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今天分享的文章是一篇2019年发表在Nature Chemistry上的文章Rapamycin-inspired macrocycles with new target specificity，通讯作者是约翰霍普金斯医学院的Jun O. Liu.，该课题组近年构建了FK506/雷帕霉素类似物库，试图发现基于FKBP的分子胶。 ——背景—— 雷帕霉素/FK506这些天然大环化合物，在体内先与FKBP（FK506-binding -protein）结合形成二元复合物，二元复合物会和第二个蛋白结合进一步形成三元复合物，最终发挥药物的功能。受此启发，作者试图构建一系列雷帕霉素/FK506类似物，希望找到新的FKBP-雷帕霉素类似物-靶蛋白的互作对。 方法：保留雷帕霉素与FKBP结合部分（FKBD），用四肽替换掉雷帕霉素中mTOR结合的部分，构建了4万余个类似物。 ——正文—— 天然产物往往以意想不到的机制发挥作用，这给药物设计提供了灵感。雷帕霉素/FK506就是这样的分子。它们进入细胞后，会首先和FKBP家族蛋白结合，尤其是FKBP12，形成二元复合物。FKBP12-雷帕霉素复合物会靶向mTOR，进一步形成三元复合物，导致mTOR激酶活性被抑制；FKBP12-FK506类似物会靶向calcineurin(一种磷酸酶)，抑制Ca2+依赖的信号传导及T细胞激活。结构上，FK506和雷帕霉素可简单地划为两个部分：1）FKBP结合片段2）效应片段（结合效应蛋白：calcineurin或mTOR）（Fig 1）。 Figure 1. 雷帕霉素与FK506结构，蓝色部分为FKBP结合片段，FKBD，红色部分为效应片段 二者FKBP结合片段非常类似，而效应片段有较大差别。通过替换效应片段构建雷帕霉素类似物，是否可以找到新的能够诱导三元复合物的大环？（Fig 2）这是本文的主要问题。注：就在本文发表的第二年（2020），就又发现了雷帕霉素类似物（WDB002，诱导FKBP12与CEP250蛋白形成复合物）。前人的工作已经合成了类似的化合物，这些多肽衍生物保留了与FKBP的结合，但没有活性。 Figure 2. 作者的设想，用四肽替换掉现有天然产物的效应片段 作者之前也做过类似的尝试，包括构建大的FKBP衍生物库（但库中化合物丧失了对FKBP的结合）。本文是作者的后续成果，构建了一个45000的雷帕霉素衍生物库，从中成功鉴定出ENT1的抑制剂。 Rapafucin的合成：作者使用固相合成+split pool策略去组装四肽。具体反应路径如下所示，1）将带有烯烃的仲胺linker固定在beads上，2）四肽的羧基与仲胺缩合，固定四肽（Fig 3）。 Figure 3. 固定Linker和四肽 3）FKBD的羧基与四肽末端氨基缩合，固定FKBD（Fig 4） Figure 4. 固定FKBD 4）通过烯烃复分解，将FKBD中的烯烃与仲胺linker连接，一步完成关环和脱beads（Fig 5）。 Figure 5. 通过烯烃复分解关环并脱Beads 优化点1：对linker的筛选。trans构型的烯烃C5只有较低的关环产率，cis构型的产率高于trans构型，其中C6,C8高于C4，但是C8的产物不单一，所以最后选择了cis-C6（Fig 6）。 Figure 6. Linker的选择 优化点2：FKBD上烯烃片段对反应产率的影响，结论是作者选取的几种结构，都不影响烯烃复分解的产率。 优化点3：反应温度、反应时间、催化剂用量等。 优化点4：不同FKBD对FKBP的亲和力。FKBD3是直接从雷帕霉素上截取而来，FKBD6是基于SLF(Synthetic Ligand of FKBP)而来。线性化的FKBD3对FKBP12的亲和力相较于雷帕霉素下降了三百倍（(Kd = 327 nM for FKBD3 and 1nM for rapamycin)），将FKBD3环化，亲和力有一定的提升（Kd = 174 nM）；FKBD7-9对FKBP的亲和力严重下降，提示更刚性的酰胺键不如酯键；线性化的SLF衍生物FKBD6对FKBP亲和力较强（Kd = 62 nM），但成环以后活性大幅丧失。将FKBD6中刚性的苯环用脂肪链替代，得到了FKBD10（Kd = 4 nM），FKBD11(Kd = 11 nM)。将二者环化之后，活性仅有轻微下降，FKBD10（Kd = 25 nM），FKBD11(Kd = 37 nM)。不同的环化不会导致含FKBD10,11的大环对FKBP的亲和力下降（Fig 7）。 Figure 7. FKBD的结构 化合物库的合成：以FKBD10，11和cis-c6 linker为基础开始构建化合物库。首先是构建四肽效应片段。氨基酸选择带有疏水侧链的天然/非天然氨基酸。同时将2，4位氨基酸胺基甲基化封闭，用于改善分子整体性质。使用split-pool策略固相合成四肽。1-4位每个位置上氨基酸残基可用数为15，10，15，10，一共构建了15 x 10 x 15 x 10 = 22500个四肽片段。每个片段可以和FKBD10和11成环，所以一共合成了45000个雷帕霉素衍生物（rapafucin），FKBD10系列环原子数36，FKBD11系列环原子数34。至此化合物构建完成（Fig 8）。 Figure 8. 四肽部分的构建及两类终产物的结构式 基于细胞表型的筛选体系：筛选能够抑制细胞胸腺嘧啶核苷摄取的化合物，发现FKBD10系列中的一个pool的化合物有较好的抑制活性。将这15个化合物单独合成并验证活性，只有三个化合物有亚微摩尔活性，最好的化合物活性为426 nM。将四肽的顺序颠倒后重新与FKBD10成环，得到的化合物SH-13抑制活性为 366 nM。对SH-13进行三轮改造后得到活性最强的化合物95-15-3（Rapadocin），抑制细胞胸腺嘧啶核苷摄取的IC50为5 nM（Fig 9）。 Figure 9. a）Rapadocin结构式 b）Rapadocin抑制胸苷摄取 ENT1是Rapadocin的靶点：Rapadocin对表达hENT1的PK15细胞的腺苷转运有明显抑制（IC50 = 3.2 nM），而对表达hENT2的细胞几乎没有抑制活性，重要的是，这一活性是FKBP依赖的（Fig 10）。 Figure 10. 左图Rapadocin选择性抑制PK15-hENT1细胞腺苷转运，右图Rapadocin对胸苷转运的抑制部分依赖于FKBP12 ——小结—— 通过模仿天然产雷帕霉素，作者成功找到了hENT1的抑制剂Rapadocin，且Rapadocin发挥功能部分依赖于FKBP12。雷帕霉素和FK506的靶点都是细胞内的蛋白质，而Rapadocin的靶点为膜蛋白，扩充了分子胶靶点蛋白的范围。 参考文献： Guo, Z., Hong, S.Y., Wang, J.et al. Rapamycin-inspired macrocycles with new target specificity. Nature Chem 11, 254–263 (2019). https://doi.org/10.1038/s41557-018-0187-4 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

