ADAM8

除病毒是生物制药生产过程中的一个关键环节，可确保生物制药的安全。除病毒过滤广泛应用于生物制药下游工艺，通过基于尺寸排阻机制将小病毒（例如，大小为 18-26 nm的细小病毒）与生物制药（例如，大小约为 12 nm的单克隆抗体）分离，有效去除病毒（即病毒去除达4-log10以上，产品回收率高）。本文回顾了过滤器形态、进料溶液成分和高通量除病毒过滤性能等关键因素，主要关注病毒去除效率的对数降低值。还讨论了液流中断和蛋白质污染问题。 简介 必须确保生物制药生产过程中的病毒安全，因为用于生产生物制药的细胞培养物容易受到病毒污染。下游工艺过程除病毒能力至关重要。目前的除病毒指南建议使用至少两种正交方法来清除病毒：采用低pH处理（和/或添加溶剂和洗涤剂）的化学灭活方法和除病毒过滤方法。已知或未知病毒至少减少 4-log10。在各种除病毒方法中，除病毒过滤工艺是一种强大的、基于尺寸的病毒去除工艺，不会损害生物药。具体来说，除病毒过滤可有效去除有囊膜病毒和无囊膜病毒，而病毒灭活仅对有囊膜病毒有效。例如，除病毒研究中最坏情况的小鼠病毒通过应用单次除病毒过滤被去除了超过4-log10，实现了超过40%的总病毒去除，在下游工艺中，除病毒过滤可应用于任何阶段；然而，优选在较后的阶段（例如，在初级捕获步骤之后），以尽量减少杂质造成的工艺影响。除病毒过滤最初以切向流过滤进行，其中施加的压力方向垂直于溶液滤液，以减少蛋白质污染和浓差极化效应等副作用。为确保工艺简单和成本效益，目前的除病毒过滤工艺采用直流过滤，施加的压力的方向与滤液方向相同。为了降低直流过滤中除病毒过滤器表面蛋白质沉积和浓差极化的潜在风险，除病毒过滤器的皮层侧置于滤液附近。 除病毒过滤器可分为大型病毒截留过滤器（标称孔径约为 50 nm，用于去除逆转录病毒）和小型病毒截留过滤器（标称孔径约为 20 nm，用于去除细小病毒）。传统的除病毒过滤过程大多需要小型病毒截留过滤器，因为它们可以有效去除大病毒和小病毒。除病毒过滤器应该能够有效去除病毒，同时允许所需产品通过；这极具挑战性，主要是因为细小病毒（18-26 nm）和生物制药产品（例如~12nm的mAb）之间的尺寸相似性。此外，在除病毒过滤器用于下游工艺前，所有除病毒过滤器必须通过完整性测试，以及病毒去除、泄漏、蛋白质传输和生物安全测试。然而，即使遵循所有严格的验证程序，除病毒过滤工艺中病毒突破和产品损失（即蛋白质污染）仍有可能发生，从而导致产品安全和经济问题。 迄今为止，已经发表了多篇与除病毒以及病毒灭活/过滤工艺相关的下游工艺的综合评论论文。在最近发表的一篇综述论文中，主要关注了除病毒工艺的工艺验证以及程序的未来发展。本文将综合性介绍除病毒过滤，重点介绍影响该工艺的关键因素和目前的局限性。通过过滤器进行病毒去除的机理主要取决于孔结构的尺寸排阻，此外还有过滤材料的化学相互作用，例如静电和疏水相互作用。本文特别强调了膜孔形态、进料溶液组成和高通量条件下的载量等影响病毒去除的因素，后者以对数降低值（LRV）表示。此外，文章将讨论过程中断的影响，例如液流中断和蛋白质污染，并介绍当前应用连续工艺的局限性。 影响病毒去除效果的关键因素 通过过滤去除病毒的机制 生物制药下游工艺中除病毒过滤的示意图如下图1所示，使用过滤器去除病毒可以通过尺寸排阻机制来解释，其中病毒被捕获在过滤器的病毒截留区域，其工作原理类似于深层过滤器。过滤过程中病毒颗粒被去除，而生物制药产品则被传输，回收率很高（>95%）。与传统的超滤膜相比，为了在获得高病毒截留率的同时获得较高的产品产量，除病毒过滤器的病毒截留区域具有较窄的孔径分布（PSD）。PSD和其它膜孔特性，如孔径梯度、孔隙连通性和对称性，是除病毒过滤性能的重要贡献者。根据膜的形态，病毒截留区域可以是除病毒过滤器的顶部或底部区域。 图1. 除病毒过滤过程中病毒去除和单克隆抗体传输的示意图。 如图1所示，病毒主要根据其大小以及一些化学相互作用（即病毒与过滤器表面之间的静电和疏水相互作用）而被捕获到截留区。自然界中，病毒被认为是带电胶体，而介质完全是中性的。介质中病毒的中性可以通过双电层的形成来解释：病毒颗粒的反离子形成第一层，靠近病毒表面（主层），扩散离子形成厚的第二层（Gouy层）。一旦病毒和过滤器表面带相反电荷，它们之间就会存在静电力，引起表面相互作用，从而使病毒吸附在过滤器表面上。在之前的研究中，普遍采用 Langmuir 和 Freundlich 理论来理解病毒吸附。两种理论都假设单层吸附，但Langmuir理论假设吸附剂表面能量分布均匀。Langmuir 和 Freundlich 理论分别用方程 1 和方程 2 表示： 其中，Rateads为吸附速率，ka为速率常数，Cv为病毒浓度，Xm为吸附位点总数，Xocc为占据的吸附位点。 其中Xads是游离病毒的比例（=吸附病毒/吸附剂重量），K和n是给定吸附质的常数，C是悬浮平衡中的病毒。 介质中病毒和过滤器表面的电荷由物质的等电点 (pI) 决定。当溶液的pH值高于病毒/过滤器的pI值时，表面带负电；相反，如果溶液的pH值低于pI值，则表面带正电荷。先前的研究已经表明膜和病毒之间的表面电荷对病毒吸附的影响。例如，Wang等人揭示了吸附在土壤上的 ΦX -174 和 MS2 噬菌体等多种病毒会受到溶液 pH 值的影响，表明病毒的 pI 与其吸附有关行为表现在表面上。Dowed 等人报道说，噬菌体 MS2 和沙土在环境 pH 值下均带负电荷，由于静电排斥力，导致吸附量减少。Voorthuizen 等人报道，带中性电荷的病毒颗粒会导致病毒聚集，并且在微滤过程中表现出比带负电荷的病毒时更高的 LRV。Dika 等人研究了噬菌体的电泳迁移率以及由于静电相互作用而导致的膜粘附差异，结果表明电泳迁移率与噬菌体的 pI 值之间没有相关性。这些有争议的结果表明必须使用多种方法来测量病毒的 pI 值。然后，必须指出测量 pI 值的最佳和最准确的方法，以阐明静电相互作用对病毒的吸附。这将有助于了解病毒与膜表面之间的静电相互作用/排斥引起的病毒去除性能的变化。 疏水相互作用是病毒吸附到病毒过滤器表面的另一种机制。在除病毒过滤中，病毒的疏水部分和过滤器表面倾向于优先彼此相互作用，而不是与水相互作用，这可以增强病毒和过滤器之间的吸附，从而提高性能。关于疏水相互作用的研究主要集中在预过滤上，以去除不需要的蛋白质聚集体，而不是病毒-过滤器相互作用。然而，已知细小病毒比蛋白质更具疏水性，并且了解病毒、过滤器表面和蛋白质之间的疏水相互作用可能有助于更高的病毒去除率和更好的蛋白质传输。 商用除病毒过滤器的特性 商用过滤器的代表性材料、物理性能和病毒去除性能总结于表1中。商用除病毒过滤器由单层或多层的聚合物材料、对称或不对称的过滤器形态组成，目的是产生高去除性能。对于生物制药下游工艺中的除病毒过滤，使用直流过滤（NFF）系统确保了高产品回收率和工艺简单性，其中施加的压力方向和溶液滤过方向相同。如表1所示，Ultipor® DV50、PlanovaTM35 N和Virosolve® NFR等过滤器用于去除大型病毒，如鼠白血病病毒、猿猴病毒40和牛病毒性腹泻病毒。同样，PegasusTM SV4、Prime、Ultipor® DV20、PlanovaTM BioEX、15 N、20 N、Virosolve® NFP、PRO、Virosart® CPV 和 HF 用于去除小病毒，如猪细小病毒 (PPV)、MVM、和细小病毒 B19。如前所述，除病毒过滤最常用的是使用小型病毒截留过滤器。 表 1.商用除病毒过滤器的物理特性。 通常使用基于聚合物的除病毒过滤器，因为它们可以实现快速去除和高产品回收率，并且不会对产品产生不利影响。用于除病毒过滤的代表性聚合物是聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）和再生纤维素（RC），它们具有低蛋白质吸附、高耐溶剂性、广泛的pH耐受性和高流速的优点。具体而言，过滤器上的低蛋白质吸附对于最大限度地减少产品损失非常重要。RC 过滤器具有最低的蛋白质吸附，而 PVDF 和 PES 过滤器具有卓越的机械强度，可在更高的施加压力下实现更高的通量。此外，一些PVDF 和 PES 过滤器进一步亲水化，以减少蛋白质吸附。例如，由铜氨再生纤维素 (CRC) 组成的 PlanovaTM N 系列过滤器的适当工作压力为 0.98 bar，最大入口压力约为 2.94 bar。相比之下，基于 PVDF 的 PlanovaTM BioEX 适合在高达 4.4 bar 的较高压力下运行。过滤材料并未被视为影响除病毒过滤过程中 LRV 变化的主要因素，因为主要的病毒去除机制由尺寸排阻模型来解释。因此，基于过滤材料的LRV的比较是有限的。Marques 等人显示了 RC 过滤器 (PlanovaTM 20 N) 在流量衰减方面优于 PVDF 和 PES（分别为Virosolve® NFP 和 Virosart® CPV）过滤器。然而，该研究是有限的，因为每个过滤器都在建议的操作条件下运行，表明不同的初始滤液通量涉及不同的流量衰减倾向。由于当前生物工艺对高度浓缩的产品液流的需求不断增加，过滤材料可能成为影响除病毒过滤性能（在产品收率和 LRV 方面）的重要因素。 商用小型病毒截留过滤器在病毒截留区域的平均孔径约为 20 nm，略小于细小病毒的平均孔径（通常为 18-26 nm）。如表 1 所列，不同的商用过滤膜形态和层数提供了适用于特定条件的特定性能特征。图 2 显示了商用除病毒过滤器（PlanovaTM 20 N、Viresolve®NFP、Viresolve® PRO 和Ultipor® DV20）的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。SEM 图像表明商用除病毒过滤器具有独特的形态。PlanovaTM20 N 和 Viresolve® PRO 表现出相对不对称的孔隙结构，入口和出口之间具有不同的孔径和孔隙密度。相比之下，Ultipor® DV20 在整个过滤区域表现出相对对称的孔形态。Viresolve® NFP 被称为一种不对称过滤器，在微滤膜上涂有一层薄薄的病毒截留层。与 Ultipor® DV20 和 Viresolve®PRO 过滤器的荧光标记纳米颗粒截留能力相比，不同的膜形态显示出不同的病毒截留能力，如图 3 所示。对纳米颗粒混合物（20、40 和 100 nm）的同时过滤表明，使用 Ultipor® DV20 会产生由所有颗粒尺寸的混合物组成的松散层，而在滤液附近发现了 40 和 100 nm 颗粒的明显薄层，20 nm 颗粒分布广泛。随后，将讨论孔形态对病毒去除性能的影响，包括病毒截留可视化方法。 图 2.商用除病毒过滤器的扫描电子显微镜 (SEM) 图像（横截面）(a) PlanovaTM 20 N、(b) Viresolve® NFP、(c) Viresolve®PRO 和 (d) Ultipor® DV20。 图 3. (a) Ultipor® DV20 和 (b) Viresolve® PRO过滤器对荧光标记纳米颗粒的截留。 影响病毒去除效果的因素 孔隙形态 在生物制药领域，病毒过滤设备需具备比市售超滤膜更精细的孔径分布（PSD），以确保高效去除病毒。研究显示，微小的缺陷在过滤过程中可能导致病毒穿透，因此对PSD的研究至关重要。先前的研究通过多种技术手段，如葡聚糖过滤、液-液孔隙率测试（LLP）和金纳米颗粒（GNP）捕获测试，来确定市售病毒过滤设备的PSD。这些研究旨在揭示PSD对病毒捕获效率的影响，并深入理解其去除机制。 最近的研究评估了市售病毒过滤设备的孔隙结构，以探索其与病毒去除能力之间的联系。Bakhshayeshi等人利用不同分子量的葡聚糖和两种市售病毒过滤设备，分析了PSD的差异。他们的研究揭示了基于膜方向的筛分效率差异，表明两种膜的进料侧较为疏松，而滤液侧则相对致密。此外，还观察到了葡聚糖过滤方向的依赖性以及进料溶液浓度梯度的局限性。 Giglia等人采用LLP方法，研究了具有不同亲水性和孔径分布的病毒过滤设备的PSD。结果显示，Viresolve PRO®的病毒捕获区域PSD较窄，且对模式病毒的去除效率估计较高，与ΦX-174病毒的单层去除效率实验数据相吻合。 