caspase 8

撰文丨王聪编辑丨王多鱼排版丨水成文成熟的红细胞（RBC）是哺乳动物（包括人类）体内数量最多的细胞，它们充当着氧气运输者和免疫哨兵的角色。因此，红细胞受损对健康构成巨大威胁，包括贫血、炎症、肾功能障碍、肝功能损害、弥散性血管内凝血、休克，甚至死亡。因此，研究人员花费了数十年的时间来阐明溶血的机制。经典理论认为，补体系统在红细胞表面打孔是溶血的主因，靶向红细胞抗原的血型抗体能够激活补体级联反应，从而导致溶血，一旦被激活，丝氨酸蛋白酶级联反应就会在最终通路中汇聚，产生裂解产物，如 C3a、C5a 和 C3b/iC3b，并组织膜攻击复合物（MAC）。近年来，靶向补体系统（尤其是 C3 或 C5）的治疗策略已被开发出来。然而，这些补体抑制剂在临床上的效果参差不齐，这提示我们，除了膜攻击复合物（MAC）的膜攻击作用之外，可能还存在着其他溶血机制。2025 年 4 月 18 日，空军军医大学附属西京医院胡兴斌副教授团队联合华东理工大学刘琴教授团队，在国际顶尖学术期刊 Cell 上发表了题为：Red blood cells undergo lytic programmed cell death involving NLRP3 的研究论文。该研究首次揭示了红细胞中存在一种全新的程序性细胞死亡方式，并将其命名为——spectosis（血影蛋白依赖性死亡），这一发现不仅颠覆了传统认知，更为溶血相关疾病及炎症相关疾病治疗打开了新思路，还可拓展至畜禽、水产养殖业感染性病害防控领域。显微镜下的红细胞的死亡程序经典的补体介导的成熟红细胞溶解，会导致严重的病理变化。然而，针对补体的抑制策略并不总是如预期般有效，这表明尚有未知机制有待阐明。在这项最新研究中，研究团队探究了补体激活后成熟红细胞内的细胞内事件。研究团队通过高精度显微镜观察发现，补体激活后的红细胞并非瞬间破裂，而是经历了圆盘状→棘状→球形→碎片化的渐进过程。这种有序的形态变化提示了红细胞内部存在主动调控的细胞死亡程序。研究团队进一步发现，补体诱导的溶血是一种 caspase-8 依赖的的红细胞程序性死亡。此外，研究团队还在红细胞中还发现了一种截短 NLRP3 蛋白（miniNLRP3），其参与了 NLRP3-ASC-caspase-8 复合物的组装。活化的 caspase-8 直接诱导血影蛋白β亚基（β-spectrin）的蛋白水解，从而破坏红细胞膜的骨架网络，进而导致红细胞解体，引发溶血，研究团队将这种新型细胞程序性死亡方式命名为——spectosis（血影蛋白依赖性死亡）。具体来说，当补体攻击时，miniNLRP3 与 ASC 蛋白组装成信号复合体，招募并激活 caspase-8 酶，caspase-8 精准切割细胞骨架蛋白 β-spectrin，骨架网络崩塌导致红细胞破裂，引发溶血。基因编辑验证：锁定“死亡密码”为确认对 β-spectrin 切割是溶血的关键，研究团队使用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）对造血干细胞进行基因编辑，使 β-spectrin 的切割位点发生突变。结果显示：突变的红细胞在补体攻击下溶血减少 50%；红细胞骨架保持完整，形态异常得到显著改善。这些实验结果不仅证实了 spectosis 的机制，更为溶血相关疾病以及炎症相关疾病的治疗提供了潜在靶点。临床应用曙光：双管齐下的治疗新策略接下来，研究团队在两类溶血疾病——自身免疫性溶血性贫血（AIHA）和阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）中发现：红细胞内 NLRP3 复合体异常激活；caspase-8活性升高；β-spectrin 断裂。进一步动物实验显示，联合使用 NLRP3 抑制剂（MCC950）和补体抑制剂，能够显著提高抑制溶血效果。这提示未来可能发展“补体阻断+细胞死亡抑制”的联合疗法以应对溶血相关疾病。