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如果要问2024年哪家中国Biotech最拉风，那毫无疑问是康方生物。康方凭借其PD-1/VEGF双抗（AK112）与药王Keytruda在3期NSCLC头对头的勇气与实力惊艳了中美制药界与投资界。 同时，康方也凭借卡度尼利（PD-1/CTLA-4）和依沃西（PD-1/VEGF）两款在中国上市的双抗药物被誉为中国“双抗龙头”。 一时间，康方成为业内关注与争相模仿的对象。甚至，fast-follow康方AK112的LM-299也于近日成功以天价出海引起轰动（详见通过比较4款出海PD-(L)1/VEGF双抗分析BioNTech/普米斯及默沙东/礼新交易背后的逻辑）。 任何Biotech的成功都离不开正确的立项，因此分析康方的立项逻辑能帮助我们理解康方为什么能成功。 从康方公开的肿瘤产品管线（图1）不难看出，康方的立项逻辑至少经历了四个发展阶段。 图1. 康方生物肿瘤产品管线   01   Fast follow 与同期成立的中国Biotech一样，成立于2012年的康方在成立初期的立项也是基于fast follow策略，公司的主攻方向为肿瘤免疫。 比如PD-1单抗、PD-L1单抗、CTLA-4单抗、PD-1/CTLA-4双抗、PD-1/VEGF双抗及PD-1/LAG3双抗在立项之初均是对应了MNC相应的单抗或是单抗联用（详见创新药Fast Follow策略的未来）。 而CD47单抗、CD73单抗及TIGIT单抗则是追随当时国际上在临床上的一些热门靶点，希望成为下一个PD-1。但遗憾的是，这三个靶点的单抗在临床上接连失败（详见TIGIT的至暗时刻），因此康方的这些项目处在了比较尴尬的位置。   02   排列组合 中国头部Biotech在尝到了fast follow策略的甜头之后都开始探索寻求进一步创新的差异化立项策略。 康方采取的策略是“排列组合”，即将两个热门靶点组合在一起形成双抗以达到差异化的目的，比如TIGIT/TGFβ双抗、PD1/CD73双抗、Claudin18.2/CD47双抗及CD73/LAG3双抗。 尽管这种排列组合而成的双抗在理论上都具有生物学合理性，但往往并没有进行严格的靶点验证及转化医学研究而具有较高的临床开发风险。特别是当靶向两个靶点中的一个的单抗在临床上经历失败的情况下，这种双抗的临床开发将面临更大的风险。 因此，康方上述的4个排列组合双抗在临床上的成功可能性较低。   03   巨噬细胞及其它免疫细胞 康方的CD47单抗目前处于临床3期，说明其立项时间较早。CD47曾是巨噬细胞最热的一个靶点，引发了业界对巨噬细胞治疗癌症的巨大期望。 康方在布局了CD47单抗及Claudin18.2/CD47双抗的基础上，选择了其它巨噬细胞（髓系细胞）靶点组合而成多抗，其临床前项目ILT2/ILT4/CSF-1R三抗应该就是基于这一思路设计的。 但由于髓系细胞特别是巨噬细胞在肿瘤免疫中的复杂机制，像ILT2/ILT4/CSF-1R三抗这样的复杂设计，首先很难在临床前动物模型中得到概念验证，其次对转化医学提出了极高的要求，因此其临床开发的难度并非PD-1/CTLA-4双抗或PD-1/VEGF双抗可比。 此外，康方还布局了NK细胞靶向方向，可能是模仿Affimed的NK cell engager技术平台。   04   ADC DS-8201在肿瘤治疗取得的突破，吸引了MNC及Biotech纷纷布局。特别是默沙东与第一三共的合作使ADC联合肿瘤免疫治疗成为未来一个吸引业内广泛关注的方向。 已经在肿瘤免疫治疗领域深耕多年并手握多款产品的康方自然也不甘落后而布局了自己的ADC平台及多款ADC产品。 今年8月，据康方公开的2024年上半年年报显示其于今年7月递交IND申请的AK138D1为一款HER3 ADC，采用新型可切割连接子、DAR值为8、可能采用拓扑异构酶抑制剂相关毒素，相关数据显示出良好的抗肿瘤活性。 但由于康方进入ADC赛道较晚，而且第一三共/默沙东的Patritumab Deruxtecan（HER3 ADC）治疗既往接受过EGFR-TKI治疗的局部晚期或转移性EGFR突变NSCLC患者的3期HERTHENA-Lung02研究已于今年9月达到了无进展生存期（PFS）的主要终点。因此，康方的Her3 ADC很可能与其肿瘤免疫产品用于联合治疗进行临床开发。 此外，康方还希望通过双抗ADC弯道超车，目前至少有2款双抗ADC处于临床前开发阶段。 通过分析康方生物十年来的立项逻辑可以折射出中国Biotech创新药研发的历程，从单纯的靶点fast follow到modality的fast follow，从靶点组合形成双抗到研发策略的模仿。 值得注意的是，尽管康方被称为中国的“双抗龙头”，但其双抗平台“Tetrabody”是上世纪90年代就已公开的技术，目前大多数公司都可以轻易上手，门槛较低。 反观全球“双抗龙头”罗氏/基因泰克/中外制药，在双抗/抗体工程领域深耕30余年，积累了丰富的平台研发经验（详见下一代TCE之共刺激信号的选择：我们从CAR-T学到了什么？）及临床开发经验，这些都是其它公司很难轻易模仿甚至超越的。 此外，尽管康方没有公布其ADC平台的技术细节，但推测应该是模仿并参考第一三共及国内一些ADC平台的技术，因此很难具有技术上的领先优势。 随着中国创新药研发进入新的发展阶段，传统的fast follow已经很难具有竞争力，这就要求药企特别是Biotech不仅要在靶点生物学和疾病生物学方面有更深的理解及探索，还要在技术平台方面不断深耕以构筑自己的技术壁垒。 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？

摘要:自然杀伤（NK）细胞是癌症免疫疗法的有力候选者，它们具有强大的先天细胞毒性，并且在嵌合抗原受体（CAR）治疗方面比T细胞具有独特优势。对病毒载体的安全性、成本和可扩展性的担忧激发了对非病毒基因传递替代品的研究。本综述全面分析了非病毒遗传修饰NK细胞在异体CAR-NK疗法中的最近进展和挑战。包括电穿孔和多功能纳米颗粒在内的非病毒替代品在CAR表达和转化反应方面受到检验。至关重要的是，NK细胞生物学与药物传递技术设计之间的联系被建立起来，这对于未来非病毒方法的发展至关重要。本综述为非病毒CAR-NK细胞工程的现状提供了宝贵的见解，旨在实现基于NK细胞的免疫疗法的全部潜力。 图形摘要:非病毒生产“现成的”CAR-NK细胞。 1.NK细胞可以从捐赠者血液中纯化，从干细胞分化，或在实验室中从永生化细胞系生产。 2.从CAR-T设计修改而来的NK特异性CAR设计，包括NK跨膜域（NKG2D、NKp44）、共刺激受体（例如，DAP10、2B4）和NK细胞受体（NKG2D）。 3.非病毒遗传修饰NK细胞可以包括通过DNA或mRNA传递CAR构建体，以及使用基因编辑工具（例如，CRISPR Cas9、转座子）敲入/敲出特定基因。这需要一种基因传递方法，可能包括电穿孔、脂质和多功能纳米颗粒和细胞。 1.引言 嵌合抗原受体（CAR）疗法是一种过继细胞疗法，其中T细胞、树突状细胞、巨噬细胞或自然杀伤（NK）细胞被遗传工程化以识别和消除癌细胞。CAR-T疗法是最成熟的形式，涉及修改患者的T细胞在体外表达一个CAR，该CAR能够识别癌细胞表面的肿瘤相关抗原（TAA），例如在许多B细胞淋巴瘤和白血病上表达的CD19。然后CAR-T细胞被扩增并重新输回患者体内，以靶向并杀死表达特定TAA抗原的肿瘤细胞。第一个CAR-T疗法于2017年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，到2022年又有五个产品获得批准；针对CD19+恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤，或表达B细胞成熟抗原（BCMA）的多发性骨髓瘤（在表1中总结）。 基本CAR结构（图1）模仿T细胞受体激活，包括几个部分：一个识别癌细胞表面的特定抗原的细胞外域；一个对将信号发送到细胞内域至关重要的跨膜域，激活CAR-T细胞增殖和存活。CAR-T构建体设计已经经历了几代的发展，如图1所示。目前商业化的CAR-T细胞产品使用第二代CAR设计，增加了一个共刺激域（CD28或4-1BB）以增强T细胞增殖、持久性和细胞毒性（表1）。共刺激域的选择可以显著影响体内持久性；基于CD28的CAR T细胞持续约30天，而4-1BB CAR T细胞在某些患者中可能超过4年。 图1. CAR-T构建设计元素进展的详细示意图。第一代CAR由单链可变片段（scFv）抗原识别域、跨膜域和源自CD3ζ链（CD3ζ）的细胞内T细胞激活域组成，发展到第二代CAR设计，增加了额外的共刺激域（CD28或4-1BB），增强了T细胞的增殖和细胞毒性，被商业产品所采用。进一步的第三代CAR构建包含两个不同的共刺激域（例如，CD28和4-1BB）。“武装”的第四代CAR（也称为T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤（TRUCKs））包含可诱导表达的成分，如细胞因子（例如，IL-12），这可以增加CAR-T细胞的激活和肿瘤杀伤，第五代或称为“下一代”CAR包含一个截短的白细胞介素-2（IL-2）受体β链（IL-2Rβ），具有与转录因子STAT3的结合位点，以充分利用通过JAK-STAT3/5信号传导的CAR激活信号；增强T细胞的激活、增殖和持久性。此图使用BioRender.com创建。 