Kosiol等人通过GNP捕获测试，对商业和非商业病毒过滤设备进行了PSD的密集测量，并使用十二烷基硫酸钠（SDS）作为模式溶液，以减少GNP吸附到膜表面的影响。研究发现，第二代过滤设备的PSD较第一代更窄，平均孔径和99%截留孔径的值相近。GNP和LLP方法被用于比较商业病毒过滤设备的平均孔径，LLP方法得到的平均孔径（约20纳米）比GNP方法测量的（约15纳米）稍大，这表明需要更精确的孔径测量技术来开发下一代病毒过滤设备。 通过使用荧光标记的病毒替代物和共焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，研究了病毒在过滤设备中的捕获机制。Bakhshayeshi等人在噬菌体PP7上标记了Alexa Fluor® 488，并比较了均质Ultipor® DV20和不对称Viresolve® PRO中的PP7捕获行为，揭示了不同的捕获位点。Ultipor® DV20的捕获位点靠近进料侧，而Viresolve® PRO的位点则靠近滤液侧。 Fallahianbijan等人开发了荧光标记纳米颗粒（FluorSpheres®），而Ayano等人则利用光学显微镜和荧光标记的病毒样颗粒（VLP）以及蛋白质，直接监测了病毒捕获和蛋白质传输的动态过程。其他用于可视化孔隙形态的方法包括透射电子显微镜（TEM）和/或扫描电子显微镜（SEM）。 Nazem-Bokaee等人使用荧光标记纳米颗粒，通过CLSM和GNP，以及SEM评估了PlanovaTM 20 N和BioEX的孔形态，结果表明两种过滤设备中的捕获行为相似，且两种可视化方法的观察结果一致。Adan-Kubo等人通过TEM分析了PlanovaTM 15 N和20 N，通过测量孔隙数量和孔径比（孔径/平均孔径）将孔隙区域区分为粗糙内层、致密中间层和粗糙外层。孔的互连性被认为是影响病毒去除性能的关键因素。 Fallahianbijan等人通过部分阻塞过滤设备的入口区域，使用GNP检查了Ultipor® DV20、Viresolve® NFP和PRO的孔隙互连性。Ultipor® DV20在阻塞区域中未显示GNP的捕获，而Viresolve® NFP和PRO在阻塞区域中观察到一些GNP，表明GNP通过互连的孔移动。Brickey等人通过聚焦离子束和SEM展示了Viresolve® PRO过滤设备的3D结构，重建的3D结构重新定义了孔隙网络，如孔隙率、PSD和孔隙互连性。过滤设备的3D结构有助于更好地理解病毒过滤设备的病毒捕获机制。 尽管在病毒过滤设备的可视化方面取得了进展，但为了全面理解病毒去除机制，仍需更精确地分析孔隙形态。 料液组成 化学因素，如溶液的pH值、电解质浓度、蛋白质种类和添加剂，对病毒清除率（LRV）有显著影响。研究已表明，不同pH和电解质浓度下，某些过滤器的LRV存在差异，强调了进料溶液化学特性在遵守现行病毒清除法规中的重要性。表2汇总了影响病毒清除性能的化学因素研究，包括过滤器类型、目标病毒、蛋白质、料液条件及其LRV结果。 Planova™系列过滤器在调整pH值、电解质浓度和蛋白质种类等进料溶液条件后进行了测试。Hongo-Hirasaki等人发现，在不同进料溶液条件下，PlanovaTM 20 N通过PPV提供稳定的LRV性能，但滤液通量受离子和蛋白质浓度影响。 表2.影响除病毒过滤的各种化学因素。 另一项研究指出，在不同电解质浓度和进料溶液条件下，含有金纳米颗粒（GNP）的1 g/L人IgG溶液的滤液通量下降行为可能显著影响病毒过滤过程。Strauss等人评估了PlanovaTM 20 N和BioEX在改变进料溶液的pH值、电解质浓度和单克隆抗体（mAb）类型后的过滤效果。研究发现，在低电解质浓度下，带相反电荷的病毒（如MVM）和模式过滤器（pH 4）表现出较高的LRV。然而，在高电解质浓度下，两种带负电荷的物质（pH 8）会产生较高的LRV。此外，研究还探讨了蛋白质类型和添加剂对病毒清除性能的影响。 Adan-kubo等人观察到基于蛋白质类型的不同病毒截留行为；人细小病毒B19在PlanovaTM 15 N过滤器中的截留随着白蛋白而向外移动，表明病毒-蛋白质相互作用改变了病毒截留行为。Bao等人使用PlanovaTM 20 N成功去除了猪圆环病毒1（PCV1），该病毒对当前的病毒灭活和去除工艺具有高度抵抗力。与其他pH条件相比，使用pH 6的0.1–0.3 M甘氨酸溶液可提高PCV1的LRV，表明补料溶液条件影响病毒清除性能。PlanovaTM系列过滤器在高蛋白质浓度下可实现高病毒截留，适用于下一代下游工艺。 研究人员还关注了Viresolve® NFP，以研究ΦX-174噬菌体的LRV在多大程度上取决于溶液pH、电解质浓度和蛋白质类型。结果表明，在低pH值下，当病毒和过滤器表面具有相反电荷时，LRV增加。此外，增加电解质浓度可以增强带相反电荷的表面之间的相互作用，从而提高病毒清除性能。除了溶液pH值和电解质浓度外，不同类型的蛋白质和病毒还可能导致复杂的直接和间接机制，同时影响LRV性能。实验室规模制造的纳米纤维素病毒过滤器在各种进料溶液条件下产生高LRV，可用作下一代病毒过滤器。不同进料溶液成分（包括单个病毒和蛋白质特性、溶液pH值和电解质浓度）获得的结果显示病毒清除性能存在差异，表明溶液化学特性在病毒过滤过程中病毒捕获和蛋白质传输中发挥着重要作用。这表明病毒过滤器的聚合物化学特性对于实现高性能非常重要。此外，生物制药生产过程正在开发为一个连续工艺过程，需要了解溶液化学对病毒过滤性能的影响。 高吞吐量操作 商用病毒过滤器在生物制药的下游工艺中能够提供高效的病毒清除率（超过4-log10），但在高流量条件下，其清除效率可能会降低。Bolton等人的研究表明，在高达60 L/m2的流量下，病毒清除率（LRV）显著下降，蛋白质浓度在LRV的衰减中起着关键作用。高蛋白质浓度可能导致流量严重衰减，LRV的降低可能与流量下降的百分比相关。然而，Khan等人的研究发现，增加蛋白质浓度并不降低LRV，只有流量的减少才与LRV的降低有关。此外，他们的研究还表明，与蛋白质相比，病毒杂质更有可能降低LRV。在高流量条件下，病毒过滤器可能会超过其最大截留能力，导致意外的病毒突破。鉴于下游工艺正朝着连续工艺的方向发展，这可能需要在高浓度进料溶液下进行高流量处理，因此了解在高流量条件下LRV的行为至关重要。 Lute等人报道，在高达500 L/m2的流量下，使用商用过滤器如Viresolve® NFP、PlanovaTM 20 N、Ultipor® DV20和Virosart® CPV进行细小病毒清除时，LRV降低（见图4）。使用Viresolve® NFP过滤器时，LRV显著下降。Ultipor® DV20过滤器也显示出LRV下降，且过滤性能差，导致滤液通量过低而不得不终止工艺。而使用Virosart® CPV和PlanovaTM 20 N过滤器，LRV几乎保持不变，且PlanovaTM 20 N实现了更高的过滤容量，高达500 L/m2。本研究的实验结果进一步通过一个机械模型进行分析，该模型解释了病毒颗粒在过滤器内的沉积以及在过滤器上形成浓差极化层的沉积。 图4. 高吞吐量条件下商用过滤器的对数降低值（LRV）比较。 Jackson等人开发了一个均质膜LRV降低的模型，以检查在高流量条件下的病毒截留行为。他们以Ultipor® DV20作为模式过滤器，该模型方程考虑了过滤层数、筛分系数、未被捕获病毒的浓度分数（游离病毒）和滤液体积。因此，LRV可以用公式3表示： 其中N代表层数，x代表游离病毒的分数，S代表筛分系数，V代表滤液体积，VR代表储存区的体积。该模型成功地将高达100 L/m2的PP7噬菌体的病毒清除与各种初始病毒浓度相关联。此外，研究表明，在高流量条件下，通过保持高达100 L/m2的恒定滤液通量，可以降低LRV。LRV的下降可能与通量的下降无关。 最近的研究集中在商业病毒过滤器在连续生物制药下游工艺中的应用。Lute等人介绍了使用PlanovaTM 20 N和BioEX进行连续病毒清除工艺的可能性，显示了在4天操作期间高病毒清除率的稳健性。Bohonak等人将Viresolve® PRO过滤器与高浓度50 g/L mAb一起使用长达50小时，并获得了对逆转录病毒和细小病毒的高病毒清除性能。他们还建议在预过滤和病毒清除过滤之间采用直接加标方法，用于连续系统。 Shirataki等人使用连续工艺（柱层析，然后病毒清除过滤）研究了病毒清除性能。这证实了将层析与病毒清除过滤步骤相结合有效地提高了蛋白质过滤性，在恒流模式下低通量下具有高病毒清除能力。Tang等人通过使用96孔过滤板开发了一种高通量工艺，用于规模缩小验证商业病毒过滤器，并并行进行了八项实验。开发的工艺预计将用于高通量实验，以减少病毒过滤器和模式产品的使用量。在高通量条件下，不期望的LRV下降取决于溶液条件和/或病毒过滤器的类型。为了防止高通量下病毒的意外突破并利用过滤器的最大载量，有必要在最佳溶液条件下选择合适的过滤器，并进一步考虑连续工艺。 除病毒过滤过程中断 在生物制药的下游处理流程中，病毒清除过滤器面临两个主要挑战：流体流动的异常中断和蛋白质的非期望吸附，这些现象都可能导致产品损失。流体流动的异常中断在过滤过程中表现为不希望的降压事件，通常称为压力下降。另一方面，蛋白质的非期望吸附是指在过滤过程中发生的不希望的蛋白质捕获，这可能导致产品损失和生产中断。有报道指出，这两个问题可能是过滤过程中病毒清除率（LRV）变化的关键驱动因素，但目前对这些现象与LRV变化之间的确切关系尚不完全了解。在本节中，我们将回顾有关蛋白质吸附和压力下降的现有研究，并讨论它们对病毒清除效率潜在影响的争议。 液流中断：压力释放 在生物制药的下游工艺中，病毒清除过滤面临着两个主要的挑战：流体流动的中断和蛋白质污染，这两者都可能导致产品损失。流体流动的中断，在大规模操作中或在缓冲液冲洗步骤后可能会发生，这种在过滤过程中出现的非期望降压现象通常被称为压力释放。这种现象成为问题，因为在压力释放后，观察到病毒突破的现象。为了深入理解和解决这个问题，Zydney的研究团队使用Ultipor® DV20过滤器进行了一系列的实验，观察了压力释放前后病毒突破行为的变化。Woods和Zydney量化了这些变化，并提出了一个假设，即完全的压力释放可能导致“回流”，这似乎是LRV下降的原因。然而，在没有“回流”可能的情况下，当压力没有完全释放时，LRV也经历了类似的下降，这反驳了他们之前的假设。共聚焦显微镜的观察显示，压力释放前后病毒截留行为存在明显的差异。压力释放后，Ultipor® DV20的病毒截留层变得更厚且不那么致密，而压力释放前，病毒截留层则更薄且更致密。这种现象可以用病毒迁移可能降低压力释放后的LRV来解释。这些研究是使用噬菌体作为细小病毒的模型进行的。 在其他研究中，研究者使用两种不同类型的荧光标记噬菌体来确认压力释放导致的病毒迁移。在这项研究中，使用了三种不同的除病毒过滤器（Ultipor® DV20、Viresolve®NFP 和 Viresolve® PRO），目标病毒（ΦX -174）被染成红色（Cy5）和绿色（SYBR Gold）。在压力释放之前和之后分别注射两种染色颗粒，以比较噬菌体截留行为的变化。根据过滤器类型的不同，压力释放前后的病毒截留以及LRV降低也有所不同。Ultipor® DV20 和 Viresolve® NFP 在压力释放后导致LRV显著降低，而 Viresolve® PRO 未检测到显著的LRV降低。在DV20和NFP的情况下，在压力释放之前和之后观察到两个独特的病毒截留层，这表明病毒迁移和截留行为的变化是由减压引起的。然而，Viresolve® PRO 没有观察到病毒截留行为发生变化，并且压力释放时LRV没有显著变化。 图5显示了Ultipor® DV20在压力释放前后病毒截留的差异，清楚地表明减压后病毒截留发生了变化。Fallahianbijan等人使用荧光纳米颗粒作为病毒颗粒，进一步研究了Ultipor® DV20 和 Viresolve® PRO 之间压力释放行为的差异。对于两种过滤器，压力释放之前和之后纳米颗粒的截留行为与荧光标记的噬菌体相似。