ERK2

MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路是细胞内一种重要的信号传导途径，广泛参与调控细胞生长、分化、死亡、应激反应等多种生物学过程。MAPK通路对于细胞应对外界环境变化具有核心作用，涉及到多种疾病的发生发展，包括癌症、炎症性疾病等。 一、MAPK通路的组成 MAPK通路主要由三类蛋白激酶组成，它们按照特定的顺序激活： 1.MAPKKK（MAPK激酶激酶）：最上游的激酶，响应信号分子的刺激。 2.MAPKK（MAPK激酶）：由MAPKKK激活，进一步放大信号。 3.MAPK：最终的执行者，被MAPKK激活后，转移到细胞核内，通过磷酸化特定的基因调控蛋白，影响基因表达。 图：MAPK通路的基本组成（来自Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.） 二、MAPK通路的主要分支 MAPK通路可以分为几个主要分支，每个分支由不同的MAPK蛋白构成，主要包括：ERK通路，JNK通路和p38 MAPK通路。 1. ERK通路（Extracellular signal-Regulated Kinases） ERK通路，也称为经典的MAPK通路，主要响应生长因子和一些其他刺激。它通常与细胞增殖和分化过程相关联。 主要组成： ●上游激酶：包括Ras小GTPase，它激活RAF激酶（如BRAF）。 ●中间级激酶：RAF激活MEK1和MEK2（MAPK/ERK激酶）。 ●下游激酶：MEK激酶进一步激活ERK1和ERK2。 生物学功能： ●细胞增殖：ERK通路的激活促进细胞周期蛋白的表达，推动细胞周期进程。 ●细胞分化：在某些细胞类型中，ERK激活是细胞分化必需的。 ●生存信号：ERK可以激活抗凋亡蛋白，如Bcl-2，帮助细胞逃避程序性细胞死亡。 MAPK/Erk 信号级联放大通过生长和分化中涉及的各种不同受体进行激活，包括受体酪氨酸激酶 (RTKs)、整合素以及离子通道。由不同的刺激物激活的级联反应的特定组分差异较大，但通路的结构通常包含一组对接蛋白（Shc、GRB2、Crk 等），它们将受体连接到一个鸟苷酸交换因子上（SOS、C3G 等），信号则转导至小分子 GTP 结合蛋白 (Ras，Rap1)，后者再激活级联中的核心单位，包括一个 MAPKKK (Raf)、一个 MAPKK (MEK1/2) 和 MAPK (Erk)。激活的 Erk 二聚物可在胞质中调控靶蛋白，也可转运入胞核，在核内磷酸化多种调控基因表达的转录因子。 图：生长和分化中的 MAPK/Erk（来自Cell signaling） 2. JNK通路（c-Jun N-terminal Kinases） JNK通路，也称为应激激活蛋白激酶通路，主要响应应激信号，如紫外线照射、热休克和炎症因子。 主要组成： ●上游激酶：包括MKK4和MKK7。 ●下游激酶：它们激活JNK1、JNK2和JNK3。 生物学功能： ●细胞应激反应：JNK通路在细胞对环境应激做出反应中发挥关键作用。 ●调节细胞死亡：JNK的活化通常与细胞凋亡相关，尤其是在病理条件下。 ●炎症反应：JNK能够调节多种炎症细胞因子的表达。 应激活化蛋白激酶 (SAPK)/Jun 氨基末端激酶 (JNK) 是 MAPK 家族的成员，可由各种不同环境应激、炎症细胞因子、生长因子以及 GPCR 激动剂激活。应激反应信号经 Rho 家族（Rac、Rho、cdc42）的小分子 GTP 酶传递到这个级联。和其他 MAPK 一样，膜近端激酶是一个 MAPKKK（通常为 MEKK1–4），或是混合性谱系激酶（MLK）中一员，能磷酸化并激活 MKK4 (SEK) 或 MKK7（即 SAPK/JNK 激酶）。此外， MKK4/7 能由生发中心激酶 (GCK) 家族成员以独立于 GTP 酶的方式激活。SAPK/JNK 转运入胞核后可调节多种转录因子的活性。 图：SAPK/JNK信号级联放大（来自Cell signaling） 3. p38 MAPK通路 p38 MAPK通路同样响应应激信号，包括细胞因子和环境应激，常与细胞生存和炎症反应相关。 主要组成： ●上游激酶：包括MKK3、MKK4和MKK6。 ●下游激酶：p38 MAPK有四个不同的同源体：p38α、p38β、p38γ和p38δ。 生物学功能： ●炎症反应：p38 MAPK是许多炎症介质表达的调节者，对免疫细胞的活化起重要作用。 ●细胞周期调控：p38在某些情况下可以抑制细胞周期的进程，从而影响细胞增殖。 ●细胞分化：特别是在骨骼肌细胞和神经细胞的分化中，p38 MAPK的激活对某些分化途径至关重要。 p38 MAPK（α、β、γ 和 δ）是 MAPK 家族的成员，各种环境应激和炎症细胞因子均可将其激活。对于其他 MAPK 级联，膜近端组分是一个 MAPKKK，其为典型的 MEKK 或混合性谱系激酶 (MLK)。MAPKKK 磷酸化并激活 MKK3/6，后者即是 p38 MAPK 激酶。MKK3/6 也可在凋亡因素的刺激下直接由 ASK1 激活。p38 MAPK 参与调节 HSP27、MAPKAPK-2 (MK2)、MAPKAPK-3 (MK3) 和其他几种转录因子，包括 ATF-2、Stat1、Max/Myc 复合体、MEF-2 和 Elk-1，而 CREB 通过激活 MSK1 间接调控。 