凋亡的疗法可能受益于直接杀死肿瘤细胞和（重新）激活患者针对癌症的免疫系统。 尽管 RIPK1 已成为治疗靶点，但其与疾病相关的活性不能轻易地仅通过激酶抑制剂来实现。 因此，替代策略，例如使用可特异性靶向 RIPK1 支架功能的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 降解剂，可能会更有效地治疗 RIPK1 驱动的疾病。为了改善 RIPK1 靶向性，本文研发生成了一系列双功能 PROTAC 分子。 2. RIPK1 PROTAC 实现 RIPK1 的选择性和有效降解 虽然RIPK1激酶抑制剂对小鼠非常有效，选择性 RIPK1 激酶抑制剂 PK68 和 GSK'963 仅部分抑制 RIPK1 诱导的人类细胞死亡，如它们不能有效地阻止 RIPK1 诱导的细胞凋亡，但可以有效地阻止坏死性凋亡（图 S1 A-C）。  为了改善 RIPK1 靶向，这里合成了一系列异双功能PROTAC分子 ，由 RIPK1 结合弹头、接头和 von Hippel-Lindau (VHL) E3连接酶配体组成（图 1A ）。 使用 PK68 作为 RIPK1 结合配体 ，它通过不同长度的接头与 VHL 配体融合。RIPK1-PROTAC 治疗显示，一组人类和小鼠细胞系以及原代细胞中 RIPK1 水平呈剂量依赖性下降（图 1 B-1E）。  R1-ICR-5 是最有效的 RIPK1 降解剂，在人和小鼠细胞中以纳摩尔浓度消耗 RIPK1。R1-ICR-5 引起的 RIPK1 降解是 VHL 介导的，即 R1-ICR-5S，它在脯氨酸4 位上具有反向立体化学，阻止了 VHL 结合，未能以类似的方式耗尽 RIPK1（图 1 F）。此外，PK68处理并不影响RIPK1蛋白水平。总之，这些数据表明 R1-ICR-5 触发 VHL 介导的 RIPK1 降解。 图1. 选择性 RIPK1-PROTAC 降解剂的开发 在有效的 RIPK1-PROTAC 浓度下，相关激酶的蛋白质水平没有明显变化，例如 RIPK2、 RIPK3 、BRAF 和TrkA， PK68 的潜在“脱靶”结合物（图 1G）。与 PK68 共同处理有效地竞争了 RIPK1 PROTAC，防止了 RIPK1 降解。R1-ICR-5 最早在处理后 2 小时就降解了 RIPK1，并在 6 小时时几乎完全降解（图 1G）。全蛋白质组分析表明，在骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 和 U937 中，只有 RIPK1 被 RIPK1-PROTAC 显著降解（图 1H ）。用 VHL 或蛋白酶体抑制剂处理证实了降解需要 VHL 结合和蛋白酶体蛋白水解（图 1G）。洗脱实验表明，RIPK1 的蛋白再合成率较低，需要 72 小时以上才能达到预处理水平（图 1I）。 尽管R1-ICR-5的亲脂性目前不利于动物的全身治疗，但局部施用R1-ICR-5即可有效耗尽体内的RIPK1。 3. RIPK1 降解剂解除先天免疫信号传导 接下来，评估了急剧消耗 RIPK1 是否会损害TNF或TLR3信号传导。出乎意料的是，R1-ICR-5 处理解除了 TNF 处理的原代 BMDM 和三阴性乳腺癌 EO771 细胞的转录反应，增强了 TNF 诱导的细胞因子表达（图 2A-C）。TNF 刺激基因中最值得注意的是Tnf 、 Il-6和A20。尽管 RIPK1 的急性缺失加剧了 TNF 诱导的 NF-κB 信号传导，但在静息 BMDM 中耗尽 RIPK1 会诱导Tnf 、 A20和Sod2的转录（图 2C）。R1-ICR-5 介导的TNF产生依赖于丝裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2 (MK2) 介导的 TNF生物合成以及随后的自分泌 TNF 介导的信号传导（图 2D ）。 与 TNF 信号传导的失调相一致，我们注意到当 RIPK1 耗尽时，通过死亡结构域 (TRADD) 相关的TNF 受体1 向TNF 受体 1 (TNFR1) 的募集增强（图 2D），这可能是由于 TNF 受体 1 的竞争动态TRADD 和 RIPK1 之间的TNFR1结合。TRADD 募集增强伴随着TRADD、TNFR 相关因子 2 (TRAF2)、细胞凋亡蛋白抑制剂 1 (cIAP1) 和 HOIL-1 相互作用蛋白 1 （HOIP，即RNF31）的增强泛素化（图2E）。由于 TNFR1 信号复合物 I (complex-I) 成分的泛素化介导 NF-κB 激活，因此复合物 I 泛素化增强可能会导致 BMDM、L929、EO771 以及人 LIM1215 和 HT29 细胞中 TNF 信号传导失调（图 2F）。 图2. RIPK1 的快速降解会解除 TNFR1 和 TLR3 信号传导的调节。 