FABP6

深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769肠道健康在人类早期生命中扮演着至关重要的角色，它不仅涉及营养吸收和消化，还关联着免疫系统的成熟和微生物组的稳定。近年来，科学界越来越重视从受孕到儿童两岁期间，即所谓的“生命早期1000天”，对肠道健康基础的奠定以及后期疾病易感性的影响。在这一时期，肠道形态的发育在妊娠大约6-8周时开始，并在妊娠22周左右完成，而肠道功能的成熟则持续到出生后的头两年。肠道上皮细胞（IECs）表达的刷状缘酶，如乳糖酶（Lactase, LCT）和蔗糖异麦芽糖酶（Sucrase-isomaltase, SIS），在子宫内开始表达并随着时间的推移逐渐增加，这些酶的表达增加是肠道屏障成熟的一部分。此外，新生儿的肠道相对“渗漏”，允许大分子从母乳中被动运输穿过IECs，而新生儿IECs的高度发达的顶端管状系统（Apical Canalicular System, ACS）有助于这些大分子在不丢失生物活性的情况下穿过上皮屏障。然而，尽管对肠道发育的基本认识逐渐增强，对于人类肠道屏障成熟机制的深入理解仍然存在挑战。主要的挑战之一是缺乏来自晚期胎儿和新生儿阶段的人类组织样本，这主要是由于伦理限制和缺乏充分表征的体外模型。此外，已有的研究表明，人类胎儿器官类器官（Human Fetal Organoids, HFOs）在体外培养时，其基因表达和甲基化模式可能与体内情况有所不同，这表明目前的体外模型可能无法完全模拟体内肠道成熟的复杂过程。在这一背景下，Francesca P. Giugliano等人的研究提供了新的视角。他们利用基因表达分析和Ingenuity路径分析（IPA）等技术手段，探索了人胎儿小肠发育的里程碑，并鉴定了一组在不同发育阶段起主要调节作用的细胞因子。研究发现，以干扰素γ（Interferon gamma, IFNγ）为首的炎症性T细胞衍生的细胞因子，能够增强HFOs的刷状缘基因表达和酶活性，以及提高跨上皮电阻，从而促进人类胎儿肠道上皮屏障的成熟。此外，通过电子显微镜观察到，经过细胞因子刺激的HFOs发育出成熟的刷状缘并失去了胎儿细胞特征。该研究还发现T细胞是胎儿小肠固有层中IFNγ生产的主要来源，并且HFOs与T细胞的共培养模拟了细胞因子刺激的主要效应。这些发现强调了炎症性细胞因子在体内诱导功能性小肠成熟的关键作用，并在体外调节HFOs的屏障成熟。这项研究不仅填补了人类肠道发育研究的空白，而且为理解肠道屏障成熟提供了新的机制见解，这对于开发预防和治疗与早产相关的肠道疾病的新策略具有重要意义。尽管如此，该研究也存在一定的局限性，例如未能包括新生儿近端小肠组织的样本，以及除了T细胞外，未能考虑肠道粘膜中其他细胞类型对上皮屏障成熟可能的贡献或增强作用。未来的研究需要进一步探索这些因素如何共同作用于肠道屏障的成熟过程。在研究背景与问题的部分，Giugliano等人关注的是胎儿小肠成熟过程中的关键转折点，尤其是肠道上皮屏障的成熟。他们意识到，尽管肠道形态的发育在妊娠早期就已经完成，但肠道功能的成熟是一个持续的过程，它在出生后的头两年继续发展。研究者们提出了一个关键问题：是什么因素驱动了人类胎儿肠道上皮屏障的成熟？基于前期研究，研究团队猜想炎症性T细胞衍生的细胞因子可能在肠道成熟中起着至关重要的作用。因此，他们提出了一个假说：特定的细胞因子，尤其是干扰素γ（IFNγ），可能通过刺激胎儿器官类器官（HFOs）来增强肠道刷状缘基因的表达和酶活性，从而促进肠道上皮屏障的成熟。为了验证这一假说，研究者采用了一系列的实验方法。他们首先通过基因表达分析和Ingenuity路径分析（IPA）来识别在不同发育阶段变化的细胞因子。接着，他们利用HFOs作为模型系统，通过体外实验来模拟肠道成熟的过程，并测试了不同细胞因子对HFOs成熟的影响。此外，他们还通过共培养实验，将T细胞与HFOs一起培养，以模拟体内炎症性细胞因子对肠道成熟的影响。在结果分析与阐述部分，研究者发现，与对照组相比，经过细胞因子刺激的HFOs显示出了显著增加的刷状缘基因表达和酶活性，特别是IFNγ的影响最为显著。