Nazem-Bokaee等人使用PlanovaTM 20 N和BioEX进行了类似的实验。该研究使用100 nm荧光标记颗粒，并测量了液流中断前后穿过整个过滤器的颗粒强度峰值。对于PlanovaTM 20 N，在液流中断后观察到滤液附近没有强度峰值，表明可能存在颗粒突破。相比之下，BioEX的峰强度没有观察到显著变化。Leisi等人最近使用激光扫描显微镜观察了细小病毒（即MVM）在PlanovaTM 20 N、PegasusTM SV4、Viresolve®Pro 和 Virosart® HC 中的截留情况。结果表明，病毒在活性层的不同深度积累，这与膜结构有关。此外，液流中断通过病毒动员和更深迁移到更致密的膜层来诱导病毒突破。 图 5. 在恒压下过滤荧光标记的 ΦX -174 后（左）和压力释放实验后（右）Ultipor®DV20 的横截面图像。Cy5 标记（红色）噬菌体用于压力释放前的挑战，SYBR 金标记（绿色）噬菌体在压力释放后使用。 一些研究人员专注于确定压力释放期间影响LRV的主要因素。Lacasse等人改变了操作条件，例如施加的压力、减压速度、溶液粘度和液流中断时间。这项研究的重要发现是，较低的施加压力（<供应商推荐的最大压力的70%）、流体流动中断3分钟以及使用典型的低粘度(~ 1 cP)会导致噬菌体PP7和MVM的LRV下降。Kosiol等人通过改变操作参数（例如溶液的pH值、电导率、蛋白质的存在、蛋白质结合能力和过滤器的最大孔径）进行了实验。因此，蛋白质结合能力低、蛋白质浓度低或完全不存在，导致压力释放后LRV急剧衰减。这似乎是过滤器和无囊膜病毒之间的吸附相互作用减少的结果。压力释放的负面影响可以通过改变进料溶液来减轻。Dishari等人报告称，在使用Viresolve® NFP过滤器释放压力后，pH值为4.9且离子浓度较低时，LRV降低几乎可以忽略不计。这一结果可以通过ΦX -174的等电点和膜的zeta电位来解释，其电荷在pH 4.9时相反。因此，病毒和膜之间的相互作用得到加强，并且能够克服压力释放过程中LRV的降低。尽管由于压力释放时病毒截留行为的变化，病毒突破看起来很复杂，但可以修改过滤器的类型和/或进料溶液条件以减轻负面影响。 蛋白质污染 在传统膜工艺中，膜污染一直是影响过滤效率、增加能耗和提高运行成本的关键问题。膜污染的机制通常可以分为四种类型：滤饼的形成、完全堵塞、部分堵塞和标准堵塞。在超滤过程中，滤饼的形成和大分子在膜入口的完全堵塞是常见的问题，而在生物制药的下游工艺中，病毒清除过滤器可能会遇到不希望的蛋白质堵塞、蛋白质聚集或膜孔部分堵塞的问题。在某些操作条件下，如高蛋白质浓度、高操作压力和高通量，蛋白质污染的倾向可能会增加，这可能会影响病毒清除过滤器的性能。过滤器的独特孔隙结构，包括其对称性和孔径梯度，也对蛋白质污染有显著影响。尽管已有研究揭示了一些关键因素，但蛋白质污染对病毒清除性能的影响仍然是一个有争议的问题。 Syedain等人的研究表明，使用Viresolve® 180过滤器时，蛋白质污染可能会对病毒清除率（LRV）产生负面影响。他们使用牛血清白蛋白（BSA）作为模式蛋白，在不同浓度和操作压力下进行了过滤实验。结果显示，BSA污染导致滤液通量随着压力或蛋白质浓度的增加而显著下降，这表明严重的蛋白质污染可能会降低过滤器的整体LRV能力。 Bolton等人的研究表明，使用Viresolve®NFP过滤器时，蛋白质污染对ΦX-174病毒的LRV有负面影响。他们观察到两种不同的污染机制：滤饼的形成和过滤器孔隙的堵塞。尽管滤饼形成（由90 nm的微粒引起），但由于流量几乎100%下降，LRV保持不变。然而，由于21 nm微粒和IgG蛋白单体堵塞孔隙造成的污染导致LRV严重下降，并伴有超过80%的流量下降。 Yokoyama等人的研究也证实了这些发现，他们使用PlanovaTM 35 N过滤器，在5% IgG和白蛋白存在的情况下观察到B19病毒的LRV性能降低。然而，也有研究报告显示，蛋白质污染导致的LRV降低可以忽略不计或没有显著影响。例如，Khan等人在ΦX-174病毒的LRV测试中使用BSA作为模式蛋白，发现不同浓度的BSA不会降低LRV，但ΦX-174形式的杂质会造成严重的过滤器污染，从而降低LRV。 Jackson等人使用干净的Ultipor® DV20过滤器和受BSA污染的Ultipor® DV20过滤器测试了LRV，结果显示，尽管进料通量下降了50%，但两种过滤器之间的LRV没有显著差异。Hongo-Hirasaki等人使用PlanovaTM 20 N过滤器，在1至30 mg/mL的IgG浓度下测量了PPV的LRV。他们发现，尽管较高的IgG浓度最初会降低通量，但无论IgG浓度如何，料液通量在5小时内保持恒定，且PPV的LRV对蛋白质污染没有任何影响。 总的来说，蛋白质污染对病毒清除过滤器性能的影响是一个复杂的问题，可能受到多种因素的影响，包括操作条件、蛋白质类型和浓度、以及过滤器的物理特性。因此，为了优化病毒清除过滤器的性能，需要对这些因素进行仔细的考虑和控制。 图 6. (a) 因蛋白质污染导致通量下降和 (b) 通量恒定时对数降低值 (LRV)。 最近的研究提出了两种污染机制：可逆污染和不可逆污染，这两种机制可以通过蛋白质的特性来区分。Bieberbach等人的研究表明，通过调整进料溶液中蛋白质的特性，可以区分这两种污染机制。具体来说，蛋白质浓度决定了通量是由可逆污染还是不可逆污染控制。在他们的研究中，使用了三种不同类型的抗体，研究了它们的通量下降行为以及缓冲液冲洗和清洁的效果。研究发现，含有高百分比高分子量物质的蛋白质会导致不可逆污染（缓冲液冲洗后没有通量恢复），而其他蛋白质则允许一定程度的通量恢复。不可逆污染不仅会导致病毒清除率（LRV）降低，还可能导致显著的产品损失和操作时间延迟。 图 7. 低浓度和高浓度下蛋白质污染机制的比较。 与传统的除病毒过滤工艺相比，连续生物制药下游工艺所需的过滤时间更长，这加剧了蛋白质污染的问题。在连续系统中，过滤过程可能需要持续几天。此外，连续工艺可能涉及高度浓缩的生物制药产品，这可能导致不需要的中间体和聚集体的形成。尽管已有多项研究证实，商业除病毒过滤器可以在连续系统中使用，但预过滤被证明是有效控制蛋白质污染和提高除病毒过滤能力的方法。 为了进一步研究除病毒过滤过程中的蛋白质污染现象，需要更深入地了解目标蛋白的污染机制。选择适当的除病毒过滤器和进料溶液条件对于最大限度地减少蛋白质污染的不利影响至关重要。 连续工艺开发的局限性 研究人员正在积极探索连续下游工艺，目的是提高生产效率并减少产品损失。一些团队专注于研究低通量条件下的病毒过滤，以及在恒定流量模式下的操作。其他研究小组则在滤液通量较低时检查通量，以研究操作压力如何影响病毒去除性能，并确定在纳滤过滤(NFF)操作中的最佳过滤通量。 Bohonak和Zydney评估了操作压力和过滤器压实对过滤性能的影响，他们发现滤液通量会随着NFF工艺中Viresolve® 180过滤器的变形而变化。Arkhangelsky和Gitis提出，在较高的跨膜压力(TMP)下，由于过滤压实导致孔隙结构变形，LRV可能会降低。PlanovaTM 20 N在低通量操作时，在0.5 bar的压力下LRV降低，这可能会改变在低施加压力下病毒截留的行为。 Fan等人使用四种不同的商业产品进行了恒定通量模式的病毒过滤工艺研究，他们展示了低通量（5 L/m²/h）操作的负面影响。这表明在低通量操作下，扩散力占主导地位时可能会导致病毒突破，而在最佳通量条件下，对流力适当时，病毒过滤器可以展示出较高的病毒去除性能。David等人还证实，使用PegasusTM SV4、Prime、Virosart® CPV和HF过滤器以0.3 L/m²/h的流量和几乎可以忽略不计的操作压力进行72小时的过滤，会导致病毒去除性能降低。 因此，为了克服低通量操作的限制，必须开发出有效的连续病毒过滤工艺。 总结和研究要点 在生物制药的下游工艺中，病毒清除过滤对于减少产品污染的潜在风险至关重要。本综述聚焦于病毒清除过滤技术的最新研究，特别探讨了病毒过滤器的特性和操作条件如何影响病毒去除效率。同时，也强调了当前病毒清除过滤技术在处理工艺中断和连续工艺方面的挑战。研究结果证实，病毒的去除主要依赖于尺寸排阻机制，即病毒颗粒在过滤器孔中的截留，这是由于病毒颗粒和过滤器孔径尺寸相近。 过滤器的各种特性，如其对称性、孔径分布（PSD）和孔的互连性，都会影响整体的病毒清除过滤性能，包括病毒的去除效率和蛋白质的过滤性。其他影响操作条件的因素，如进料溶液的条件、长时间的操作和高通量处理，也会通过改变病毒截留行为和/或过滤器、病毒与蛋白质之间的相互作用，从而影响病毒清除率（LRV）。工艺中断如压力释放和蛋白质污染也会对病毒去除性能产生影响；然而，由于这些影响也依赖于实验条件（例如过滤器类型和进料溶液条件），因此不同研究的报告结果存在差异。 对于商业病毒过滤器在连续生物制药下游工艺中的有效性已经进行了研究，这种过滤器通常需要在恒定通量模式下进行低通量操作。在不引起病毒突破的情况下，实现高蛋白质浓度下的高产品收率和高病毒过滤器处理量是一个挑战。高蛋白质浓度带来的高溶液粘度可能会由于过滤过程中的严重蛋白质污染和浓度极化效应，对病毒去除性能产生显著的负面影响。此外，在长期操作过程中可能会形成不良的中间体或产品聚集。 因此，开发下一代病毒清除过滤工艺需要采取综合方法，特别考虑各种因素，如过滤材料和通过过滤去除病毒的各种机制。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：在过去二十年中，病毒样颗粒（VLPs）引起了广泛关注。基于VLP的疫苗已获批准用于预防三种传染病——乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒和戊型肝炎病毒；它们非常有效，并能提供持久的免疫反应。除此之外，其他病毒（包括感染人类、动物、植物和细菌的病毒）的VLPs也在开发中。这些VLPs，尤其是来自人类和动物病毒的VLPs，作为独立疫苗用于预防VLPs来源的病毒。此外，包括来自植物和细菌病毒的VLPs在内的VLPs，作为平台用于展示来自其他传染病或代谢疾病（如癌症）的外来肽抗原，即它们可用于开发嵌合VLPs。嵌合VLPs的目标是增强展示在VLPs上的外来肽的免疫原性，而不一定是平台本身。本综述总结了已获批准和正在开发的用于人类和兽医用途的VLP疫苗。此外，本综述总结了已开发并在临床前研究中测试的嵌合VLP疫苗。最后，综述以VLP疫苗相对于传统疫苗方法（如减毒活疫苗和灭活疫苗）的优势作为结论。 1.引言 病毒感染了广泛的生物，包括人类、植物、动物、鸟类、昆虫以及微生物（例如，真核生物和原核生物）。病毒的一个独特特点是它们的结构蛋白、包膜蛋白或衣壳蛋白以及其他结构蛋白，可以独立或集体自发自组装形成不含病毒基因组的病毒样颗粒（VLPs）。因此，任何病毒都可以用来开发VLPs；VLPs可以通过将编码感兴趣病毒蛋白的结构基因克隆到表达载体中来开发（图1）。表达载体取决于将在其中表达蛋白（s）的表达系统，有时，如果表达系统（包括哺乳动物、昆虫和细菌）与病毒通常感染的细胞不同，则对蛋白进行密码子优化。然后，携带结构蛋白（s）DNA的载体被转染/转化到感兴趣的细胞中，在那里DNA被转录和翻译。翻译的蛋白折叠并组装形成VLPs。VLPs在生物医学科学中有多种应用，例如：（i）治疗——将药物/货物运送到特定的癌细胞；（ii）体内成像——装载荧光团的VLPs；（iii）诊断测试——使用装甲RNA作为传染病的阳性对照；（iv）疫苗开发。本综述仅关注后者：VLPs在疫苗开发中的应用。 图1. 一个示意图，展示了VLPs和嵌合VLPs的生成。一种病毒的衣壳蛋白被克隆到一个表达载体中。带有衣壳蛋白的载体也可以用来将外来肽插入到衣壳蛋白中（底部）。然后，每个载体被转化或转染到一个表达系统中，在那里蛋白质被表达并组装成VLPs。 VLPs具有许多不同于传统疫苗的特点，这使它们成为非常有吸引力的疫苗设计平台。它们在尺寸（20-200纳米）、几何形状（即多价表位的二十面体结构）以及激活T辅助细胞的能力方面模仿它们来源的病毒。