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引言 随着生命科学领域的快速发展，研究人员已经不再仅仅依赖传统的群体样本分析，而是开始深入探索单个细胞的复杂性。单细胞蛋白质组学（Single-Cell Proteomics, SCP）作为一项前沿技术，正在为我们提供前所未有的机会，直接揭示单个细胞内的蛋白质组成和功能状态。这一技术不仅能够揭示细胞在不同生物学过程中的动态变化，还能帮助我们更深入地理解疾病的机制，特别是在癌症、免疫和神经退行性疾病等领域的潜在应用。 然而，单细胞蛋白质组学的广泛应用面临着许多技术挑战，其中最为突出的是分析的灵敏度、样本处理的复杂性以及数据分析的高难度。为了突破这些障碍，研究人员们不断努力优化现有的技术手段，提升单细胞分析的准确性和高通量处理能力。 1月16日Nature Methods的研究报道“Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics”，研究团队提出了一种创新的单细胞蛋白质组学工作流程——“Chip-Tip”方法，显著提高了蛋白质的识别灵敏度和分析的深度。这项技术利用了新型的ProteoCHIP EVO 96芯片进行单细胞样本的高效制备，通过直接转移和清洗步骤，结合Evosep One液相色谱系统和Orbitrap Astral质谱仪，极大提升了样本分析的通量和精确度。研究人员在单个HeLa细胞中成功识别了超过5000种蛋白质，并且能够直接检测到细胞中的翻译后修饰（PTMs），如磷酸化和糖基化，无需进行额外的修饰富集步骤，这一突破为研究细胞的功能提供了更加全面的视角。 此外，研究团队还扩展了该方法的应用，分析了人源诱导多能干细胞（hiPSCs）的分化过程，并识别出了多个细胞谱系特异性的标志物。这项研究不仅推动了单细胞蛋白质组学的技术发展，也为生物医学研究中细胞功能和疾病机制的深入理解奠定了基础。 单细胞蛋白质组学：揭开细胞奥秘的钥匙 单细胞蛋白质组学（Single-Cell Proteomics, SCP）是一项能够深入探索单个细胞内蛋白质组的前沿技术。与传统的群体细胞研究不同，单细胞蛋白质组学为我们提供了一个更精细的视角，让我们能够理解每个细胞在复杂生物体中的独特功能和行为。这项技术不仅为基础生物学研究提供了新的思路，还在癌症、免疫学和神经科学等领域的临床研究中展现出巨大的潜力。通过揭示不同细胞在相同环境下的差异，我们能够更好地理解细胞分化、疾病发展以及药物反应等生命过程。 尽管单细胞蛋白质组学为生命科学研究带来了革命性进展，但其实施过程依然面临着诸多挑战。首先，单细胞中的蛋白质数量极为稀少，这使得传统的蛋白质分析方法往往难以检测到所有的目标蛋白质。在早期的单细胞蛋白质组学研究中，研究人员通常只能识别出几百个蛋白质，且这些蛋白质往往集中在丰度较高的蛋白质上，而低丰度的蛋白质则常常被忽视。这种数据的偏差限制了我们对细胞功能全面了解的能力。 其次，单细胞样本的制备过程非常复杂。细胞裂解、蛋白质提取和消化等步骤都容易引入样本损失，影响最终的分析结果。传统方法中，细胞破裂后的蛋白质可能因表面吸附而丢失，进一步限制了我们对细胞内蛋白质的深度探测。此外，单细胞蛋白质组学还面临着高通量和高灵敏度之间的平衡问题。单个细胞的样本量极其微小，如何在保证高灵敏度的同时，还能进行高通量的分析，成为了科研人员的一大难题。 在数据分析方面，如何从海量的质谱数据中提取出有意义的信息也是一个亟待解决的问题。由于单细胞样本中的蛋白质数量较少，且与多细胞样本相比背景噪音较大，传统的数据处理算法往往无法有效地识别低丰度蛋白质和翻译后修饰（PTMs）。这些技术瓶颈使得单细胞蛋白质组学的应用受到了限制。 “Chip-Tip”方法：突破单细胞分析的技术瓶颈 “Chip-Tip”方法是一种创新的单细胞蛋白质组学分析技术，旨在突破单细胞研究中常见的灵敏度、通量和样本损失等技术瓶颈。该方法通过一系列精细优化的步骤，将细胞样本制备、蛋白质提取与质谱分析有机结合，极大提升了单细胞分析的深度和广度。 这一方法的核心在于ProteoCHIP EVO 96芯片，它能够在微纳体积下高效处理单个细胞。首先，细胞被精确分配到芯片上的小孔内，利用微流控技术进行细胞裂解和蛋白质提取。与传统的处理方法不同，这一过程减少了表面吸附和样本损失，从而保证了最大化的蛋白质提取率和分析深度。经过这一预处理，样本会直接转移到Evosep One液相色谱系统（LC）进行分离，再结合Orbitrap Astral质谱仪（MS）进行高灵敏度的分析。 通过这种无缝衔接的流程，研究人员能够在单细胞水平上获取高质量的蛋白质组数据，识别出更多的蛋白质和翻译后修饰（PTMs）。这一技术的突破不仅增强了分析的灵敏度，还实现了更高的通量，使得研究者能够在一天内处理多达120个单细胞样本，显著提升了数据采集效率。 技术创新：从样本准备到数据分析的革新 “Chip-Tip”方法在技术上具有多个创新亮点，特别是在样本准备和数据分析阶段。首先，ProteoCHIP EVO 96芯片的设计使得单细胞蛋白质样本的制备更加高效和无损。芯片的每个孔能够精确处理1-96个细胞，这意味着在同一实验中，研究人员可以同时处理大量的单细胞样本，减少了实验周期和人工干预的误差。此外，芯片采用纳升级别的微流控技术，能够最大限度地减少样本损失，避免了传统方法中常见的样本吸附和分析误差。 随后，样本会被转移至Evosep One液相色谱系统进行高效分离。在这一过程中，Evosep One利用了Whisper flow技术，通过精确控制流速和温度，确保了分离过程的高效性和准确性。与传统的液相色谱系统相比，Evosep One系统在处理单细胞样本时显示出更高的灵敏度和分辨率，从而可以识别更多的低丰度蛋白质。 最后，质谱分析阶段采用的是Orbitrap Astral质谱仪，它结合了最新的nDIA技术，通过优化的扫描模式和高精度的离子捕获方法，使得在单细胞蛋白质组学分析中取得了前所未有的深度和灵敏度。研究表明，使用这一系统，研究人员能够在单个HeLa细胞中识别出超过5000种蛋白质，且这些蛋白质的序列覆盖率和丰度范围均表现出极高的一致性和准确性。 Chip-Tip SCP工作流程与结果（Credit: Nature Methods） a. Chip-Tip工作流程示意图：展示了Chip-Tip方法的总体流程，包括单细胞样本的处理、ProteoCHIP EVO 96芯片用于细胞裂解和蛋白质提取、样本通过Evosep One液相色谱系统分离后进行Orbitrap Astral质谱分析等步骤。通过这一流程，研究人员能够高效地识别和量化单细胞中的蛋白质。 b. 