颠覆认知的科学启示1、无核细胞（成熟红细胞没有细胞核）也有精密的死亡程序：推翻了“成熟红细胞无法程序性死亡”的传统观点；2、细胞骨架是死亡执行者：发现 β-spectrin 不仅是结构蛋白，更是死亡信号枢纽；3、提出治疗新策略：溶血相关疾病的传统疗法专注于补体抑制，这项新发现提供了细胞内干预新靶点。据悉，研究团队已着手建立以红细胞 spectosis 为核心的药物筛选平台，首批筛选的药物分子在养殖鱼类感染性肠炎的口服治疗中表现出良好效果。这项研究犹如打开红细胞死亡的“黑匣子”，让我们重新审视红细胞这种看似简单的细胞中隐藏的生命智慧。将来，“补体阻断+细胞死亡抑制”或成为对抗溶血相关疾病的新武器。空军军医大学附属西京医院胡兴斌副教授、华东理工大学刘琴教授及华东理工大学陈守文副研究员为共同通讯作者；西京医院陈要臻副研究员、华东理工大学陈守文副研究员、西京医院刘志新副主任技师、王雅芬医师为共同第一作者。论文链接：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00389-7设置星标，不错过精彩推文开放转载欢迎转发到朋友圈和微信群 微信加群 为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。点在看，传递你的品味

OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。肿瘤芯片(ToC)是研究肿瘤生理学和评估抗癌药物疗效和毒性的有用平台。然而，生物医学界对ToC的获取还远未普及，同时，微流体装置的制造工艺依然很麻烦。3D打印可以大大简化设计和测试新微流体装置的周期。基于此，来自墨西哥蒙特雷理工学院的Mario Moisés Álvarez团队在《Biofabrication》期刊发表了题为“A 3D-printed tumor-on-chip: user-friendly platform for the culture of breast cancer spheroids and the evaluation of anti-cancer drugs”的文章。该研究专注于ToC应用，特别是同型(MCF7)和异型(MCF7/BJ)球体的培养，以及作为研究抗癌药物测试平台。该研究中，3D打印的芯片将为药物开发提供一个强大而可靠的平台。1.ToC系统介绍微流体装置采用光聚合半透明树脂打印而成，并改装了PMMA盖子，以实现可视化。芯片由三个主要隔室组成：一个中央室和两个侧通道。中央室用于容纳水凝胶。在本研究中，使用具有中等程度甲基丙烯酰改性的5% GelMA培养MCF7和MCF7/BJ球体。左、右隔室是流体通道，通过液体流提供细胞培养基。每个通道的侧面通过内置的六边形网格状网状结构向中央隔室开放。网格的设计旨在保留放置在中央室中的水凝胶，并允许液体从侧通道渗透。值得注意的是，可以通过改变每个入口的流速来调整中央室内的压力分布。图1. 3D打印芯片的设计、制造和组装2.打印树脂细胞相容性评估使用非常规材料进行细胞培养时，细胞相容性是一个明显的问题。为此，使用树脂打印了一个96孔板，并进行活/死和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定。在实验中，两种基质的接种密度一致。然而，培养24小时后，传统聚苯乙烯培养表面上的 MCF7细胞密度似乎更高。假设树脂上较低的初始细胞粘附性可能导致了这种细胞密度差异。重要的是，没有观察到在常规细胞培养板或3D打印板中MCF7细胞在细胞活力方面的性能有任何显著差异。培养24小时后，大量细胞仍然活着并成功附着在96孔板的PS和树脂表面上。此外，LDH结果显示，在两种表面生长的培养物上清液中观察到了统计学上相似的LDH活性。这些实验表明，打印树脂适用于MCF7细胞培养实验。在评估打印表面是否适用于细胞培养时，评估其对蛋白质或药物吸附的敏感性很重要。实验结果表明，在暴露于阿霉素溶液24小时后，阿霉素确实被吸收到3D打印树脂表面。然而，与PDMS相比，阿霉素在打印树脂表面的吸收率明显较低。图2. 打印树脂的细胞相容性3.