RIPK1-PROTAC 治疗还解除了 TLR3 信号传导的调节，增强了 BMDM 和 EO771 中Il-6 、 Tnf 、 Ccl2 、 Cxcl9 、 Cxcl10和Ifnβ的诱导（图 2G）。此外，R1-ICR-5 处理并没有增强EO771 Ripk1- KO细胞中的先天免疫信号传导。这些数据表明，且 RIPK1 是微调 TNFR1 和 TLR3 信号传导激活所必需的，从而防止这些途径的过度激活。 4. RIPK1 PROTAC 促进 TNFR1 和 TLR3/4 介导的 RIPK3 激活 急剧降解 RIPK1 也会使细胞对细胞死亡敏感，同时增强 RIPK3 和MLKL(mixed lineage kinase domain-like pseudokinase) 的磷酸化和激活（图 3 A-C）。同样，急剧降解 RIPK1 也会增强 TLR3 和 TLR4 诱导的坏死性凋亡，这是由含有 TIR 结构域的接头蛋白诱导干扰素-β（TRIF，或 Ticam1）介导的，不依赖于 TNFR1 和ZBP1 （图 3 D-E）。TLR3/4 介导的坏死性凋亡部分需要干扰素 α 和β 受体1 (IFNAR1)，因为Ifnar1 -KO 抑制了这种死亡。因此，急剧降解 RIPK1 不仅会导致先天免疫信号通路（例如 TNFR1 和 TLR3）过度激活，还会引发不受阻碍的细胞死亡激活。 图3. RIPK1 降解剂驱动 TNFR1 驱动的坏死性凋亡，独立于 TRIF 和 ZBP1。 RIPK1 降解后 TNF 诱导的细胞死亡需要 TNFR1，而不是 TNFR2（图 3F）。TNF/R1-ICR-5 诱导的细胞死亡完全不依赖于 RIPK1，因为与多种 RIPK1 激酶抑制剂共同处理并不能阻止这种死亡（图 3G）。然而，当 RIPK1 存在时，这些 RIPK1 激酶抑制剂可有效阻断 TNF 诱导的细胞死亡，表明 RIPK1 的支架功能阻断 TNFR1 触发细胞死亡的能力。 降解 RIPK1 也会使细胞对自分泌产生的 TNF 敏感。因此，BMDM 对单独 RIPK1-PROTAC 处理敏感，并且通过Tnfr1基因删除或与 TNF 中和生物制剂Enbrel共同处理可防止这种效应（图 3H）。抑制 MK2 介导的 TNF 生物合成也抑制了 BMDM 中的 R1-ICR-5 杀伤作用。无活性对照化合物 R1-ICR-5S 或使用 RIPK2 靶向 PROTAC 接合 VHL 对细胞活力没有影响（图 3B 、3I 和 3J），表明 R1-ICR-5 的细胞毒性作用是特定于 RIPK1 耗竭并依赖于 TNFR1 通路的参与。 PROTAC 的细胞毒性与其降解 RIPK1 的能力相关，其中 R1-ICR-5 是最有效的。R1-ICR-5不仅杀死原代BMDM，还杀死小鼠真皮成纤维细胞和腹膜巨噬细胞，将这一观察扩展到其他细胞类型。单独的 PROTAC 治疗主要引起敏感细胞的坏死性凋亡（图 3 J-K），表明当 RIPK1 急剧降解时，TNFR1 信号传导可以通过未知机制触发 RIPK3 激活，这一观察结果已被注意到之前。 虽然 RIPK1-PROTAC 诱导的 RIPK3 激活发生在一系列细胞类型中，但对 RIPK1 急性降解的反应是细胞和组织类型依赖性的，因为有些细胞无法驱动 TNF 介导的自分泌RIPK1缺失时 RIPK3 激活。 5. TNF/RIPK1-PROTAC 诱导的 RIPK3 激活独立于 TRIF 和 ZBP1 TNF/RIPK1-PROTAC 诱导的 RIPK3 激活独立于 TRIF 和 ZBP1 接下来，评估了 TNF 如何驱动 RIPK3 激活。将 RIPK3 募集至 RIPK1、 TRIF或 ZBP1（Z-DNA 结合蛋白 1，又称为DAI 或 DLM-1）的 RIP 同型相互作用基序 (RHIM) 可以启动 RIPK3 激活和坏死性凋亡。为了评估 RIPK3 的 RHIM 的重要性，我们用野生型 (WT) RIPK3 或 RIPK3 的 RHIM 突变形式重建了 RIPK3 缺陷细胞。尽管 RIPK3WT在 RIPK1 缺失的情况下很容易重建 TNF 诱导的坏死性凋亡，但 RIPK3RHIMm却不能（图 3L），这表明 RIPK3 的 RHIM 在其激活过程中发挥着不可或缺的作用。 由于 TRIF 和ZBP1是唯一的其他含有 RHIM 的蛋白质，因此，研究了 TRIF 和/或ZBP1是否在 RIPK1 耗尽时介导 TNFR1 诱导的 RIPK3 激活。原代肺成纤维细胞 (LF) 中Trif和Zbp1的双重缺乏并不影响 R1-ICR-5 处理后 TNF 诱导的细胞死亡（图 3M-N），排除了这些含有 RHIM 的蛋白质的参与。 6. RIPK1 与 DD 结构域作用限制 TRADD 的纤维化 接下来，测试了复合物 I 成分在 RIPK3 激活中的参与情况。TRADD 的敲减完全保护细胞免受 PROTAC 或 RIPK1 基因耗尽时 TNF 诱导的坏死性凋亡（图 4A）。