不同细胞数量下识别的蛋白质数量：展示了在单个、10个、20个和40个HeLa细胞样本中，使用不同的nDIA（narrow-window data-independent acquisition）设置时所识别的蛋白质数量。数据显示，随着细胞数量的增加，识别的蛋白质数量呈显著上升趋势，单细胞样本中识别到约5204个蛋白质，而20个细胞样本中识别到超过7000个蛋白质。 c. 不同细胞数量下识别的肽段数量：展示了在单细胞、10个、20个和40个细胞样本中，使用nDIA设置时识别的肽段数量。数据显示，细胞数量的增加同样导致肽段数量的增加，单细胞样本中识别到约41,700个肽段，20个细胞样本中则增加到98,054个肽段。 d. 蛋白质序列覆盖率：展示了单细胞、10个细胞和20个细胞样本中的蛋白质序列覆盖率。数据表明，随着样本细胞数的增加，蛋白质的序列覆盖率也有所提升，20个细胞样本的序列覆盖率达到了25%。 e. iBAQ值分布：iBAQ（intensity-based absolute quantification）值反映了蛋白质定量范围及一致性，该部分展示了不同细胞数量下蛋白质的定量范围。结果显示，不同细胞数量样本中的蛋白质定量值在iBAQ范围内表现出较好的一致性，验证了方法的可靠性。 f. 蛋白质在细胞不同部位的定位：展示了所识别蛋白质在细胞内各个亚细胞区室的定位分布。研究发现，超过200种蛋白质定位于细胞膜，显示了该方法在蛋白质组学分析中的全面性和准确性。 高灵敏度与高通量：如何实现蛋白质的深度分析 蛋白质识别：从单个细胞到20个细胞的蛋白质量化 在单细胞蛋白质组学中，蛋白质的精确识别一直是一个难题，尤其是在蛋白质丰度较低的情况下。传统方法常常无法有效捕捉到这些低丰度蛋白质，导致蛋白质组覆盖度较低。然而，通过“Chip-Tip”方法，研究人员突破了这一瓶颈，实现了从单个细胞到20个细胞的高效蛋白质识别。 研究数据显示，使用这一技术，单个HeLa细胞中能够识别出超过5000种蛋白质，而在20个细胞的样本中，蛋白质识别数量超过了7000种。这一突破显示，随着细胞数目的增加，蛋白质的识别数量呈现出明显的增长，且随着样本量的扩大，蛋白质的多样性得到了显著提升。 此外，通过使用nDIA（narrow-window data-independent acquisition）质谱扫描模式，研究人员能够在每个细胞中实现对蛋白质的深度挖掘，确保了即使是低丰度的蛋白质也能被准确捕捉。这不仅提高了蛋白质组的识别数量，还为进一步的功能分析和疾病机制研究提供了更多数据支持。 高深度蛋白质组学：如何在单细胞分析中实现前所未有的灵敏度 “Chip-Tip”方法的核心优势之一便是其在深度分析方面的卓越表现。研究表明，通过这一方法，单个细胞的蛋白质组覆盖度达到了前所未有的深度。具体来说，在单细胞样本中，研究人员能够获得超过41,000个肽段的标定数据，这使得对每个蛋白质的分析更加全面和精准。尤其是在低丰度蛋白质的检测方面，这一技术展现了无与伦比的灵敏度。 例如，在磷酸化修饰分析中，研究人员在单个细胞中直接识别出了超过120个磷酸化位点，涵盖了包括丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）在内的多个关键磷酸化位点。这一发现表明，单细胞蛋白质组学不仅能提供蛋白质识别的数据，还能够深入探测细胞内的翻译后修饰（PTMs），进而揭示细胞在不同生物过程中的功能状态。这种深度的分析能力在传统方法中是难以实现的，尤其是在无需额外富集步骤的情况下，仍能准确捕捉到翻译后修饰的信息。 此外，随着样本量的增加，蛋白质组的覆盖率也有了显著提升。在20个细胞样本中，研究人员能够识别出高达98,000个肽段，极大提高了数据的可靠性和深度。这一高深度的分析为研究人员提供了更加丰富的细胞内信息，帮助他们更好地理解细胞的生物学功能以及疾病的分子机制。 直接揭示翻译后修饰（PTMs）：一个革命性的突破 磷酸化与糖基化：无需额外富集步骤的检测 翻译后修饰（Post-translational Modifications, PTMs）是蛋白质功能调控的关键机制，涉及磷酸化、糖基化、乙酰化等多种化学修饰。磷酸化和糖基化是细胞内两种最为常见且功能至关重要的翻译后修饰。磷酸化调控着蛋白质的活性、稳定性、位置以及与其他分子的相互作用，而糖基化则在细胞信号传导、免疫反应和细胞通讯中发挥着重要作用。 传统的PTM分析方法通常需要对样本进行特定的富集步骤，以便检测这些低丰度的修饰位点。例如，磷酸化通常需要通过磷酸化抗体进行富集，糖基化则通过特定的糖基化抗体或化学标签进行富集。然而，这些步骤不仅增加了实验的复杂性，还可能导致某些低丰度修饰的丢失。 “Chip-Tip”方法的创新之处在于，它能够直接在单细胞样本中进行PTMs分析，无需任何额外的富集步骤。通过这种方法，研究人员能够更高效地识别细胞中的磷酸化和糖基化位点，且在无需繁琐富集的情况下，依然能够获得高质量的数据。这为PTM研究开辟了新的方向，使得我们能够更全面、准确地了解翻译后修饰对细胞功能的调控。 如何在单细胞中直接识别翻译后修饰 “Chip-Tip”方法的引入，使得在单细胞层面上对磷酸化和糖基化的识别变得更加直接和精确。研究人员在单个细胞样本中，利用这一技术成功识别了多个关键的磷酸化位点，包括丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）的磷酸化修饰。通过无富集的直接分析，研究人员在单细胞中识别到了约120个磷酸化位点，其中包括来自不同激酶家族的蛋白质，如CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶1）和MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）等。 特别地，在糖基化修饰的识别上，研究人员在单细胞样本中直接检测到多种糖基化相关的糖基转移酶和糖基化位点。这一发现表明，“Chip-Tip”方法能够在单细胞分析中同时揭示磷酸化和糖基化等多种翻译后修饰，并且其覆盖面广泛，深度足够，使得细胞内的复杂调控机制得以全貌呈现。 以磷酸化为例，研究团队通过提取质谱数据中的特定离子，准确识别了位于不同蛋白质中的磷酸化位点，极大提升了磷酸化分析的深度和精确度。糖基化修饰的分析同样展现出巨大的优势，研究人员通过扫描特定的醣基离子（如HexNAc、NeuAc等）成功识别出细胞内多种糖基化类型，揭示了细胞内复杂的糖基化网络。 这一研究成果展示了“Chip-Tip”方法的强大能力，不仅使得PTMs分析变得更加高效和精准，也为我们深入了解细胞内的调控机制提供了新的视角。 