在芯片上培养乳腺癌衍生的球体将直径范围为650±72 μm的同型(MCF7)和异型(MCF7/BJ)球体与100 μL 5% GelMA混合并放入装置的中央腔中进行交联。封装后，连续明场图像分析表明MCF7和MCF7/BJ球体的侵袭指数都以类似的方式随时间增加。然而，到第9天MCF7球体的侵袭指数高于MCF7/BJ球体。使用异型球体的芯片实验表明，成纤维细胞和癌细胞都表现出迁移行为。同时，该工作还研究了VEGF-A(癌组织的关键标志物）的存在情况。免疫染色结果显示，在第1天和第10天，两种球体中均存在VEGF-A，而且异型球体中的VEGF-A量高于同型球体。qPCR实验表明第1天两种培养物之间的VEGF-A表达水平没有统计学差异。第10天异型球体中VEGF-A的表达水平明显高于同型球体。通过进一步的实验结果表明，两种球体中VEGF-A基因表达均由于高缺氧水平而上调。图3. 在微流体系统中培养乳腺癌衍生的球体评价4.抗癌药物测试本研究将溶解氧加入培养基可延长芯片上异型球体培养的实验时间。为了进行药物测试，首先在连续培养基灌注下连续培养异型球体5天。然后，灌注阿霉素 (17.10 μM) 96小时。实验结果表明，在没有阿霉素的情况下，经过前5天的连续灌注后，球体正有效消耗葡萄糖，因此具有代谢活性。在第5天，治疗组开始使用阿霉素治疗，经阿霉素处理的芯片中测得的出口葡萄糖浓度几乎保持恒定，该浓度与培养基的浓度相似。这表明经阿霉素处理的癌症球体消耗的葡萄糖可以忽略不计。96小时后的LIVE/DEAD分析显示在用阿霉素处理的球体中观察到的红色区域比在未处理的球体中观察到的红色区域(死细胞)大得多。LDH活性实验表明，经阿霉素处理的芯片中LDH活性显著升高。这些结果也表明阿霉素治疗严重损害了癌性球体的活力和葡萄糖摄取。其次，研究者还通过测量裂解的caspase-3和-8水平来评估细胞死亡。免疫染色图像显示，用阿霉素处理的球体的caspase水平高于未处理的对照球体，而且经处理的球体中 caspase-8的水平高于caspase-3，这与之前的报告一致。图4. 抗癌药物芯片评估5.总结该研究设计了一种用于ToC应用的3D打印芯片。该芯片的目的是重现一个癌变环境，这种微流体装置的制造和设置非常简单，这大大增强了ToC的实用性。预计这种用户友好的微流体装置可用于广泛的实验应用，包括癌症研究和抗癌药物筛选。文章来源：光谱与液芯器械医工交叉团队END免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。戳“阅读原文”立即领取OTC2025免费参会名额!

关注并星标CPHI制药在线靶向机体亚单位治疗是当前癌症治疗的新型策略，也是现代分子药理学研究和发展的重点方向。线粒体是产生能量的场所和细胞的代谢中心，肿瘤细胞具有代谢异常的特征，这使得开发靶向线粒体的化合物成为新的抗肿瘤研究方向。线粒体与癌症的关系线粒体与癌症的关联体现在多个相互交织的生物学过程中。从凋亡调控到氧化还原稳态，从离子平衡到遗传物质变异，每个环节均存在促癌与抑癌的动态博弈。①线粒体调控细胞凋亡。细胞凋亡可由内源性线粒体途径（Bcl-2 途径）与外源性死亡受体途径两种途径引发。在线粒体在内源性凋亡途径中，Bcl-2 家族蛋白通过调控促凋亡信号，改变内质网与线粒体间的钙离子（Ca²⁺）动态平衡，促使动力相关蛋白 1（Drp1）介导线粒体分裂形成碎片化结构。这一过程导致细胞色素C释放至胞质，进而激活 Caspase-3 并引发凋亡级联反应。外源性凋亡途径则由细胞表面死亡受体（如TNFR 家族）启动，通过 Caspase-8 水解促凋亡蛋白，最终激活下游 Caspase-3和Caspase-7。②线粒体产生 ROS。作为活性氧（ROS）的主要来源，线粒体在肿瘤进展中呈现双重角色。肿瘤细胞内 ROS水平通常高于正常细胞，低浓度 ROS 通过激活Ras-ERK 、MAPK 及PI3K/AKT 等信号通路促进癌细胞增殖与侵袭。