VLPs自然编码T辅助细胞表位，这些表位由抗原呈递细胞（APCs）与主要组织相容性复合体（MHC）II类一起呈递给T辅助细胞。除了APCs的共刺激分子外，表位的呈递还导致T辅助细胞的激活。这激活了T辅助细胞分泌细胞因子，激活了其他免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞（图2）。VLPs还可以被设计为包裹内源性佐剂，如单链（ss）RNA，以刺激先天免疫反应，如下所述：ssRNA与位于免疫细胞的细胞内隔室（例如，内质网）的Toll样受体TLR7和TLR8结合。ssRNA与TLR7和TLR8的结合导致受体的激活，这些受体向下发送信号，导致细胞因子（例如，干扰素α、干扰素γ、TNFα、IL-1β、IL-6和IL-12）的表达/分泌。分泌的细胞因子激活先天免疫细胞，以及控制病原体入侵的适应性免疫系统的细胞。这一特性还增强了VLPs的免疫原性，即使是在较低剂量下。此外，VLPs被认为是安全的，因为它们不包含病毒基因组，因此不能复制。值得一提的是，像任何疫苗一样，VLPs可能会引起副作用，如注射部位的疼痛和肿胀。因此，VLPs在过去二十年中作为疫苗设计的有吸引力的平台引起了相当大的关注。虽然来自人类和动物病毒的VLPs被开发用于保护人类和动物免受VLPs来源的病毒的侵害，但来自其他生物（包括植物和原核微生物）的VLPs被开发用于展示人类和动物病毒的异源抗原，即开发嵌合VLPs（图1，底部）。嵌合VLPs的目标是引发对平台上展示的异源抗原的免疫反应，而不一定是平台本身。值得一提的是，来自人类或动物病毒的VLPs也可以用来开发嵌合VLPs，其中在VLP上展示的异源抗原来自其他人类病毒（图1，底部）。 图2. VLPs激活免疫反应。抗原呈递细胞吞噬并处理VLPs成片段，这些片段在MHC类II的帮助下呈递给T辅助细胞（顶部图像）。这导致T辅助细胞的激活，它们分泌激活B细胞的细胞因子（下方）。B细胞也通过VLPs交联B细胞受体（BCRs）被激活。激活的B细胞分裂并分化成浆细胞和记忆细胞（这里未显示）。浆细胞向体内分泌抗体，这些抗体中和了VLPs来源的感兴趣病毒。 2.来自人类病毒的VLP疫苗  已经开发了（还有一些仍在开发中）使用感染人类的病毒的VLPs（表1）。事实上，基于VLP的疫苗已获批准用于预防三种人类病毒感染，即乙型肝炎病毒（HBV）、人类乳头瘤病毒（HPV）和戊型肝炎病毒（HEV）。其中，全球至少有九种基于HBV的VLP疫苗已获批准，包括Engerix-B、Recombivax HB、Euvax B、Hepavax-Gene、GenHevac B、GenVac B和Heberbiovac HB。这些疫苗基于HBV表面抗原；其中一些疫苗；例如，Engerix-B和Recombivax HB，自20世纪80年代中期以来一直在使用，它们对其他HBV基因型，如A型和C型，提供交叉保护。尽管这些疫苗对其他基因型提供交叉保护，但已报道了几种疫苗逃逸病毒突变株。尽管如此，HBV保护性抗体在某些个体中可持续长达30年。接种时的年龄似乎与HBV抗体反应有关。例如，平均年龄36岁接种的个体产生的抗HBV抗体比平均年龄32岁接种的个体少。然而，一次加强注射使94%抗体水平低的个体的抗体水平提高。 三种基于VLP的疫苗——Gardasil-9、Gardasil-4和Cervarix——已在全球范围内获得批准，用于预防人类乳头瘤病毒。这些VLPs源自主要衣壳蛋白L1；它们提供针对两种至七种HPV类型的保护——HPV16、18、31、33、45、52和58——这些类型与70-90%的宫颈癌病例相关。它们还提供针对两种HPV类型的保护——HPV6和11——与约90%的生殖器疣相关。对Cervarix和Gardasil-4的免疫反应至少持续13年，而Gardasil-9的免疫反应至少持续6年。Cervarix疫苗在接种11年后对HPV35、31、33、45和58提供21-64%的交叉保护。另一方面，接种Gardasil-4的90%个体在14年后对异源HPV类型（HPV6、11和16）有抗体，52%对HPV18有抗体。值得一提的是，这三种疫苗的长寿研究正在进行中。另外两种有潜力提供更广泛保护的HPV疫苗正在进行临床试验；一种11价候选疫苗，含有未公开的HPV类型，和一种14价候选疫苗，分别处于III期和I期临床试验。预计14价候选疫苗将提供针对HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59的保护。 在中国，一种用于预防HEV的基于VLP的疫苗（Hecolin）已获批准；评估其在其他国家——孟加拉国和美国——的效力的临床试验正在进行中。该疫苗基于来自HEV基因型1衣壳蛋白开放阅读框2的氨基酸368-606。在16至64岁个体中，接种三剂疫苗后的12个月有效率为100%。在老年人中，即大于65岁的个体，接种Hecolin的97.3%个体在第三个月（第7个月）后的1个月内血清转换。此外，87%的接种者体内可检测到至少持续4.5年的抗体。该疫苗针对基因型1、2和4提供保护，并预计在较小程度上对基因型3提供交叉保护。 除了上述批准的基于VLP的疫苗外，还有几种候选基于VLP的疫苗正在开发中。Pumpens和Pusko的一本新书提供了一份全面的总结，介绍了从各种病毒开发的候选基于VLP的疫苗[1]。已开发并测试的VLPs包括流感病毒、SARS-CoV-2、人类免疫缺陷病毒和寨卡病毒。表1总结了一些从人类病毒开发的VLPs在临床前和临床试验中的情况。这些VLPs源自包膜蛋白、衣壳蛋白或两者兼有，并使用各种表达系统表达，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞，以及转基因植物。其中一些VLPs的效力可与传统方法开发的批准疫苗相媲美。例如，使用来自两种流感A亚型——H1N1和H3N2——的结构蛋白开发的杂交VLPs进行免疫接种，其免疫原性与批准的灭活流感病毒疫苗（Vaxigrip；H2N3）一样；IgG反应的标准化中位荧光强度>107。同样，用来自寨卡病毒或埃博拉病毒的VLPs免疫小鼠，提供高达100%的存活率，而对照小鼠则没有存活。 源自人类病毒的VLPs也被用来开发针对其他人类病毒的候选疫苗。例如，源自HBV的VLPs已被用来开发针对幽门螺杆菌（H. pylori）、丙型肝炎病毒（HCV）、与HPV相关的癌症和四种登革热病毒血清型的候选疫苗（表2）。在临床前研究中，用来自H. pylori的肽段展示的嵌合HBV VLPs免疫的小鼠细菌负担减少。在其他研究中，用来自HCV和登革热病毒的肽段展示的HBV VLPs免疫的小鼠的血清中和并保护小鼠免受HCV和登革热病毒感染。此外，展示来自HPV16 E7的肽段的HBV VLPs在HPV相关癌症的小鼠模型中抑制肿瘤。 3.源自兽医病毒的VLP候选疫苗 源自感染动物和鱼类的病毒的VLPs也被用来开发针对影响各种动物的病毒的疫苗，包括猪、兔、羊、马、鸡和鱼（表3）。例如，源自猪圆环病毒-2（PCV-2）的VLPs在小鼠中引发更好的抗体反应，优于商业亚单位疫苗。PCV-2与仔猪断奶后多系统消瘦综合征相关。在羊中，用源自蓝舌病病毒的VLPs免疫提供与活疫苗（单价BTV-8）相同的保护水平。在马驹中，用源自三种非洲马病病毒——AHSV-6、AHSV-3和AHSV-1——的嵌合VLPs免疫，引发了针对这些病毒的中和抗体，尽管水平较低。在鸡中，用来自不同亚型/株的流感A病毒的马赛克VLPs免疫，或用源自传染性法氏囊病病毒的VLPs免疫，比商业灭活疫苗（例如，H6N2用于流感病毒）提供更好的保护（表3）。与此同时，在鱼类中，用源自红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）的VLPs免疫，将死亡率降低到约3.3%，相比之下，用商业灭活疫苗OceanTect病毒性神经坏死和对照组（死亡率分别为10%和约79%）免疫。此外，用源自大西洋鳕鱼神经坏死病毒的VLPs免疫鱼类，将死亡率降低到14%，相比之下，对照组的死亡率降低到只有约80%。 源自动物病毒的VLPs也被用作平台，开发针对其他病毒感染的候选疫苗（表4）。例如，源自犬细小病毒的VLPs已被用来展示来自中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的肽抗原，VLPs在小鼠中引发平衡的免疫反应；免疫小鼠的血清中和了假MERS-CoV。此外，用展示布鲁氏菌抗原——BCSP31——的新城疫病毒VLPs免疫，提供了针对布鲁氏菌强毒株（16M）的保护；保护水平与商业活疫苗：布鲁氏菌melitensis株M5相似；布鲁氏菌melitensis是一种与布鲁氏菌病相关的人畜共患病。 4.来自植物和细菌病毒的VLP候选疫苗  不仅人类和动物病毒，植物病毒和细菌病毒也已被用于开发VLPs。使用各种病毒开发了植物源VLPs，如苜蓿花叶病毒（AMV）、冬葵花叶病毒（PhMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒和锦葵花叶病毒（MaMV）（表5）。展示疟原虫（Pfs25蛋白）抗原的AMV VLPs在I期临床试验中被证明是安全且可耐受的。展示HER2肽的PhMV VLPs被发现可以减缓小鼠的肿瘤生长并延迟其死亡。此外，展示家猫过敏原肽——Feline domesticus——的PVY VLPs引发了针对抗原的高抗体滴度。而且，用展示犬流感病毒H3N8抗原的MaMV免疫的小鼠，与对照小鼠不同，能够保护小鼠免受同源和异源小鼠适应性流感病毒株的致命挑战。 在感染细菌的病毒（噬菌体或phages）的另一侧，已从噬菌体AP205、MS2、PP7、Qβ、P22等开发了VLPs（表6）。用展示HPV肽的MS2和PP7 VLPs免疫可以保护小鼠免受与癌症相关的11种HPV假病毒类型的感染。噬菌体VLPs也已被用于癌症研究。展示来自卵清蛋白的B细胞和T细胞表位的噬菌体P22 VLPs抑制了小鼠中EG.7-OVA淋巴瘤细胞。总的来说，来自感染人类、动物、植物和细菌的病毒的VLPs已被用来开发针对传染病代理以及代谢性疾病的疫苗/候选疫苗。表1-6提供了从各种病毒开发的不同VLPs及其潜在应用的概览。 5.专家评审评论和未来展望  VLP疫苗是蛋白质，因此它们不能像其他重组疫苗（如病毒载体疫苗和mRNA疫苗）那样在体内扩增（即转录和翻译以制作更多副本）。尽管如此，VLP疫苗是这两种重组疫苗的更好替代品。VLP疫苗不需要像mRNA疫苗那样在-20至-80°C的冷冻条件下运输和储存。此外，一旦VLPs被注入体内，它们就会立即被APCs处理，不像DNA和mRNA疫苗，细胞首先需要转录（对于DNA疫苗）并将其mRNA翻译成蛋白质，然后才能被APCs处理并呈递给免疫系统。 VLP疫苗也是传统疫苗（减毒活疫苗和灭活疫苗）的更好替代品，原因有几个：首先，VLP疫苗不复制，因此它们可以用于每个人，包括孕妇或免疫系统受损的人。此外，来自具有分段基因组的病毒（例如，流感病毒、AHSV和蓝舌病病毒）的衣壳蛋白——包括其他结构蛋白——也可以用来开发杂交/马赛克VLP疫苗，而不必担心基因重组，就像在减毒活疫苗中那样。具有分段基因组的病毒有能力进行基因重组；不幸的是，一种由AHSV衍生的减毒多价疫苗导致了AHSV 1型的毒力反转和与AHSV 1、3和4型的基因组重组，导致AHSV的零星爆发。第二，VLPs与真实病毒的结构非常相似，不像灭活疫苗，其结构蛋白可能在灭活过程中被修改，导致免疫原性受损。因此，VLP疫苗是灭活疫苗的更好替代品。它们在较低剂量下也具有免疫原性；事实上，研究表明，用0.3微克的候选狂犬病病毒VLP疫苗免疫引发的抗体滴度与用3微克的VLPs或兽医和人类疫苗免疫相当。 尽管VLP疫苗在较小剂量下具有免疫原性，但目前尚不清楚较小剂量的VLPs是否能为具有不同基因型的病毒（如HBV（至少有九种基因型）、HPV（与癌症相关的20多种类型）或HEV（至少有七种基因型））提供长期保护。如上所述，基于VLP的疫苗提供的免疫反应对不同HBV、HPV和HEV基因型提供交叉保护，但对其他基因型或逃逸突变株（例如，HBV）的保护较少。