从基础研究到临床应用：单细胞蛋白质组学的广泛潜力 单细胞分析在癌症和疾病研究中的应用 单细胞蛋白质组学（SCP）的引入为癌症和多种疾病的研究提供了全新的视角。癌症细胞的异质性使得传统的群体细胞研究方法难以全面揭示癌症发展和治疗的复杂机制。而通过单细胞分析，研究人员能够揭示不同癌细胞之间的功能差异，了解癌症在不同阶段的分子特征，进而为精准医疗的制定提供关键的数据支持。 在该研究中，研究人员通过“Chip-Tip”方法分析了癌细胞在5-氟尿嘧啶（5-FU）治疗中的反应。在处理后的肿瘤球样本中，研究人员发现，5-FU的作用不仅显著影响了细胞的结构完整性，还改变了肿瘤细胞中的多个关键蛋白质的表达。尤其是在细胞周期调控、核糖体合成及嘧啶代谢等重要生物过程中的变化，揭示了5-FU通过改变这些机制来抑制肿瘤生长。此外，研究团队还通过数据挖掘发现了肿瘤细胞对治疗的不同反应，这些发现为未来癌症治疗的靶向药物设计提供了重要依据。 单细胞蛋白质组学的应用还扩展到了其他疾病的研究中，尤其是在神经退行性疾病和免疫疾病的研究中。通过对单个免疫细胞或神经元的蛋白质分析，研究人员能够深入了解免疫反应或神经退行性病变的分子机制，为新的治疗策略的开发提供了关键的分子靶标。 从干细胞分化到癌细胞反应 除了癌症和疾病研究外，单细胞蛋白质组学还在干细胞研究中展现了巨大的应用潜力。在该研究中，研究人员采用了“Chip-Tip”方法分析了人源诱导多能干细胞（hiPSCs）在不同分化状态下的蛋白质组特征。研究人员不仅在hiPSCs中成功识别了超过4700种蛋白质，还在分化过程中成功检测到多个谱系特异性标志物，如GATA4（内胚层）、HAND1（中胚层）和MAP2（外胚层），这些蛋白质的变化为研究细胞分化提供了新的分子依据。 特别是在EBs细胞的分析中，研究人员发现，不同分化阶段的细胞展现出截然不同的蛋白质表达特征，且这种差异与特定基因的激活及细胞功能的改变密切相关。这些发现不仅加深了我们对干细胞分化的理解，还为干细胞相关疾病的治疗提供了新的研究方向。 此外，研究人员还通过分析癌细胞与干细胞的对比，展示了“Chip-Tip”方法在癌细胞反应分析中的强大能力。例如，在研究细胞暴露于抗癌药物的反应时，研究人员能够在单细胞水平上揭示药物作用后的蛋白质变化，这为精准药物筛选和个性化治疗方案的制定提供了重要参考。 未来：技术发展的方向与挑战 技术整合：单细胞蛋白质组学与其他“组学”的结合 随着单细胞技术的不断进步，单细胞蛋白质组学（SCP）与其他组学技术的结合正在推动生物学研究进入一个新的时代。单细胞RNA组学、单细胞基因组学和单细胞表观组学的整合，使得我们可以从多个维度全面解析单个细胞的功能状态。通过将这些技术结合，研究人员能够不仅仅了解细胞的基因表达，还能深入到蛋白质的功能调控和翻译后修饰等层面，从而获得更全面的细胞功能图谱。 例如，结合单细胞RNA测序和蛋白质组学，可以对转录和翻译层次进行对比分析，揭示mRNA水平和蛋白质水平之间的关联，进一步理解基因表达的复杂性和翻译后修饰的调控作用。此外，单细胞基因组学的结合使得研究人员能够探索单细胞的遗传变异及其如何影响蛋白质功能，尤其是在癌症研究中，基因突变与蛋白质变化之间的关系对于肿瘤异质性和抗药性机制的理解具有重要意义。 在未来，通过多组学技术的结合，研究人员将能够更精确地描绘细胞内外的复杂相互作用，推动精准医学和个性化治疗的发展。这种整合不仅提高了单细胞分析的深度，也为探索复杂生物现象提供了强有力的工具。 面临的挑战与未来的方向 尽管单细胞蛋白质组学在技术和应用上取得了显著进展，但它仍面临着许多挑战。首先，当前技术在样本处理和数据分析方面仍有一定的局限性。单细胞样本的处理和蛋白质提取过程需要极高的精度，且由于细胞本身的微小尺寸和低丰度蛋白质的存在，任何微小的误差都可能导致数据的丢失或偏差。尽管“Chip-Tip”方法通过精确的芯片技术减少了样本损失，但如何进一步优化样本制备流程、减少背景噪声和提高分析的准确性，仍然是未来研究的重点。 其次，数据分析是另一个亟待突破的领域。单细胞蛋白质组学的数据量巨大，如何从海量的质谱数据中提取出高质量的信息，尤其是在低丰度蛋白质和翻译后修饰的检测方面，需要更加先进的算法和计算工具。随着数据分析技术的不断提升，机器学习和人工智能的引入可能会成为解决这一问题的关键，通过智能化的算法提高数据处理的效率和准确性。 此外，单细胞分析的通量问题仍然是制约其广泛应用的瓶颈之一。尽管当前技术已能处理大量样本，但如何进一步提高样本处理的速度和规模，使得单细胞分析能够在临床诊断和大规模筛查中得到应用，仍然需要更多的技术创新。 未来，单细胞蛋白质组学将继续发展，在技术创新和多组学整合的推动下，逐步克服这些挑战。未来的研究方向可能会集中在提高分析的灵敏度、提升样本通量以及开发更高效的数据分析方法上。随着这些问题的解决，单细胞蛋白质组学无疑将在精准医学、疾病早期诊断和治疗靶点的发现等领域发挥越来越重要的作用。 参考文献 Ye Z, Sabatier P, van der Hoeven L, Lechner MY, Phlairaharn T, Guzman UH, Liu Z, Huang H, Huang M, Li X, Hartlmayr D, Izaguirre F, Seth A, Joshi HJ, Rodin S, Grinnemo KH, Hørning OB, Bekker-Jensen DB, Bache N, Olsen JV. Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics. Nat Methods. 2025 Jan 16. doi: 10.1038/s41592-024-02558-2. Epub ahead of print. PMID: 39820750. 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ End 往期精选 围观 Science | 免疫系统如何挑选抗体中的“尖兵”? 热文 Nature Aging | 衰老可以被逆转吗？从血液标志物揭示抗衰老的可能性 热文 Cell | 肠道微生物如何影响肺部健康？“肠-肺轴”的免疫调控奥秘 热文 Cell | 突破感官边界：触觉与听觉信号整合的全新发现 热文 Nature Aging | 抗衰老的新方向：GD3能否成为治疗突破口？