例如，肝癌细胞中ROS 通过 AKT 通路调控端粒酶活性，而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可阻断这一过程。然而，当ROS积累超过阈值时，会造成脂质过氧化、蛋白质失活及 DNA 损伤，最终触发细胞死亡。研究显示，丙氨酸内酯通过 ROS-MAPK 通路抑制 NF-κB 、AP-1 和STAT3 转录因子活性，从而抑制肿瘤生长；葫芦素 B则通过提升 ROS 水平破坏线粒体膜电位，诱导前列腺癌细胞凋亡。③线粒体内Ca2+的摄取。线粒体钙离子单向转运体（MCU）介导的 Ca²⁺摄取机制在癌症中同样呈现矛盾特性。肝癌等肿瘤中 MCU 的过度表达可通过增加线粒体内Ca²⁺浓度，激活ROS/Nrf2/Notch信号轴，促进上皮-间充质转化及转移进程。此外，Ca²⁺信号还可通过稳定 p53 蛋白调控细胞周期。但在病理条件下，MCU 介导的 Ca²⁺内流与硫化氢（H₂S）协同引发氧化应激暴发，抑制 ATP 合成和下调热休克蛋白表达，从而抑制癌症的发展。④线粒体DNA（mtDNA）。mtDNA因缺乏组蛋白保护及高效修复系统更易发生突变，其异常与肿瘤代谢重编程密切相关。 mtDNA突变可导致氧化磷酸化功能障碍，迫使癌细胞依赖糖酵解供能（即Warburg 效应），从而适应缺氧微环境。尽管膀胱癌、乳腺癌等肿瘤中常观察到 mtDNA拷贝数减少，但部分癌细胞通过上调核编码线粒体基因进行代偿。例如，肾癌细胞可通过增强线粒体基因表达抵消 mtDNA 损耗，维持呼吸链蛋白水平。靶向线粒体小分子化合物1、亲脂性阳离子小分子化合物亲脂性阳离子小分子可通过肿瘤细胞线粒体超极化膜电位（ψm）实现靶向蓄积。正常细胞线粒体膜电位（130~150 mV）与胞浆（-60 mV）形成约180 mV 跨膜电位差，而肿瘤细胞ψm更高，使带正电分子更易富集于其线粒体。三苯基膦（TPP）容易穿透带负电荷的细胞膜和线粒体膜，使其积累在线粒体的浓度可达其他部位的数百倍，成为纳米递药系统常用靶头。研究发现，罗丹明-23可用于活细胞的线粒体定位，并在较高浓度下通过抑制ATP 合酶破坏线粒体的生物能量功能，从而对线粒体产生毒性，其衍生物 MKT-077能优先在肿瘤细胞线粒体中积累，并诱导线粒体DNA选择性耗损，抑制肿瘤生长。但由于具有反复肾毒性的不良反应，其临床试验已在第一阶段被终止。地喹氯铵（DEQ）可选择性靶向线粒体，从而抑制线粒体 ATP 酶，阻止细胞中的能量产生，但随后发现它在多药耐药性肿瘤细胞系中表现出交叉耐药性，DEQ可通过外排泵被肿瘤细胞排出。尽管 TPP 、DEQ 等药效有限，但其高靶向性为递药系统设计提供了基础，通过偶联药物或结构优化可提升线粒体富集效率，增强抗肿瘤效果，但仍需解决毒性、耐药性等挑战。2、改变线粒体膜通透性的小分子化合物线粒体膜通透性改变是触发内源性细胞凋亡的关键机制，凋亡信号及多种因子通过激活线粒体膜通透性转换孔（MPTP）引发线粒体膜完整性破坏，导致基质肿胀、外膜破裂、膜电位（ψm）下降或丧失、氧化磷酸化解耦联及 ATP 合成减少，进而通过内容物释放诱导细胞凋亡或坏死，在肿瘤治疗中起到重要作用。①Bcl-2 蛋白家族类似物Bcl-2蛋白家族通过调控线粒体外膜通透性成为细胞凋亡的“主开关”，其成员包含促凋亡蛋白（如Bax、Bad）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL）。基于 Bcl-2同源结构域 BH3设计的靶向小分子化合物中，天然化合物棉酚作为首个 BH3 模拟物可抑制 Bcl-2 并破坏线粒体膜完整性，但因脱靶效应终止临床开发；后续研发的 ABT-737对 B细胞淋巴瘤和小细胞肺癌具有显著细胞毒性，但口服生物利用度不足，经结构优化得到的 ABT-263进入临床 III 期试验，其衍生物 ABT-199（venetoclax，9）凭借纳摩尔级亲和力成为首个FDA批准的BH3 模拟物，用于治疗特定慢性淋巴细胞白血病。此外，WEHI-539作为高选择性 Bcl-xL 抑制剂被发现，经研究优化获得高效口服抑制剂 A-1331852。