图：p38 MAPK信号转导相互作用通路（来自Cell signaling） 三、MAPK通路的激活机制 MAPK通路通常是通过细胞表面的受体如受体酪氨酸激酶（RTKs）或G蛋白偶联受体（GPCRs）接收信号，触发一系列下游事件： 1.受体激活：受到外界信号分子（如生长因子）的结合后，受体自身活化或聚合，激活与其相连的适配蛋白。 2.Ras蛋白的激活：在ERK通路中，适配蛋白进一步激活小G蛋白Ras。 3.MAPKKK的激活：Ras激活RAF家族蛋白（MAPKKK的一种），后者激活MEK（MAPKK）。 4.MAPK的激活：MEK进一步激活ERK，ERK磷酸化核内的靶蛋白，如转录因子，从而改变基因表达。 四、MAPK通路的生理与病理意义 MAPK通路在维持正常细胞功能和发展中起着关键作用，但当这些通路异常激活或抑制时，可能导致多种疾病的发生： ●癌症 MAPK通路的持续激活常见于多种肿瘤，促进肿瘤细胞的增殖和存活。 MAPK信号通路与细胞增殖和分化密切相关。在许多恶性肿瘤中发现MAPK信号的持续激活。细胞增殖在很大程度上有助于肿瘤发生。肿瘤转移和侵袭是致命原因。在哺乳动物MAPK通路中，ERK通路是研究最充分的，在大约三分之一的人类癌症中失调。 ERK1/2通路在肿瘤细胞的增殖、分化、转移和侵袭中起重要作用。 温等人发现乙型肝炎病毒x蛋白通过p38/MAPK通路使p53基因失活，从而诱导原发性肝癌（PLC）。Kim MS等人证明，p38 MAPK是Ras诱导的乳腺癌细胞侵袭和转移的关键信号分子。许多研究表明，p38 MAPK通路在细胞外刺激产生的MMP（基质金属蛋白酶）中发挥重要的调节功能。MMP是一种与肿瘤侵袭和迁移密切相关的蛋白水解酶。此外，p38 MAPK通路促进维持肿瘤细胞生长所必需的肿瘤血管生成。 癌症经常暴露于各种压力条件下，例如缺氧和炎症。许多MAPK通路都参与应激信号传导。因此，一些激酶在癌症中被应激激活，以响应炎症、DNA 损伤和细胞凋亡。缺氧状态在实体瘤中广泛存在。缺氧信号刺激MKP-1的激活。MKP-1 进一步激活 SAPK/JNK，从而激活 c-Jun。活性 c-Jun 促进多个下游基因转录，这对癌细胞的增殖和存活很重要。 MAPK信号转导的畸变会影响大多数致癌过程，对癌症的发展和进展至关重要。大多数癌症相关病变，如受体酪氨酸激酶的过表达、受体酪氨酸激酶的激活突变、激活配体的持续自分泌或旁分泌产生、Ras 突变和 B-Raf 突变导致 ERK 信号转导的组成型激活。据报道，c-Jun 的 JNK 活性和磷酸化在 Ras 诱导的肿瘤发生中起关键作用。 ●炎症性疾病 在炎症性疾病中，MAPK通路通过影响细胞因子、生长因子和应激反应等因素的表达和活性，起到了至关重要的调控作用。 MAPK通路参与调控包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（如IL-1, IL-6）等多种炎症性细胞因子的产生。这些细胞因子是炎症反应中的关键介质，能够激活更多的免疫细胞和促进炎症反应的发展。MAPK通路通过调节各种趋化因子和黏附分子的表达，影响免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞）的活化、迁移和入侵到炎症部位。在炎症和其他应激条件下，JNK和p38 MAPK的激活促进细胞应对损伤和恢复平衡。 由于MAPK通路在炎症反应中的核心角色，研究者开发了多种针对该路径的抑制剂，以治疗如类风湿性关节炎、银屑病等炎症性疾病。例如，p38 MAPK抑制剂已被证明可以减轻炎症反应，通过减少炎症性细胞因子的产生。 ●神经退行性疾病 在神经退行性疾病的研究中，MAPK通路显示出其在神经保护和神经损伤中的双重作用，这些疾病包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等。 AD中，异常的tau蛋白磷酸化与MAPK通路的过度活化有关。特别是JNK和p38 MAPK在tau磷酸化和神经纤维缠结的形成中起着重要作用。PD中，JNK和p38 MAPK的活化与多巴胺神经元的死亡相关。MAPK通路参与了氧化应激和炎症反应的调控，这些都是PD的关键病理过程。在HD中，JNK的激活与疾病相关的神经毒性密切相关。JNK抑制剂显示出在预防神经退行方面的潜力。 五、MAPK通路的治疗应用 由于MAPK通路在多种疾病中的核心作用，该通路的组分成为了药物开发的重要靶点。目前已有多种针对MAPK通路的抑制剂被开发用于治疗特定类型的癌症（如BRAF抑制剂在黑色素瘤中的应用）和其他疾病。此外，针对JNK和p38 MAPK的抑制剂也在被研究中，以期治疗炎症和神经退行性疾病。 六、总结 MAPK通路是一条复杂的信号传导途径，涉及到多种生理和病理过程。对其深入研究不仅有助于我们理解细胞如何响应外界信号并调控各种细胞功能，还可以为疾病的预防和治疗提供新的策略。随着研究的深入，未来可能会发现更多的关于这一信号通路的调控机制和治疗潜力。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