尽管在这些条件下，Spata2 和Cyld的敲减部分保护了细胞，但 TNFR1 下游没有其他信号成分的敲减或药物抑制抑制了 TNFR1 介导的 RIPK3 激活（图 4 B-C）。这表明 TRADD 在驱动 R1-ICR-5 介导的 RIPK3 激活中发挥关键作用。 图4. RIPK1 降解促进 TRADD 纤维化形成和 TRADD-RIPK3 相互作用 RIPK1 不仅抑制 TRADD 向 TNFR1 复合物-I 的募集，而且还阻止其与死亡诱导复合物-II 中的 RIPK3 结合（图 4D ）。RIPK3 向 TRADD 的募集增强与 RIPK3、MLKL 激活增强和细胞死亡相关（图 4 D-F）。 RIPK1 响应 TNF 抑制 TRADD 聚集和纤维化形成（图 4G），因为当 RIPK1 降解时，TNF 处理会导致 TRADD 聚集体出现时间依赖性积累。RNAi 消耗 RIPK1 同样会引起 TNF 介导的 TRADD 纤维化形成。 7. PROTAC 介导的 RIPK1 降解实现抗肿瘤活性 协调暴露于 iDAMP 和死细胞可以激活免疫细胞，驱动抗肿瘤免疫。由于 RIPK1 的消耗同时增强 NF-κB/IFN 信号传导和对坏死性凋亡的反应，作者探索了利用 PROTAC 介导的 RIPK1 降解来触发ICD和增强抗癌治疗的潜力。 R1-ICR-5 处理后，几种不同的癌细胞系能够驱动 TNFR1、TLR3 和 IFNR 介导的坏死性凋亡（图 5 A-C）。R1-ICR-5 处理还使癌细胞对 IFN 诱导的坏死性凋亡敏感（图5 C-D）。R1-ICR-5 处理后 TRADD 与 RIPK3 有效结合，导致 RIPK3 激活增加和坏死性凋亡（图5 E-G）。 图5 . RIPK1 保护癌细胞免受 TNF 和 IFN 诱导的细胞死亡 由于 PROTAC 介导的 RIPK1 降解使癌细胞对 TNF 和IFN敏感（图 5 A-5D），因此假设 R1-ICR-5 可能与产生富含 TNF 和 IFN 的肿瘤微环境的疗法（例如 RT 和 IFN）具有协同作用。 这里专注于 TNBC，其中 放疗 和 免疫阻断肿瘤 是标准护理治疗。放疗不仅刺激NF-κB和IFN驱动的信号传导反应，而且引起EO771和MC38细胞的坏死性凋亡，这种坏死性凋亡被Mlkl缺陷阻断，并被RIPK1-PROTAC处理增强（图5 I-J）。 总之，这表明 RIPK1 作为生存因子，抑制 放疗 介导的细胞死亡。放疗 诱导的坏死性凋亡部分由 TNF 介导，因为Enbrel或Tnfr1缺陷治疗抑制了治疗反应（图 5K-L）。总之，这些观察结果表明癌细胞可以劫持 RIPK1 来抑制细胞对 放疗 的反应。 接下来，测试了靶向 RIPK1 是否可以增强 放疗在体内“加热”肿瘤的能力。肿瘤形成后，进行三次瘤内注射 R1-ICR-5（图 6A ）。尽管放疗 和 R1-ICR-5 作为单一疗法的效果可以忽略不计，但放疗/R1-ICR-5 在 50% 的小鼠中实现了治疗反应。尽管 70 天后，十分之三的小鼠没有肿瘤，但一只小鼠在第 76 天时复发（图 6B -D）。结果表明，R1-ICR-5 可以通过增强活化的 TNF + IFNy +淋巴细胞向肿瘤微环境的募集来延长 放疗 治疗小鼠的存活时间，同时使 EO771 癌细胞容易受到 TNF/IFNy 诱导的细胞死亡的影响。 图6 . RIPK1 作为癌细胞对抗 RT 影响的保护因子 接下来，测试了 R1-ICR-5 是否增强 RT/ICB 组合，使用较低剂量的放疗 (4 Gy)，然后使用 CTLA-4单抗± R1-ICR-5 治疗（图 6J -N）。放疗/ CTLA-4单抗 与 R1-ICR-5 组合可强烈抑制肿瘤生长（图 6K-L），十分之九的荷瘤小鼠对治疗有反应，其中八只完全治愈（图 6M-N）。 图6 . RIPK1 作为癌细胞对抗 RT 影响的保护因子 此外，还确定了 R1-ICR-5 是否可以增强PD1单抗独治疗的抗肿瘤功效。尽管 R1-ICR-5 和PD-1单抗 ICB 作为单一药物都没有被证明有效，但该组合显著减缓了治疗肿瘤的生长动力学（图 7A -D）。联合治疗的小鼠受益于改善的反应率（60%反应）和总体存活率，且三分之一的治疗小鼠完全治愈（图7E ）。 图 7. RIPK1 PROTAC 增强对免疫检查点阻断的反应。 8. RIPK1 急性降解可抑制 RIPK1 驱动的皮肤炎症 先前的研究表明，异常的 RIPK1 介导的角质形成细胞死亡可导致皮肤病变。由于角质形成细胞对 RIPK3 的独立于 RIPK1 的激活有一定的抵抗力，因此，评估了 PROTAC 介导的体内RIPK1 降解是否可以抑制 RIPK1 诱导的皮肤炎症。单独皮下注射R1-ICR-3 或 R1-ICR-5 不会引起皮肤毒性，表明 RIPK1 的急性消耗具有良好的耐受性，并且不会引起皮肤中 RIPK3 的激活。 为了测试 RIPK1-PROTAC 的治疗效果，使用了两种皮肤炎症模型。结果表明 RIPK1-PROTAC 可以抑制 RIPK1 介导的炎症性皮肤病。