②VDAC/ANT 抑制剂电压依赖性阴离子通道（VDAC）和腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）作为线粒体膜的关键整合蛋白，分别在线粒体外膜和内膜构成代谢物运输的重要通道。研究表明，VDAC/ANT 复合体功能紊乱可通过诱导线粒体通透性转变（MPT），进而触发肿瘤细胞凋亡级联反应。这一分子机制为开发新型抗肿瘤药物提供了重要理论依据。在靶向治疗策略开发方面，有研究基于砷化物的生物活性设计的三价砷-谷胱甘肽复合物 GSAO，通过特异性结合 ANT 蛋白的半胱氨酸残基产生共价交联，有效抑制线粒体功能并阻滞肿瘤细胞增殖。尽管该化合物在临床I期试验（NCT01147029）中因砷毒性问题终止研发，但其结构优化产物 PENAO展现出显著改进特性。研究证实，PENAO 通过调控多药耐药蛋白 MRP1/2 的转运动力学，使细胞内蓄积速率较母体化合物提升 85 倍，且具有更强的抗肿瘤效力。目前该衍生物已进入 I/IIa 期临床试验，正在评估其单药或联合雷帕霉素的治疗效果。此外，Bcl-2 蛋白家族与 VDAC/ANT 系统在线粒体膜通透性调控中具有协同作用。已进入临床研究的ABT-199 等靶向药物，通过验证其安全性和有效性，进一步证实了该策略的可行性。3、靶向己糖激酶 2(hexokinase 2，HK2)的小分子抑制剂HK是催化己糖转化成6磷酸己糖的一种酶，包含HK1、HK2、HK3、HK4 4个亚型，对其进行阻断可以抑制肿瘤细胞的生长。其中HK2 亚型因在恶性肿瘤中特异性高表达而备受关注，其可通过催化葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖（G6P），并通过与VDAC1 的竞争性结合干扰 Bax 介导的凋亡通路，使肿瘤细胞逃离凋亡。针对 HK2 的抑制策略主要聚焦于三个关键作用位点。①靶向葡萄糖结合位点基于竞争性抑制原理，2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）作为经典抑制剂可通过占据 HK2 葡萄糖结合位点实现抑制作用，10 mmol·L⁻¹浓度即可显著下调 HeLa 细胞 HK2 表达。目前该化合物已在转移性前列腺癌领域进入I/II 期临床评估（NCT00633087）。通过虚拟筛选发现的苄丝肼（Benserazide）及其结构优化产物BNBZ，经苯环引入和肼氮芳构化修饰后，其与结合袋的极性/非极性相互作用显著增强，抑制活性提升11倍，IC50从5.5 μmol·L⁻¹优化至 0.5 μmol·L⁻¹，展现出更优的成药潜力。②靶向G6P 结合位点G6P作为葡萄糖的HK2 催化产物，是HK2的天然抑制剂，有葡萄糖片段和磷酸片段2个与HK2结合的关键片段。G6P 能与葡萄糖结合竞争，破坏HK2的独特催化结构而发挥选择性抑制功能。③靶向HK2催化功能结合位点最新研究发现，3-溴丙酮酸（3-BP）可通过烷基化修饰 HK2 的Cys158 残基，破坏其与 VDAC1 的蛋白互作网络。实验证实，该化合物能有效恢复线粒体凋亡通路敏感性，在乳腺癌小鼠模型中可使肿瘤体积缩小62%。尽管目前尚处临床前研究阶段，但其独特的作用机制为开发新型多靶点抑制剂提供了重要启示。参考资料[1]黄佳藤,王甜甜,刘华,等.线粒体靶向小分子化合物在肿瘤研究中的应用[J].中国现代应用药学,2024,41(22):3245-3254.[2]邹鑫,黄璨,李佳良,等.靶向线粒体在癌症治疗中的作用研究进展[J].肿瘤药学,2024,14(02):166-172.作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。END2025金笔奖征文活动开启，来投稿吧！领取CPHI & PMEC China 2025展会门票智药研习社直播预告来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~