中文摘要 间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）源性外泌体（MSC derived exosome，MSC-Exo）是由MSC通过旁分泌作用产生的携带大量生物信息传播介质和活性物质的脂质双分子层包裹纳米级囊泡，可实现有选择性、定向性的细胞间信号转导，抑制炎症反应，促进受损组织的修复与再生。此文就MSC-Exo的生物学特性、作用机制及其在常见疾病治疗中的潜在应用与发展进行综述。 正文 干细胞是能够实现自我更新、自主增殖的原始细胞，在体内可分化产生某种特定组织类型的功能细胞。近年来，干细胞引起了研究者的广泛关注，且研究发展迅速，其中被研究最多的为间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）。按来源划分，MSC属成体干细胞，来源广泛，可从骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带和脐带血等不同组织中获取，能够参与组织器官的修复与再生。 外泌体（exosome，Exo）是非常重要的细胞外囊泡，直径30~100 nm，广泛存在于机体几乎所有细胞及多种体液中。MSC源性Exo（MSC derived Exo，MSC-Exo）携带大量生物信息传播介质和活性物质，可实现选择性、定向性细胞间信号转导，抑制炎症反应，促进受损组织的修复与再生。本文就MSC-Exo的生物学特性、作用机制及其在常见多发疾病中的研究进展进行综述，以期为MSC-Exo在各种难治疾病中的规范有序应用提供借鉴。 1 MSC-Exo的生物学特性与作用机制 MSC-Exo是由磷脂双分子层包被且腔内充满多种蛋白质、核酸、脂质和可溶性因子的纳米级囊泡，通过细胞膜内陷方式从MSC中释放。如图1所示，MSC-Exo的特殊“脂筏”结构使其表面含有特异蛋白（如CD9、CD63、CD81等），能够直接与靶细胞的质膜融合，还可通过细胞内吞实现信息传递，参与信号转导、炎症因子释放调控、细胞增殖分化调控等过程。 相较于MSC，无细胞结构的MSC-Exo易于存储管理，且稳定性更好、免疫原性更低，可有效减少医源性肿瘤的形成和生长，进而降低细胞治疗过程中存在的风险。研究者认为，MSC-Exo可成为替代MSC的无细胞治疗新手段并具有光明前景，目前已在恶性肿瘤、肝脏疾病、心血管及神经退行性疾病、糖尿病等常见疾病的动物模型中对其进行了广泛探究。 MSC-Exo主要通过与靶细胞进行融合，向靶细胞释放神经因子、微RNA（microRNA，miRNA或miR）及多种蛋白质等活性物质，或直接与靶细胞的表面受体结合进行基因调控以发挥其免疫调节和促进组织再生和修复的作用。然而MSC-Exo在不同疾病中的作用机制复杂，更为具体的调控机制仍是研究者攻克的难点。 2 MSC-Exo在常见疾病中的研究进展 2.1 恶性肿瘤 MSC-Exo可通过释放活性物质参与调控肿瘤细胞的血管生成能力和上皮间质转化过程，同时在大多肿瘤细胞内可实现自由扩散和定植，对肿瘤微环境产生一定影响，进而实现对肿瘤细胞生物学功能的调节。 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）即肝癌，是常见的恶性肿瘤，死亡率居全球第4位。研究显示，MSC-Exo可通过不同机制保护肝脏，抑制HCC的发展、转移和耐药。Ding等发现，由骨髓源的MSC-Exo——BMSC-Exo转移的miR-374c-5p对HCC患者的细胞增殖和转移具有抑制作用。Lou等证明，源于脂肪组织的MSC-Exo可通过携带miRNA-199a调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，进而提高HCC的化学治疗敏感性。此外，研究显示，MSC-Exo也可作为载体靶向递送抗肝癌物质（药物或基因），以实现疾病治疗。Li等利用葡萄糖调节蛋白78特异性干扰小RNA修饰的BMSC-Exo联合索拉非尼后，能够靶向HCC细胞中的葡萄糖调节蛋白78，使耐药肿瘤细胞对索拉非尼增敏，逆转耐药性，提高疗效。 结肠癌在我国的发病率逐年升高。研究显示，除手术切除和常规用药外，携带miRNA的MSC-Exo被认为是新型的生物标志物，可用于结肠癌的诊断和预测。李晓辉等证实了高表达miR-196b-5p的MSC-Exo可降低结肠癌CT26.WT细胞对5-氟尿嘧啶的耐受性，从而促进细胞凋亡。其作用的潜在机制被认为与抑制PI3K/Akt信号通路的激活有关。Chen等研究发现，BMSC-Exos中miR-4461可以通过下调包被体蛋白复合物亚基β的表达，进一步抑制结直肠癌细胞HCT116和SW480的细胞迁移和侵袭，是潜在的结肠癌治疗靶点。 胃癌早期通常无症状，这是导致患者因确诊延时而错过最佳手术时机的最主要因素，进而造成多数胃癌发现即晚期的现象；虽然可采取手术联合用药的策略进行治疗，但预后效果仍不理想。杜雄等研究发现，在缺氧条件下，BMSC-Exo能够促进Wnt/β联蛋白信号通路的激活，实现胃癌细胞的快速增长和转移。同时，董俊刚等研究发现，胃癌细胞的生长和转移与BMSC-Exo的分泌呈正相关，即BMSC-Exo促进胃癌细胞的增殖。这为研究靶向BMSC- Exo治疗胃癌奠定了理论基础。 近年来，肺癌患者的新增率和死亡率均居高不下。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）作为肺癌的一大种类，传统治疗手段为手术切除和药物治疗，治疗效果不理想。MSC-Exo作为远程信号效应物，可远距离进行细胞间信息交流，进而调控肿瘤的生物学功能、生长状态和耐药性等。