BALTIMORE, Oct. 17, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Rapafusyn Pharmaceuticals, a leader in the field of non-degrading molecular glues, is pleased to announce the upcoming presentation of preclinical in vivo data from its selective ENT1 inhibitor for Acute Kidney Injury (AKI) at the American Society for Nephrology (ASN) Kidney Week 2024 to be held from October 24-27, 2024, in San Diego, CA. Rapafusyn’s lead program, RAP-0001, is advancing rapidly to address a critical unmet need: the prevention of Acute Kidney Injury (AKI) in patients undergoing cardiac surgery. AKI is a severe and common complication, leading to prolonged hospital stays, increased morbidity, and higher mortality rates. With no approved therapies currently available, novel solutions are urgently needed. RAP-0001, a potent and selective inhibitor of the ENT1 transporter, has shown preclinical efficacy in preventing ischemia/reperfusion injury, a major driver of AKI. “This compound was discovered through the RapaGlue™ platform. As a molecular glue, RAP-0001 uniquely binds to the intracellular chaperone protein FKBP12 and ENT1 to form a ternary complex. To our knowledge, it’s the only SLC inhibitor that targets the intracellular domain of a transporter,” said Dr. Matthew Olson, VP of Biological Sciences of Rapafusyn, who will present in vivo data demonstrating RAP-0001’s ability to significantly reduce kidney damage in this high-risk context on October 25 th , 2024. Dr. Sean Hu, CEO of Rapafusyn, stated, “We believe RAP-0001 could change the standard of care for AKI, providing a critical therapeutic option where none currently exist. This is yet another example of recent developments demonstrating how non-degrading molecular glues could potentially tackle challenging disease targets and address high unmet medical needs in ways more effective than other drug modalities.” About Rapafusyn At Rapafusyn, we’re creating non-degrading molecular glues to address hard-to-drug targets. Using our FKBP12-binding macrocyclic peptide platform, we’ve built large DNA encoded libraries (DELs) and arrayed libraries, yielding novel starting points. Our approach targets intracellular proteins and domains of transmembrane proteins like SLCs, ion channels, and GPCRs. With a modular design, we rapidly optimize key drug properties to accelerate drug-discovery. For more information, please visit or contact Heather Lavin at hlavin@rapafusyn.com .