综述 药物基本生命周期是从发现阶段到临床前开发再到临床试验，最终获得监管部门批准和商业化生产。 可开发性是指候选药物成为可生产、安全、有效的药物的可能性。尽管候选药物的安全性和有效性会受到申办方和监管机构的充分考虑，但狭义的可开发性可以定义为抗体候选药物以合理的成本和在合理的时间内顺利通过化学、生产和控制过程的可能性。 分享一篇综述，详细介绍了抗体药物 (包括单抗，双抗和ADC) 的可开发性，并对抗体药物的物理化学性质和决定可开发性的关键属性进行了全面总结。 图 1. 影响可开发性评估的关键因素。可开发性的四个关键属性 (同质性、稳定性、溶解性和特异性) 由抗体结构和改变决定，这些属性和抗体候选物的用途用于确定可开发性标准 抗体药物发现和开发的一般过程 抗体发现和开发过程包括图2所示的几个步骤。 靶标评估：靶标或与疾病相关途径的评估和确定； 抗体生成：基于靶标信息使用体内免疫、体外展示、B细胞选择或多种技术组合来生成一组抗体； 抗体筛选：从数百到数千种靶标结合抗体开始，可以使用几个筛选步骤来缩小有希望的抗体的范围，即识别有适当亲和力、特异性和功能性的抗体。 抗体改造：筛选出来的抗体可以通过亲和力成熟、人源化、Fc工程和其他过程进一步优化或改造。 ADC和BsAb：如果抗体在与细胞上的靶标结合后可以被内化，那么该抗体可以与有效载荷结合以制成ADC。BsAbs候选物的筛选和设计过程与mAb类似，BsAbs候选物可以从对合适的mAb对进行原始筛选中产生，也可以在确定一对mAb后对其进行改造 (图3)。 确定临床前候选药物：一旦抗体被确定为临床前候选药物，就会开发一种细胞系来稳定表达该抗体，并开发一系列纯化步骤。 毒理学研究：在临床前开发期间，抗体可能会在猴子或其他相关物种中进行毒理学研究测试。国际协调会议 (ICH) 指南 (S6R1) 建议“应选择剂量水平来提供有关剂量反应关系的信息，包括毒性剂量和未观察到不良反应水平 (NOAEL)”。在毒理学研究中选择高剂量水平来指导临床使用是常见的，有时也是必要的。 图 2. 从靶点评估到IND申请的不同阶段对可开发性相关的考虑 图 3. IgG mAb的结构和bsAbs或msAbs的基本构建模块。IgG mAb (PDB代码5DK3) 的结构是使用PyMol创建的，BsAbs或msAbs可以由五个抗原结合域组装而成：VHH, Fv, scFv, Fab和scFab，这五个构建块也可以与异二聚体或同二聚体Fc组装以形成含有Fc的bsAbs或msAb，Fc域中的红色标记表示促进异二聚化的突变 发现和开发阶段可开发性评估的差异 药物发现阶段的可开发性评估与化学、制造和控制 (CMC) 阶段的可开发性研究不同 (图4)，在发现和CMC阶段用于可开发性评估的测试组合列于图5。 在发现阶段，重要的是确定具有目标产品特征的治疗分子 (通常基于该潜在治疗剂的临床用途)。发现阶段的评估旨在使用快速和高通量方法识别潜在的可开发性风险。在早期发现阶段，可以通过可开发性相关分析比较几种具有相似生物功能的抗体候选物，通常会选择一两种可开发性可接受的抗体进入CMC阶段。即使在发现阶段仅确定了一种功能最佳的抗体，仍需要评估其可开发性并可能进行优化。在发现阶段设计抗体的成本明显低于在开发阶段优化工艺和处方的成本。抗体的理化性质不良可能会影响其在体内外的生物学功能。如果在发现阶段发现抗体存在可开发性问题，可以通过蛋白质工程进行修复。例如，删除mAb CDR结构域中的两个疏水残基可显著降低其沉淀趋势。先导分子的关键质量属性 (CQA) 将被进一步评估，以在CMC阶段建立目标产品的质量特征。 在CMC开发阶段，进行可开发性研究是为了获得足够的材料以及合理的工艺和处方以供临床前和临床使用。该研究通常很全面且耗时，并且需要大量 (数百毫克到几克) 的测试材料，这些材料通常来自稳定的细胞系或稳定转染池。可以通过用聚乙二醇沉淀法筛选不同pH值的不同缓冲液 (例如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液) 来确定溶解度最高的缓冲液来开始，还可以通过筛选含有合适赋形剂 (例如蔗糖和聚山梨醇酯80) 的缓冲液来进一步评估溶解度。然后在每种处方下将抗体溶解至最高浓度并储存在2-8°C，在不同的时间间隔采集样品，确定其外观、浓度和尺寸排阻色谱 (SEC) 曲线，并将结果与T0进行比较。研究的这一部分可以作为预配方筛选。然后，可以在应力条件下使用选定缓冲液中的样品与目标浓度的赋形剂进行可开发性研究。通常使用一组测试来评估候选物的可开发性 (图5)，包括一般测试方法和压力条件下的稳定性研究 (例如暴露于高温、低或高pH、光、氧化试剂和冻融)。 生物药候选物的可开发性极大地影响了其从发现到临床开发和商业化的速度、成本和成功率。随着现代生物技术的进步和经验的积累，应在发现早期就对可开发性进行评估，以降低此类次优药物的开发风险。 图 4. 发现和开发阶段的不同目的和测试 图 5. 在发现和CMC阶段用于可开发性评估的测试组合. (A) 在发现和CMC阶段通常用于可开发性评估的分析方法； (B) 在发现和CMC阶段典型的强制应力研究计划；a. 在发现阶段，低pH用于Asp异构化敏感性测试，而高pH用于脱酰胺敏感性测试；b. 在25°C下进行0.05%和1% H2O2氧化处理；c. 低pH3.5孵育和高pH9.0孵育；d. 3或5次冷冻 (在-70°C下) 和解冻 (在25°C下) 循环；e. 将抗体暴露在5000 lx的强光下4小时和24小时；f. 在 2-8°C, 25°C和40°C下进行热应力测试 发现阶段中与可开发性相关的考虑和评估 图6总结了美国、欧洲、日本和中国的机构批准的129种抗体药物的浓度和给药途径。通过分析这些已获批的抗体药物可以得出，不同项目的可开发性标准可能有所不同，这取决于抗体药物治疗的疾病适应症以及抗体药物可能的剂量和给药途径。 这里作者概述了不同发现阶段与可开发性相关的考虑因素，并提出了一些评估可开发性相关属性的检测方法 (图2)。 在靶标评估阶段：作者建议考虑治疗性抗体的可能临床用途。例如用于眼科适应症的治疗性抗体通常以小剂量玻璃体内注射，因此抗体候选物需要具有高浓度，高溶解性和低粘度。 在抗体生成阶段：通常通过抗原结合活性和生物学功能筛选抗体候选物。在此阶段应检查外观、表达水平、产量、纯度以及与靶标同源物的结合。在整个抗体生产和使用过程中，包括细胞培养、培养上清液的收集、纯化、浓缩、储存、冻融和稀释至检测缓冲液，都应观察抗体的外观。发现颗粒、聚集体、低表达、低纯度或与同源物结合可能是可开发性问题的警告信号。 在抗体优化阶段：mAb通常会进一步设计以满足项目的要求，例如人源化、亲和力成熟、Fc工程等。在此阶段，除了监测外观、表达水平和纯度外，还应去除具有高风险的PTM热点并进行热稳定性测试。应去除高风险基序，包括NG/NS/DG基序、额外的Cys残基和可变区上的N-糖基化基序，以减轻对功效和安全性的潜在风险。 对于ADC：当mAb通过接头与有效载荷结合形成ADC时，有效载荷、接头和结合可能会改变mAb的构象。