Liang等阐述了BMSC-Exo中的miR-144通过下调细胞周期蛋白E1和E2从而抑制NSCLC细胞的增殖，以此间接阻断肿瘤生长。 乳腺癌是世界范围内女性群体高发的浸润性恶性肿瘤，如今除常规化学治疗和手术切除外，MSC-Exo也可作为载体联合化学药物对其进行治疗。如BMSC-Exo装载阿霉素（doxorubicin，DOX）是目前研究较为集中的一个载药系统，实验表明，BMSC-Exo@DOX的药物载体可靶向结合乳腺癌细胞，同时不会削弱和降低药物本身对癌细胞的杀伤作用。MSC-Exo装载和厚朴酚（Honokiol）也是重要的载药系统，Kanchanapally等将乳腺癌细胞系与Honokiol、MSC-Exo@Honokiol共培养72 h后发现，MSC-Exo@Honokiol组对癌细胞的杀伤力远高于Honokiol组，是Honokiol组的4~5倍，潜在机制是缩短细胞周期和加快细胞凋亡从而遏制癌细胞的生长。 MSC-Exo在其他肿瘤治疗中的应用也有所报道，如通过对肾癌细胞内胆固醇代谢关键酶的表达量进行调控，进而影响肾癌细胞的生物学功能和行为；高浓度MSC-Exo可抑制口腔鳞状细胞癌的生长，这可能是由于MSC-Exo结合PI3K/Akt信号通路靶点，通过直接或间接接触的方式抑制癌细胞增长和定植；MSC-Exo作为旁分泌的一种重要活性物质，可通过向前列腺癌细胞递送miR-126-3p进而遏抑癌细胞的增殖和迁移。 2.2 肝脏疾病 肝功能受损导致肝细胞的自我调节与再生功能异常，从而诱发各种肝脏疾病，如肝硬化、肝炎等。目前，肝移植仍是治疗肝脏疾病的主流治疗措施，但供体器官短缺及移植后产生的终身免疫等问题阻碍了肝移植技术的发展。随着MSC-Exo的发现，肝脏疾病治疗有了新的方向。国内外均有开展利用MSC-Exo治疗肝脏疾病的实验研究（表1）。 Watanabe等用非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatiti，NASH）模型评估MSC-Exo的治疗效果发现，MSC-Exo可减轻NASH的炎症反应并抑制纤维化。宋晓静分别构建大鼠肝切除模型及大鼠缺血再灌注损伤模型，并进行体内注射人脐带来源的MSC-Exo（human umbilical MSC-Exo，hUCMSC- Exo），验证了其发挥促进肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用。急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）也是一种常见的肝脏疾病，Wu等利用C57BL/6小鼠和LO2细胞ALF模型，进一步探究hUCMSC-Exo的治疗机制，结果证明其可通过上调胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2和PI3K/Akt信号通路，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，减少氧化应激，从而达到保护肝脏的目的。除此之外，hUCMSC-Exo也被证实可以延缓和减轻小鼠模型的肝损伤程度。 Psaraki等通过建立的急性肝病或慢性肝病动物模型，确定了不同来源的MSC-Exo可有效发挥抗凋亡、抗炎和抗纤维化等作用，同时证明了MSC-Exo的靶向能力可通过膜修饰来提高。这意味着MSC-Exo的修饰可能是肝病治疗的有前途的替代方法。除直接注射进行治疗外，有研究人员利用MSC-Exo设计药物递送系统，用于装载激素药物地塞米松（dexamethasone，DEX），即构建装载有地塞米松的MSC-Exo@DEX。该载药系统可降低肝脏转氨酶和炎症因子的表达水平，进而有效减小激素药物对肝脏的损伤。这也给肝脏疾病的无细胞治疗和药物递送载体的构建提供了新的思路。 2.3 心血管及中枢神经系统疾病 近年来，全球范围内的心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）和中枢神经系统疾病（central nervous system disease，CNSD）发病率均呈上升趋势。通常CVD和CNSD被认为是不可逆的损伤，目前的治疗手段仍存在一定的局限性。已有大量研究证实，MSC-Exo在CVD和CNSD相关疾病模型中具有极大的治疗潜力。 CVD在我国是常见高发疾病，同时具有全球高发病率和高病死率。研究发现，体内和体外进行MSC-Exo移植均可通过增强血管生成能力、减轻心脏纤维化，达到修复损伤心肌细胞和保持心脏功能的目的。Zhao等发现，MSC-Exo可通过miR-182信号通路改变M1巨噬细胞向M2巨噬细胞的极化来减轻心肌I/R损伤，为MSC-Exo作为心肌I/R损伤的潜在治疗工具提供了新的思路。Liu等探索了过表达巨噬细胞移动抑制因子的BMSC-Exo的外显子在心肌梗死大鼠模型中的心脏保护作用。结果发现，其可通过减少心脏重塑及心肌细胞线粒体断裂，避免活性氧生成和细胞凋亡，进而实现心脏功能的增强。该研究阐述了以巨噬细胞移动抑制因子-MSC-Exo为基础的心肌梗死治疗的新机制，并为心血管疾病的诊治提供了崭新的方式。 