40Hz多感官刺激如果可以作为一种新型非侵入性策略，调节并增强脑类淋巴流动，将为相关疾病的治疗带来极大的改善。 近日，来自温州医科大学附属眼视光医院陈江帆教授的研究成果，将40Hz感官刺激促进脑内致病蛋白清除的机制进行了更新升级。他们发现40Hz光闪烁增强了脑类淋巴的流入和流出，并且发现腺苷-A2A受体（A2AR）信号传导是脑类淋巴流动增强的神经化学基础。 研究发表在Cell Discovery杂志上。 脑类淋巴系统的运转依赖于脑脊液（CSF）的流动和星形胶质细胞末端足的水通道蛋白-4（AQP4）极化，使脑脊液和间质液（ISF）进行液体交换，帮助大脑清除代谢废物。 利用荧光示踪剂，研究人员可以看到40Hz光闪烁显著增加了野生型小鼠脑脊液流动，基底前脑、前额叶、上丘和海马等区域表现出显著的脑脊液灌注速度加快，淋巴流入和流出增强。 40Hz光闪烁增强淋巴流入和流出 AQP4作为血管周围空间的外部屏障，在40Hz光闪烁30分钟后，极化显著增加，意味着更有效地定位在星形胶质细胞末端足处，有助于增强脑内的液体流动和类淋巴的废物清除功能。与此同时，小鼠的动脉血管运动和脑血流量显著增加，有助于增强类淋巴流入。 当然，研究人员也关注了小鼠的心血管健康。虽然血管运动增强，但是40Hz光闪烁没有造成小鼠的血压和心率显著上升，不会影响整体的心血管状态。 脑血流量增加 接下来，研究人员进一步探索40Hz光闪烁影响脑类淋巴流动的潜在机制。在之前的研究中，陈教授团队已经发现40Hz光闪烁可以增强胞外腺苷水平。而腺苷作为一种神经调质，在睡眠调控、心血管和炎症反应等功能中扮演着重要角色，并且与受体A2AR结合可以调节脑血流量。 因此，研究人员针对小鼠腺苷水平进行了分析。腺苷的跨膜转运依赖于两种不同的转运蛋白ENT1和ENT2。40Hz光闪烁30分钟后，小鼠脑脊液细胞外腺苷水平显著升高，脑类淋巴流动增强；分别对两种转运蛋白基因进行敲除，发现只有ENT2缺失影响了40Hz诱导的腺苷水平增加和脑类淋巴流动增强，并且在ENT2缺失小鼠中也没有发现AQP4的极化增加或者动脉血管运动增强。 ENT2缺失影响40Hz诱导的脑淋巴流动、血管运动和脑血流量增加 进一步对40Hz光闪烁诱导后的野生型小鼠大脑进行分析，可以看到全脑提取物中的ENT2密度增加以及A2AR密度增加，说明腺苷和A2AR在40Hz光闪烁促进脑类淋巴流动中的重要作用。 总的来说，研究证明40Hz光闪烁通过ENT2介导的腺苷释放和A2AR激活增强了野生型小鼠的脑类淋巴流动。 机制示意图 在多种衰老相关疾病以及神经系统疾病中，都存在脑类淋巴系统功能减退，从而导致认知能力下降和蛋白质病变。40Hz多感官刺激如果可以作为一种新型非侵入性策略，调节并增强脑类淋巴流动，将为相关疾病的治疗带来极大的改善。