这些疫苗的剂量至少为每次免疫10微克（例如，用于HBV的Engerix-B）；因此，减少每次免疫的剂量可能不会增强交叉保护。我们认为，增加VLPs（一般抗原）的浓度或增加加强剂量的数量可能会增强交叉保护。例如，研究表明，与10微克相比，较高剂量的抗原（例如，90微克）可以增强对流感病毒亚型和小鼠存活率的交叉保护。同样，用高剂量（106空斑形成单位）的ASFV疫苗免疫可以完全交叉保护ASFV株，而用一半剂量免疫则只能提供部分交叉保护。 因此，针对感兴趣病毒的基于VLP的疫苗应该引发针对感兴趣病毒的所有基因型的交叉保护性免疫，以确保全球效力，考虑到基因型的分布在不同地理区域之间有所不同。例如，HBV基因型在不同大陆之间有所不同，A型在北美、南美、非洲和欧洲更为普遍，而B型和C型在东南亚和东亚更为普遍。D型在西亚、中亚和南亚以及欧洲更为普遍。用于全球使用的基于VLP的HBV疫苗应该提供针对所有HBV基因型的保护，无论个人居住在哪里。HPV和HEV疫苗也是如此。尽管已经通过开发Gadarsil-9来扩大对在世界其他地区普遍的致癌HPV类型（HPV16、18、31、33、45、52和58）的保护范围（如上所述），但仍有一些与10%的宫颈癌相关的HPV类型（例如HPV35、39、51、59等），疫苗不提供保护。例如，虽然Gadarsil-9为非洲、欧洲、北美和拉丁美洲及加勒比地区的大多数与约90%的宫颈癌病例相关的HPV类型提供了保护，但它在澳大利亚和亚洲分别只提供了86.5%和87.5%的保护。该疫苗不保护与非洲3.4%的宫颈癌病例、亚洲1.6%、拉丁美洲和加勒比地区2.3%、澳大利亚1.8%和欧洲1.4%相关的HPV35。HPV56是另一种普遍的HPV类型，疫苗不提供保护，它与欧洲和非洲1.4%的宫颈癌病例以及北美1.0%的病例相关。开发一种14价候选疫苗（包括Gadarsail-9未涵盖的HPV35、39、51、56和59），将在全球范围内保护上述HPV类型。 要在全球范围内有效，基于HEV的VLP疫苗，如Hecolin，必须提供针对在世界各地不同地理区域普遍的四种HEV基因型（HEV1-4）的保护。如上所述，Hecolin疫苗源自HEV基因型1，它对基因型2和4提供交叉保护。疫苗还预计将对基因型3提供一定程度的交叉保护。然而，由于基因型3在全球范围内普遍存在，而基因型1和2主要在亚洲和非洲的发展中国家普遍存在，而疫苗目前正在这些地区进行测试（即在孟加拉国，而不是非洲），至关重要的是要进行包括基因型3在内的其他地区保护研究，以确保疫苗在全球范围内的有效性；基因型4也在中国普遍存在。值得一提的是，Hecolin疫苗是使用细菌表达系统开发的。使用细菌表达系统比使用真核表达系统更便宜。然而，与真核表达系统不同，细菌表达系统缺乏翻译后修饰，如糖基化。尽管缺乏糖基化与一些疫苗的效力较差有关，但这似乎并不适用于Hecolin疫苗；事实上，用该疫苗免疫的猴子完全免受HEV基因型1感染。 如前所述，VLPs（尤其是来自HBV和HPV的VLPs）也被用作展示平台，以增强来自其他传染病（例如细菌和其他病毒）和非传染病（例如癌症）的肽段的免疫原性，最终目标是保护这些代理。然而，使用人类病毒的VLPs作为外来肽段的展示平台存在挑战，因为人类人群中存在针对平台的预先存在的抗体，这些抗体可能来自自然感染或疫苗接种。事实上，一些研究表明，对某些平台的高预先存在的抗体水平可能会降低平台的免疫原性以及平台展示的异源抗原的有效性。例如，儿童体内对脊髓灰质炎病毒的预先存在的母体抗体已被证明在儿童接种相同抗原后，疫苗效力降低高达28%。为了克服这一限制，可以使用不寄生在人类身上的动物病毒、植物病毒和细菌病毒的VLPs来展示外来肽段。 总体而言，VLPs是用于疫苗开发的多功能和高效平台。它们可以用来开发不仅针对它们来源的病毒，而且针对其他传染病和非传染病代理的疫苗。此外，它们是开发针对具有分段基因组的病毒（尤其是那些通过昆虫传播的病毒，例如AHSV）的杂交/马赛克疫苗的极好平台。它们在昆虫体内无法复制，降低了减毒活疫苗可能发生的重组事件的风险。此外，针对AHSV等病毒的基于VLP的疫苗还可能有助于区分已接种疫苗的马匹和感染的马匹，这在使用减毒活疫苗时可能是一个挑战。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 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摘要：病毒样颗粒（VLPs）是具有多种应用的纳米结构，包括治疗、免疫和诊断。随着生物医学工程技术的最新进展，商业化的基于VLP的疫苗正在被广泛用于抗击传染病，同时还有更多疫苗处于临床研究的不同阶段。由于它们在效果、安全性和多样性方面的期望特性，基于VLP的方法在未来几年可能会变得更加常见。然而，在基于VLP的方法能够广泛应用于治疗之前，必须解决一些生产和制造方面的挑战。这篇综述提供了对近期基于VLP疫苗开发情况的见解，重点介绍了它们的特性、表达系统以及作为理想候选者对抗新兴病毒病原体的潜在适用性。最后，详细阐述了基于VLP的疫苗作为可行且高效的免疫剂，诱导对包括SARS-CoV-2在内的病毒性传染病病原体以及基于蛋白质纳米颗粒的疫苗产生免疫的潜力。因此，VLP疫苗可能作为传统疫苗策略的有效替代品，用于抗击新兴的传染病。 1.引言 目前市场上的大多数疫苗主要基于灭活（杀死）或减毒活疫苗的方法。尽管这些传统疫苗已经有效地用于对抗各种传染病，但它们存在一些限制，包括较低的诱导更强免疫反应的潜力和较差的效力。最近传染病的爆发表明了开发强大疫苗以克服这些限制的需求。主要挑战在于开发新的技术方法，增强免疫力，同时不损害安全性、效力和耐受性。最近在DNA、mRNA和重组病毒载体疫苗方面的进展为针对难以靶向的病原体和控制传染病爆发的有效疫苗开发方法。 病毒样颗粒（VLP）技术为开发有效疫苗以抗击严重关注的传染病提供了一个替代平台，并且它与mRNA和病毒载体疫苗并行发展。与其他亚单位疫苗相比，VLPs在免疫原性方面也更强，因为它们在表面以更真实的确认形式呈现重复的抗原表位，免疫系统可以容易地检测到。另一方面，亚单位疫苗由于目标抗原的错误折叠或对免疫系统的呈现不足而具有较差的免疫原性。此外，它们需要佐剂和多次疫苗接种才能引发足够的免疫反应。Fraenkel-Conrat和Williams（1955年）首次通过从纯化的RNA和蛋白质组分重新组装烟草花叶病毒（TMV）颗粒来描述病毒样颗粒这一术语。这些纳米结构诱导强效免疫反应的潜力随后得到了进一步研究。VLP平台可以克服通常与传统疫苗相关的各种问题；具体来说，与减毒活疫苗相关的传染性、向毒株的逆转、突变风险、灭活疫苗的免疫原性降低、不稳定毒性、产量低和配方时间长（图1）。 图1: VLP疫苗与传统疫苗相关风险的比较。 这些生物启发的纳米结构具有来自不同病原体的重复和高度密集的抗原，有助于触发强烈的免疫反应。此外，这些高度免疫原性分子具有病毒蛋白的自组装特性。它们是生物相容的，并在其合成过程中具有结构灵活性的潜力。它们可以通过化学或遗传方式进行修改，具有更高的稳定性、均匀性和功能性，被认为是各种生物医学应用中的有效工具（图2）。它们根据是否存在脂质膜被归类为包膜或非包膜VLP。 图2: 不同类型VLPs的生产及其应用、特性和挑战。(A) 不同的人类致病病毒和寄生虫，(B) 识别形成病原体结构特征并能导致VLPs形成的基因，(C) 将识别的基因整合到质粒等表达载体中，(D) 允许载体在各种表达系统中表达，(E) 形成不同类型的VLPs，如包膜、非包膜和嵌合VLPs。非包膜VLPs可以有两种类型：单蛋白或多蛋白。在多蛋白VLPs中，可能存在单层、多层，并且有些也是马赛克式的。嵌合VLPs可以内部、外部修改，或者可以通过化学偶联进行修改。 然而，与VLPs相关的一些关键挑战包括较低的稳定性、下游处理困难、生产成本高和对环境条件的敏感性。已经在各种表达系统（ESs）中合成了许多不同的VLP，例如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物。基于VLP的疫苗可能用于治疗包括HIV、流感、乙型肝炎、戊型肝炎、疟疾、埃博拉病毒、SARS-CoV-2、寨卡病毒、登革热和口蹄疫在内的各种传染病。 几种基于VLP的疫苗已经获得许可，并在市场上商业化，包括Engerix-B R（GlaxoSmithKline）和Recombivax HB R（Merck & Co）针对HBV，Gardasil R（Merck & Co）和Cervarix R（GlaxoSmithKline）针对HPV，Hecolin R（厦门万泰生物技术有限公司）针对HEV，以及MosquirixTM（GlaxoSmithKline Inc.）针对疟疾。这篇综述着重于VLP疫苗开发的基础知识和技术方面的高级技术。此外，还讨论了用于VLP生产的不同ESs以及针对各种传染病，尤其是SARS-CoV-2的潜在疫苗的开发。最后，详细阐述了作为疫苗开发中承载抗原的蛋白质纳米颗粒的支架。 2. 病毒样颗粒的特性 病毒样颗粒（VLPs）通常因其独特特性（图2）而被视为有效的疫苗候选物。它们是强效的免疫刺激分子，展现出高度密集的病毒表面蛋白，以适当的构象和高度重复的方式呈现，引发强烈的T细胞和B细胞获得性免疫反应。大多数VLPs来源于病毒的衣壳或包膜蛋白，尽管核心蛋白也可以使用。VLPs天然生物相容且不具传染性，因为它们缺乏病毒遗传物质，因此无法复制。它们还被认为是比传统减毒活疫苗更安全的（不会恢复到野生型）。此外，它们是高度多功能的分子，大小从20到200纳米不等。这种大小范围是最优的，可以自由地将它们排入淋巴结，并被抗原呈递细胞（APCs），特别是树突细胞（DCs）更容易地摄取，然后通过主要组织相容性复合体（MHC）II类分子进行抗原处理和呈递。它们高度有序，可以自组装成不同的几何对称性，通常以二十面体、螺旋对称性、杆状结构或球形的形式出现，这取决于病毒的来源。 VLPs已在广泛的表达系统（ESs）中合成，包括原核（细菌）和真核（昆虫细胞、哺乳动物细胞系、植物细胞或酵母）。可以通过肽偶联、遗传融合和化学交联等不同方法，在它们的外部或内部表面展示感兴趣的异源表位，从而增加VLPs的功能。VLP技术提供了一个重要优势，因为它是一种更快的疫苗合成方法。在特定菌株测序后12-14周内就可以制备出针对该菌株的新VLP疫苗，而传统疫苗通常需要24-32周的制造过程。这些疫苗不含卵白蛋白，这对容易过敏的个体来说是巨大的缓解，并且比传统疫苗提供更强的疾病保护。 3. 基于结构的病毒样颗粒类型 根据它们的结构复杂性，VLPs可以分为两组：包膜和非包膜VLPs。两组都展示外来抗原（图2）。 3.1. 非包膜病毒样颗粒 这些VLPs通常由目标病原体或病毒蛋白结构的单个或多个自组装组分构成。这些新形成的VLPs中没有宿主细胞膜（脂质包膜）。主要病毒核衣壳蛋白的表达主要负责这些VLPs的形成。非包膜VLPs仍在作为开发针对几种病原体疾病的亚单位疫苗的首选候选物进行研究，因为它们更容易生产和纯化。此外，这些VLPs体积更小，使它们能够轻松穿过组织屏障并排入淋巴结。病毒粒子的主要结构组成部分是由单个病毒编码蛋白形成的，来源于病原体，如杯状病毒、乳头瘤病毒和小病毒，而多蛋白非包膜VLPs则更为复杂，包含多个相互作用的衣壳蛋白。它们展示了几个显著的结构特征，如多个不同衣壳蛋白的复杂同心层。它们比仅由一个主要衣壳蛋白（CP）构成的VLPs更难制造，来源于传染性腺胃炎病毒、脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒。 3.2. 包膜病毒样颗粒 与非包膜VLPs相比，包膜VLPs（eVLPs）的组成要复杂得多。这些纳米结构由来自宿主细胞的细胞膜称为包膜，外表面有病毒蛋白存在。它们的脂质双层中嵌入了一个或多个糖蛋白刺突，作为产生中和抗体的靶抗原。这些eVLPs显示出更高的灵活性，因为它们针对相同或异源病毒的抗原表位。例如，已经开发了包含SIV的Gag蛋白和HIV的Env蛋白的eVLPs。尽管这可能会影响下游应用，因为存在宿主蛋白。