血液系统恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，迄今为止一直是CAR-T疗法的主要目标，治疗效果令人印象深刻。在2015年和2017年之间，针对tisagenlecleucel的第二阶段ELIANA临床试验，包括75名难治性或复发性B细胞急性淋巴细胞性白血病（ALL）的儿童患者，结果显示在三个月时的总体缓解率为81%。然而，73%的患者经历了严重的不良事件，其中47%发展为严重的细胞因子释放综合征（CRS）。CAR-T疗法的安全性问题是一个主要关注点，患者遭受的毒性包括CRS和肿瘤溶解综合征、神经毒性以及移植物抗宿主病（GVHD）的风险。此外，用CAR-T疗法治疗实体瘤已被证明更加困难，因为肿瘤异质性、炎症和肿瘤微环境中的免疫逃逸（TME）。与自体细胞疗法相关的成本也极高，CAR-T疗法的治疗费用从373,000美元到475,000美元不等，还有与白细胞分离、淋巴细胞清除疗法以及CAR-T免疫疗法的副作用相关的额外成本。例如，使用tisagenlecleucel治疗的患者的总治疗费用据报道，对于没有CRS的患者范围从478,777美元到对于有严重CRS的患者531,823美元，由于需要进一步的治疗和医院护理，包括在某些情况下的重症监护治疗。因此，有必要开发更安全的替代品，以减少患者的并发症风险，同时也有助于降低制造成本和与医院治疗相关的成本，以管理严重的副作用。这样的替代品之一是使用自然杀伤（NK）细胞进行CAR疗法，它们有潜力克服CAR-T疗法中的一些问题。 2.自然杀伤（NK）细胞 NK细胞是高度细胞毒性的免疫效应器，被定义为CD56+ CD3–淋巴细胞，能够发挥自然细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。它们在癌症监测中扮演重要角色，具有对癌细胞的自发细胞毒性的独特能力，无需事先暴露或由其他免疫细胞刺激，这归功于一系列激活受体。NK细胞可以通过下调通常在健康细胞上表达的人类白细胞抗原（HLA），与主要组织相容性复合体（MHC）同义，或上调应激诱导配体，如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B（MICA, MICB）来识别异常细胞。在识别目标细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤Ig样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。许多NK激活和抑制受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞的损害，如图2总结，更详细的内容在表2中。 图2. NK细胞常见的激活性A和抑制性B受体及其相应配体的简化示意图。NK受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞造成损害，并且可能通过下调人类白细胞抗原（HLA，与主要组织相容性复合体MHC同义）或上调应激诱导配体（如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B，MICA，MICB）来识别异常细胞。在识别靶细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。此图使用BioRender.com创建。 抑制性受体识别HLA分子，使自然杀伤（NK）细胞能够区分正常细胞和异常细胞。当激活受体的平衡倾向于激活时，会释放含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性颗粒，通过caspase介导的凋亡直接杀死目标细胞。NK细胞还表达死亡受体，如FasL、TRAIL和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）受体，以诱导表达相应受体的目标细胞凋亡。产生多种细胞因子和趋化因子，如干扰素-γ（IFN-γ）和TNF-α，激活其他免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，并促进炎症。此外，NK细胞能够通过识别被抗体包被的目标细胞进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。成熟的NK细胞表达CD16受体（也称为FcγRIIIA），该受体识别与目标细胞表面表位结合的免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段。与IgG包被的细胞相互作用后，含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的CD16亚基将受体连接到细胞内信号传导途径，触发肌动蛋白和微管的重组以实现ADCC。这最终导致含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放，FasL和TRAIL死亡受体的参与，以及促进进一步招募多种免疫细胞的细胞因子和趋化因子的释放。CD16的表达对于NK细胞的ADCC功能至关重要，并且表达在更成熟的NK细胞上。因此，CD16的表达在命名法中用于分类NK细胞的成熟状态。人类NK细胞通常被细分为两个主要亚群：CD56brightCD16dim/−和更成熟的CD56dimCD16+。CD56dim亚群在外围血液中更为常见，而CD56bright在组织中更丰富。CD56bright NK细胞被认为是不成熟的，表达NKG2A但不表达KIRs。它们的细胞溶解能力差，分泌细胞因子IFN-γ、GM-CSF，并对IL-2或IL-15产生反应而增殖。相反，CD56dim被认为是成熟的，表达NKG2A和/或KIR受体，并在激活时具有强大的细胞溶解活性和细胞因子分泌能力。最成熟的、终末分化的NK细胞被分类为CD56dim KIRpos CD57pos CD16bright（图3）。成熟的CD56dimCD16+亚群是癌症治疗的理想选择，因为它们具有强大的细胞溶解活性和ADCC能力。因此，采用NK细胞的过继免疫疗法已成为一种有希望的治疗选择，研究正集中在探索如何利用NK细胞的力量用于癌症免疫疗法，如CAR-NK细胞疗法。[图3]。 图3. NK细胞成熟度与其他免疫细胞的相互作用。A. NK细胞根据成熟状态改变受体状态，从未成熟的CD56bright/CD16−细胞到成熟的CD56dim/CD16+细胞，以及最终分化的NK细胞，这些细胞有时也被称为“记忆样”NK细胞。B. NK细胞在激活后与髓系细胞和靶细胞的信号传递和相互作用。NK细胞通过直接杀伤（激活受体包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、KIRs）、凋亡（TRAIL和FasL死亡受体）和/或ADCC（CD16）对靶细胞发挥细胞毒性，并产生炎症细胞因子和趋化因子，这些因子刺激并招募其他免疫细胞。此图使用BioRender.com创建。 2.1.CAR-NK疗法的优势 与T细胞相比，NK细胞在CAR疗法中具有几个潜在优势，包括增强的安全档案、异体疗法的潜力以及通过CAR依赖和非CAR依赖的癌细胞靶向实现更广泛的目标特异性。CAR-Ts分泌包括IL-1、IL-2、IL6、TNF-α、MCP1、IL8、IL10、IL-15在内的一系列细胞因子。这些细胞因子，特别是促炎性的TNF-α、IL-1和IL-6，被报道是与CAR-T疗法相关的严重副作用的原因，包括神经毒性和CRS。相比之下，CAR-NK与不同的细胞因子档案相关，它分泌IFN-γ和GM-CSF。事实上，在给药CD19+淋巴样肿瘤患者后，CAR-NK细胞的炎症细胞因子并未超过基线。这种细胞因子释放档案的差异被认为是NK细胞增强安全档案的原因之一，导致毒性较小，减少细胞因子风暴的发生。尽管重要的是要注意这些结论是基于有限数量的临床CAR-NK研究和有限的患者数量，与许多大型CAR-T临床研究相比，并且尚未在CAR-T和CAR-NK疗法之间进行直接比较。CAR-NK细胞的另一个潜在安全优势是降低了与CAR-T细胞相关的靶向内肿瘤毒性的风险。所有细胞，无论是恶性还是非恶性的，如表达CAR靶抗原的CD19+ B细胞，都可能被CAR-T细胞靶向。NK细胞上的抑制性受体可能在非恶性细胞被CAR抗原识别时充当安全开关。如果识别非恶性细胞，将启动NK抑制信号，防止靶向内肿瘤毒性。 NK细胞在异体应用中的潜力在于CAR-NK细胞治疗后GVHD（移植物抗宿主病）的低风险。在T细胞的情况下，由于它们的αβ T细胞受体（TCRs）高度多变，供体T细胞与受体组织细胞广泛表达的HLA I类分子结合。在供体T细胞输注后，TCR识别HLA为外来物，启动针对受体细胞的免疫反应，导致导致GVHD的异体反应。相比之下，NK细胞的活性不依赖于HLA I类识别，允许NK细胞针对经常丢失HLA I类受体作为免疫逃逸手段的恶性细胞。因此，NK细胞治疗的GVHD风险较低，并且NK细胞的研究在安全性方面取得了有希望的结果。 由于安全性档案的改善和GVHD风险较低，有可能开发出一种“现成的”CAR-NK产品，这可能对领域产生变革性影响。尽管正在研究自体NK细胞治疗，但异体NK细胞可能比自体NK治疗更有效，克服了来自免疫抑制患者的耗尽NK细胞的问题。异体供体NK细胞可以大规模培养，便于更有效的质量控制测试、转染和输注；允许从同一批次治疗多名患者，这可能消除了对专业中心的需求。