与只能有效阻止人类细胞坏死性凋亡的 RIPK1 激酶抑制剂不同，RIPK1-PROTAC 可以有效抑制人类细胞系中 RIPK1 诱导的caspase激活和凋亡。而RIPK1 激酶抑制剂 PK68 和 GSK'963 在人类细胞中对此无效。因此，RIPK1-PROTACs 可能有效治疗由 RIPK1 诱导的细胞凋亡和/或坏死性凋亡驱动的人类病理，特别是在 RIPK1降解时固有地缺乏 RIPK3 激活的组织中。 参考：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.04.025IF：25.5 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

侃言 PROTACs通过降解靶蛋白的策略治疗疾病，对于缺乏有效活性口袋的靶标相关疾病的治疗开拓了新的治疗思路。PROTAC降解靶蛋白不仅受POI配体、E3配体的影响，同时还受合适的连接子的影响。 近期EJMC上一篇综述汇总了含氮杂环连接子在PROTACs分子中的合理性设计和应用，分以下几点展开： 1、引入含氮杂环考虑的主要因素 2、不同类型的含氮杂环：     三氮唑     单个饱和氮杂环     多个饱和氮杂环     氮杂螺环 3、氮杂环连接子设计&优化中的挑战 4、谈谈一些感想和新的设计、发现策略 01 引入含氮杂环的主要考虑因素 在PROTACs早期设计中，主要集中于柔性链作为连接子，如：烷基链、聚乙二醇链（PEG）、和类聚乙二醇链等。 虽然以烷基柔性链为连接体的PROTAC在体外生物活性评价中表现良好，但亲脂性烷基柔性链的引入降低了这些药物分子的亲水性，导致其在体内生物实验中的药代动力学特性和药理活性普遍较差。 同时，也有报道表明，在PROTACs分子中引入烷基柔性链，具有引起体内溶血的风险！这进一步限制了烷基链在临床PROTACs分子中的应用。 PEG链、和类PEG链在PROTACs中的应用可以弥补某些种类烷基链的不足，但使用过长的PEG链会引起大量氧原子的积累，从而增加PROTACs的极性表面积，降低细胞的通透性。这不利于PROTACs分子被细胞吸收，进而降解靶标蛋白。 此外，药物代谢研究表明，含有PEG链和类PEG链的PROTACs分子在生物体内容易发生氧脱烷基反应，导致药物代谢稳定性下降。 链长&柔韧性：另一个值得一提的问题是，无论使用烷基链、PEG链还是类PEG链，当长度过长时，由于其柔韧性的增加，整体分子构象会逐渐变得更加复杂。在微观水平上，它表明柔性链很容易与蛋白质缠绕在一起，这不利于三元复合物的稳定性。因此，柔性链仅适用于PROTAC探索的早期阶段，后续开发仍需对连接子进行持续优化。 刚性结构：近些年，利用刚性结构，包括氮杂环、炔、和芳香环，在PROTAC连接子的设计和化学合成中得到了广泛的报道。 多项报道证明，这些刚性结构的引入，有利于提高PROTACs分子的药物活性、和代谢稳定性，并显著推进PROTACs分子的开发。 在这些刚性结构中，氮杂环更受研究结构和制药公司的青睐，包括三氮唑、吡啶环、哌嗪环等。 氮杂环的优势： （1）用柔性链相比，氮杂环作为连接子，保留了一定的柔韧性、和刚性。这不仅减少了PROTACs在三元复合物形成过程中，连接子黏附在蛋白质表面的可能性，使三元复合物更加稳定；而且使PROTACs能够以合适的构象与靶蛋白和E3连接酶链接，进一步增强PROTACs降解活性。 （2）氮杂环中的氮原子在整个PROTACs分子的极性表面积和亲脂性之间提供了一个精细的平衡。这种微妙的平衡使得PROTACs分子更容易被细胞吸收。 （3）环形结构可以延缓药物在体内的代谢，从而延长药效时间。 （4）在连接子中引入氮杂环，可以提高PROTACs分子的选择性！ 02 不同类型的含氮杂环 鉴于含氮杂环在PROTACs分子的连接子中的优势，文中汇总了近些年的应用实例，主要阐述了三氮唑、单个饱和氮杂环、多个饱和氮杂环、氮杂螺环等的主要应用。 2.1、三氮唑 三氮唑是一种以其稳健性、和多功能性而闻名，在PROTAC生成中作为连接子的一部分发挥了至关重要的作用。 一方面，三氮唑通过限制连接子的柔韧性，稳定PROTAC与POI和E3连接酶形成的三元复合物，从而显著增强降解POI的活性。 一方面，三氮唑类化合物能与POI相互作用，增强PROTAC分子与POI的结合力。 另一方面，可以通过高效、温和的化学反应，构建三氮唑，如“Click”环化，使三氮唑易于融入PROTAC连接子中。 这些都是三氮唑在PROTACs连接子中应用的优势，使其成为连接子设计中的热门选择。 如下图，是近些年报道的三氮唑在PROTAC连接子中的应用的一些实例。 化合物1中三氮唑，增强了POI与SIRT2蛋白之间的亲和力； 化合物2中的三氮唑，增强了烷基链连接子生成的PROTAC分子降解CDK9的活性，这可能源自于三氮唑基团增强了POI配体与POI之间的结合力； 化合物3中引入三氮唑，显著增强了其对CDK6的降解活性，并没有影响其选择性。