CNSD主要包括阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson disease，PD）、脊髓损伤(spinal cord injury，SCI) 等，其特点是神经元结构和功能丧失，进而阻碍神经元间的信息转导。MSC-Exo内含抗炎RNA和多种神经保护蛋白，可对神经细胞发挥保护作用。Perets等使用以金纳米颗粒作为标记剂的计算机体层成像技术追踪鼻腔内给药的MSC-Exo在不同脑病中的迁移和归巢模式，发现MSC-Exo能够特异性靶向不同病理小鼠模型的大脑区域并进行累积；而在对照组中则呈现弥漫性迁移模式，这和神经免疫应答的趋化能力存在紧密联系。黄荣等对AD小鼠模型进行静脉输注BMSC-Exo，连续给药21 d后发现，与未处理组相比，BMSC-Exo组小鼠逃避潜伏期显著缩短，Toll样受体2、诱生型一氧化氮合酶及含NACHT、LRR和PYD结构域蛋白3等因子表达显著减少，三结构域蛋白31的表达显著增加。这意味着BMSC-Exo可能通过促进三结构域蛋白31表达和抑制炎症小体的产生来改善AD小鼠的认知功能障碍。另有研究表明，在SCI模型大鼠中，接受注射MSC-Exo组别的病变处神经和血管内皮的细胞数量均有所增加，表现出良好的神经及血管再生能力。Yang等利用MSC-Exo包被反义寡核苷酸4（Exo-ASO4）进行药物递送，结果表明 Exo-ASO4可到达PD模型小鼠的脑实质并明显降低α突触核蛋白的表达量进而减弱其在病灶内的聚集程度，减轻PD模型小鼠的多巴胺神经元退化，改善运动功能障碍。 2.4 炎症类疾病 炎症反应是指当机体受到病原微生物感染、创伤、变态反应等刺激时，自身产生一系列组织细胞的反应。通过MSC标志物（如CD29、CD44、CD90和CD73）标记发现，MSC-Exo可驻留在受伤和发炎的组织中，将活性物质转移至受体细胞，从而介导细胞间通讯，改变受体细胞的基因表达并影响其生理和病理状态。MSC-Exo可通过对免疫细胞和炎症细胞的极化反应进行调控，达到减轻炎症反应、抑制氧化应激和修复的目的，具体机制如表2所示。 MSC-Exo治疗的炎症类疾病主要涉及骨科疾病、泌尿系统疾病、免疫系统疾病、消化系统疾病以及呼吸系统疾病等5大类。 骨科相关炎症疾病中最为常见的是骨关节炎（osteroarthritis，OA），以关节软骨病变为主。已有研究表明，MSC-Exo促进软骨损伤修复的重要作用机制之一是抑制炎症因子表达，从而为软骨修复提供良好的微环境。Zhou等采用负载miRNA-126-3p的滑膜MSC-Exo处理OA大鼠，处理后的大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达量均降低，进而抑制骨赘形成，防止软骨退变，并对关节软骨发挥抗凋亡和抗炎作用。Jin等在OA大鼠模型的膝关节上进行前交叉韧带横切和内侧半月板-胫骨韧带切除手术，然后在关节内注射BMSC-Exo，发现其能减轻大鼠模型的软骨破坏程度、促进软骨下骨重塑。结果说明BMSC-Exo通过减少软骨细胞的衰老和凋亡对OA起到治疗作用，这表明BMSC-Exo可能为OA治疗提供候选治疗方法。 膀胱炎和肾脏疾病均是常见的泌尿系统疾病。Wen等建立了动物模型发现，MSC-Exo可减轻胶原纤维累积并促进组织再生，从而保护组织免受损伤，有助于治疗间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征且无致瘤性。Lu等发现BMSC-Exo可通过激活前列腺素E2受体2遏抑促炎因子分泌，改善M1和M2型细胞的极化状态，减少肌成纤维细胞的形成，进而降低细胞外基质沉积和肾纤维化的程度。 常见的免疫系统疾病包括类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等。目前临床应用较多的RA治疗药物为生物制剂和小分子激酶抑制剂，但药物自身的毒性极大限制了RA的治疗效果。赵相卓等利用 BMSC-Exo对RA-成纤维型滑膜细胞模型进行处理，结果证明，BMSC-Exo可通过抑制p38丝裂原激活的蛋白激酶活化进而抑制RA-成纤维型滑膜细胞的生长和转移，减少炎症因子分泌。王喆等通过构建负载双氯芬酸钠（diclofenac sodium，DS）的MSC-Exo（DS@EX），利用激光共聚焦成像观察发现，与普通药物递送载体相比，DS@EX可以更多地累积于发炎的关节中；同时，DS@EX减弱了关节表面的骨侵蚀，其骨密度值由921 mg/cm3升高至1 195 mg/cm3。这表明DS@EX可以减弱RA小鼠的炎性反应并缓解骨质的侵蚀。SLE也是多因素介导的自身免疫疾病。最近的研究证实，在动物模型中，BMSC-Exo可以提高miR-10a-5p的表达，进而靶向下调紫外线抵抗相关基因的表达水平，达到抑制SLE外周血单个核细胞增殖并促进细胞凋亡的目的。 慢性肝炎和炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是较为常见的消化系统疾病。自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种高发慢性肝炎疾病，MSC-Exo通过特定的miRNA调节肝脏Treg和Th17的比例对AIH起治疗作用。Lu等建立AIH小鼠模型，应用携带miR-223-3p的MSC-Exo进行处理。结果显示，MSC-Exo可通过miR-223-3p调控信号转导及转录激活蛋白3、IL-1β以及IL-6的表达，同时提高Treg/Th17比值，进而减轻肝损伤，利于AIH的炎症修复。