相比之下，目前CAR治疗中使用的T细胞通常来源于患者自身的细胞，这可能既耗时又昂贵，并且难以收获和工程化。自体CAR-T治疗的费用可能高达每次治疗475,000美元，由于CAR-T治疗劳动密集、难以扩展且容易失败。相比之下，一个周期的异体“现成的”NK-92治疗的费用可能不到20,000美元，使其成为一个更具成本效益的选择。需要注意的是，只有在多个患者之间共享工程化的异体NK细胞产品时，才能实现这样的成本节省。此外，生产异体T细胞的努力也在进行中，也可能有助于克服自体T细胞工程化过程中遇到的问题。 CAR-NK疗法可能在实体瘤治疗中具有潜力。CAR-T疗法在实体瘤中产生了令人失望的治疗结果，原因是诸如肿瘤异质性、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、不足的交通和渗透以及毒性等障碍。CAR-NK细胞已在多种实体瘤中进行了研究，如胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌，并且提出NK细胞的天然属性可能对治疗实体癌有益。与稳定过表达B细胞抗原的淋巴瘤相比，实体瘤通常具有可变的抗原表面表达水平和肿瘤内及原发与转移组织之间的异质性，使得用单一CAR目标成功治疗变得困难。除了任何CAR修饰外，NK细胞还有潜力通过多个激活和抑制受体识别异质性肿瘤细胞，尽管HLA-I分子的表达减少或缺失。激活信号的存在，如NKG2D，允许NK细胞直接对缺乏特定CAR抗原并可能被CAR-T细胞遗漏的转化细胞发挥其细胞毒性，这在异质性实体瘤环境中很常见。这是NK细胞相对于CAR-T细胞的一个明显优势，后者只对表达CAR抗原的细胞活跃，并允许NK细胞针对更广泛的癌细胞群体。实际上，即使没有CAR抗原的添加，未修饰的NK细胞已被用于针对癌细胞，并已在临床试验中显示出其有效性的早期迹象。此外，除了它们对癌细胞的直接细胞毒性效应外，NK细胞对于招募常规1型树突状细胞（cDC1）和随后的CD8+ T细胞也很重要，这将促进癌症免疫周期的激活，有潜力克服免疫抑制性TME。 3.CAR-NK 疗法的发展现状 目前市场上还没有获批的基于 NK 细胞的产品，但自 2016 年以来，研究 NK 细胞疗法的临床试验数量激增，截至 2023 年 5 月，已有近 60 项试验启动。该领域仍处于新兴阶段，大多数试验处于 I 期或 II 期，并且仍在进行中，因此结果尚未完全报告。然而，早期数据令人鼓舞，表明 CAR-NK 细胞疗法是安全的，并有潜力成为癌症的有效治疗方法，尽管尚未报告显著的临床效果。虽然针对多种抗原和恶性肿瘤，但相当数量的 CAR-NK 试验集中在针对 CD19 的血液癌症，这是 CAR-T 疗法成功的目标之一。一个针对 CD19 的 CAR-NK 细胞的例子是，一项 I/II 期临床试验，研究 CD19 靶向 CAR-NK 细胞在复发或难治性 CD19+ B 淋巴样恶性肿瘤患者中的安全性和有效性，包括急性淋巴细胞性白血病（ALL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NCT03056339）。来源于脐带血的 HLA 不匹配 NK 细胞与 K562 饲养细胞共培养，并与 IL-2 一起在第 6 天通过逆转录病毒载体转导，表达抗 CD19 CAR、IL-15 以增强 CAR-NK 细胞在体内的扩增和持久性，以及诱导性 Cas9 作为安全开关，在不可接受的毒性效应情况下触发 CAR-NK 细胞的凋亡。扩增后，CAR-NK 细胞在第 15 天收获用于新鲜输注，并给与 37 名复发或难治性 CD19+ 癌症患者，包括非霍奇金淋巴瘤和 CLL。临床对疗法的反应基于 2018 年慢性淋巴细胞性白血病国际研讨会（iwCLL）的标准和 2014 年非霍奇金淋巴瘤的卢加诺分类。1 年总生存率为 68%，无进展生存率报告为 32%。重要的是，没有发生显著毒性，包括 CRS、神经毒性或 GVHD，炎症细胞因子水平也没有增加，包括 IL-6。这一有希望的临床结果和安全概况突出了 CAR-NK 疗法作为异体疗法的潜力，可以开发成“现成”产品。CAR-NK 细胞疗法治疗实体瘤的潜力推动了这一领域的研究，目前正在进行的几项临床试验涉及胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌。这些研究中的许多还处于非常早期阶段，仍在招募患者，因此结果尚未完全报告。最近，Burger 等人发表了第一项探索胶质母细胞瘤患者中 CAR-NK 细胞疗法的临床试验结果；一项 I 期试验，研究在复发手术期间颅内注射针对人表皮生长因子受体 2（HER2）的 CAR-NK 细胞在 9 名复发 HER2+ 胶质母细胞瘤患者中的疗效（NCT03383978）。这项研究调查了慢病毒转导的 NK-92 细胞表达 CAR，包括 HER2 特异性单链抗体、CD8α 铰链区和 CD28 及 CD3ζ 信号域。在手术期间将 CAR-NK 细胞注入手术腔边缘后，五名患者的病情稳定，持续了 7 至 37 周。四名患者病情进展，两名患者在注射部位出现假性进展，提示治疗诱导的免疫反应。对于所有患者，中位无进展生存期为 7 周，中位总生存期为 31 周。此外，没有剂量限制毒性，也没有患者发展为 CRS 或免疫效应细胞相关神经毒性综合征。这项研究表明 CAR-NK 细胞治疗胶质母细胞瘤的可行性和安全性。尽管这是一项非常侵入性的研究，需要在手术期间注射 CAR-NK 细胞，但需要进一步研究以评估 CAR-NK 细胞通过静脉输注靶向和渗透实体瘤的能力。希望这些有希望的结果也能在其他实体瘤类型中复制，早期阶段的临床试验正在进行中。 4.CAR-NK 生产考虑因素 尽管安全性和治疗结果令人鼓舞，但 CAR-NK 疗法仍处于起步阶段，在它们被批准用于临床之前还有很多工作要做。如果需要实现 CAR-NK 疗法的潜力，需要解决的一些考虑因素包括 NK 细胞的来源、CAR 结构设计以及 NK 细胞的遗传修饰方法。 4.1.异体 NK 细胞来源 异体 NK 细胞可从多种来源获得，包括外周血（PB）、脐带血（CB）、诱导多能干细胞（iPSCs）和永生化细胞系。这些来源在扩增和遗传修饰方面都有其独特的考虑因素，目前都在临床研究中。 从外周血（PB）和脐带血（CB）衍生的 NK 细胞 从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞是获取 CAR 疗法 NK 细胞的主要方法，广泛用于 NK 细胞应用。然而，细胞增殖能力可能较低，细胞存活时间短。大约 85-95% 的 PB NK 细胞是 CD56dimCD16high，具有高度的细胞毒性，但与其产生细胞因子的 CD56bright 对应物（占 PB NK 的 5-15%）相比，增殖能力较低。相比之下，由于常规储存，CB 衍生的 NK 细胞可能更容易获得，并且比 PB NK 细胞更具增殖性，允许在体外轻松扩增。然而，CB NK 细胞在表型和功能上不成熟，可能不如其他来源的 NK 细胞具有细胞毒性。从 PB 或 CB 分离 NK 细胞后，需要扩增以创建异体剂量，由于治疗剂量所需的 NK 细胞数量大，这已被证明是具有挑战性的。扩增协议可分为基于饲养细胞的或无饲养细胞的系统。与饲养细胞（例如 Epstein-Barr 病毒转化的淋巴母细胞系（EBV-LCL））共培养，这些细胞向 NK 细胞呈现配体，刺激 NK 细胞的激活和扩增，相对快速地扩增到大量（几周内）。然而，使用饲养细胞与安全和监管问题相关，包括最终 NK 细胞产品中残留活性饲养细胞的潜力。因此，已开发了使用细胞因子和抗体刺激 NK 细胞的无饲养细胞扩增方法。包括 IL-2 和 IL-15 在内的细胞因子是强大的 NK 细胞刺激剂，但包括 IL-15、IL-21、IL-12、IL-18 和 IL-27 在内的一系列细胞因子组合已显示出扩增 NK 细胞的前景。虽然无饲养细胞系统避免了与饲养细胞相关的安全问题，但产生的 NK 细胞产量较低。将饲养细胞遗传修饰以表达刺激细胞因子的组合已产生高度细胞毒性和增殖性的 NK 细胞。例如，K562 饲养细胞遗传修饰以表达膜结合 IL-15 和 41BB 配体（K562mbIL12-41BBL）在培养 10 天内导致大量扩增 PB NK 细胞在透气静态细胞培养袋（G-REX）中。另一个可能影响 NK 细胞效力的因素是冷冻保存。从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞可能在扩增前或在“现成”产品的情况下需要冷冻保存，这可能对 NK 细胞的增殖和细胞毒性功能产生不利影响。潜在的解决方案包括准备额外的细胞以弥补冷冻保存后的损失，或在解冻后立即用 IL-2 等细胞因子刺激，或用 IL-15 和 IL-18 预处理以提高冷冻保存后的活性。此外，在非病毒遗传工程方法的背景下，与 iPSCs 和细胞系相比，PB 和 CB NK 细胞仍然难以操纵。与 NK 细胞的培养和扩增相关的因素可能影响转染率，包括 NK 细胞的激活状态、扩增期间的转染时机、扩增方法（饲养或无饲养方法）和冷冻保存。病毒转导率在体外扩增（激活）的 NK 细胞中得到增强，而在静止的原代 NK 细胞中观察到较低的转导。大规模扩增 NK 细胞的标准协议需要在病毒转导前的初始扩增，然后是第二阶段的扩增。这种顺序的原代扩增、遗传编辑和次级扩增协议也适用于电穿孔，基于饲养细胞或无饲养系统的扩增方法和时机也可能影响转染率。饲养细胞可能通过诱导细胞分裂增强遗传编辑，饲养刺激可能支持 NK 细胞在体外操纵后的恢复。