这一点通过图1中的基因表达分析得到了证实，其中展示了妊娠20周与13周相比，近端组织中OLFM4、IAP、LCT等成熟标记的显著上调。此外，通过电子显微镜观察，研究者发现经过细胞因子刺激的HFOs发育出了成熟的刷状缘，并失去了胎儿细胞特征（见图4）。进一步的2D单层实验表明，IFNγ和细胞因子混合刺激增强了上皮屏障的形成，提高了跨上皮电阻（TEER）值，并增加了刷状缘酶的活性（见图5）。共培养实验结果也支持了这一发现，T细胞与HFOs共培养显著增加了TEER值和刷状缘基因的表达，这些效应在IFNγ活性被抑制时部分丧失（见图6）。总结与结论部分，Giugliano等人的研究结果表明，炎症性T细胞衍生的细胞因子，尤其是IFNγ，在人类胎儿肠道上皮屏障的成熟中起着关键作用。这些发现不仅为理解肠道屏障成熟的机制提供了新的见解，而且为开发新的治疗策略提供了可能的靶点，特别是对于与早产相关的肠道疾病。最后，研究者提出了新的延伸问题，并为下一步的实验提出了方向。他们指出，尽管本研究揭示了炎症性细胞因子在肠道成熟中的重要作用，但仍需进一步研究其他细胞类型如何与T细胞相互作用，以及这些相互作用如何共同促进肠道屏障的成熟。此外，未来的研究还应该探索这些细胞因子在出生后肠道发育中的作用，以及它们如何影响后期健康的长期影响。图1. 基因表达分析揭示了涉及吸收、防御和干细胞功能的发育肠道成熟标记物集合。主成分分析（PCA）在全局基因表达谱上对人类胎儿近端（a）和胎儿及新生儿远端（b）小肠组织进行了处理，涵盖了13、16、18、20和35-36周的妊娠年龄。层级聚类分析显示了在20周与13周近端组织（c）和20周与13周远端组织（d）以及35-36周与13周远端组织（e）之间，前50个上调基因的表达情况。特别选择了最具生物学意义和上调幅度最大的特定基因进行高亮显示。每个组别有5个独立的捐赠者。颜色条代表每个样本标准化的基因表达值。图4. IFNγ和细胞因子混合刺激增加了HFOs中IAP活性和FABP6蛋白表达。在近端（a）和远端（b）HFOs中，通过细胞因子刺激后碱性磷酸酶活性水平（µg pNPP/min）。(c) 与对照组相比，经IFNγ和细胞因子混合刺激后嵌入HFOs中碱性磷酸酶（IAP）的染色。(d-e) 在远端HFOs中通过西方印迹法测量FABP6蛋白表达。图5. IFNγ和细胞因子混合刺激增强了2D肠上皮单层的上皮屏障形成、刷状缘酶活性和消失的上核空泡。(a) 与对照组相比，经IFNγ和细胞因子混合刺激后器官单层的TEER值。(b-d) 分别在IFNγ和细胞因子混合刺激后，与对照组相比，器官2D单层上测量的碱性磷酸酶（b）、乳糖酶（c）和蔗糖异麦芽糖酶活性水平（d）。(e) 经IFNγ和细胞因子混合刺激后，与对照组相比，嵌入跨孔板上的2D单层的碱性磷酸酶染色。(f) 透射电子显微镜（TEM）显示，在IFNγ和细胞因子混合刺激后，与对照组相比，失去了空泡（红色箭头）。图6. T细胞与3D/2D上皮细胞的共培养增加了刷状缘和吸收标记的表达以及上皮屏障形成。这一效应在IFNγ抑制时部分丧失。(a-l) 在近端（红色）和远端（蓝色）小肠HFOs中，通过3D/T细胞共培养后，OLFM4、LGR5、IAP、LCT、SIS和FABP6基因表达的RT-qPCR分析。每个组别有6个独立的捐赠者，数据以个体培养的配对值表示。(m-n) 在近端（m）和远端（n）小肠中，通过HFOs 3D/T细胞共培养后的碱性磷酸酶活性水平。(o) 经2D/T细胞共培养后的器官单层的TEER值。(p) 在添加IFNγ抗体抑制剂或小鼠IgG2B同型对照的每个跨孔条件下，经2D/T细胞共培养72小时后的器官单层的TEER值。Giugliano等人的研究在多个方面展现了其特色与创新之处：人类胎儿器官类器官（HFOs）的应用：研究者利用HFOs作为模型系统，这在模拟人类肠道成熟过程中是一个重要的创新。HFOs能够模拟肠道上皮的多种功能，提供了一个独特的平台来研究人类肠道发育，而不受伦理限制。多阶段基因表达分析：通过对比不同妊娠阶段的人类肠道组织样本，研究者能够识别与肠道成熟相关的基因表达变化，这种方法增加了研究的深度，并为理解肠道成熟过程中的分子机制提供了宝贵的数据。