有效载荷的疏水性和不均匀的电荷分布可能会引发ADC的聚集。因此，在偶联后需要检测ADC的纯度、产量和药物抗体比 (DAR)。还应检测ADC在几次冻融循环后的稳定性，可以检查ADC的血清稳定性以测量从 ADC 中裂解的有效载荷的百分比。 对于BsAb：bsAb通常由一对针对不同靶标的亲本抗体组装而成，由于亲本抗体可变区的物理化学性质将转移到bsAb，因此强烈建议在构建和优化bsAb之前评估亲本抗体并在必要时对其进行优化。还应检查BsAbs的外观、表达、纯度、热稳定性等。还应进行计算机模拟分析，以避免在设计BsAbs时引入PTM热点。 如何应对具有潜在可开发性风险的抗体候选物？ 前期测试：可以在不同的处方缓冲液中测试具有轻微可见颗粒或沉淀物的抗体分子； 序列优化：对于具有严重可开发性风险的抗体，例如具有连续聚集、稳定性差、意外低溶解度或显著非特异性结合的分子，有必要重新设计和优化抗体序列。序列优化后应重新评估所有可开发性属性，如果仍发现危险信号，则需要进一步优化。 强制应力研究：如果在不改变抗原结合的情况下无法去除PTM热点，则应进行强制应力研究以评估潜在风险 (图5B)。 图 6. 根据疾病适应症 (A) 和给药途径 (B) 划分的获批抗体浓度：数据分析包括美国、欧洲、中国和日本机构批准的129种抗体，不包括生物仿制药或已撤回的产品。(A) 根据疾病适应症分组的获批抗体浓度，箱线图中显示了每种适应症的浓度以及中位数 (中心线) 和四分位距 (25%和75%) 范围；(B) 根据给药途径划分的获批抗体浓度，显示了IV和SC注射的浓度以及中位数 (中心线)， IV, 静脉内; SC, 皮下; IVI, 玻璃体内; IM, 肌肉内 决定抗体可开发性的内在特性 为了分析和优化可开发性相关属性，例如抗体衍生候选物的同质性、稳定性、溶解性和特异性，有必要了解影响抗体可开发性的抗体的内在特性，包括其多肽折叠、电荷分布和疏水性 (图1)。 1. 同质性 由于抗体是由活细胞制成的，因此抗体衍生药物不可能像化学合成的小分子药物那样均质。 ICH指南 (Q6B) 建议应将制造工艺相关杂质和一些产品相关杂质降低到可接受的水平。制造工艺相关杂质包括细胞底物 (例如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA)、细胞培养成分 (例如诱导剂、抗生素或培养基成分) 和下游加工底物；产品相关杂质 (例如前体、某些降解产物) 是在制造和/或储存过程中产生的分子变体，其在活性、功效和安全性方面不具备与所需产品相当的属性。在发现阶段，产品相关杂质是评估和优化可开发性的主要关注点。 1.1 未配对、缺失或错配的链 未配对或缺失的轻链是mAb和bsAb制剂中常见的异质性。通常，缺失轻链的抗体的大小、电荷或疏水性/亲水性与完整抗体不同，这种差异可用于纯化完整抗体产品。 BsAb错配：单细胞中可能存在两种HC和两种LC，因此IgG样bsAb可能组成错配的HC-LC或HC-HC。防止bsAb产品错配是一项特殊的挑战，knobs-into-holes和WuXiBody等是尝试提高同质性的bsAb形式。当表达和组装不对称IgG样bsAb 时，有可能形成同二聚体而不是异二聚体，需要评估正确组装的bsAb和错配副产物的百分比。 副产物去除：不良bsAb的特异性副产物 (如聚集体和碎片) 一般采用下游纯化工艺去除，如基于亲和力、电荷、尺寸、疏水性和混合模式。 1.2 切割 抗体的切割可能发生在N/C端，铰链区或恒定区。 信号肽的切割：信号肽酶识别的特定切割位点需要满足A-X-B规则，其中A和B位置的残基通常是小的中性氨基酸，例如Ala, Gly和Ser。虽然抗体中剩余的信号肽对抗原结合没有影响，但截断的抗体变体可能会影响抗体的功效和生物活性。准确和特异性地切割信号肽对于制造完整和均质的产品至关重要，工程化信号肽序列或成熟蛋白质的N端氨基酸可用于精确切割信号肽。 肽键切割：肽键切割可以发生在抗体的铰链区和恒定区。与抗体的其他部分相比，铰链区具有高度灵活性并且暴露于溶剂中。肽键切割 (无论是酶切还是化学切割) 主要发生在铰链区和CH2-CH3界面，产生不同大小的片段。切割敏感性与铰链区的长度和灵活性有关。研究发现，IgG1比IgG2和IgG4更容易受到切割过程的影响。铰链切割可能对二价结合、Fc效应功能和新生儿Fc受体 (FcRn) 功能产生负面影响，导致疗效下降和清除速度加快。因此，铰链切割对抗体效力的影响应根据抗体的作用机制进行评估。恒定区中的裂解位点通常位于环或域-域界面处 。高温或酸性或碱性pH可加速裂解速度，恒定区裂解可能会影响Fc介导的效应功能或FcRn相关的药代动力学 (PK) 特征。IgG HC以Lys终止，在细胞加工过程中易被羧肽酶剪切，从而产生电荷异质性。鉴于C端赖氨酸远离抗体的功能部分，C端异质性一般不会影响mAb的结构、热稳定性、抗原结合、效力或PK。 1.3 修饰 修饰可发生在抗体药物制造过程的任何阶段，甚至在给药后。常见的修饰包括Cys相关修饰、脱氨、异构化、氧化和糖基化。这些修饰可能导致抗体的大小或电荷异质性，也可能影响抗体的稳定性、安全性和有效性。在发现阶段可以对一些容易发生修饰的热点通过蛋白质工程方法去除。 半胱氨酸相关修饰：Cys残基通常参与链内或链间二硫键的形成，以支持抗体的结构完整性。每个IgG含有12个链内二硫键、两个连接LC和HC的链间二硫键以及HC铰链区中不同数量的链间二硫键，见历史推送文献分享：IgG分子中二硫键的结构和功能。碱性环境可促进二硫键混乱，并可能导致IgG抗体中链间二硫键的重新配置，特别是IgG2和IgG4亚类。许多IgG分子中二硫键形成不完整，并且已证明会降低抗原结合亲和力和效力。带有额外半胱氨酸的抗体 (尤其是在CDR区) 可以半胱氨酸化，半胱氨酸化可能会扰乱抗体的结构稳定性，增加聚集，并最终对分子的生物功能产生不利影响。建议通过计算机分析识别额外的半胱氨酸，并将半胱氨酸突变为其他残基，以防止异质性和效力或稳定性丧失的风险。另外，硫原子插入二硫键形成的三硫键也可出现在所有同种型的IgG中，具有三硫键的抗体的分子量增加32Da，并产生相对酸性的变体。 N端修饰：Gln/Glu环化是一种主要的N端修饰，对抗体的结构、稳定性和功能没有显著影响。 Asn脱酰胺：Asn脱酰胺广泛发生在CDR或Fc区，每次Asn脱酰胺都会给抗体增加一个负电荷，并使抗体的质量增加1Da。Fc区的Asn脱酰胺对抗原结合没有影响，在发现阶段不需要担心。然而CDR中的Asn脱酰胺可能会降低抗原结合亲和力，导致效力和疗效的丧失。脱酰胺速率取决于pH、Asn之后残基的大小和灵活性、温度和抗体的三级结构。pH8.0下的脱酰胺速率几乎比pH5.5下的脱酰胺速率快40倍，脱酰胺引起的电荷异质性也可能影响抗体的稳定性和粘度。