例如，Pomeroy 等人观察到在与 K562-mbIL-21-41BB 饲养细胞共培养的 PB NK 细胞电穿孔后第 4 天 TcBuster 的转位最高。根据协议阶段调整饲养细胞与 NK 细胞的比例（电穿孔前 2:1 饲养：NK，电穿孔后 48 小时 5:1 或所有随后扩增的 1:1）。同样，Gurney 等人使用 EBV-LCL（10:1 饲养：NK 比例）在 IL-2 和 IL-21 存在下激活 NK 细胞。NK 细胞在第 4 天电穿孔并在 IL-15 存在下休息 48 小时，然后重新刺激饲养细胞。进一步扩增进行到第 25 天，观察到不同捐赠者之间细胞扩增的变化。这突出了遗传工程和扩增 NK 细胞所需的优化的复杂性，并且一系列因素可能影响转导/转染率，尚未建立标准协议。需要进一步的研究来阐明最佳条件，并且可能需要根据基因传递方法定制条件。 iPSC 衍生的 NK 细胞 作为解决原始 PB 和 CB 衍生 NK 细胞问题的替代方案，iPSC 提供了无限的资源来生产同质 NK 细胞，并且可以在大规模上进行遗传修饰和扩增。从单一 iPSC 系生成的 iPSC 衍生 CAR-NK 细胞，然后进行分化和扩增，成为通用的细胞产品，有潜力成为“现成”疗法。2021年12月，Fate Therapeutics 的新闻稿详细介绍了一项 I 期研究的中期临床数据，该研究调查了表达 CD19 的“现成” iPSC 衍生 CAR-NK 细胞（称为 FT596），用于治疗复发/难治性 B 细胞淋巴瘤（NCT04245722）。FT596 iPSC CAR-NK 细胞被设计表达高亲和力不可切割的 CD16 变体，以增强 ADCC；一种膜结合 IL-15/IL-15R 融合蛋白，以支持体内持久性；以及针对 NK 细胞优化的抗 CD19 CAR，用于直接肿瘤靶向。据报道，接受第二个 FT596 周期治疗的 11 名患者中有 10 名持续反应，其中三名患者在≥6 个月的随访中持续完全反应。此外，FT596 治疗方案耐受性良好，没有剂量限制毒性，如神经毒性或 GVHD，尽管在 FT596 单剂量递增队列中有两例低级别不良事件的 CRS 报告，这些事件在未经重症监护治疗的情况下得到解决。这些早期数据突出了 iPSC CAR-NK 疗法的潜力，但在这种疗法在临床上更大规模推广之前，需要完成进一步的研究和优化。iPSC NK 细胞的一个问题是需要高度专业化的培养条件，其中 iPSC 被分化为 CD34+ 造血祖细胞，然后进一步分化为 NK 细胞。从 iPSC 生产 NK 细胞的成熟协议可能需要 4-5 个月，尽管最近开发了一种新方法，将处理时间缩短到大约 2 个月。控制 iPSC 的分化是一个劳动密集型的制造过程，需要遗传工程和细胞培养专业知识，这对于大规模生产财务上可行且能够被更广泛患者群体接受的“现成”产品可能是有问题的。此外，存在对 iPSC 遗传突变风险的主要关注，特别是当需要长时间的培养时。此外，还存在未分化 iPSC 潜在的肿瘤形成风险。因此，需要开发稳健的质量测试对 iPSC 衍生的细胞进行筛选，包括筛选在培养过程中可能发生的任何遗传改变。 NK 细胞系 迄今为止，已有 10 个永生化模型 NK 细胞系，包括 NK-92、KHYG-1、NKL 和 YT，它们是从 NK/T 淋巴瘤患者中建立的，并用于 CAR 疗法的临床前开发。NK 细胞系对恶性细胞具有高度的细胞毒性，并且比原始 PB 或 CB 来源的 NK 细胞更容易进行遗传修饰和扩增。尽管需要注意的是，与其他类型的细胞系相比，NK 细胞系更难培养，因为它们对培养条件的变化非常敏感，通常需要添加细胞因子 IL-2 或 IL-15 来支持增殖。由于 NK 细胞系的恶性特性，因此在转移给患者之前需要进行辐射处理，这可能对输注的 NK 细胞的存活和细胞毒性效应产生不利影响。尽管如此，NK-92 细胞已获得 FDA 批准用于临床使用，到 2021 年，它们是临床试验中最常用的工程化 NK 疗法来源（占试验的 43%），其次是 PB NK（21%）、iPSC（17%）和 CB NK（13%）。NK-92 细胞系源自 1994 年一名 50 岁男性非霍奇金淋巴瘤患者，由于表达 CD56 和许多主要 NK 激活受体，包括 NKp30、NKp46、2B4、NKG2D 和 CD28，被认为是类似 NK 的细胞系。相反，NK-92 细胞几乎缺乏所有的 KIR 受体，并且表达很少的抑制性受体（NKGA/B、低水平的 KIR2DL4、ILT-2），并且不表达负责 ADCC 的 CD16 受体。NK-92 细胞的强细胞毒性可以归因于这种受体表达谱，当激活时，它触发穿孔素-颗粒酶细胞毒性途径，以及由 FasL、TRAIL、肿瘤坏死因子样弱诱导凋亡因子（TWEAK）和 TNF-α 引导的死亡受体细胞毒性途径。为了克服 NK-92 细胞的局限性并朝着开发“现成” CAR-NK 细胞的方向迈进，已经开发了几个衍生细胞系。NK-92MI 被设计为产生 IL-2，从而不需要补充 IL-2。首个人体临床试验（NCT02944162）中，NK-92MI 表达 CD33 CAR 用于治疗复发和难治性急性髓系白血病（AML）患者，证明了这些细胞的临床安全谱。NK-92MI 细胞被慢病毒转导 CAR CD33.CD28.41BB.CD3z 构建体，扩增并在输注前共辐射（10 Gy）。在每个患者输注高达 5×10^9 个细胞后，未观察到显著的不良效应，尽管一名患者经历了 I 级 CRS。接受治疗的三名患者中，一名患者对治疗没有反应，而另外两名患者在 1 个月和 4 个月后复发。尽管这是一项小规模研究，患者数量有限，但它有助于证明 CAR-MI 细胞的积极安全谱，但治疗效果并不令人印象深刻。 NK-92细胞系的进一步优化产生了高亲和力NK-92（haNKs），这些细胞表达CD16受体，增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性。目标亲和力NK-92（taNK）经过改造，能够针对特定的肿瘤细胞配体，此外，t-haNKs结合了所有这些特性，表达高亲和力CD16，分泌IL-2，并识别特定的肿瘤配体，如PD-L1。在II期QUILT 88试验（NCT04390399）之后，t-haNKs治疗典型难以治疗的胰腺癌的潜力得到了突出，该试验调查了ImmunityBio的Nant癌症疫苗，包括PD-L1靶向t-haNK细胞与IL-15受体激动剂Anktiva（N-803）、阿霉素、白蛋白修饰剂以及低剂量化疗在胰腺癌治疗中的组合。在联合治疗后，第三、第四和第五线患者的总生存期为5.8个月，几乎是历史生存期3个月的两倍，严重副作用不常见，为8%。随着许多关于CAR表达NK-92细胞的试验正在进行，调查使用包括CD19、MUC-1、HER2、ROBO1和PD-L1在内的一系列癌症靶标治疗血液和实体肿瘤，这些早期积极的结果可能预示着利用NK-92细胞的CAR-NK疗法的未来潜力。 KHYG-1细胞系已被证明比NK-92细胞具有更强的细胞毒性。这表明这个细胞系也可以作为“现成的”CAR-NK疗法的治疗应用，如Stikvoort等人的概念验证研究中所报告的。KHYG-1细胞通过逆转录病毒转导了含有CD28共刺激域的CD38-CAR，并产生了针对CD38high多发性骨髓瘤（MM）细胞系（UM9和THP-1）和来自患者的原发性MM细胞的有效CD38依赖性细胞毒性。此外，CD38-CAR KHYG-1细胞显著减缓了UM9肿瘤在具有人骨髓样生态位的RAG2–/–γc–/–小鼠异种移植模型中的生长。植入了表达荧光素酶的UM9 MM肿瘤的RAG2–/–γc–/–小鼠接受了多次静脉注射CD38-CAR KHYG-1细胞的治疗，治疗后20天，与未经治疗的对照组的24倍增长相比，CD38-CAR KHYG-1治疗小鼠的生物发光仅增加了四倍。这项研究突出了KHYG-1细胞被开发成类似于NK-92细胞的CAR-NK细胞的潜力，但需要进一步的研究来评估这在人类中的潜力，因为小鼠模型中的结果并不总是能够转化为人类。 从恶性来源衍生的NK细胞系在临床应用前需要进行辐射，这可能会影响其在体内的增殖和持久性。例如，NK-92细胞在体内的寿命很短，通常在初次输注后两天，这在减少副作用方面可能是有利的，与可以循环数月或数年的CAR-T疗法相比。然而，这种短暂的寿命可能导致较差的治疗结果和多次治疗的需求。已经对NK-92细胞进行了工程改造，以表达IL-2，增强体内扩增，但需要更复杂的工程来对抗TME中的NK耗竭，特别是对于实体肿瘤的治疗。KHYG-1细胞强烈表达抑制性受体NKG2A，当与MM细胞共培养时，发现其表达高水平的PD-1。这可能是CAR-NK疗法发展的一个主要障碍，需要在这些疗法成功之前加以解决。 4.2.NK细胞的CAR构建设计 最初的CAR-NK研究采用了旨在模仿T细胞受体的CAR-T骨干。然而，NK细胞毒性是由一组不同的激活和抑制受体调节的，这些受体可以并入CAR设计中，以激活天然NK受体并利用NK功能。CAR-NK细胞可以通过表达包含NK特异性跨膜信号域以及共刺激受体（例如，NKG2D、DNAM-1、2B4、CD28或4-1BB）的抗原特异性CAR分子来工程化，以优化NK细胞效应功能。这些设计旨在增强NK细胞在识别肿瘤抗原时的激活，并提高CAR-NK细胞的持久性、细胞毒性和细胞因子产生能力（图4）。 图4. 比较CAR-T和CAR-NK疗法中CAR构建设计元素的示意图。最初研究CAR-NK细胞时使用的构建与第三代CAR-T疗法中使用的构建相同，这些构建旨在模仿T细胞受体。