eVLPs已被用于开发针对病毒疾病，如汉坦病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、流感A和逆转录病毒的疫苗。这些大型eVLPs的尺寸大于100纳米，因此它们可能会在注射部位聚集，并且不会到达淋巴结，这限制了它们的应用。相比之下，携带mRNA疫苗的脂质纳米颗粒尺寸范围在100纳米或更小，并在将疫苗高效传递到目标部位方面显示出高效性。 3.3. 嵌合病毒样颗粒 嵌合病毒样颗粒（cVLPs）被认为是开发提供更广泛、更强大、更全面保护以应对新兴传染病的有效工具。这些复杂的多蛋白宏观结构包含不同病毒的表位。cVLPs可以通过构建编码相关病毒蛋白和外来肽或蛋白的重组DNA分子来创建。这些基因工程cVLPs在其表面展示大量重复序列，可以通过化学偶联或遗传融合从其他病毒加载外源抗原。不同的嵌合疫苗已经进行了临床试验，包括针对乙型肝炎的基于VLP的疫苗（M2–HBcAg）、抗疟疾疫苗（MalariVax）、抗流感A、抗HIV和减少吸烟者血液中尼古丁水平的尼古丁-Qb VLP疫苗。这些嵌合颗粒有利，因为它们显著增加了对外国抗原的免疫反应和抗体滴度。cVLPs给药后，它们诱导强烈的细胞溶解性T淋巴细胞免疫反应。这些疫苗还针对非传染性疾病，如高血压、阿尔茨海默症、尼古丁成瘾、过敏和糖尿病。cVLPs的上游和下游处理产量通常较低，其体内稳定性也相当不确定。 4. 病毒样颗粒作为免疫原 已经证明，与亚单位疫苗相比，VLPs具有潜在的高免疫原性和抗原性。这些颗粒的效力有可能显著诱导细胞和体液免疫（图3）。在对VLPs的反应中，各种成熟标志物如CD40、CD80和CD86在树突细胞表面表达，这些标志物负责激活树突细胞。在第一步中，树突细胞通过与树突细胞表面存在的特定模式结合，称为模式识别受体（PRRs），即Toll样受体（TLR2），来激活VLPs。随后，VLPs在树突细胞的细胞质中发生内化，并通过MHC I类和II类分子分别呈递给细胞毒性T细胞和辅助T细胞。VLPs不仅可以刺激B细胞介导抗体反应，还可以刺激CD4+和CD8+细胞增殖。一些研究表明，外源性抗原也可以通过一种称为交叉渗透的过程到达MHC I类途径。 图3: VLPs诱导先天和适应性免疫反应（A）体液免疫；（B）细胞介导的免疫），（1）基于VLP的抗原通过树突细胞等抗原呈递细胞（APCs）增强吸收和呈递，这些细胞向T细胞通报潜在风险，（2）VLP有效运输到淋巴结，这是适应性免疫反应的关键场所，（3）改善B细胞、T细胞和APCs之间的细胞通信，以及（4）基于VLP的抗原有效交联并激活B细胞受体，这些受体在抗原暴露后发展成记忆细胞和长期及短期存活的浆细胞。 此外，B细胞的激活可以通过Toll样受体（TLR）信号或同源相互作用诱导Th细胞的扩增和分化，这些相互作用控制细胞因子的产生。为了提高VLPs的效力，还可以将不同的分子如Toll样受体配体、生物活性介质或其他细胞受体附加到VLPs上。 5. 基于病毒样颗粒的商业批准疫苗 第一种重组VLP是从病毒衣壳蛋白合成的，来自乙型肝炎病毒（HBV）的两个基因（HBsAg和HBcAg）和烟草花叶病毒（TMV）。第一种通过重组DNA方法生产的商业VLP疫苗在1986年获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。这些是在酵母中生产的HBsAg疫苗，被命名为Recombivax HB R。后来，在2006年，第二种基于VLP的疫苗Gardasil R针对人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗获得了FDA的许可。此后，几种针对HPV和HBV的VLP疫苗已经获得批准，其中一些在临床和临床前试验中显示出效力。研究表明，至少有110种VLP已经从35个不同家族的病毒中生产出来。针对不同病毒的几种VLP疫苗，包括诺如病毒、HIV、埃博拉病毒、SARS-CoV-2病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒仍在不同的临床试验阶段。然而，只有少数VLP疫苗进入市场，显示出它们的商业可行性，其中大多数针对非包膜病毒有效。 6. 特定于基于病毒样颗粒疫苗平台的挑战 目前，VLPs与传统疫苗一样有效，还有更安全的额外好处。然而，在成功开发基于VLP的疫苗方面需要解决几个障碍。主要挑战是确定与下游处理有关的问题，以生产临床可行的VLPs，以便及时管理并具有经济可行性。 6.1. 包膜病毒样颗粒的稳定性 VLPs通常被认为比亚单位疫苗更稳定。然而，当环境条件发生变化时，特别是在下游处理过程中，VLPs可能变得非常不稳定，因为它们缺乏病毒的遗传物质。尽管市场上已经有多种VLP疫苗可用，但一些候选疫苗的稳定性存在问题。通常，eVLPs通常比非包膜VLPs更容易受到外部环境条件的影响。温度变化、剪切应力、溶解氧、流体动力学、搅拌速率和化学处理等条件的变化都可能影响颗粒的完整性和稳定性。此外，这种结构破坏显著降低了eVLPs的免疫原性。它还干扰细胞生长和代谢蛋白的产生，这影响了VLP的生产。这一直是将它们作为疫苗制造中活病毒替代品使用的关键障碍之一。然而，已经进行了几种修改以增加它们的热稳定性。一种典型的程序是插入稳定突变。Marsian等人进行的一项研究表明，当在3型脊髓灰质炎病毒VLP的衣壳蛋白中诱导稳定突变时，它比野生型VLP更稳定。它修改了衣壳前体和病毒蛋白酶，而不影响其抗原表位和结构确认。Schumacher等人的另一项研究通过添加C末端连接体-六组氨酸肽增加了嵌合体（HBcAg-VLP）的稳定性。 6.2. 高生产成本 一些基于VLP的疫苗在结构上更为复杂，因此生产成本更高。与eVLPs相关的众多杂质带来了巨大的挑战。在下游处理（DSP）过程中，会像包膜杆状病毒颗粒的情况一样，共同纯化各种杂质，如宿主细胞碎片（HCD）、宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞DNA（HCD）。如果这些污染物在DSP期间没有正确去除，它们可能会在疫苗中引起不良副作用。大规模生产和纯化VLPs需要不同的工艺，如密度梯度或甚至色谱法，以制造最终配方产品。这些复杂工艺成本高昂且耗时。这也导致了在工业规模生产上的困难，并需要进行多项质量控制措施，因为不同的下游加工步骤可能会降低VLPs的质量。需要更健壮和更好的分析方法来确保产品的质量和数量，以便促进它们在临床和制药领域的应用。在VLPs的上游和下游加工过程中，已经实施了不同的策略，如克隆筛选、高通量筛选、生物反应器工程、材料/基质筛选、过滤、流穿或尺寸排除色谱和抛光，以实现可扩展和成本效益高的工业制造。 6.3. 组装困难 将表位序列遗传融合到VLPs中有时可能具有挑战性，因为VLPs可能会失去自我组装属性或导致颗粒错误折叠。将抗原遗传融合到病毒的衣壳蛋白通常会阻碍抗原组装或VLP，使技术变得繁琐。因此，需要耗时的规划和优化，以单独测试每个单一抗原。 7. 病毒样颗粒生产的表达宿主系统 已经使用了不同的表达系统（ESs）来制造VLP疫苗，包括植物、哺乳动物、昆虫、酵母和细菌（图4）。 图4:不同表达系统在病毒样颗粒开发中的优缺点。 7.1 细菌 大多数细菌系统都集中在大肠杆菌（Escherichia coli）的工业菌株和表达载体上，这些已经得到了深入研究。细菌细胞培养作为VLP开发的平台进行了研究，具有成本和可扩展性方面的优势。使用细菌系统生产VLP的其他有利特点包括（a）易于操作，（b）高水平表达，（c）快速生长速率，（d）遗传稳定性，以及（e）表达的简单性。 Huo等人使用pCold表达载体在大肠杆菌菌株（BL21）中表达和纯化诺如病毒（NoV）VLPs，并展示了在大肠杆菌中组装的VLPs与在Sf9细胞中组装的VLPs具有相似的结合模式。类似地，在最近的一项研究中，表达全长CP的2型猪圆环病毒和猪小病毒的VP2蛋白在大肠杆菌中表达，它们自我组装成VLPs。研究表明，大肠杆菌中CP和VP2的表达可以用于大规模开发VLP疫苗。Yazdani等人研究了利用葡萄扇叶病毒（GFLV）的VLPs作为呈现HPV L2表位的潜在载体的可能性。抗原因子决定簇序列被遗传地结合到GFLV衣壳蛋白的“αB-αB”域C中，然后在大肠杆菌和毕赤酵母中过度表达。在大肠杆菌中观察到最高的表达产量。对于戊型肝炎病毒（HEV），ORF2蛋白区域368-606 aa从大肠杆菌不溶性分数中纯化体外组装成VLPs。这种HEV VLP在临床试验中对症状性HEV有100%的效果，并已在中国作为疫苗批准商业使用。在另一项研究中，从重组IHHNV的CP重建的传染性皮下和血胞坏死病毒（IHHNV）VLPs在大肠杆菌中显示出出色的物理稳定性。 由于几个因素，细菌系统并不总是VLP开发的最佳策略，包括（a）免疫原性差，（b）无法发展具有类似哺乳动物的翻译后修饰（PTMs）的重组蛋白，（c）蛋白质溶解度问题，（d）无法形成正确的二硫键，以及（e）在重组蛋白的制备中存在细菌内毒素/或脂多糖。 Brito和Singh强调了各种类型疫苗的可接受内毒素水平。有各种方法可以在纯化步骤中去除内毒素，如固定化琼脂糖、表面活性剂、活性炭、超滤和阴离子交换色谱。然而，使用这些技术通常会导致产量显著降低、成本增加或目标蛋白的生物活性缺乏。因此，开发了ClearColiTM，这是一种基因工程大肠杆菌菌株，具有基因修饰的LPS，不会在人类中引起内毒素反应。 7.2 酵母 真核表达系统是原核系统的有力替代品，特别是当涉及到解决疫苗生产中细菌内毒素问题时。通过在酵母细胞中重组表达蛋白，可以更具成本效益地生产VLPs。酵母中的基因操作相对简单，转化细胞可以生长到极高的密度，直到诱导重组蛋白的表达。这允许商业规模的发酵罐大规模生产VLPs。一些哺乳动物病毒的结构基因在酵母中表达可以形成VLPs。 美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了一些基于酵母衍生的VLP疫苗，包括针对人类乳头瘤病毒（HPV）的Gardasil®和Gardasil9®，以及针对恶性疟原虫（P. falciparum）的MosquirixTM。一些研究已经使用酵母作为表达系统（ES）来研究VLP的生产。Wetzel等人建立了一个健壮且成本效益高的酵母模型，用于生产嵌合VLPs。选择了鸭乙型肝炎病毒膜整合小表面蛋白（dS）作为VLP的支架，以及安全且工业上应用的Hansenula polymorpha酵母作为异源表达宿主。从感染动物的四种病毒中获得了8种不同的高分子量抗原，并将它们与蛋白dS遗传链接，然后鉴定并纯化了重组分离物。在所有情况下，融合蛋白都高度表达，并且与蛋白dS共产后，可以生成包含两种蛋白的嵌合VLP。基于酵母的生产系统允许生产成本低廉的产品，且不仅限于小规模基础研究。在另一项研究中，Alireza等人通过将HPV-16 L2的交叉中和表位插入到HPV-16 L1基因中，首次在P. Pastoris系统中生产了嵌合蛋白L1/L2 VLPs。随后，将HPV-16的嵌合L1/L2引入质粒（pPICZA）并在P. pastoris中表达。L1-HPV-16 Ab和L2-HPV-16 Ab检测的ELISA结果表明，与商业测试套件的灵敏度相当的阳性反应。同样，在P. pastoris ES中，Gupta等人生产了一种针对HEV的重组VLP，包括蛋白ORF2的112-608 aa区域。结果表明，对于112-608 aa VLP的开发，P. pastoris ES似乎是比杆状病毒（Bv）ES更优越且更安全的选择。在病毒感染期间，像脊髓灰质炎病毒这样的肠道病毒会产生与成熟病毒粒子在抗原上无法区分的空衣壳。通过异源系统（如酵母）的帮助，这种衣壳的重组合成作为VLP疫苗候选物具有巨大的潜力。Sherry等人通过共表达病毒蛋白酶3CD和结构前体蛋白P1，在P. pastoris中展示了VLP的生产。构建酵母ES比细菌ES更具挑战性，特别是Pichia和Hansenula菌株。此外，VLP产量低于大肠杆菌。酵母ES的另一个缺点是它在蛋白质翻译后修饰（PTMs），特别是糖基化方面与哺乳动物ES的相似性不足。