引入三氮唑前，以长链聚乙二醇为连接子，链长更长，具有选择性降解，但降解活性不理想。 化合物4中引入三氮唑（注，文中三氮唑结构错误，应为1,2,3-三氮唑），在保持原连接子长度最小变化的情况下，有效解决了原化合物缺乏降解活性的问题。改造前，研究人员发现烷基链、或聚乙二醇链作为连接子生成的PROTAC，对GSK-3β靶蛋白具有很强的亲和力，但没有降解活性！ 化合物5采用三氮唑作为连接子，在1μM时几乎完全降解BRD4。在优化过程中，研究人员也是发现，三氮唑的引入显著提高了降解剂的降解活性。 化合物6是在化合物5的基础上保留了原有的三氮唑连接子，选用亲和力更强的配体，对POI配体和E3配体进一步的优化，获得了降解活性更强的PROTAC分子。 化合物7能够同时降解p38α、p38β。在设计的过程中，烷基链和PEG链作为连接子，化合物的降解活性都不是很好，只有20个原子的长柔性链具有良好的p38α降解活性，且E3配体通过酰胺键连接连接子时，降解活性进一步下降。通过三氮唑固定连接子的构象，降解活性显著提高！ 化合物8是在化合物7的基础上，用VHL配体代替了CRBN配体，并对连接子做了细微的调整。化合物8的水溶性显著增加，同时比化合物7降解p38α的活性增强，且具有选择性。 化合物9在PEG链连接子连接POI配体端引入三氮唑，在100 nM时，SHP2几乎被完全降解，显著抑制HeLa细胞的增殖。 化合物10引入三氮唑，显著提高了对AR靶标的亲和力，在30 μM时，几乎完全降解AR，还有进一步优化的潜力。 化合物11在连接子的中间引入三氮唑，并对两端的烷基链长度进行了优化，具有良好的FLT3的降解活性、和选择性。 化合物12中引入三氮唑，同时对烷基链、PEG链等柔性链进行长度的优化，以及E3配体的选择性优化，获得的具有EGFR特异性降解活性的PROTAC分子，最大降解效率91%。 化合物13在连接子中引入三氮唑的同时，在两端分别优化烷基链、PEG链的长度，大大提高了对EZH2的亲和力、以及降解活性。 化合物14在柔性链中引入三氮唑，大大提高了对ERα的降解活性。 这些PROTACs分子针对的POI、细胞系以及降解活性如下表所示。 以上实例揭示了三氮唑在改变连接子性质方面的关键作用，其能够显著地降低连接子的灵活性，从而使连接子稳定在最佳构象中。在连接子的两端引入三氮唑，不仅可以增加其刚性，还加强了配体与靶标之间的相互作用，从而提高化合物的降解效率。 目前的研究，三氮唑在连接子中的应用主要还是涉及其与柔性链的结合，而其与其它刚性结构协同提高连接子的性能方面的研究较少。 2.2、单个饱和氮杂环 哌啶、哌嗪等半刚性饱和氮杂环在PROTACs连接子的应用中日益广泛。 一方面，哌啶、哌嗪等氮杂环在一定程度上提高连接子的刚性，使连接子趋于有利于参与三元复合物形成的构象，因此，增强PROTACs降解POI的活性； 另一方面，哌啶、哌嗪的氮原子为整个PROTACs分子提供了碱性中心，有可能提高PROTACs分子的口服利用度，增强其在生物体系中的代谢。 以下是近些年，一些PROTACs实例中，单个饱和氮杂环的应用。 化合物15的改造过程可以看出，使用单个氮杂环（如哌啶环），同时将链长保持在6-7个原子长度，即使采用弱亲和的E3配体产生的PROTACs，也具有更好的AR降解活性。这表明，在连接子中使用氮杂环可能会增强弱亲和力E3连接酶配体在PROTAC中的适用性。 化合物16是SHP2的有效PROTAC降解剂。然而，在后续的优化中，研究人员发现，利用烷基链等长的PEG链迭代，或者用哌嗪氮杂环迭代酰胺键等措施，降解活性明显降低，或未达到增强的目的。 而利用哌嗪氮杂环迭代原有的酰胺键氨基，得到化合物17，获得了对SHP2较高的降解活性！这表明，酰胺键产生的空间排列时必要的。而保持酰胺键位置不变的情况下，哌嗪环逐渐向VHL配体靠近，活性逐渐减弱。这表明氮杂环引入的位置需要仔细地探究，它可能影响三元复合物内结合地角度。 化合物18中引入哌嗪环，显著增强了其降解H-PGDS地活性；在研发过程中发现，利用PEG链作为连接子，随着链长地缩短降解活性增加，刚性地哌嗪环时降解活性达到峰值！而换用乙二胺，降解活性降低。 化合物19在连接子中引入哌嗪环，增强了化合物地活性，其对SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E等多种冠状病毒具有良好的药物活性。 化合物20在化合物19地基础上进一步缩短了连接子，获得了更优地抗病毒活性。然而，两个化合物的溶解度都处于中等，哌嗪环的引入使整个PROTAC分子具有了一个碱性位点，然而由于邻位的羰基具有吸电子的效应，使得这个碱性位点并没有显著提高化合物的pKa值。 化合物21是研究人员通过在连接子POI配体端引入哌嗪环，获得的PROTAC分子，显著增强了其降解AR的活性。然而，哌嗪环的引入并没有如预期的那样增强分子的质子化过程，进而增强溶解性。