此后，已开发出针对NK细胞的特定CAR构建，以纳入NK跨膜信号域以及共刺激受体（例如，DAP10、2B4、CD28或4-1BB），以增强NK细胞的效应功能。激活受体NKG2D也被纳入NK特异性CAR构建中；尽管NKG2D不是经典的“CAR”因为它不是单链可变片段（scFv），但在文献中它们被称为CAR。此图使用BioRender.com创建。 Li等人筛选了几种为NK细胞活动优化的CAR构建，包括各种跨膜和共刺激域的组合。比较了表达针对间皮素的CAR的iPSC-NK细胞（称为CAR-iPSC-NK），该CAR包含NKG2D跨膜域、2B4共刺激域和CD3ζ信号域，与基于T细胞的CAR包含两个CD28域与4-1BB（CD137）和CD3ζ（称为T-CAR-NK）在荧光素酶表达的A1847卵巢癌异种移植模型中的活性。与T-CAR-NK治疗组相比，CAR-iPSC-NK在生物发光成像后导致肿瘤负担显著减少并改善了生存期。此外，在与表达CAR的原代T细胞进行比较后，CAR-iPSC-NK组在70天时的生存期提高到80%，而T-CAR组为20%。重要的是，T-CAR组表现出严重副作用的证据，包括显著的体重减轻（>50%，在第23天和第39天各有2个n），严重的内脏出血和缺血，脾脏肿大以及对包括肝脏、肺、肾脏和肠道在内的内部器官的病理性损害的证据。相比之下，CAR-iPSC-NK治疗组没有观察到这样的效果。 我们知道NKG2D是一个主要的激活受体，负责在识别肿瘤细胞上表达的“杀伤我”压力信号，即MICA、MICB和UL16结合蛋白（ULBP-1和ULBP-6）后，引发caspase介导的凋亡。利用NKG2D可以增强NK细胞的抗肿瘤细胞毒性。Xiao等人报告了一项小型临床试验，研究PBMC衍生的NK细胞表达NKG2D与DAP12共刺激域融合，通过腹腔内（i.p.）输注给三名转移性结直肠癌患者（NCT03415100）。作者报告说，在两名患者中，腹水生成减少，腹水中的肿瘤细胞显著减少，而在第三名患者中，通过超声观察到肝脏区域的肿瘤迅速退缩，并通过PET-CT扫描确认完全的代谢反应。所有三名患者均报告病情稳定，重要的是，没有观察到剂量限制性毒性或GVHD。尽管这项研究中使用的CAR构建只有一种细胞内域的第一代设计，但它为进一步开发携带NKG2D受体的下一代CAR构建铺平了道路。这强调了精心设计的NK特异性CAR构建的重要性，以最大化CAR-NK治疗效应并减少与CAR-T构建相比的副作用，仍有相当数量的NK受体、共刺激域和每种组合需要探索。 4.3.CAR-NK制造的遗传改造方法 对于大规模生产“现成的”CAR-NK产品，用于遗传工程NK细胞的方法是一个重要的考虑因素，这可能影响生产时间、成本和可扩展性。理想情况下，用于创建CAR的转染方法应该是高效的、可扩展的，且非免疫原性的。目前，大多数CAR疗法是使用病毒载体工程化的，与非病毒方法相比，病毒载体产生稳定的基因表达和更高的转导率。NK细胞极难转导，特别是原发性PB和CB NK细胞，即使使用通常非常有效地转导广泛细胞的病毒载体；由于高表达免疫受体，如模式识别受体（PRRs），这些受体在病毒转导后触发NK细胞的凋亡。因此，通常用于CAR-T生产的遗传编辑的病毒载体，如水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）慢病毒，在NK细胞中的转导率降低（<10%转导效率）。在VSV-G的情况下，这据说是由于NK细胞上低密度脂蛋白受体的低表达，这是VSV-G细胞进入所需的。 狒狒包膜假型慢病毒载体（BaEV-LV），它结合钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（ASCT1和ASCT2）进行细胞进入，已被报道在新鲜分离的人NK细胞中产生23%的增强转导，并至少持续21天的稳定转基因表达。对于体外遗传工程，慢病毒载体的稳定表达是一个重要考虑因素，因为细胞被工程化以永久表达转基因，然后扩增后再输注给患者。然而，病毒载体有显著的缺点，包括关于突变、毒性、免疫原性的安全问题；昂贵且耗时的生产，除此之外还有漫长的NK细胞扩增协议；以及有限的核酸载体能力，这在传递更大的第三代、第四代和第五代CAR构建时可能是有问题的。例如，用于慢病毒生产的第二代CAR构建可能在10 kbp左右，随着后续几代中添加更多组件，这个数字会增加到20 kbp。因此，需要开发更安全、更高效的非病毒遗传改造方法用于CAR-NK生产。 5.基因编辑工具用于CAR-NK细胞 遗传编辑工具的发展，如DNA转座子和规律成簇短回文重复序列（CRISPR）技术，提供了一种稳定的转基因表达的非病毒方法。转座子系统是一类具有从一个位置移动或“转座”到基因组内另一个位置能力的遗传元素，通过“剪切和粘贴”机制，使它们成为遗传工程的强大工具。最有希望用于基因治疗的转座子是源自睡美人（SB）和猪儿虫（PB）系统。转座子系统由两个组成部分构成，转座子包含感兴趣的基因，通常以质粒形式存在，以及相应的转座酶酶，可能以蛋白质或编码转座酶蛋白的mRNA形式存在。转座子由特定的DNA序列包围，称为反向末端重复序列（ITRs），被转座酶识别。一旦识别ITR，转座酶就会切出转座子，然后将其插入新的基因组位置。尽管转座子系统有稳定的基因传递潜力，但由于担心意外的基因组中断或插入性突变和免疫原性导致难以获得监管批准，还没有转座子系统进入临床。最近，为SB系统开发的迷你圈载体的生产改进，这些载体具有最小的表达盒，缺乏细菌质粒骨架，有助于克服与质粒DNA载体相关的变量转染效率和宿主细胞毒性问题，与mRNA转座酶配对使用，有助于将转座子推向临床。BioTechne的TcBuster转座子系统是一个例子，它专门为CAR-T和CAR-NK生产而开发。它由一个含有基因表达盒的纳米质粒组成，与编码转座酶酶的mRNA配对。TcBuster成功地向原代人PB NK和T细胞传递了CD19-CAR构建，也表达了EGFP，产生的CAR表达NK和T细胞产生的细胞因子（IFNγ、TNFα和CD107a脱颗粒标记）显著多于CAR阴性对照，并且有效地杀死了目标CD19表达的Raji细胞。截至2023年11月，clinicaltrials.gov上注册了七项使用转座子系统的CAR-T细胞的临床试验，表明这项技术有可能应用于CAR-NK生产。 CRISPR是一类重复的DNA序列，与CRISPR相关（Cas）基因协同作用。CRISPR技术包括三个主要组成部分：crispr-RNA，与目标基因互补；Cas核酸酶蛋白，这是一种由crispr-RNA引导到DNA上特定位置的酶，像分子剪刀一样切割DNA；tracer-RNA有助于处理和绑定crispr-RNA和Cas核酸酶。CRISPR技术已被用来增强与原代NK细胞相比免疫功能较弱的NK-92细胞系的细胞毒性。使用针对CD96和KLRC1（编码NKG2A）的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物通过核糖体电穿孔成功敲除抑制性CD96和NKG2A受体，结果只有2.8%的编辑NK-92细胞表达这些受体，而未编辑的亲本细胞为92.5%。此外，作者敲入了一个荧光mCherry基因，并替换了一个沉默的启动子，重新激活内源性CD16和DNAM-1。由此产生的CRISPR工程化NK-92细胞与未编辑的NK-92细胞相比显示出显著增强的细胞毒性，并且可以通过CD16介导的ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）对抗包括MDA-MB-231和BT-474乳腺癌细胞在内的一系列癌细胞。这项研究突出了CRISPR在工程化中利用各种NK激活和抑制受体以获得治疗效益的潜力。 转座子和CRISPR技术也可以同时使用，结合强大的遗传编辑活动。实际上，转座子工程和CRISPR/Cas9基因组编辑的结合被用来产生在PB NK细胞中表达髓样相关抗原CLL-1的强大CAR-NK细胞。TcBuster转座子系统传递了CLL-1 CAR构建，而CRISPR/Cas9载体被用来敲除NK细胞细胞因子检查点细胞因子诱导的含有SH2的蛋白（CIS，CISH基因的产物）。在CLL-1 CAR-NK细胞中同时敲除CISH与DNAM-1的减少和CD69表达的增加，NKG2D、NKp30、NKG2A、PD-1和TIGIT表达的减少有关。对控制和CLL-1 CAR-NK细胞都观察到增强的原发性AML芽细胞毒性，表明这些技术有潜力增强细胞毒性和改变NK细胞表型。同样，这种CISH敲除方法已在人类iPSC衍生的NK细胞和CB衍生的NK细胞中使用；导致增强的体内持久性、代谢健康和抗肿瘤活性。这些研究作为非病毒遗传编辑潜力的例子，但是NK激活和抑制受体之间平衡的复杂性需要进一步研究，以优化和利用这种治疗。 同样重要的是要承认围绕基因编辑工具存在安全性和伦理问题，包括转座子和CRISPR技术的风险，即插入性突变的风险。转座子基因组整合可能会激活潜在的原癌基因或中断肿瘤抑制基因，这可能导致恶性转化。尽管到目前为止SB转座子系统已经显示出良好的安全档案，但一项使用PB工程供体衍生的CD19 CAR-T细胞的临床试验导致10名患者中有2名发展出源自CD19-CAR-T细胞的T细胞淋巴瘤。尽管这项技术具有潜力，但在向临床进展之前，需要进一步的研究以确保转座子系统的安全性。包括避免可能增加原癌基因激活风险的强病毒增强子、使用“安全港”位点和位点特异性DNA结合域以实现位点特异性转座等策略，是克服转座子问题的潜在解决方案。在CRISPR的情况下，“非目标”DNA切割可能会引入不需要的突变，并可能加剧逆转录转位。