它们的糖型主要是高甘露糖型，这对大多数制药糖蛋白（GPs）来说是不受欢迎的。 7.3. 昆虫细胞 基于杆状病毒的昆虫细胞系蛋白表达已成为开发复杂基于蛋白质的生物制剂的有效工具，用途多样，从多蛋白复合体到用于治疗用途的蛋白质开发，如VLPs。Bv在能够容纳大量异源DNA并将其忠实地传递到目标宿主细胞的能力方面，与其他广泛使用的病毒载体不同寻常。Gopal和Schneemann详细描述了生产重组杆状病毒（rBVs）、筛选昆虫细胞系中VLP表达以及纯化VLPs的程序。 Bv-昆虫细胞系统是一个两步程序，首先将昆虫细胞培养到所需的细胞浓度，然后感染rBVs以表达蛋白质。使用Bv表达载体系统（EVSs）的重组蛋白和VLP生产是快速、多功能的，并提供大量的产量。该系统可以产生异常高的蛋白质产量，结合复杂的真核蛋白质PTMs，这对于某些VLPs的正确自组装和释放可能至关重要。 MultiBac是一个创新的Bv EVS，它由一个已经被设计用于特定目的的病毒基因组组成。最近，一组科学家描述了基于MultiBac的VLP工厂的开发，该工厂依赖于流感病毒的CP（M1）及其在生成具有流感病毒血凝素（HA）功能修饰的流感衍生VLPs中的利用，这些修饰预计将调节VLP衍生的免疫反应。 昆虫细胞-Bv EVSs已被证明与流感病毒疫苗生产的常规鸡蛋和基于细胞的方法一样有效，具有高产量和短生产时间的额外特点。此外，rBVs构建变得更快、更容易、更灵活，允许在相同的表达载体中融合不同类型和/或亚型的流感病毒基因。Sequeira等人成功创建了一个强大的High Five基于昆虫的细胞平台，该平台结合了稳定的表达和Bv介导的表达，以产生多价流感VLPs。通过用两种不同的H3亚型HA蛋白（称为HA2和HA1）感染High-Five细胞系，并用表达M1和三种额外的H3亚型HA蛋白（称为HA5、HA4和HA3）的Bv，这种方法的模块化能力得到了证明，以产生五价VLPs（H3）。 扎伊尔埃博拉病毒血清型（ZEBOV）是所有血清型中最有毒的，并且具有最高的死亡率。通过共表达3种病毒结构蛋白，核衣壳蛋白（NP）、基质结构蛋白（VP40）和糖蛋白（GP），已经在昆虫和哺乳动物细胞系中实现了ZEBOV-VLPs的开发。Pastor等人报告了一种在昆虫细胞系中生成ZEBOV-VLPs的技术，基本上包括使用高感染度（MOI）的bac-GP和bac-VP40，并限制NP表达，要么通过防止感染，要么通过降低bac-NP MOI，是开发VLP的最适当方法。 昆虫细胞ES的主要限制是（a）被包膜杆状病毒污染的蛋白质，（b）难以扩大规模，以及（c）比哺乳动物细胞更简单的N-糖基化。 7.4. 哺乳动物细胞 二十多年来，各种哺乳动物细胞系，如小鼠骨髓瘤（Sp2/0、NS0）、中国仓鼠卵巢（CHO）、小鼠C127、婴儿仓鼠肾（BHK21）、HT-1080和HEK293，由于它们能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白质，已被建立为商业化蛋白质治疗剂的可能来源，用于医疗目的。基于哺乳动物细胞培养的系统提供了许多好处，包括在开发过程中的一致性和灵活性。它还有助于糖蛋白以与病毒宿主相似的脂质膜组成被恢复。据报道，将病毒基因稳定转染到哺乳动物细胞系中，包括293或Vero细胞，可以产生VLP。 多项研究报告了从哺乳动物细胞培养中高效生产VLPs。Hsin等人利用Huh7细胞作为表达系统，开发了一种MERS VLP系统，用于了解病毒感染和形态形成。在另一项研究中，通过瞬时转染在Vero、293 T或CHO-K1细胞系中表达了编码神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA）和基质M1蛋白的流感VLPs。在BALB/c小鼠的临床前研究显示，当肌肉注射给药时，流感VLPs在低剂量下具有显著的免疫原性，诱导针对NA和HA的功能抗体。Wu等人设计了一种可扩展的方法，用于有效生产在哺乳动物细胞系中表达的各种亚型的流感VLPs。该研究表明，这些哺乳动物流感VLPs在粒径、结构、宿主因子组成和病毒抗原糖基化方面与原始病毒非常相似。同样，在另一项工作中，开发并利用了一种可诱导的人类胚胎肾HEK-293细胞系，表达NA和HA，以在用编码HIV-1 Gag的质粒进行瞬时转染后生成VLPs。为在哺乳动物细胞悬浮培养中通过瞬时基因表达合成HIV-1 Gag VLPs制定的协议表明，细胞培养上清中存在的大部分Gag-GFP完全组装成与HIV-1未成熟颗粒一致的预测形态和大小的VLPs。 基于哺乳动物细胞的表达系统需要大规模生产设施，如发酵生物反应器，这些设施建造成本过高。因此，生产成本高昂是细胞基础的哺乳动物ES的一个具有挑战性的部分。其他限制包括长时间的表达时间、产量低以及易受哺乳动物病原体感染的脆弱性。 7.5. 植物 “分子农业”是用来描述利用植物或植物细胞生产重组蛋白或其他生物药物的术语，这些药物用于作为化妆品、生物制药、治疗剂、疫苗和其他试剂。植物为VLP疫苗的生产提供了一个诱人的替代系统，因为它们有潜力以最小的成本生成大量的重组蛋白，它们具有正确的PTM和蛋白质折叠组装的真核生产机械，并且它们引入意外人类病原体的风险低。植物不需要安装昂贵的发酵设施来生产生物质，也不需要建立重复的设施来扩大生产规模。与微生物发酵不同，植物有能力进行N-糖基化作为糖蛋白PTM。在植物细胞中表达的工程VLP形成人类或动物病毒衣壳蛋白包括人类诺如病毒CP、HPV L1蛋白、乙型肝炎核心和表面抗原、HIV Gag多蛋白和流感病毒的HA蛋白。 多项研究已经广泛讨论了在各种植物ESs中构建VLPs的概念、在植物宿主中有效生长VLPs以及在植物中自组装多种病毒结构蛋白。Santi等人利用TMV衍生的瞬时ES，在烟草植物叶片中生产了正确组装的重组诺如病毒VLPs。Young等人生成了可追踪的基于血凝素的VLPs，使他们能够在植物中检查颗粒组装和VLPs在哺乳动物免疫系统内的相互作用。van Zyl等人通过农杆菌介导的瞬时表达，研究了在烟草植物中生产蓝舌病病毒VLPs，这是一个低成本系统。同样，Veerapen等人在烟草植物中瞬时表达了口蹄疫病毒的VLPs。Diamos和Mason使用改良的双生病毒载体在基于植物的系统中生产了诺如病毒VLPs。最近，Roales-Mendoza等人提出了一种针对SARS-CoV-2的基于植物的VLP疫苗开发的视角，SARS-CoV-2是导致COVID-19大流行的罪魁祸首。 用于VLP平台生产的植物并不完全可接受，因为与哺乳动物ESs相比，VLP的生产水平相对较低，以及植物特有的N-糖基化糖蛋白。然而，最近创造的新型植物ESs，以及植物糖工程的进步，都已经解决了这些挑战。植物糖工程的最新进展允许人类样的糖修饰，并优化所需的糖结构，以提高重组药物糖蛋白的功能和安全性。 8. 针对新发传染病的病毒样颗粒疫苗的开发 近年来，已经生产并使用了多种VLP疫苗来对抗不同的病毒和寄生虫感染（表1）。下面讨论了针对寨卡病毒、基孔肯雅病毒、流感病毒和人类乳头瘤病毒的VLP疫苗的开发。 表1: 针对不同病毒和寄生虫的VLP疫苗 8.1. 寨卡病毒 寨卡病毒（ZIKV）是一种小包膜蚊媒神经性正链RNA病毒，属于黄病毒科。ZIKV感染与急性产前异常有关，例如感染母亲所生的新生儿小头症，以及成人中的格林-巴利综合征（GBS）。目前，没有治愈方法或商业疫苗可用于有效治疗，因此开发针对ZIKV的疫苗非常重要。 ZIKV具有一个RNA基因组，只有一个开放阅读框，并形成一个单一的多蛋白。这种蛋白链被细胞和病毒蛋白酶切割成7种非结构蛋白（NS5、NS4B、NS4A、NS3、NS2B、NS2A和NS1）和3种结构蛋白（C、prM和E）。E蛋白参与病毒粒子的结合及其融合。E蛋白具有三个域结构，像包膜域-I也称为ED-I，然后是ED-II和ED-III。体液反应主要针对属于ED-II的融合环。针对融合环表位的抗体增强了通过Fcγ受体摄取DENV。因此，这种蛋白可能是疫苗开发的一个可能靶点。 已经开发了许多针对ZIKV的VLPs。Garg等人比较了小鼠中不同的ZIKV VLPs疫苗，并表明CprME-VLPs（衣壳前膜-包膜）比prME-VLPs（前膜-包膜）效果更好。由于需要共表达蛋白酶NS2B-3，无法使用CprME-生成细胞系。为了克服这个障碍，生成了一个双顺反子载体，利用IRES序列产生NS2B-3和CprME-VLPs。Alvim等人展示了HEK293细胞持续表达ZIKV-VLPs。简而言之，稳定产生寨卡VLPs的细胞系是开发疫苗的理想选择。 8.2. 基孔肯雅病毒 这是一种由携带蚊虫传播的CHIKV（基孔肯雅病毒）引起的严重和周期性传染病。症状包括高烧、皮疹等。目前没有可用的疫苗，但有许多VLP疫苗候选物处于不同的开发阶段。通过选择性表达CHIKV包膜和衣壳蛋白产生的自组装VLPs可以提供对这种病毒的多种菌株的保护。 Arévalo等人报告说，当使用无佐剂CHIKV VLPs时，成年小鼠对CHIKV感染实现了100%的保护。同样，Metz等人比较了在昆虫中由重组杆状病毒产生的三种不同疫苗，它们分别产生sE1、sE2 CHIKV和CHIKV（VLPs）。与VLP免疫的小鼠相比，E1和E2免疫的小鼠有一半存活，显示出不完全的保护。Akahata和Nabel发现，可变CHIKV结构蛋白表达产生的VLPs，模仿具有复制能力的α病毒。这种疫苗引起针对这种病毒的多种菌株的大量中和抗体的诱导，并提供完全保护。 与CHIKV-OPY-1菌株的VLPs相比，CHIKV 37997菌株的VLPs更容易产生，尽管它们具有高度的氨基酸序列相似性。了解CHIKV VLP生产的机制将有助于其他疫苗的开发，也扩大了它们对其他病原体的应用范围。此外，VLP生产受到E2的第234个氨基酸在酸敏感区域的影响。酸敏感区域的突变和pH变化也提高了VLPs的产量。 8.3. 流感病毒 流感病毒（Iv）感染是导致人类慢性呼吸道症状的主要原因，导致严重的公共卫生结果，包括流行性和季节性感染，甚至导致不可预测的大流行爆发。Iv是一种包膜的、分段的、负义RNA病毒，属于Orthomyxoviridae科。迄今为止，已经鉴定出四种类型的Iv，根据它们的核心蛋白存在情况分类：A、B、C和D。三种Iv类型，A、B和C对人类细胞具有致病性并引起严重感染，其中A型和B型是最普遍流行的类型。流感病毒的主要表面糖蛋白是神经氨酸酶（NA）和血凝素（HA）。 HA是参与感染的关键抗原，它附着在细胞膜表面的唾液酸残基上，促进Iv进入宿主细胞。与HA相比，NA在病毒表面上出现的频率较低，通常观察到的NA：HA比例为1：4。它的酶功能在切割唾液酸中至关重要，从而促进病毒从感染的宿主细胞表面释放。NA激活还使流感病毒能够通过涉及唾液酸切割的机制成功穿透粘液。 Kim等人研究了来自2009年H1N1流感病毒大流行的含NA（N1 VLP）的VLP的交叉保护效率和免疫原性，并将其与灭活分裂流感疫苗进行了比较。用N1 VLPs免疫的小鼠能够诱导病毒特异性抗体（Ab）反应以及交叉反应的NA抑制活性，而灭活分裂疫苗则诱导了株特异性的血凝抑制试验。用N1 VLPs免疫的小鼠导致对抗原多样化的Iv产生交叉保护免疫力，通过体重变化、肺病毒滴度、先天白细胞浸润、细胞因子和Ab分泌细胞、生发中心B细胞的测量。此外，在未处理的小鼠中，N1 VLPs的免疫血清提供了交叉保护。N1 VLPs诱导的免疫力在缺乏Fc受体γ链的小鼠中既没有受损也没有减少。这些发现表明，代表NA的VLPs，以及当前的流感疫苗，可能进一步改进并开发成为交叉保护疫苗的重要候选物。 最近，Kirsteina等人研究并检查了一系列广泛保护原型Iv疫苗的效力和免疫原性，重点关注流感三联矩阵蛋白2离子通道（3M2e）和并入噬菌体AP205 VLPs的三叉抗原。仅含3M2e抗原的VLPs在小鼠中刺激了对标准同源以及异源病毒挑战的保护。将流感病毒的两种保守抗原结合到一个单独的VLP中，可在小鼠中实现对高剂量同源流感H1N1感染的完全保护。 8.4. 