可能的原因是哌嗪与POI配体的吡啶环邻近，降低了哌嗪环的电子云密度，因而没有增强化合物结合质子的能力。 化合物22中引入了刚性的哌啶环，改变了原有POI配体仅针对BRAF V600E的特异性，使其对其它突变体也具有降解活性。 化合物23在连接子中引入哌嗪环，对HER2具有良好的降解活性，且对POI具有高选择性。哌嗪环上的两个氮原子都被烷基链的给电子作用增强，从而提高了它们接受质子的能力，这使得其亲脂性和亲水性之间的平衡更加理想。 化合物26是通过对PEG链连接子的不断优化，引入哌嗪刚性环，并获得最合适的连接长度而产生的PROTAC分子，可以解决c-MET耐药问题。然而，哌嗪环上两个氮原子都受到羰基和苯基环吸电子作用，导致氮原子的碱性降低，这使得化合物26很难通过哌嗪环的引入质子化来提高其水溶性，以及获得理想的口服PK特性。 化合物27是通过烷基链连接VHL配体和KRASG12C配体获得的有效降解剂。研究发现，在烷基链中引入哌啶、哌嗪、三氮唑等刚性结构，以稳定构象，能够显著提高对POI的降解活性。其中，引入哌啶环获得的化合物28，其降解活性是化合物27的2.5倍！ 化合物29具有较高的CKD9降解活性，但水溶性较低。研究人员希望通过引入哌啶环，增加连接子的刚性，并增加整体分子的碱性中心，以提高水溶性。 初步利用哌啶环直接迭代原有的短柔性链，获得化合物30，降解活性显著提高，但水溶性没有明显改善。推测是羰基的吸电子效应，降低了整体PROTAC分子的质子化效应。 去除羰基，获得化合物31，降解活性略有下降，但水溶性大大提高！这种现象可能是由于去除了羰基，导致连接子中整体吸电子作用减弱，从而提高了哌啶环内氮原子的碱度。这使得氮原子更容易与质子结合，从而提高了化合物的水溶性。 化合物32是通过对烷基链的不断优化，并引入刚性氮杂环，最终获得的降解活性显著提高的PROTAC分子。研究发现，当氮杂环和羰基中间引入亚甲基时，降解活性略有下降，直接去除羰基，则降解活性消失。同时还发现，在10μM时，具有强烈的钩效应。 化合物33是引入哌啶环获得的对CBP较强降解活性的PROTAC分子。有趣的是，通过将化合物33的4-氨基哌啶环的取向反转到连接子结合位点，得到的化合物34，显示出对CBP的选择性降解。随后，在化合物33的E3配体优化过程中，开发出了CBP/p300强降解化合物35 ，其对CBP和p300的最大降解率达到99%，DC50值分别低至0.05 nM和0.2 nM。 化合物36是在连接子中引入哌啶环获得的针对AR有效降解的PROTAC分子；进一步对POI配体进行优化，获得化合物37，具有良好的口服生物利用度（F=99%)。 化合物38是通过在连接子中引入哌嗪取代柔性烷基碳链获得的对GPX4降解活性显著提高的PROTAC分子（从10%提高到33%）。化合物39也是同样的策略，提高了分子的靶向性和生物活性。用VHL配体替换CRBN配体，获得化合物40，降解活性进一步提高，且具有更高的耐药性和选择性。 化合物41引入哌嗪作为连接子，具有良好的BRD9降解活性，且增强了其选择性，对同源的BRD4/7均无降解活性。此外，整体的碱性中心，增加了分子的碱性，进而增加了其水溶性。同时还是其获得了较强的药代动力学特性。 化合物42在烷基链中引入氮杂环替代，有效地规避了其低选择性、副作用，提高了口服生物利用度，具有良好的EML4-ALK降解活性。 下表中是各PROTACs分子对应的POI、细胞系、以及降解活性。 单饱和氮杂环在PROTAc连接子的设计中经常单独使用，这对PROTAC的降解活性、药代动力学数据等有显著影响。与四元、五元饱和杂环相比，六元饱和氮杂环限制了连接子的灵活性，提供了合适的构象，在设计应用中具有一定优势。 哌嗪、哌啶等六元氮杂环构象相似，但是，哌嗪中额外的氮原子会影响连接子的极性表面积；哌啶的引入还要考虑方向性的问题；还要考虑杂环在连接子中的位置，以及是否受邻近基团电子效应的影响等。 2.3、多个饱和氮杂环 在连接子中引入单个饱和氮杂环显著影响PROTAC的活性和体内药代动力学特性，这说明氮杂环可以促进PROTAC分子的临床药物性能的开发，因此，也有众多的研究将多个饱和氮杂环引入到连接子的设计之中。 化合物43在连接子中同时引入了哌啶、哌嗪环，获得了最优的IRAK3降解活性。然而，化合物44（DC50=52nM)仅比化合物43（DC50=2nM)在两个氮杂环中多了一个亚甲基，其降解活性明显降低。这表明，虽然氮杂环引入带来了刚性环境，但过于刚性的连接子可能会影响PROTAC与POI、E3连接酶形成三元复合物的角度。因此，适当的引入柔性链可以调节键合角度，是三元复合物稳定形成。 化合物45、46都是在AR降解剂中引入哌啶、吡咯氮杂环、以及羰基连接两个氮杂环，但吡咯环连接POI配体的手性不同。结果是，具有R型手性构型的化合物45具有最高的AR降解活性，而对应的化合物46降解AR活性较弱。这说明连接子的构象对于三元复合物的形象至关重要。 