减少非目标效应的方法包括优化CRISPR-Cas9系统的不同组成部分，开发主要编辑器和RNA编辑。尽管如此，在2023年11月，英国药品和保健产品监管机构（MHRA）成为第一个批准CRISPR-Cas9基因编辑疗法Casgevy（exagomglogene autotemcel）用于治疗输血依赖性β-地中海贫血和镰状细胞病的机构。这一里程碑式的批准在12月由FDA对Casgevy和Lyfgenia（lovotibeglogene autotemcel）以及欧洲药品管理局（EMA）对Casgevy的批准跟进。尽管接受Casgevy和Lyfgenia治疗的患者仍在进行这些治疗的安全性和有效性的长期评估，但这一批准无疑将为CRISPR基因组编辑技术的进一步使用和批准打开大门。 图5. 非病毒基因工程化“现成”CAR-NK细胞需要高效转染和CAR转基因的稳定表达。 1.引入编码DNA和/或mRNA中的CAR结构的CAR构建，或使用CRISPR Cas9或DNA转座子技术如PiggyBac和Sleeping Beauty进行基因编辑，以实现稳定的基因表达。2. 编码CAR构建的核酸可以通过多种非病毒递送策略传递给NK细胞，包括电穿孔、脂质纳米颗粒、细胞穿透肽或多功能纳米颗粒。3. 转染后，表达CAR构建的NK细胞在体外扩增，以生产可用于治疗多个患者的“现成”CAR-NK产品。 6.向NK细胞的非病毒基因传递 尽管非病毒基因组编辑方法具有巨大的潜力，但一个主要障碍是细胞内传递的方法。总的来说，转座子和CRISPR技术由核酸组成，无论是DNA还是RNA形式，因此需要一种细胞进入的方法。一般来说，最常用的非病毒传递方法通过物理电穿孔裸核酸，或涉及与脂质体、阳离子聚合物、蛋白质或细胞穿透肽（CPPs）的复合物的化学方法，这些复合物包装核酸并促进细胞内传递，在图5中总结。尽管在其他细胞类型中取得了成功，但与病毒转导相比，NK细胞更难转染，非病毒转染率令人失望。对于体外基因传递，基因传递的主要障碍是细胞膜、内体陷困，在DNA的情况下，是进入细胞核，为了成功的基因传递，理想的传递载体必须克服这些障碍，同时无毒。电穿孔（包括核糖体电穿孔）是用于NK细胞非病毒传递的最广泛使用的方法，转染效率高达90%，但由于对细胞施加的强电场可能导致问题，可能会增加制造时间表和成本。在电穿孔传递质粒编码报告基因绿色荧光蛋白（GFP）时，原代NK细胞的细胞存活率报告低至2%，尽管通过仔细优化提高到50%，一些电穿孔器制造商引用的存活率为80-90%。尽管如此，这些方法需要仔细优化，使用细胞因子刺激或与饲养细胞一起扩增以获得足够的转染效率和存活率。少数研究使用非病毒传递系统作为NK细胞基因传递的方法（在表3中总结），取得了不同程度的成功。 6.1.基于脂质的NK细胞递送 脂质在脂质体和脂质纳米颗粒（LNP）中被用来递送核酸，用于多种应用，包括最重要的，使用脂质纳米颗粒递送mRNA新冠疫苗，由BioNTech和Moderna两家公司开发。这些基于LNP的疫苗的批准代表了非病毒递送系统领域的一个重大突破，并为后续产品铺平了道路。脂质是含有极性头基团与疏水尾部相连的两亲分子，具有一系列属性的脂质已被用于基因递送。阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷（DOTMA）及其衍生物1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）允许包装遗传货物并通过静电相互作用和膜融合进行细胞内递送。在生理pH值下呈中性的可电离脂质，在内体的低pH值下变得质子化，促进内体释放货物。其他脂质，如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）和胆固醇类似物已被用来帮助稳定LNP结构。LNPs可能通过各种内吞途径被内化，如巨胞饮作用、网格蛋白介导的和洞穴蛋白介导的内吞作用，这在不同细胞类型之间有所不同。内化后，LNPs通常进入内体隔室，需要一种逃逸机制来释放货物。因此，通常使用具有不同属性的脂质组合来优化LNP功能。Nakamura等人开发了一种多功能信封型纳米装置（MEND），其中包含一种可电离-阳离子脂质，以促进内体逃逸，称为YSK12-C4脂质（YSK12-MEND），用于递送siRNA到免疫细胞系。作者证明了YSK12-MEND在一系列人类免疫细胞中递送编码GAPDH的siRNA的转染能力。在NK-92细胞中的基因沉默为75%，远高于商业上可用的Lipofectamine RNAiMAX的19%沉默。然而，YSK12-MEND LNP在NK-92细胞中引起了细胞毒性（在30 nM siRNA剂量下60%的细胞存活率）。该团队最近生产了由pH敏感阳离子脂质CL1H6组成的LNP，用于siRNA递送到NK细胞系。CL1H6具有与YSK12-MEND相同的亲水头基团和油酸结构作为疏水尾部，用氨基取代了甲基基团，这促进了NK-92细胞通过膜融合的细胞摄取和内体逃逸。CL1H6与LNP中的胆固醇的比例被优化为25/75，以获得更好的基因沉默效果（在递送针对GAPDH的siRNA后，GAPDH的基因沉默为90%），同时保持NK-92细胞中的良好细胞存活率（90%存活率）。对于KHYG-1细胞也报告了类似的结果。作者将这种改善的细胞存活率归因于内体逃逸期间的膜融合活性。YSK12-MEND以高度的膜融合从内体逃逸，而CL1H6-LNP仅以轻微的膜融合从内体逃逸。同样，Doukas等人最近优化了LNP配方，用于mRNA递送到NK细胞，使用可电离脂质。优化的LNP由可电离的“Lipid 5”，DSPC，β-谷甾醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）组成，在KHYG-1细胞系中产生了>80%的转染效率，在CB衍生的NK细胞中为75%，每种细胞类型的细胞存活率都>95%。Wilk等人提出了使用电荷改变可释放转运体（CARTs）将基因递送到NK细胞。CARTs是由≥1个脂质块和为mRNA递送设计的电荷改变块组成的多块寡聚体。CARTs最初是阳离子，可以与阴离子核酸复合，但在生理条件下（pH7.4）生物降解为中性二酮哌嗪小分子，促进阴离子货物的释放。在用CART递送31 ng mRNA编码GFP到PB NK细胞后，32%的细胞表达了GFP，细胞存活率为78%，这明显优于Lipofectamine 2000（0% GFP+细胞，90%存活率）和电穿孔（2% GFP+细胞，40%存活率）（注：当通过电穿孔递送的mRNA质量增加到10 μg时，转染效率提高到28% GFP+细胞，存活率为40%）。此外，CART成功产生了CD19-CAR-NK细胞，这些细胞对CD19+ Nalm6细胞具有强大的细胞毒性，死亡目标细胞比例为10%，而原始NK细胞为5%。这表明CARTs作为一种非病毒系统用于CAR-NK生成的潜力，但瞬时mRNA递送可能对体内CAR-NK细胞的扩增和效力构成问题。需要进一步的研究来扩大这种方法用于更大的体内研究，评估体内CART产生的CAR-NK细胞的寿命，并与病毒转导的CAR-NK细胞的效力进行比较。 6.2.多功能纳米颗粒用于NK细胞递送 Kim等人描述了一种由磁性Zn/Fe核、咖啡酸封顶以及表面涂覆阳离子多巴胺聚合物组成的多功能纳米颗粒（MFNPs），这些纳米颗粒与阴离子核酸形成复合物，用于向NK-92MI细胞递送CAR。磁性核使NK细胞的磁共振成像成为可能，并促进体内细胞追踪。通过MF-NPs向NK-92MI细胞递送编码表皮生长因子受体（EGFR）CAR结构的质粒，转染效率为60%，细胞存活率为98%。将EGFR-CAR-NK-92MI细胞通过尾静脉注射到无NK细胞的NOG小鼠（NOD/Shi-scid/IL2Rγnull）体内，这些小鼠携带MDA-MB-231异种移植物，与接受原始NK-92MI和PBS对照处理的小鼠相比，CAR-NK-92MI组的肿瘤生长明显减少（与原始NK-92MI和PBS对照相比，肿瘤大小分别减少了两倍和3.5倍）。进一步的工作将需要评估基于磁性NPs的生物相容性和降解特性，并确保MF-NP编辑的CAR-NK细胞在临床应用中有足够的扩增和持久性。 6.3.基于肽的NK细胞递送 基于肽的载体因生物相容性、灵活性和低毒性等优势而受到基因递送的关注。从病毒中衍生或设计模仿病毒载体序列的肽具有广泛的特定功能，使基因递送成为可能并得到增强，通常根据功能分类；DNA凝聚肽、细胞穿透肽（CPPs）、内体溶肽和核定位序列（NLS）。CPPs是短肽（5-30个氨基酸），它们有效地携带大分子货物穿过细胞膜，无需受体或其他载体。开发了一种肽辅助基因组编辑（PAGE）CRISPR-Cas系统，该系统利用CPP和内体逃逸肽在髓系细胞、原代T细胞和NK-92细胞中进行基因组编辑。设计了一种细胞穿透Cas9，由N端融合HIV TAT（GRKKRRQRRR）和4×Myc NLS，C端融合2×SV40 NLS和GFP。然后，这种细胞穿透Cas9与一个“辅助肽”共递送；融合肽（称为TAT-HA2（RRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG））由源自HIV-1的CPP TAT肽和流感A病毒血凝素（HA2）蛋白的内体逃逸肽组成。TAT-HA2辅助肽在mCherry+ EL4 T淋巴母细胞报告细胞中增强了Cas9编辑，效率从无法检测提高到85%，细胞存活率超过80%。此外，PAGE系统在NK-92细胞系中实现了78%的基因编辑，突出了CPPs在NK细胞基因编辑中的潜力。