CDR上的Asn-Gly (NG)和Asn-Ser (NS)基序比其他基序更容易脱酰胺，并可能通过蛋白质工程将其去除。 Asp异构化：Asp异构化将甲基引入肽骨架，这可能会改变抗体的结构，当异构化发生在CDR中时会损害其抗原结合亲和力。Asp异构化可能会改变分子对蛋白水解的敏感性，并可能引发免疫原性。异构化率与Asp后残基的大小和灵活性、pH和温度密切相关。在发现阶段，需要识别抗体候选物的CDR中的Asp-Gly (DG)和Asp-Ser (DS)基序，并尝试在不改变抗原结合的情况下去除该基序。 糖基化：寡糖可以引入Asn以生成N连接糖基形式，或引入Ser，Thr或Tyr的羟基以生成O连接糖基形式。糖基化可以是异质性的，从而改变抗体的大小、功能性和半衰期。在发现阶段，通常关注N连接糖基化基序，而O连接糖基化基序尚未确定。人IgG在Fc区的Asn297处具有保守的N糖基化位点，该位点参与效应功能，例如抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性 (CDC) 和抗体依赖性细胞吞噬作用，并可能通过与FcRn结合影响抗体的半衰期。约20%的人IgG在可变区含有 N-糖基化共识NXS/T基序，这可能会影响抗体与抗原的结合亲和力。在抗体发现阶段，去除可变区的N-糖基化位点是一种普遍的做法。 氧化：氧化主要发生在Met和Trp残基上，当它们暴露于光、与氧化剂一起孵育或长时间储存时发生。Fc区中两个保守的Met残基 (M252和M428) 的氧化对抗原结合没有影响，但可能降低热稳定性、诱导聚集、降低CDC活性、降低与FcRn的结合并缩短体内半衰期。相反，Trp残基通常存在于抗体CDR区并通常暴露于溶剂。CDR中Trp的氧化可能导致抗体的抗原结合和效力降低。应评估CDR中Trp对氧化的敏感性并开发适当的处方。 1.4 聚集 聚集是治疗性抗体生产的 CQA 之一。蛋白质聚集的主要机制包括天然单体的结合、构象改变的单体的聚集、化学修饰的单体的聚集、成核控制的聚集和表面诱导的聚集。抗体聚集可能导致抗体候选物的免疫原性潜力增加和生物功能下降。 内在因素：抗体的聚集倾向主要与折叠稳定性和表面的疏水性有关。具体而言，抗体聚集主要是由于蛋白质部分或短暂展开导致CDR或框架区中疏水区的分子间相互作用。上述CDR中Trp的氧化和额外半胱氨酸的修饰也可能导致聚集倾向增加。 外在因素：一些外在因素可能会诱导或减少抗体聚集。抗体候选物的聚集可以在低pH值、超滤/浓缩步骤、物理应力、冻融循环后、与容器相互作用或长期储存后加速。 稳定剂：赋形剂可以充当一般的蛋白质稳定剂。蔗糖可以通过将蛋白质推向紧凑的天然状态来稳定蛋白质；盐和缓冲液可以通过“盐析”蛋白质来最大限度地减少暴露于溶剂的蛋白质表面积；一些缓冲分子 (磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液) 与IgG的Fc域之间特定相互作用与热变性IgG的聚集倾向有关。 对称型BsAbs：聚集可能是具有延长链的对称bsAbs的主要问题。链延长增加了bsAbs的灵活性和不均匀的电荷分布，并增强了分子内和分子间的相互作用，从而导致聚集。 2. 稳定性 稳定性是发现和开发治疗性抗体候选物的关键因素，包括热稳定性、光敏稳定性、pH敏感稳定性、物理应力相关稳定性和冻融稳定性等。 热稳定性：蛋白质的热稳定性与氢键数量和极性表面积分数呈正相关。在发现阶段添加氢键和二硫键通常用于提高抗体的热稳定性。 光敏稳定性：在生物制剂的制造过程中，抗体不可避免地会受到光照。光照可诱导多种氨基酸残基的氧化，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸，可能导致mAb液体制剂表现出溶液颜色变化、氧化、聚集、碎裂和生物活性丧失。在制造和储存区域安装安全灯可以在操作人员的安全和产品质量的保护之间取得平衡。 pH敏感稳定性：低pH可诱导抗体裂解和修饰，并增加聚集倾向。 物理应力稳定性：在制造、运输和最终给药过程中，抗体会受到物理应力，例如剪切、搅拌和搅动，可能导致物理和化学不稳定。暴露于气液界面可能会导致抗体展开，蛋白质展开产生的泡沫会影响气液界面的性质和蛋白质聚集。pH值和离子强度是处方筛选以控制抗体产品展开和聚集的两个主要因素。各种表面活性剂已被用于最大限度地减少搅拌和表面诱导的聚集。 冻融稳定性：冻融会对抗体造成压力，例如，产生冰液界面、相变、pH变化以及溶质分布和浓度的变化。当抗体溶液被冷冻时，水分子从蛋白质表面被去除，导致蛋白质表面周围的水化壳被破坏，抗体的三维结构被破坏。同时，由于液液相分离和未冷冻溶质的分配，溶质 (盐，赋形剂，抗体等) 的浓度可能会增加几倍，产生结晶或沉淀，或pH变化，最终损害蛋白质的稳定性。一些蛋白质在低温下由于静电和疏水相互作用减弱而容易展开。此外，随着冰的形成，蛋白质可以直接与冰表面相互作用，从而扰乱抗体的天然结构并导致蛋白质变性。制剂缓冲液的组成、冻融速率、冻融循环次数和抗体浓度都会影响冻融过程中抗体的稳定性。例如，表面活性剂 (如聚山梨醇酯80) 可作为冷冻保护剂，通过防止或减少冰液界面处蛋白质的展开来稳定抗体。 3. 溶解度和粘度 溶解度与抗体的自身相互作用呈负相关。抗体自身相互作用是由疏水效应、范德华相互作用、水合力和静电相互作用引起的，这些相互作用是由抗体的三维结构和溶液的性质决定。 影响因素：溶解度是评估可开发性的重要参数。易聚集区域、不对称带电斑块、构象变化和抗体的化学修饰可显著影响抗体的溶解度。溶解度还与缓冲液处方 (缓冲液组成，pH，温度，盐浓度和赋形剂)、抗体粘度和相分离有关，低溶解度通常导致高粘度、脱靶结合和快速清除。 皮下注射：由于皮下注射的体积有限 (通常小于2毫升)，因此需要高浓度产品。除了良好的溶解性外，药物生产和患者使用还需要低粘度。 4. 特异性 抗体的抗原结合位点包含三个 (对于VHH) 或六个 (对于Fab) CDR环，它们可以通过非共价相互作用 (主要通过氢键、疏水相互作用、范德华力和静电相互作用) 与特定抗原表位结合，这些多重非共价相互作用可在抗体和抗原之间提供相对较强的结合。 非特异性结合：经过良好表征的治疗性抗体应该对单个靶标具有极高的特异性。然而，并非所有抗体都是真正特异性的。非特异性结合可能是由于抗体可变区正电荷分布不平衡或疏水性过强造成的。抗体上正电荷不平衡可能导致其与带负电荷的聚合物 (如细胞外基质或FcRn) 相互作用。过度疏水性可能导致非特异性膜相互作用。抗体的非特异性结合可能导致PK不良和生物活性降低。此外，与靶标相关的高水平结构冗余也可能导致非特异性结合。 