化合物47是通过一系列的结构优化、引入哌啶、哌嗪，获得的高效降解BCR-ABL的PROTAC分子。研究人员首先通过POI配体Asciminib与POI的共晶结构研究，发现用哌嗪替代配体中暴漏出来的吡咯烷-3-醇基团对POI保持了较强的亲和力，并显著提高了水溶性。 随后，研究人员通过酰胺键将柔性链连接的CRBN配体连接在哌嗪N上，然而，获得的PROTAC分子降解活性不高；去除羰基，降解活性显著提高！而用相当长度的柔性链取代哌嗪环，降解效果几乎消除。在哌嗪和吡啶之间引入一个哌啶环，优化得到最终的化合物47，又进一步提高了降解活性。 化合物48是在连接子中同时引入两个哌啶环、和一个炔烃，开发出来的口服BTK降解剂。两个哌啶的碱性中心有助于提高化合物的水溶性，使其在亲脂和亲水之间达到微妙的平衡，具有特殊的口服利用度。 化合物49使用1-(哌啶-4-基)哌嗪作为连接子，对MDM2蛋白的降解活性最好。 化合物50使用两个连续的乙基哌啶作为连接子，对PARP1的降解活性最好。 化合物51在两个哌啶氮杂环中间加入一定长度的烷基柔性链，对BTK降解活性最强。 化合物52在氮杂环-氮杂环体系中间加入亚甲基以改变连接子构象，对AR-FL、AR-V7具有有效的降解活性。 化合物53也是研究人员在探索连接子的过程中发现，在半刚性的氮杂环中间引入亚甲基柔性链获得的BTK降解活性显著提高的降解剂。然而，其口服利用度较差，可能是由于氮杂环中碱性过高，导致水溶性过高，亲脂性不足。 化合物54是通过4元杂环的刚性环代替柔性环优化而得的高选择性、高BRD4降解活性的降解剂。然而，其水溶性较差。通过引入一条4-甲基哌嗪-1-乙基侧链，通过这条侧链增强了碱性中心，从而提高了整个PROTAC分子结合质子的能力，从而提高了其水溶性，获得化合物55，不仅具有较高的水溶性，而且保持了其选择性、和降解活性。 化合物56-59等AR降解剂的研发、优化过程堪称经典。最初先以烷基链作为连接子确定了降解AR最佳的碳链长度，精确的11-12个原子范围；随后，引入不同氮杂环（吡啶、哌啶、哌嗪）到连接子中，保持总长度，观察到了降解活性的显著提高、和溶解性的改善；通过比较，最终确定1,4’-双哌啶作为连接子；最后对剩余的柔性链进行固定构象优化，获得化合物56（DC50=0.86nM)，具有较好的AR降解活性。使用CRBN配体替代VHL配体，获得化合物57（DC50=0.28nM)，降解活性略有提高，同时还改善了口服生物利用度(F=67%）。进一步对POI配体和连接子杂环进行优化，获得化合物58（DC50=0.04nM)，降解活性极高，同时保持了口服生物利用度（F=51%)。化合物59相比于化合物58，用螺环代替了POI配体中的六元环，降解活性降低，但也相对较高（DC50=0.6nM)，但是大鼠的口服生物利用度提高到了82%。 化合物60、61在连接子中引入两个哌啶环、一个哌嗪环，并保持原有柔性链的长度，降解活性得到显著提高。两个化合物的降解活性在伯仲之间。 化合物62通过在PEG链中引入哌嗪、吡嗪等刚性杂环的引入，改善了其水溶性和代谢稳定性，同时可有效降解RIPK2。 化合物63通过哌嗪环、哌啶环作为连接子，连接3CLpro配体和CRBN配体，能够有效降解POI。 下表中是各PROTACs分子针对不同靶标、不同细胞系的降解活性汇总。 与单个饱和氮杂环相比，多个饱和氮杂环可能不会显著提高PROTACs分子的降解活性，但可以显著改善其体内药代动力学特性，进一步提高其临床应用价值。 但是，多个饱和氮杂环的引入，也可能大大增加整个连接子的刚性，可能导致连接子失去最佳构象，影响三元复合物的稳定性；或者大大增加整个PROTACs分子的碱性，进而失去了亲脂性、亲水性的平衡，导致口服生物利用度降低；因此，需要综合评估引入氮杂环的种类、数量、附着位置，而且要深入调查氮杂环之间的连接模式是否影响形成稳定构象等，必要的时候需要引入适当的柔性链。 2.4、氮杂螺环 氮杂螺环相比于饱和含氮杂环，在三维空间构象上具有独特性，赋予PROTAC连接子立体化学构象。 一方面，而这种空间构象的修饰可能潜在地增强三元复合物的稳定性，从而增强PROTAC分子的降解活性。 一方面，这种氮杂螺环多由脂肪环烃、和氮杂环烃组成。其中的氮原子提供了碱性中心，有利于提高化合物的水溶性。 另一方面，螺环中的环状脂肪烃有助于维持化合物的亲脂性。 因此，氮杂螺环在PROTACs连接子中的应用，可以有效地平衡整体分子的水溶性和脂溶性，进而促进其更有效地进入细胞、以及发挥治疗作用。 以下是一些报道的氮杂螺环在连接子应用中的实例。 化合物64在连接子中引入了氮杂螺环和羰基哌啶，与单独引入氮杂环相比，可有效增强化合物对AR靶标的降解活性以及高生物利用度。需要注意的是，连接子中羰基的存在，降低了螺环中氮原子结合质子的能力，导致整个PROTACs分子水溶性降低、亲脂性增加。因此，化合物64在口服生物利用度上表现中等。同时，化合物64具有良好的体内药代动力学。 