人类乳头瘤病毒 人类乳头瘤病毒（HPVs）是Papillomaviridae家族的成员，是微小的、圆形的、双链DNA病毒，导致宫颈癌，这是继乳腺癌之后世界上第二致命的女性疾病。目前，有两种基于VLP的疫苗可供商业使用，用于抑制由HPV引起的疣和治疗宫颈癌。这些包括GlaxoSmithKline（GSK）制药公司的Cervarix和Merck制药公司的Gardasil。两种疫苗均由HPV 16和18的免疫原性主要衣壳蛋白（L1）VLPs组成，Gardasil还含有6和11 VLPs。 使用L1蛋白作为VLP疫苗的抗原的缺点是它在不同的HPV血清型中并不保守。相反，次要衣壳蛋白（L2）在所有HPV血清型中高度保守，长期以来一直被认为是开发具有广泛保护的HPV疫苗的主要潜在靶点抗原。与衣壳蛋白（L1）相比，衣壳蛋白（L2）不能用于VLP生产，因此免疫原性较低。L2蛋白免疫原性低的原因是由于其相对于L1的轻微表达，以及L2主要埋藏在衣壳表面下，在那里它在体外与细胞表面接触，或在体内与基底膜接触并诱导构象转变。 已经应用了几种方法来提高和增强L2肽的低免疫原性，例如由多种HPV类型的L2表位组成的串联融合肽，结合免疫激活的TLR激动剂，或在颗粒免疫刺激平台（如TMV、MS2或PP7噬菌体、腺相关病毒、干酪乳杆菌或细菌硫氧还蛋白的VLP）上重复表面阵列的L2表位。 另一种提高L2低免疫原性的有前景的策略是通过由HPV L1-L2嵌合蛋白组装的VLPs在表面展示L2表位。通过将高度保守的B细胞表位RG1的HPV16 L2遗传插入到HPV16 L1蛋白的表面环（DE）中实现，导致其在VLP表面上多价（360倍）免疫原性展示，而HPV16 L1框架的构象中和抗原决定因素大多保留。用这种嵌合RG1-VLP免疫引起了高型特异性HPV16滴度和广泛的异源粘膜和远亲皮HPVs的交叉中和。 Pouyanfard等人描述了基于单一肽的热稳定硫氧还蛋白疫苗开发，能够携带多达11种不同类型HPV的L2多肽。L2多肽的抗原在免疫应答的稳健性和保护方面表现出色。为了进一步提高和增强免疫原性，将硫氧还蛋白的多肽抗原L2与七聚体化域融合。在疫苗的最终设计中，实现了对所有14种致癌型HPV，以及较低风险的HPV类型（6和11），以及一系列皮肤HPV的保护反应。 9. 病毒样颗粒对抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2 去年，全球有超过200万人的死亡和2亿多人受到影响，200多个国家受到严重影响，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已成为全球性的麻烦。由SARS-CoV-2引起的COVID-2全球大流行影响了数十亿人，并成为2009年H1N1大流行之后的第一个重大全球灾难。目前，一些商业上可用的抗病毒药物，包括Remdesivir®（吉利德科学公司）、Paxlovid®（辉瑞公司）、Molnupiravir®（默克公司）已获得FDA和WHO的批准，用于治疗感染SARS-CoV-2的患者。由于针对病毒的目标药物疗法在开发、成本和分发方面的限制，研究人员正将重点和努力放在开发疫苗上，以长期对抗COVID-19。针对SARS-CoV-2的VLPs可以帮助抗击广泛流行的大流行。VLPs可以作为治疗剂和针对这种病毒疾病的可行疫苗，此外还可以作为可行的诊断工具。SARS-CoV-2有一个缓慢的作用机制，因为病毒进入宿主后，一个人需要5到15天才会出现症状，因为病毒通过内体途径进入宿主细胞，并不擅长逃避免疫系统，而针对其他冠状病毒（CoVs）株的疫苗，这些株引起SARS和中东呼吸综合征（MERS），已被证明在动物模型中对SARS-CoV-2有效和活跃。像其他CoVs一样，SARS-CoV-2由四种在不同病毒血清型中结构保守的蛋白质组成：刺突（S）、核蛋白（N）、包膜（E）和膜（M）蛋白。上述蛋白质及其相关交互模式对VLPs的生产和组装至关重要。M、N和E对SARS-CoV-2的VLPs生产至关重要（图5）。S蛋白就是这样一种在不同冠状病毒株中常见的蛋白质，可能作为潜在的疫苗开发目标。通过在昆虫宿主细胞ES中展示S蛋白，已经生产了针对MERS-CoV的VLPs。 图5:提议的SARS-CoV2病毒样颗粒疫苗的生产系统和作用机制。编码SARS-CoV2的结构蛋白（S、N、M和E）的质粒可以转染到适当的哺乳动物细胞系中。然后收集、纯化组装的VLPs，并将其施用于人类。VLPs的施用刺激了先天和适应性免疫反应。如果原始的SARS-CoV2将来进入人体，记忆B细胞激活并释放针对它的抗体。同样，激活的CD8+ T细胞识别并杀死病毒感染的细胞。 在开发基于SARS-CoV-2 VLP的疫苗之前，必须首先考虑以前针对先前和密切相关的菌株的VLPs的工作。以前已经证明VLPs在通过rBV ES生产时，通过在小鼠中引起特定的体液和细胞免疫防御来有效对抗SARS-CoV。Ho等人报道了SARS-CoV的VLPs的合成。这些VLPs是通过rBV的共感染在昆虫ES中组装的。通过使用蛋白质冠层形成制备的VLPs在CoV感染的禽类模型中显示出有效的疫苗接种，并导致显著的免疫反应。同样，含有SARS-CoV的4种结构病毒蛋白（S、N、E和M）的质粒被转移到Vero E6细胞中以生产VLPs。这些VLPs可以作为研究SARS-CoV与宿主细胞病理机制的有效工具。最近，一种表达SARS-CoV-2 VLPs的COVID-19 mRNA疫苗在小鼠模型中显示了诱导强大的抗病毒免疫反应。 目前，NVX-CoV2372是唯一商业上可用的针对SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗。这种疫苗是通过在rBV中展示SARS-CoV-2 S蛋白生产的，然后通过感染蛾细胞表达系统进行大规模生产。这种疫苗在不同国家的不同试验中显示出不同程度的有效性。目前，还有五个团队分别致力于针对COVID-19的基于VLP的疫苗，临床试验正在进行中，正在努力开发可行的基于VLP的疫苗。已经开发出生物计量VLPs，可以通过在RT-PCR过程中作为阳性对照来帮助准确诊断SARS-CoV-2。Ghorbani等人使用免疫信息学分析评估了各种SARS-CoV-2刺突衍生表位的免疫原性质，这些表位已被报道可诱导特定的免疫反应。最后，建议一组筛选出的表位，这些表位可以在不同植物物种中使用分子农业方法合成针对SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗。 不同的哺乳动物ESs被用于合成SARS-CoV-2 VLPs。结果表明，来自Vero E6细胞系的SARS-CoV-2 VLPs比来自HEK-293T细胞的更耐用、更集成。最近，有报道称一种基于植物ESs的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。针对SARS-CoV-2的VLP疫苗（CoVLP）的临床I期试验结果表明，该疫苗在个体中显著发展了IL-4和IFN-γ免疫反应。CoVLP疫苗是通过在植物ESs（N. benthamiana）中短暂表达SARS-CoV-2的S蛋白生产的。三聚体S GPs展示在自组装VLPs的表面，模仿SARS-CoV-2的大小和形状。同样，针对SARS-CoV-2的组合小刺突VLP疫苗在小鼠中也显示出高水平的免疫，在单剂量后。疫苗引发了中和Abs的发展，并保护K18-hACE2小鼠免受COVID-19的侵害，类似于患有COVID-19的患者。 以衣壳VLP为中心的SARS-CoV-2疫苗（ABNCoV2）在小鼠模型中显示出有效的SARS-CoV-2中和。ABNCoV2疫苗是通过在昆虫（Drosophila）细胞中展示SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合域生产的。研究人员还在致力于开发一种可以通过鼻腔输送到目标组织的基于DNA的疫苗，这将在个体中产生SARS-CoV-2 VLPs，从而在个体中产生强烈的免疫反应。 10. 蛋白质纳米颗粒在疫苗开发中的应用 蛋白质纳米颗粒（NPs）有助于开发针对免疫逃逸病原体的疫苗，如HIV、流感、疟疾，并通过单独作用或作为靶向药物传递的载体，帮助对抗新兴的毒株。利用NPs辅助的蛋白质分子工程进行抗原表达，用于疫苗开发以产生免疫反应，是治疗和药物开发中日益受欢迎和迅速发展的领域。基于蛋白质的病毒样颗粒（VLPs）作为天然NPs，因设计简便、自组装和高稳定性而在疫苗开发中得到广泛应用。有三种不同的方法用于将抗原附加到NPs上进行展示，（1）标签偶联，（2）化学偶联，以及（3）遗传融合。这些技术使平台能够装饰各种抗原，导致尺寸增加和展示效果增强。 大多数抗原通常不会自行组装成NPs，如在流感亚单位疫苗中使用的那些。在这种情况下，可以通过将这些抗原附加到多聚蛋白平台上来实现自组装。有许多天然存在的多聚蛋白，如蝶呤合酶（LS）、铁蛋白、二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2p）、非结构蛋白10（nsp10）、包裹素和热休克蛋白（HSPs），这些已被开发用于设计靶向治疗的平台。使用NPs展示病毒糖蛋白在开发针对特定抗原的抗体方面是有效的。展示抗原的蛋白质NPs在产生针对特定抗原的免疫反应方面非常有效，可以单独使用或与疫苗结合使用。 在可用于展示抗原的广泛平台中，铁蛋白已成为一个主要的蛋白质复合物，可以与NPs结合用于疫苗开发。由于其高pH和热稳定性，它允许与表面分子容易结合。近年来，铁蛋白在临床前研究中作为针对多种病毒传染病的可行疫苗平台进行了研究，包括HIV、H1N1、HCV、HBV、HFMD、Epstein–Barr、轮状病毒和由冠状病毒引起的呼吸道疾病。 Kelly等人比较了体内展示流感HA的铁蛋白NPs与可溶性蛋白（HA）的免疫原性。与可溶性蛋白（HA）相比，HA-铁蛋白NPs显示出更高的免疫原性和对病毒挑战的更大保护作用。 最近，一种基于结构的自组装蛋白质NP免疫原的设计，针对SARS-CoV-2产生了保护性和强大的抗体反应，在小鼠的体内研究中展示了先天免疫的发展。同样，基于铁蛋白NPs的SARS-CoV-2疫苗在小鼠中诱导了有效的抗体反应，据报道这种反应至少在免疫后持续了7个月，有助于充分发展免疫。 尽管蛋白质NPs可以作为疫苗开发的可行候选物，但由于其有机性质，NPs的体内应用通常受到几个挑战的限制，包括细胞毒性、炎症反应和不足以递送到目标部位。“蛋白质冠层”形成这个术语被用来总结体内条件下蛋白质与NPs之间不利相互作用。附加到NPs表面的蛋白质影响其生物行为并改变其功能，有时导致功能增加或丧失。蛋白质冠层形成是一个复杂的过程，涉及两个相互作用实体之间的复杂动态和动力学。有些病例报告了在与NP表面相互作用后发生了结构变化，明显改变了NPs的原始功能。因此，为了克服这些挑战，了解蛋白质构象变化和展开过程对于加速NPs的生物医学应用至关重要。 11. 结论 在过去二十年中，一些病原体对商业化抗生素的耐药性急剧增加，主要是由于无监管的非处方销售、药物的滥用和过度使用以及遗传适应。药物开发是一个严格的任务，需要充足的时间、资金和重复试验，才能使一个可行的产品商业化，以帮助对抗众多新兴病原体。由于耗时的限制，特别是患者获得适当药物的机会受到阻碍，而病原体的耐药性却在持续增加。因此，预防措施对于解决传染病的紧急情况具有重要意义。在努力抗击这类疾病的过程中，VLPs在医疗行业中崭露头角，应用范围从疫苗开发、药物传递系统到分子诊断等多个领域。基于VLP的方法为疫苗开发提供了一种替代现有传统方法的选择。目前，一些针对危险病原体的基于VLP的疫苗已经商业化，如ZIKV、HCV、HBV和HPV。与此同时，正在努力生产和设计针对包括SARS-CoV-2在内的各种新兴毒株的有效VLP疫苗。然而，在基于VLP的治疗能够与传统药物疗法在成本和效果方面竞争之前，仍需要解决一些主要障碍。尽管如此，基于VLP的医疗策略未来可能会与药物制剂一起广泛使用，以帮助对抗众多传染病。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。