在发现阶段，需要评估抗体候选物的非特异性结合，尤其是具有强效细胞杀伤活性的抗体，例如ADC和双特异性T细胞接合剂。 发现阶段的实验评估和可开发性的改进 一般而言，在发现阶段进行的可开发性评估旨在确定所选候选药物的潜在风险，例如聚集或片段倾向高、溶解性差、稳定性低等。在发现阶段进行的可开发性评估通常快速且通量高，消耗的测试材料量较少 (微克至几毫克)。发现阶段的可开发性评估和改进应包括对表达水平、收率、纯度、同质性、稳定性、溶解性和特异性等的评估。 表达水平和收率：表达水平低通常是抗体折叠和组装不良以及稳定性低的表现。当抗体表达水平正常时，抗体产量低可能是由于在纯化的多个步骤中去除了副产物，或者在过程中聚集和沉淀。通常表达水平和产量低表明抗体的可开发性差。此外，表达水平和产量低会增加获得足够材料以在体外和体内表征抗体所需的总成本和时间。蛋白质建模和工程工具可用于提高抗体的表达水平和产量。 纯度和同质性：抗体在纯化和储存过程中可能会发生聚集和降解，并产生大小或电荷异质性。大小异质性可以通过尺寸排阻色谱 (SEC-HPLC) 和还原/非还原SDS-PAGE或毛细管电泳十二烷基硫酸钠 (CE-SDS) 来确定，而电荷异质性可以通过等电聚焦 (IEF)、毛细管等电聚焦、成像毛细管等电聚焦 (icIEF) 和离子交换色谱 (IEX) 检测。 热稳定性：传统上差示扫描量热法 (DSC) 和差示扫描荧光法 (DSF) 用于评估抗体的热稳定性。DSC 获得的热转变中点 (Tm) 是基于热容量与温度的关系，而DSF通过记录添加到溶液中的疏水性荧光染料的荧光强度变化来确定Tm。DSF和DSF测得的熔化曲线通常一致，而DSF的通量高且蛋白质消耗量极少，因此DSF比DSC更适合在发现阶段使用。或者通过动态光散射 (DLS) 测量的聚集起始温度也可以指示热稳定性。随着温度升高，蛋白质将改变构象、展开并最终聚集。抗体的展开和聚集导致半径的增加可以通过DLS测量。 化学稳定性：影响化学稳定性的主要因素是PTM。高风险的PTM热点应该在发现阶段进行改造，但有时这些热点基序对于抗原结合至关重要，因而无法改造去除。在这种情况下有必要进行压力测试以评估PTM热点的风险 (脱酰胺、异构化或氧化)。在压力条件下孵育的抗体候选物可能会降解或产生大小/电荷变体，可以通过检测变体评估抗体候选物的化学稳定性。此外，还可以进行抗原结合或功能分析来评估抗体变体，可以根据效力和稳定性对不同的抗体候选物进行排名。 溶解性：治疗性抗体需要具有高溶解度 (尤其是通过皮下注射、玻璃体内注射或肌肉注射给药的抗体)。超滤浓缩是测量溶解度的常规方法，该方法需要数百毫克抗体且通量低，不适用于在发现阶段筛选和评估数十至数百种抗体候选物。向抗体溶液中添加聚乙二醇即使在低浓度下也会引起沉淀，因此可以利用聚乙二醇以相对高通量的方式 (每个蛋白质样品1毫克) 测定抗体的溶解度指数。较低的溶解度与抗体的强自缔合有关，这主要由抗体表面的疏水和带电部分决定。 特异性：非特异性和脱靶结合会导致抗体在体内被快速清除、意外毒性或免疫原性风险。有几种方法可以评估抗体的非特异性相互作用，常见的经典方法是ELISA，即将抗体与固定的生物分子 (如蛋白质、脂多糖和DNA) 一起孵育，以评估抗体的非特异性相互作用。另外还有BLI、表面等离子体共振、交叉相互作用色谱和荧光激活细胞分选 (FACS) 方法。 计算机预测 计算工具已用于评估可开发性相关属性，包括化学稳定性、折叠能和表面胶体特性。 大量计算机模拟方法可用于预测抗体的内在和外在特性。这些计算工具的输入可以是序列、结构以及序列和结构的组合。根据所使用的理论，这些方法可分为基于能量、基于统计和基于机器学习。基于机器学习的方法从大量数据中检索序列和结构特征来训练模型，然后使用这些模型预测新输入的相关属性。训练数据的数量和质量是机器学习模型的关键因素。 PTM和异质性：PTM的高风险基序包括可变区中的NS，NG (脱酰胺)，DG (异构化) 和NXT/S (N-糖基化) 以及抗体任何位置上的未配对Cys (聚集和氧化)，这些基序很容易识别。最近，基于机器学习的模型已被科学家用于预测PTM。如Sankar等人报道了一种定量模型，该模型由122种不同mAb中的蛋氨酸氧化数据集训练而成，以预测蛋氨酸氧化。 聚集和溶解度：聚集和溶解度是密切相关的属性，可以使用多种计算方法进行预测，例如SAP，CamSol和Aggrescan3D。这些方法有助于合理设计可溶且稳定的治疗性蛋白质。SAP和Aggrescan3D有一个共同的假设，即暴露的疏水残基很可能形成易聚集区域。这些方法采用疏水残基的溶剂可及表面量作为易聚集区域的量度。Aggrescan3D利用实验得出的每个残基的固有聚集倾向尺度，而SAP使用文献中标准化的疏水性值。CamSol方法可用于评估蛋白质溶解度特性，CamSol基于蛋白质结构，利用氨基酸残基的物理化学特性 (例如疏水性、静电荷和空间残基相互作用) 来计算蛋白质溶解度评分。 热稳定性和折叠能：抗体的稳定性是指其相对于变性状态以折叠形式存在的能力。抗体的热稳定性和折叠能对其生物功能和可开发性至关重要。评估抗体折叠能可以提高对抗体结构的根本理解，并为提高抗体稳定性提供可能的途径。已经有许多计算机模拟方法来预测突变对稳定性和折叠能的影响。FoldX和 Rosetta-ΔΔG是两种基于结构的方法，并通过实验数据进行了验证。FoldX和Rosetta-ΔΔG使用野生型和变体之间的折叠能 (ΔΔG) 作为蛋白质稳定性的评估。一些基于深度学习的方法来预测突变后蛋白质折叠能的变化正在开发中。 总结与未来展望 mAb、bsAbs和ADC已成为重要的治疗实体，在有效的抗体发现计划中，需要仔细检查领先候选药物的生物学和可开发性相关参数。 目前，对领先候选药物可开发性的筛选和优化已推进到早期发现阶段。这些可开发性评估通常需要高通量来筛选数十到数百个抗体候选物，同时消耗相对较少的测试材料。 此外，计算工具已用于设计、预测、筛选和优化抗体候选物的可开发性。AlphaFold 和其他人工智能工具在预测蛋白质结构方面表现出很高的准确性。基于结构和力场的方法可以利用人工智能工具预测的结构来提高其对蛋白质可开发性评估的准确性。 此外，深度生成学习模型已被提出用于从头设计具有所需特性（例如亲和力、溶解性和稳定性）的蛋白质。值得注意的是，随着蛋白质数据集质量的提高和数量的增加，高精度的计算工具将广泛应用于可开发性的评估。可以同时预测抗体衍生分子的亲和力、稳定性和溶解度等多种特性。这些高精度、多方面的模型将大大减少湿实验并加速生物药物的开发。 原文链接：Developability assessment at early-stage discovery to enable development of antibody-derived therapeutics.pdf