IBD是一种非特异性的慢性肠道炎症疾病，分为溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn disease，CD）。随着其发病率的逐年上升，目前IBD已成为全球性疾病。通过构建IBD的动物模型发现，MSC-Exo治疗IBD的潜在机制可能是参与调节相关转录因子的表达，进而发挥炎症抑制作用。Pak等应用源于人胎盘（human placenta，hp）的MSC-Exo（hPMSC-Exo）治疗CD具有良好的安全性和治疗效果。Duan等采用三硝基苯磺酸诱导构建UC小鼠模型，并采用原位注射hPMSC-Exo的方式进行治疗。结果显示，注射hPMSC-Exo可调节结肠细胞中促炎和抗炎细胞因子的平衡；同时，hPMSC-Exo还可通过降低髓过氧化物酶MPO和活性氧类的活性来抑制氧化应激。 常见的呼吸系统疾病包括哮喘、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和COVID-19等。因为过敏性鼻炎是导致哮喘病发的主要因素之一，所以治疗过敏性鼻炎也是从根本上治疗哮喘的有效途径。吴杰应用低氧处理的hUCMSC-Exo治疗过敏性鼻炎小鼠模型，结果发现，实验小鼠的IL-4和IL-10的表达量明显下降，存在更低分化程度的树突状细胞，进而证明MSC-Exo的注入可以增强对过敏性鼻炎的疗效。ARDS属于弥漫性肺损伤，是全球性普发疾病。胡松采用ARDS小鼠模型，通过尾静脉注入BMSC-Exo观察发现，实验组小鼠的生存率得到提高，同时肺组织炎症得到缓解。COVID-19具有高传播性和强变异性的特点，目前尚无有效治疗方法。MSC-Exo对病灶的免疫调节和组织修复能力可视作 COVID-19创新性疗法的重要基础，具有强大的医治潜力。Sengupta等在患有ARDS的COVID-19受试者中进行了第1阶段临床试验，结果显示，采用BMSC-Exo治疗的患者肺部的血氧饱和度以及氧合指数均显著升高，且体内炎症因子水平降低，患者存活率高达83%，肺部损伤情况也有所改善。 2.5 骨科疾病 骨骼是人体重要的器官，参与运动系统的组成，同时发挥支持和保护作用。骨科疾病除上述炎症疾病外，常见疾病还包括软骨损伤、骨折和骨质疏松（osteoporosis，OP）等。 MSC-Exo可促进软骨细胞增殖和基质生成，维持微环境“稳态”，还可激活软骨的修复和再生能力。Zhang等利用大鼠模型证实BMSC-Exo通过调控CD73的表达参与PI3K/Akt和ERK信号传导过程，进而促进细胞快速生长和浸润，实现软骨修复。此外，MSC-Exo携带的遗传分子也可以促进软骨修复。王宪峰等构建稳定过表达LncRNA H19的MSC并提取外泌体（H19-Exo），将其用于大鼠骨关节炎模型的治疗，证实高表达LncRNA H19的MSC-Exo通过靶向miR-29b-3p/转化生长因子β1/Smad3通路，促进软骨细胞的增长与再生，修复软骨损伤。 骨折修复是包括血管生成、细胞分化、成软骨合成的再生过程，愈合延迟或不愈合的现象会导致患者需要反复治疗，严重影响患者的生活质量。研究证实，促使MSC对骨骼组织进行再生修复的重要物质之一就是MSC-Exo。李畅等发现BMSC-Exo可以促进愈伤组织中骨形态发生蛋白2、Smad1和Runt相关转录因子2的表达，同时在骨折大鼠模型中，用BMSC-Exo治疗的组别愈伤组织体积明显增大，骨体积分数也显著提高。这表明BMSC-Exo可有效增强成骨作用。Furuta等通过尾静脉输注方式将MSC-Exo分别用于愈合能力障碍的CD9型小鼠和野生型小鼠。结果发现，MSC-Exo在成骨细胞内富集并积累，进而促进成骨细胞的增长，并极大缩减骨修复时间。 OP是常见、多发的骨代谢疾病，主要病征包括骨密度下降和骨组织微结构损伤。研究发现，MSC-Exo可通过介导骨代谢相关信号通路而实现对相关疾病的治疗。田荣华的研究显示，hUCMSC-Exo能促进骨质疏松大鼠成骨细胞的增殖，并呈浓度依赖性。其主要通过hUCMSC-Exo调控骨代谢循环，促进血管生成和成骨转化实现，进而对OP大鼠模型发挥修复作用。研究发现，MSC-Exo富含的多种microRNA能恢复继发性损伤，促进神经元细胞的修复和再生。张美玲等研究发现，注射MSC-Exo的大鼠模型组比注射PBS组的神经元光密度更高，而且信号转导及转录激活蛋白3与生长相关蛋白43的表达量更多，表明MSC-Exo可通过调控该通路促进轴突生长，进而发挥对神经元细胞的修复和再生作用，最终改善损伤大鼠的感觉功能。 2.6 其他疾病 除上述代表性疾病外，MSC-Exo的应用研究还有很多，如可用于创面愈合。皮肤通过对机体形成保护屏障以避免外界有害物质进入体内，当皮肤组织遭受外伤或糖尿病带来的并发症时，皮肤组织会产生不同程度的创伤。研究发现，MSC-Exo可控制胶原纤维在伤口愈合中的分布，减少瘢痕形成的同时加快创面愈合。此外，MSC-Exo包含的miRNA参与调控转化生长因子β信号通路，可诱导肌成纤维细胞分化，同时抑制促炎因子分泌，促进抗炎因子表达，利于创伤修复。 MSC-Exo在糖尿病及其并发症中同样发挥作用，Hu等发现经吡格列酮预处理后的MSC-Exo在高糖环境中可通过调控PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶信号通路进而增强血管再生能力，促进糖尿病足溃疡的创口愈合。