然而，这是一种复杂的工程策略，如果要递送CAR结构，将需要更多的开发。 7.NK细胞基因递送的特定挑战 目前非病毒转染NK细胞的困难因对这些高度专业化细胞中特定生物学障碍的理解不足而更加复杂，设计针对NK细胞治疗的非病毒递送系统时必须考虑NK细胞特有的元素。细胞摄取是基因递送的第一个生物学障碍，而具有专门激活和抑制受体的NK细胞比大多数细胞类型更为复杂。在细胞内摄取之后，内体逃逸是成功基因递送的第一个障碍。考虑NK细胞的特殊溶解机制很重要，以避免遗传货物在内体/溶酶体隔室中降解。此外，NK细胞通过模式识别受体（PRR）信号传导的先天免疫活性，促进了NK细胞的抗病毒活性，被认为是NK细胞对病毒载体的抵抗力，非病毒载体必须设计得避免同样的命运。克服这些NK特定的基因递送障碍对于非病毒基因递送系统在NK细胞治疗中取得成功至关重要。 7.1.NK细胞的细胞内递送 内吞作用被认为是大多数非病毒基因递送系统的主要摄取途径，可以分为网格蛋白介导、洞穴蛋白介导或微囊泡形成。摄取可能受到递送系统的性质和细胞类型等因素影响。在NK细胞的情况下，激活和抑制受体的平衡由受体的内吞作用和再循环到细胞表面来调节。例如，抑制性受体CD94/NKG2在细胞表面和细胞内隔室之间不断循环，这一过程类似于巨胞饮作用。流感病毒通过网格蛋白和洞穴蛋白依赖性内吞作用直接感染PBMC-NK细胞。感染是通过病毒HA蛋白与NK细胞表面存在的α-2,3和/或α-2,6连接的末端唾液酸的结合而发生的，特别是在激活性受体NKp46上。NKp46与病毒感染细胞表面的HA的相互作用是NK细胞识别和杀死感染靶细胞的已知机制，但看来病毒本身也可以通过与NKp46的相互作用感染NK细胞，这导致感染的NK细胞凋亡增加，NK细胞毒性活性降低。这些关于病毒感染方法的知识可能被利用来设计非病毒递送系统，就目标或避免特定摄取途径以增强基因递送而言，而不会引起不希望的激活导致NK细胞内表型变化。 阳离子递送系统，特别是富含精氨酸的肽，已知会通过静电作用结合细胞膜外表面存在的阴离子物种（例如脂质头基、肝素硫酸蛋白聚糖（HSPGs）和细胞膜上的syndecans），启动细胞摄取。Letoha等人报告称，syndecans促进阳离子CPPs（例如，TAT）的摄取。该研究表明，syndecan-4特别结合并介导阳离子CPPs通过质膜进入K562红细胞白血病细胞，更高的syndecan-4水平与更高的转染效率相关。根据细胞分化的不同阶段和细胞类型，syndecans上存在的肝素硫酸链的数量和大小各不相同。因此，不同细胞表达的syndecans可能导致不同的转染结果。HSPGs和syndecans由NK细胞表达，并已报告与激活性NCRs（NKp30、NKp44和NKp46）和KIR2DL4（抑制性受体）相互作用并调节其功能。这些受体可以识别并结合HSPG，这些HSPG通常在靶细胞（例如癌细胞）中上调，但它们也可能与NK细胞表面的HSPG结合；通过掩盖与靶细胞的相互作用或可能影响NCRs的内吞作用、降解和再循环途径，影响NK受体的功能。如果递送系统结合HSPG或syndecans进行内吞作用，可能会触发不希望的NCRs激活；影响NK细胞的激活状态或触发凋亡。因此，需要仔细设计以获得最佳的转染效率，而不扰乱NK受体状态。 受体介导的内吞作用通常被用来增强基因递送系统的转染，而主动靶向策略可能有助于克服与HSPG相关内吞作用的问题。同样，从病毒载体中获取灵感，当确定适合受体介导的内吞作用的靶标时。例如，BaEV慢病毒转导是通过与新鲜分离的人类NK细胞中的ASCT1和ASCT2结合来介导的，这可能被非病毒递送系统所针对。 7.2.NK细胞的内体逃逸 非病毒递送系统被设计为通过“质子海绵”效应或对内体中低pH值的融合活性来促进内体逃逸。然而，内体隔室的确切pH值可能因细胞类型而异，细胞系和原代细胞之间存在差异，内体中的具体功能或货物内容也会影响。在设计基因递送系统方面，关于NK细胞内体pH的文献资料很少。我们可以比较其他免疫效应细胞，如T细胞和巨噬细胞，以了解免疫细胞内体的特性，但这不能代替对NK细胞的专门评估。内体酸化在人类Jurkat T细胞中被报道比常用的评估阳离子聚合物基因递送的HeLa人类细胞系慢且不如其稳健（在摄取后240分钟内从pH 6缓慢下降至pH 5.2），而HeLa细胞系在摄取后120分钟内pH值下降至5.0，原代T细胞显示出更高的内体pH（>pH 6）。也有报道称巨噬细胞的早期内体和循环内体具有中性pH，这促进了瞬时受体电位muclipin 2（TRPML2）的活性；TRPML2是位于溶酶体隔室的钙通透阳离子通道，参与质膜蛋白的循环。TRPML2也在CD57+ NKG2C+ NK细胞中表达，被推测涉及调节激活NK细胞中的趋化因子分泌。因此，可以推断NK细胞中的内体也可能在早期内体隔室中具有更高的pH（pH>6），但需要研究来确认这一点。考虑到NK细胞的细胞毒性主要通过含有穿孔素和颗粒酶的专门分泌溶酶体或溶解颗粒来执行，因此这种溶酶体机制的存在可能会影响转染后的内体运输和逃逸。如果NK细胞的内体pH接近中性，如T细胞和巨噬细胞一样，那么这可能对需要更低pH值来触发内体逃逸的递送系统构成问题，需要进一步调查以优化针对NK细胞的递送系统设计。 7.3.避免NK细胞中的模式识别受体（PRR）激活 在感染期间，NK细胞通过PRR检测病毒或细菌病原体相关分子模式（PAMPs）的存在，PRR是NK细胞介导的先天免疫反应的重要组成部分。NK细胞表达多种PRR，包括Toll样受体（TLR）1-10、RIG1、NOD2和MDA5，这些在激活时参与诱导细胞毒性。TLR3、7、8在内体中表达并检测双链RNA（TLR3）、单链RNA（TLR7和8）和CpG DNA（TLR9）。这种核酸感应有助于病毒检测和抗病毒免疫反应。这样的PRR被认为是NK对基于病毒的转导产生抵抗力的原因之一。实际上，抑制PRR活性可以增加NK细胞中VSV-G假型慢病毒载体的转导效率。作者用BX795，一种TBK1/IKKe复合体的抑制剂，该复合体作用于PRRs RIG-I、MDA5和TLR3的下游，预处理新鲜分离的PB NK细胞，结果使慢病毒转导效率增加了3.8倍。在NK-92细胞系中也观察到在BX795存在下转导显著增强。 因此，PRR的核酸感应是NK细胞基因递送的一个障碍。mRNA或DNA货物的递送可能会激活PRRs，触发抗病毒NK过程，导致转染NK细胞的存活率差。可能可以利用修饰的mRNA来避免NK细胞中的PRR识别。核苷替换已被证明在减少PRR检测和改善mRNA翻译方面具有显著意义。常见的修饰包括用类似核苷如假尿嘧啶（ψ）或N-1-甲基-假尿嘧啶（m1ψ）替换尿嘧啶，以及用5-甲基胞嘧啶替换胞嘧啶。在“基于脂质的NK细胞递送”一节中讨论的研究包括两个使用修饰mRNA递送到NK细胞的例子。Doukas等人用LNPs递送了5-甲氧基尿嘧啶（5moU）修饰的mRNA，而McKinlay等人递送了5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA。两项研究都没有评论他们选择使用修饰mRNA的决定或选择特定修饰的原因。在mRNA疫苗领域，尤其是假尿嘧啶修饰的mRNA产生了更好的翻译，归因于减少了与RNA依赖蛋白激酶的结合。然而，需要进一步的研究来确定CAR递送到NK细胞的最佳核苷修饰。 如果要递送基于DNA的货物，例如在转座子系统中，那么应该考虑限制CpG含量。在CAR结构递送的背景下，这一点尤其重要，考虑到要递送的CAR构建物的较大尺寸。DNA迷你圈技术已被用于SB转座子系统，以帮助减小货物大小并提高转染效率。TcBuster系统使用了专门针对T和NK细胞CAR结构递送设计的“纳米质粒”技术。 8.结论和未来方向 总之，这篇综述详细分析了当前CAR-NK疗法和非病毒工程化NK细胞的状态，强调了CAR-NK作为一种有前景的癌症免疫治疗方法的潜力，以及实现这一潜力需要克服的挑战。CAR-NK疗法的使用仍处于早期阶段，但在多种癌症类型的前临床和早期临床试验中已显示出强大的抗肿瘤活性。增强的安全档案和更可扩展、成本效益更高的“现成”CAR-NK疗法的潜力将增加患者的可及性；改善患者的治疗结果和生活质量。需要开发针对NK细胞的高效非病毒工程策略，以改善CAR-NK疗法的制造过程，以支持对先进疗法日益增长的需求。到目前为止，理想的非病毒递送系统尚未开发出来，该系统能够高效地将CAR转基因递送到NK细胞中，而不会影响细胞的活性或受体状态；考虑到受体状态对NK细胞功能的重要性。有必要进一步研究新的递送系统和临床试验，以充分释放CAR-NK细胞的治疗潜力，并将这些发现转化为常规临床实践。 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摘要：追求有效的登革热疫苗已经取得了两个获批疫苗和另一个完成了第三阶段临床试验的成果。然而，每个疫苗都存在不足，这表明用于开发这些疫苗的登革热免疫知识是不完整的。疫苗试验的发现可能会完善我们对登革热免疫的理解，因为这些数据是通过实验得出的，并且是安慰剂对照的。这些试验的结果表明，仅靠中和抗体滴度不足以说明对症状性感染的保护，这暗示了细胞免疫在保护中的作用。这些发现对今后登革热疫苗的开发和应用现有疫苗以实现最大的公共卫生效益具有相关性。 1.引言 登革热是一种急性病毒性疾病，普遍存在于热带地区。据估计，每年约有1亿人受到感染。这种疾病是由四种不同的登革热病毒（DENV-1至DENV-4）中的任何一种引起的，这些病毒主要但并非仅由埃及伊蚊（Aedes aegypti）传播。