导读：黑色素瘤，是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤，每年导致约55500人死亡，一旦黑色素瘤扩散会迅速危及生命。40多年来，可供选择的治疗方案很少，期间在研的临床试验均不成功。BNT111基于BioNTech专有的FixVac平台，是一种用于静脉给药的现成癌症免疫治疗候选药物，编码一组固定的四种黑色素瘤相关抗原，旨在晚期黑色素瘤患者中引发强烈而精确的免疫反应。2024年7月，BioNTech宣布了BNT111的Ⅱ期临床试验的阳性顶线结果，BNT111联合西米普利单抗在不可切除的III/IV期黑色素瘤中产生应答，临床试验结果积极。 图1 BioNTech BNT111研发管线 01 BNT111的设计 BNT111是一种利用FixVac技术平台制造的即用型治疗性疫苗，是一种静脉注射的脂质体RNA（RNA-LPX）疫苗。BNT111疫苗是一种经过优化的疫苗，可诱导针对四种特定的恶性黑色素瘤相关抗原的抗原特异性分化簇（CD）8+和CD4+T细胞反应，包括纽约食管鳞状细胞癌1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、黑色素瘤相关抗原A3（Melanoma-associated antigen A3，MAGE-A3）和具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶（TransmembranePhosphatase withTensinHomology，TPTE）。NY-ESO-1、TYR、MAGE-A3、TPTE这4种非突变的肿瘤相关抗原在超过90%的皮肤黑色素瘤中表达[1]。 图2 黑色素瘤肿瘤相关抗原表达的免疫组织化学染色 裸露的RNA DP与脂质体配制以形成RNA-LPX（BNT111），其保护RNA免于在血清中降解，实现抗原呈递细胞的体内靶向性，构成支持静脉给药的新型疫苗制剂。RNA-LPX在静脉注射后归巢到淋巴器官中的抗原呈递细胞（Antigen-PresentingCells，APC），在那里它们被专职的APC迅速吸收。整合的RNA被转运到细胞质中，导致其被宿主核糖体复合物翻译成四种抗原编码蛋白，这些蛋白被加工并呈递于人类白细胞抗原HLA-I类和HLA-II类分子上。抗原呈递细胞表面的HLA-肽复合物将依次触发抗原特异性CD8+和CD4+T细胞反应。 02 BNT111  一期临床试验 2015年3月，BioNTech开启了BNT111的Ⅰ期临床试验，此研究的目的是确定针对晚期黑色素瘤患者静脉注射针对四种肿瘤相关抗原的四价BNT111癌症疫苗的安全性和耐受性（NCT02410733）[2]。2020年7月29日，BNT111的Ⅰ期临床试验结果以《An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma》为题发布在《Nature》上，结果表明，BNT111疫苗接种对患有的黑色素瘤患者是一种有效的免疫疗法，并表明非突变共享肿瘤抗原作为癌症疫苗接种靶点的普遍效用，针对四种黑色素瘤相关抗原的RNA疫苗在黑色素瘤患者中产生持久的客观反应，并伴有强大的CD4+和CD8+T细胞免疫[3]。2021年11月BioNTech公司宣布，美国食品和药物管理局已授予BNT111快速通道资格。 图3 BNT111的Ⅰ期临床试验设计 03 BNT111 二期临床试验 2020年，BioNTech与Regeneron合作开发BNT111与西米普利单抗（Cemiplimab）的组合疗法，并在2021年启动了这项Ⅱ期临床试验（NCT04526899）[4]。该试验旨在评估该组合疗法对既往接受PD-（L）1抑制剂治疗但病情进展的无法切除的Ⅲ/Ⅳ黑色素瘤患者的疗效。这项Ⅱ期试验在全球多个中心进行，共招募了184名患者。试验主要目标是评估BNT111与Cemiplimab组合疗法对客观缓解率（Overall Response Rate，ORR）的影响。该研究团队将组合疗法组的结果与历史对照组的数据进行了比较，以确定其有效性和安全性。初步结果显示，与历史对照组相比，BNT111与Cemiplimab联合治疗显著提高了ORR，并且这种提高具有统计学显著性。虽然次要终点（缓解持续时间、疾病控制率等）数据在主要分析时尚未成熟，研究团队计划继续跟踪这些数据，并在未来的医学会议上公布更详细的结果[5]。 图4 BioNTech宣布BNT111Ⅱ期临床试验取得积极结果 04 结语 BNT111作为BioNTech公司研发的一款针对黑色素瘤的mRNA疫苗，通过编码四种黑色素瘤相关抗原，旨在激发患者体内强烈的免疫反应。从Ⅰ期临床试验的初步成功，到Ⅱ期临床试验与西米普利单抗联合疗法的显著疗效，BNT111展现了其作为晚期黑色素瘤免疫治疗手段的巨大潜力。随着临床试验数据的不断完善，BNT111有望为黑色素瘤患者提供新的治疗选择，也为mRNA疫苗在癌症治疗领域的应用开辟了新道路。 参考文献  [1] Loquai C, Hassel J, Brück P, et al. 549 An RNA-lipoplex (RNA-LPX) vaccine demonstrates strong immunogenicity and promising clinical activity in a Phase I trial in cutaneous melanoma patients with no evidence of disease at trial inclusion[J]. 2021. [2]https://clinicaltrials.gov/study/NCT02410733 [3] Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, et al. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma[J]. Nature, 2020, 585(7823): 107-112. [4]https://clinicaltrials.gov/study/NCT04526899 [5] https://investors.biontech.de/news-releases/news-release-details/biontech-announces-positive-topline-phase-2-results-mrna 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！