化合物65通过羰基连接两个哌啶杂环作为连接子，对ERα具有较强的降解活性。然而，其大鼠口服生物利用度仅有10%。可能是羰基的存在导致的！降低了哌啶环的电子云密度。 化合物66是在化合物65的基础上对两个哌啶环和羰基的位置进行了重新排列，从而引入了螺环结构。改造后，化合物的降解活性并没有降低（有一定提高），反而大大改善了其口服生物利用度。 化合物67以烷基-氮杂螺环为连接子对MLKL的最大降解率超过90%。 化合物68以烷基柔性链为连接子，确定了最优链长，能够有效降解SMARCA2；引入哌啶杂环，保持链长，显著提高了降解活性；通过氮杂螺环替代哌啶环，同时引入环己烷将柔性链固定在E3配体附近，这些优化，最终获得了选择性的降解剂化合物70。 各PROTACs分子对应POI及细胞系的降解活性如下表。 相对于饱和氮杂环，氮杂螺环环化合物作为连接体在平衡PROTAC分子的水溶性和亲脂性方面具有更大的优势，从而更好地促进PROTAC分子进入细胞发挥其治疗作用。此外，氮杂螺环化合物还可以通过维持水溶性和亲脂性之间的平衡来促进口服活性PROTAC的发展。 然而，氮杂螺环化合物的种类远远超过饱和氮杂环，这给氮杂螺环化合物的选择、优化带来了巨大的挑战。 03 含氮杂环连接子设计&优化中的挑战 含氮杂环在PROTACs连接子的应用中具有改善降解活性和药代动力学特性的优势，但在设计和应用中仍存在着诸多挑战。 挑战一：含氮杂环类型的选择。在四元到六元氮杂环之间选择、从饱和到不饱和、含氮原子数（如哌嗪环还是哌啶环）、单个杂环还是多个杂环、含氮杂环的选择等，仍然是一个巨大的挑战。 挑战二：优化位点的选择。氮杂环引入的位点仍是个棘手的问题。 挑战三：引入氮杂环需要加入的化学键的选择。在PROTACs连接子的设计中，单个原子都有可能显著影响POI降解的活性，不同的连接基团，降解活性差异很大。如前文中提到的羰基对邻近基团电子云的影响、亚甲基对连接子柔韧性/刚性的影响等。这些都需要大量的实验工作来验证合适的连接组合。 挑战四：氮杂环的引入，可能引起的手性选择的问题，对PROTAC活性影响也比较显著，如前文提到的化合物45、46。这无疑给优化的工作带来了更复杂繁琐的挑战。 挑战五：连接子支链的选择。目前与PROTAC连接子设计相关的文献很少涉及引入支链，但也有少数研究报道，引入支链可以显著改善PROTAC在体内的药代动力学特性，如前文提到的化合物54、55。如果考虑支链的影响，这无疑更加加大了连接子优化的工作量。 然而，最大的挑战是对于PROTACs连接子中含氮杂环的合理设计仍然缺乏有效的理论指导。研究人员只能靠分子对接和大量实验的经验总结，经过长期探索，获得经验性积累。 总结与展望： PROTACs无疑给疑难疾病治疗，特别是不具有传统意义上的“可药物化”靶标的疾病治疗带来了革新的治疗手段。 PROTACs连接子需要具备一定的刚性、柔性、亲脂性、亲水性，刚柔并济，亲脂亲水平衡，才能在稳定三元复合物构象、增强细胞渗透性和口服生物利用度上获得改善。因此含氮杂环，如三氮唑、哌嗪、哌啶、以及单个、多个或者含氮螺环等在改善连接子的构象和水溶性上将发挥巨大的作用。 但是含氮刚性杂环不易过多，“过刚易折”不利于三元复合物适合键合度的形成，过碱也不利于生物口服利用度，需要把握好刚与柔、亲脂性与亲水性的平衡。 出来数量和种类，同时还需要注意杂环的方向性、邻近化学键基团电子诱导效应、连接杂环的手性、侧链等等因素的影响。 这还仅仅是连接子的“选择困难症”，如果再加上POI配体、E3连接酶配体的选择等，这将更是一个庞大的工程！ 虽然，现在已经有了行之有效的方案，如，先确定高亲和力的POI配体、E3配体；通过烷基柔性链或PEG柔性链的筛查，确定合适的连接子长度；再通过引入合适的含氮杂环改善化合物的降解活性、水溶性、药代动力学特性；而后亦可再优化POI配体或E3连接酶配体。这已经是一个非常逻辑严密的策略了，但是中间的每一步的实施都需要大量的实验工作，以及长期的经验积累。 或许DNA编码化合物库（DEL）筛选技术，可以给以上繁琐的工作量带来解放！ 前面我曾分享过DEL技术在PROTACs分子、分子胶等靶向降解剂发现的应用，详见👉🔗。DEL技术基于亲和力筛选，可以高通量地构建包含POI配体、E3配体、连接子的多样性文库，同时筛查连接子的选择、POI配体的选择、E3配体的选择，甚至包括筛查连接化学键的选择。以上提到的挑战，都可以在DEL文库的构建中“一视同仁”！目前已经在一些靶标如BRD4、BRD9等得到了POC验证，未来，这或许是一个解放工作量的选择！ 参考文献 Application and challenges of nitrogen heterocycles in PROTAC linker. Eur. J Med. Chem., 2024, 273, 116520 DOI: 10.1016/j.ejmech.2024.116520 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