还有研究证实，MSC-Exo中的miR-17-5p可激活PTEN/Akt/低氧诱导因子1/血管内皮生长因子信号通路，提高血管内皮生长因子的表达水平进而加快血管生成，修复糖尿病产生的慢性伤口。 除此之外，MSC-Exo还可用于子宫内膜损伤和卵巢相关疾病。Zhang等构建子宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）模型动物以评估MSC-Exo对IUA的治疗效果。结果发现， MSC-Exo能够阻遏TGF-β-Smad信号通路的转录与表达，促进血管生成，从而逆转子宫内膜纤维化。杜小倩等采用卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）大鼠模型腹腔注射hUCMSC-Exo，结果发现，hUCMSC-Exo可依靠改善POF小鼠的3种激素水平来修复大鼠卵巢功能，为POF的无细胞疗法奠定实验基础。 3 展望 MSC-Exo通过MSC旁分泌途径作用于靶细胞，释放内容物将信息传递给靶细胞，调控细胞生物学行为。而其无细胞的“脂筏”结构更赋予了MSC-Exo更高的信息转导效率、稳定性和安全性，同时也更利于储存，这显示出无细胞疗法的巨大发展潜能。目前大量基础研究已证实MSC-Exo能够减轻炎症反应，实现细胞损伤的修复与再生，同时可作为药物载体进行联合治疗，提高药物局部浓度进而增强疗效。而且经过修饰的MSC-Exo载药系统具备更高的靶向能力和更好的生物相容性。因而通过开发设计MSC-Exo载药系统以及对MSC-Exo进行靶向修饰来提高治疗精准性均具有广阔的应用前景。 从Clinicaltrials披露的研究数据可以发现，当前采用无细胞疗法治疗疾病的临床研究仍是空白，缺乏相关的临床试验，MSC-Exo对于各种疾病的治疗研究多处于动物模型试验阶段。这意味着MSC-Exo还未达到商业化制备的条件，相关高效、标准化的制备方法亟待探究，同时缺少合理化、规范化的临床应用标准。选择合适的剂量和最佳给药途径，也是推进MSC-Exo临床治疗应用的难点之一。此外，MSC-Exo在不同疾病治疗中的相关分子机制尚未阐述清晰，治疗过程中的药代动力学和不良反应等问题仍未被解答，未来仍需对MSC-Exo展开深入探索，以便评估其在无细胞疗法中的价值。 作者 孙馨  黄玉香 青岛奥克生物开发有限公司研发部，青岛 266000 通信作者：黄玉香， Email：abmd2003@163.com 引用本文：孙馨, 黄玉香. 间充质干细胞源性外泌体在疾病治疗中的潜在应用研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 260-268.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231115-00018 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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01   引言 本研究中，作者展示了一种结合蛋白质结构骨架坐标的通用蛋白质语言模型，能够在无需针对具体功能任务建模的情况下，引导多种蛋白质的进化。作者还证明了仅在单链结构上训练的ESM-IF1模型可以扩展用于设计蛋白质复合物。利用这种方法，作者筛选了大约30种用于治疗严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染的临床治疗抗体变体。使得逃逸的病毒变异株BQ.1.1和XBB.1.5的中和能力分别提高了25倍和37倍。这些发现突显了整合结构信息的优势，即在无需特定任务训练数据的情况下，识别高效的蛋白质进化路径。   02   为何蛋白质设计（引导蛋白质进化）如此困难？ 蛋白质设计的困难体现在多个方面。首先，虽然蛋白质的序列信息可以提供设计的高级原则，但真正决定蛋白质功能和活性的是其三维结构。其次，随着蛋白质突变的增加，它们会经历相应的结构变化，这些变化影响功能适应性。逐步进化过程中发生的突变可能导致结构不稳定，降低蛋白质的进化能力。绝大多数突变对蛋白质功能是有害的或中性的，只有极少数突变是有益的。所以发现功能上有益的蛋白质突变是非常困难的。此外，结构变化和突变的复杂性减少了进化上可行的路径，使得设计蛋白质容易陷入局部最优解，无法找到全局最优解。设计特定结构的序列（例如逆向折叠）仅考虑蛋白质折叠，不能保证功能蛋白质。许多序列可能折叠成相同的骨架构象，但不一定具备所需功能。突变搜索空间的高维性进一步增加了设计的复杂性。综上所述，蛋白质设计的主要挑战在于找到既能保持结构稳定性，又具备所需功能的突变组合，同时避免陷入局部最优解。   03   结合结构信息的语言模型 作者的模型通过结合结构信息和序列信息，采用逆向折叠任务，利用序列-结构退化，减少因序列变化导致的结构偏离趋势，从而保持蛋白质的稳定性，并在高维突变搜索空间中找到高适应性变体，解决了蛋白质设计的诸多困难。该模型不对具体功能任务进行专门建模，而是通过结构指导的模式探索适应性景观，显著提高了设计效率和成功率。 1. 