炎症性细胞因子的角色探索：该研究特别关注了炎症性T细胞衍生的细胞因子在肠道成熟中的作用，这是一个相对较少被探索的领域。通过体外实验模拟细胞因子对HFOs的影响，研究者能够揭示这些因子在肠道成熟中的潜在作用。共培养系统的建立：研究者通过将T细胞与HFOs共培养，模拟了体内环境，这为理解肠道上皮与免疫系统之间的相互作用提供了新的视角。功能验证实验：通过测量跨上皮电阻（TEER）和刷状缘酶活性等，研究者不仅在分子水平上，还在功能水平上验证了HFOs的成熟，这增强了研究结果的说服力。电子显微镜的应用：使用透射电子显微镜（TEM）观察HFOs的超微结构变化，为理解细胞因子如何影响肠道上皮屏障的形态提供了直观的证据。免疫调节的深入研究：研究揭示了低剂量的炎症性细胞因子，特别是IFNγ，对肠道上皮成熟具有积极作用，而不是像在某些病理条件下那样具有破坏性，这为炎症与肠道健康之间的关系提供了新的见解。治疗策略的潜在影响：研究结果不仅增进了对肠道发育的理解，还可能对开发新的治疗策略，特别是针对早产儿肠道疾病的预防和治疗具有重要意义。综上所述，Giugliano等人的研究在人类肠道发育的研究领域提供了新的见解，并可能对相关的临床实践产生深远影响。通过结合先进的分子生物学技术和创新的实验模型，这项研究为未来的研究开辟了新的道路。尽管Giugliano等人的研究在模拟人类肠道成熟和探索炎症性细胞因子的作用方面做出了重要贡献，但仍存在一些不足之处，这些限制可能影响研究结果的解释和未来应用的推广：样本来源的限制：研究中使用的人类胎儿组织样本来源于人工流产，这可能限制了样本的多样性和代表性。此外，缺乏新生儿近端小肠组织的样本可能影响了对成熟过程中区域差异的理解。体外模型的局限性：虽然HFOs是模拟肠道发育的有力工具，但它们可能无法完全复制体内复杂的生理环境和动态过程。体外模型通常无法捕捉到所有生物学复杂性，这可能限制了研究结果的外推性。细胞因子单一刺激的局限性：研究主要关注了IFNγ和其他几种炎症性细胞因子的作用，但肠道成熟是一个多因素过程，可能涉及更多未在研究中探讨的细胞因子和信号通路。短期刺激的影响：实验中的细胞因子刺激是短期的，而肠道成熟是一个长期过程。短期刺激可能无法完全模拟慢性炎症或持续暴露于细胞因子的体内情况。共培养系统的简化：尽管共培养系统提供了研究肠道上皮与免疫系统相互作用的机会，但当前的共培养模型可能过于简化，未能充分反映肠道内复杂的免疫微环境。功能验证的深度：虽然通过TEER和酶活性测量对功能成熟进行了一些验证，但可能需要更多的功能实验来全面评估HFOs的成熟状态。后续长期影响未知：研究未探讨细胞因子刺激对HFOs后续成熟阶段或长期功能的影响，这对于理解肠道成熟和疾病的长期发展至关重要。干预策略的具体化：研究提出了炎症性细胞因子在肠道成熟中的潜在作用，但具体的干预策略和治疗应用尚未明确，需要进一步的研究来探索和验证。伦理和法律的约束：研究中使用人类胎儿组织受到伦理和法律的严格约束，这限制了样本的获取和实验的设计。疾病模型的缺乏：研究未涉及炎症性肠病（IBD）或其他肠道疾病的模型，这些疾病状态下的肠道成熟过程可能与正常发育有显著不同。这些限制表明，尽管该研究在理解肠道成熟方面取得了进展，但仍需要更多的研究来克服这些挑战，以更全面地理解肠道发育的复杂性，并为临床应用提供坚实的基础。Giugliano等人的研究通过利用人类胎儿器官类器官（HFOs）模型，深入探讨了炎症性T细胞衍生的细胞因子在胎儿肠道上皮屏障成熟中的作用，特别是在IFNγ如何促进肠道刷状缘基因表达和酶活性方面的发现，为理解肠道发育的分子机制提供了新的视角。该研究不仅增进了我们对肠道成熟过程中细胞因子作用的认识，而且通过揭示肠道上皮与免疫系统之间的相互作用，为开发针对早产儿肠道疾病的预防和治疗策略提供了潜在的靶点。此外，该研究的方法论和发现还可能促进未来关于肠道疾病发病机制的进一步研究，以及为个性化医疗和精准治疗提供科学依据。尽管存在一些局限性，但该研究无疑为肠道健康和疾病管理领域提供了重要的科学贡献，并可能对改善人类健康产生长远的影响。END深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额！