结合结构信息的语言模型： 作者使用了一种结合结构信息的通用蛋白质语言模型（ESM-IF1），该模型不仅考虑序列信息，还结合了蛋白质的三维结构。这种方法能更好地预测序列与结构之间的关系，从而指导蛋白质设计。 2. 高置信度的折叠预测： 在给定前面的氨基酸序列和整个结构的骨架坐标的情况下，模型能够预测出将以高置信度折叠成目标结构的序列。这提高了设计蛋白质的成功率。 3. 逆向折叠任务： 模型的任务是预测将采用预期目标结构的序列，这与最近强大的结构预测工具（如AlphaFold和ESMFold）的任务相反。通过逆向折叠任务，模型能够找到那些能够保持目标结构的序列。 图a.序列设计问题是指对蛋白质氨基酸序列的三维结构的预测，这在概念上类似于AlphaFold等结构预测工具解决的逆问题 4. 利用序列-结构退化： 作者利用序列-结构退化，通过将探索集中在蛋白质骨架折叠保持的区域间接探索适应性景观（Landscape）。这种方法有助于在高维突变搜索空间中找到高适应性变体。 图b, 一个混合自回归模型（11）整合了氨基酸值和主干结构信息，以评估一个序列中所有位置的联合可能性。从蛋白质序列中提取的氨基酸被标记（红色），结合从结构编码器中提取的几何特征（绿色），并使用编码器-解码器变压器（紫色）建模。 5. 减少结构偏离的趋势： 通过结合结构信息，模型能够减少因序列变化导致的结构偏离，从而保持蛋白质的稳定性，提高进化能力。 6. 没有明确的功能或适应性定义： 模型不对明确的蛋白质功能或适应性定义进行建模，而是通过结构指导的模式来探索适应性景观。这种方法避免了需要为每个具体功能任务进行专门建模的复杂性。 图c, 蛋白质设计结构指导框架间接地探索了潜在的适应度景观，而没有建模特定的适应度定义，或者通过将搜索空间限制在主干折叠保留的区域，需要任何特定任务的训练数据。 7. 应用于抗体设计： 作者证明了该模型在抗体设计中的应用价值。通过将结构信息语言模型应用于整个抗体-抗原复合物，发现能够保留或增强复合物稳定性的突变，从而改进抗体功能。这一方法在临床治疗抗体的开发中具有重要意义。 04   结论 作者评估了将结构信息添加到语言模型中是否能够用于指导蛋白质进化。因此，对于来自四种生物中不同家族的10种蛋白质（其功能范围从酶催化（TPMT）到致癌（HRAS）再到转录调控（GAL4）），作者根据大规模深度突变扫描实验中分析的变体，将其与野生型蛋白的目标骨架进行比对，计算序列的对数似然值。这些预测是在完全无监督的环境下进行的，模型从未经过任何实验数据的训练。为了展示这种方法对实际用户的实用性，即希望找到最有益突变的潜在蛋白质，作者通过将最高评分的变体与其在整个序列适应性景观中的实验确定的功能活性进行比较来评估预测精度。 在前10个预测中，作者在数千个测试的变体中识别出许多高适应性的蛋白质变体，其实验确定的活性在整个深度突变扫描中的前百分位内（图D）。作者的分析表明，利用结构信息可以显著改善蛋白质语言模型的预测能力，在10种蛋白质中，有9种的前5百分位突变被成功预测出来，而仅使用仅基于序列信息的最先进通用蛋白质语言模型（ESM-1v）进行变体预测时，这一数字仅为两种蛋白质，图D）。这种预测改进在放宽高适应性变体分类阈值时同样成立。 图d, )高适应度敏感性分析显示，与仅对来自不同蛋白质家族的10个蛋白质进行输入的序列输入相比，多模态输入提高了语言模型的性能（左图）。“高适应度预测精度”指的是前10个单氨基酸替代预测的一部分，其定义是在所有实验筛选的变异中，活性水平高于指定的百分位阈值。一个具有代表性的图（右）显示了这个评估高适应度MAPK1突变富集的指标。考虑到搜索空间非常达，找到任何功能增强的变体都是很有价值的，所以在实验数据的经验累积密度函数（ECDF）上，只有成功预测的突变才会被突出显示（蓝色）（黑色）。由百分位数定义的三个不同的阈值也显示为虚线。平均而言，对于高适应度分类的各种测试阈值，结构知情语言模型预测结果要更好一些。   05   讨论 由于序列搜索空间庞大以及序列与功能关系的复杂性，发现能改进蛋白质功能的突变非常具有挑战性。作者展示了一种基于逆向折叠的蛋白质语言模型，该模型结合了蛋白质的序列和骨架结构坐标，相较于仅基于序列的深度学习方法。结构引导的方法无需明确建模各个功能任务或属性，即可间接探索蛋白质适应性景观，适用于多种蛋白质。该方法无需实验数据或特定任务监督，显示出加速进化活动的潜力，并有望在多个领域广泛应用。 参考资料：Shanker VR, Bruun TUJ, Hie BL 等。利用结构知情语言模型实现蛋白质和抗体复合物的无监督进化[J]。Science，2024, 385(6704): 46-53。 版权信息 本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号sixiali_fox59)进行删改处理。 本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至sixiali@stonewise.cn 版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。 免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。 往期推荐 乐威医药顺利通过CNAS复评审及扩项评审 中国矿业大学（北京）师生走进乐威医药 乐威医药成功开展“安全生产月”活动