这种蚊子高度适应城市环境，人类人口密度通常很高。这种与人类的密切接触和对人类血液的专一性使其成为DENV的高效传播媒介。随着A. aegypti的地理分布从热带扩展到亚热带，预计未来几十年全球登革热的负担将加剧。这种负担可能被低估了，因为除了急性疾病外，部分登革热患者还会出现长期后遗症，如疲劳、记忆力减退和注意力受损。因此，减少全球登革热的负担是一个紧迫的公共卫生优先事项。 迄今为止，A. aegypti种群的抑制是预防登革热的唯一方法。这种方法在泛美伊蚊根除计划以及古巴和新加坡的国家病媒控制计划中取得了显著的成功。然而，维持这些成功已被证明是具有挑战性的，不仅仅是因为涉及的高成本。在新加坡，长期减少DENV传播导致了一个群体免疫力低的人口，现在更容易受到流行病的影响，尽管病媒种群密度持续较低。因此，通过疫苗接种提高和维持群体水平的免疫力必须是任何成功的登革热预防计划的基石。 开发登革热疫苗的努力始于A. Sabin的基础工作。开发安全有效的疫苗的一个主要挑战是登革热病理学的复杂性。一次DENV感染后发展起来的持久适应性免疫反应是针对该DENV的；对其余三种异质DENV的保护是短暂的。此外，一次DENV感染后发展的抗体可以增强第二次异质DENV感染，增加严重登革热的风险。这种抗体依赖性增强（ADE）的DENV感染的生物学将在后面的章节中进一步阐述。为了充分保护所有四种DENV并防止ADE的风险，疫苗开发工作集中在选择能够引起对所有四种DENV类型平衡中和抗体反应的疫苗候选物上。 自Sabin的工作以来的半个多世纪后，我们现在有两种获批的活减毒四价登革热疫苗；第三种疫苗已完成第三阶段临床试验。 尽管登革热现在技术上是一种可通过疫苗预防的疾病，但仍有空间开发更多疫苗，这些疫苗在提供更好的适应性免疫反应的同时，引起的副作用更少。然而，这篇综述并不专注于已经使用或可以用于开发登革热疫苗候选物的不同疫苗平台。它也不打算为登革热流行国家的公共卫生机构提供当前疫苗的头对头比较。这篇综述的目的是通过对已完成的第三阶段临床试验的疫苗效力结果，从疫苗效力结果中提炼出对登革热免疫的更细致的理解；完善我们对登革热免疫学的知识，可以进一步巩固下一代登革热疫苗开发的基础。 2.登革热疫苗 已完成第三阶段临床试验的登革热疫苗的发展历史和不同构建已经在其他地方进行了回顾。总之，第一种获批的登革热疫苗CYD-TDV是一种基于黄热病病毒17D（YF17D）骨架的嵌合疫苗，其中YF17D的前膜（PrM）和包膜（E）基因已被DENVs的基因所取代（图1）。然而，由于在没有先前DENV感染的情况下接种疫苗会增加严重登革热的风险，可能由于ADE，其使用仅限于那些有先前DENV感染的人。第二种疫苗TAK003，使用减毒DENV-2骨架，其PrM和E基因被野生型DENV-1、DENV-3和DENV-4的基因所取代（图1）。这种疫苗最近获得了欧盟的批准，用于4岁及以上人群，即使在没有先前DENV感染的人中也可以使用。第三种疫苗TV003最近完成了第三阶段临床试验，并取得了有希望的结果。这种四价疫苗是通过在DENV-4和DENV-1的3'非翻译区删除30个核苷酸（rDEN4∆30和rDEN1∆30），以及从DENV-3删除30和31个核苷酸（rDEN4∆30/31）构建的。DENV-2组分是通过将DENV-2 PrM和E基因拼接到rDEN4∆30骨架中构建的（图1）。 由于上述疫苗是活的，尽管是减毒的，并且是四价的，疫苗接种应该理想地导致四种同时的DENV感染，从而推动所有四种DENV的E蛋白的B细胞反应（图1）；将PrM基因拼接到嵌合构建中是确保适当的E蛋白折叠和病毒粒子成熟所必需的。随着病毒血症感染，更有可能发展出高结合亲和力和类型特异性的中和抗体。疫苗病毒血症的持续时间是与相关黄热病疫苗的中和抗体滴度的直接相关性，可以说是世界上最强大的疫苗。因此，由于CYD-TDV疫苗接种主要产生嵌合YF17D-DENV-4病毒血症，CYD-TDV疫苗接种主要产生DENV-4特异性中和抗体；对DENV-1至DENV-3的中和主要是由于交叉中和抗体。同样，TAK003疫苗接种仅产生可检测的DENV-2病毒血症，导致相应的DENV-2特异性中和抗体的富集。 图1. 登革热病毒(DENV)的主要免疫原性蛋白和三种活减毒四价登革热疫苗的分子结构。 登革热病毒(DENV)是一种单股正链RNA病毒，包括三种结构蛋白[衣壳(C)、前膜(PrM)和包膜(E)]和七种非结构蛋白(NS1至NS5)。针对DENV的抗体反应主要针对PrM、E和NS1蛋白。DENV特异性CD4+ T细胞反应主要针对C蛋白，其次是E、NS3、NS2A/B和NS5，而CD8+ T细胞反应主要针对NS3，其次是C、NS5和NS4A/B。 CYD-TDV是基于减毒黄热病(YFV)骨架，其PrM和E基因被替换为四种DENV血清型各自的基因。 TAK003使用减毒DENV-2骨架，其PrM和E基因被野生型DENV-1、DENV-3和DENV-4株的基因所取代。 TV003是通过在DENV-4和DENV-1的3'非翻译区删除30个核苷酸(rDEN4∆30和rDEN1∆30)以及从DENV-3删除30和31个核苷酸(rDEN4∆30/31)构建的。DENV-2组分是通过将DENV-2 PrM和E基因拼接到rDEN4∆30骨架中构建的。 这张图展示了DENV病毒的主要免疫原性蛋白和三种不同疫苗的分子设计。了解这些疫苗的构造有助于我们理解它们如何诱发免疫反应，以及为何它们可能在效力和安全性方面存在差异。 TV003疫苗接种可以产生所有四种DENV组分的病毒血症。相应地，TV003疫苗接种后产生了针对四种DENV的特异性中和抗体。然而，在进入第三阶段临床试验的TV003配方中，也称为Butantan DV，每个参与者最多只能检测到四种DENV组分中的两种病毒血症。值得注意的是，MSD（美国默克公司）的TV003专有配方V181的第一阶段临床试验，在大多数接种疫苗的个体中产生了四价病毒血症。将V181的未来疫苗效力研究结果与Butantan DV观察到的结果进行比较，可能会进一步揭示疫苗病毒血症如何塑造登革热免疫。尽管如此，这篇综述将关注从Butantan DV配方的TV003中可以得出的登革热免疫学课程，因为它已完成了第三阶段临床试验。 非中和抗体可以触发保护性Fc效应功能，如补体激活和抗体依赖性细胞毒性（抗体依赖性吞噬作用将在后面的章节中更详细地介绍）。针对非结构蛋白1（NS1）的抗体，其在登革热病理学中的作用将在后面的章节中更详细地讨论，也从疫苗接种中产生；然而，这些抗体将针对用作疫苗遗传骨架的病毒（图1）。同样，尽管在E蛋白中发现了CD4+ T细胞表位，但大多数T细胞表位，特别是CD8+ T细胞表位，位于衣壳（C）和NS蛋白中（图1）。因此，大多数疫苗诱导的细胞免疫反应将针对用作遗传骨架的病毒的NS蛋白，因此可能不会在所有四种DENV中平衡。 对症状性DENV感染的疫苗效力在四种DENV类型之间有所不同。此外，所有三种疫苗在有先前DENV感染（基线时血清阳性）的人群中显示出比那些没有感染过至少一种DENV（基线时血清阴性）的人更高的效力。CYD-TDV、TAK003和TV003临床试验的效力终点总结在表1中。关于保护的持久性和加强剂量的需求仍然存在问题。免疫减弱在多大程度上会影响登革热病理学，以及DENV的类型，仍然不确定。 3.理解登革热免疫的挑战 对登革热免疫的了解不得不依赖于流行病学观察的描述性数据。这些数据的质量取决于用于检测和分型登革热病例的研究或监测方法的灵敏度。鉴于临床表现的广泛范围，可能受到诸如DENV株、种族和年龄等因素的修改，再加上在感染期间在一致的时间点获得人类样本的困难，因此数据中存在相当大的异质性也就不足为奇了。这种异质性阻碍了识别登革热保护的免疫相关性。 除了从流行病学研究中得出明确的免疫保护相关性的困难外，对登革热免疫的理解也受到缺乏一个能够密切再现人类DENV感染和疾病病理学的动物模型的限制。产生疾病的小鼠模型大多是免疫缺陷的，特别是通过敲除干扰素（IFN）信号通路中的基因，这是人类对DENV感染免疫反应的关键部分。因此，不能直接将小鼠研究的结论外推到人类登革热。非人灵长类动物（NHPs）可以被DENV感染，尽管大多数在可检测的病毒血症情况下并不发展成类似登革热的疾病。因此，将动物中的登革热免疫研究近似于人类免疫是不确定的。 获得实验性和适当控制的数据的方法之一是应用控制人类感染模型（CHIM）。Sabin的登革热疫苗开发工作依赖于在人类志愿者中进行的这种实验性感染研究。尽管现在以类似的方式进行这种挑战性研究在道德上是不合理的，但值得注意的是，Sabin使用了未传代的野生型DENVs，并没有在任何感染的志愿者中观察到严重的登革热。人类感染研究的最新方法使用了部分减毒的DENVs，以获得更大的安全边际。这种挑战性感染的临床表型范围从无热病毒疹（55）到轻微的类似登革热的自限性急性疾病。然而，使用部分或自然减毒的DENV株可能会低估保护野生型DENVs引起的症状性感染所需的免疫力程度。例如，TV003疫苗接种在未暴露于DENV感染的个体中，在用部分减毒的DENV-2（rDEN2Δ30 Tonga/74）株挑战时，对病毒血症结果提供了100%的保护。然而，rDEN2Δ30 Tonga/74感染仅产生最大病毒血症2.9 log10斑块形成单位（PFU）/ml。另一种引起自限性发热疾病的人类感染模型使用了部分减毒的DENV-1株，其峰值病毒血症范围为4.1至4.8 log10 PFU/ml；这些个体中相应的病毒RNA血症为5.9至7.9 log10 RNA拷贝/ml。相比之下，登革热患者的RNA血症通常在诊断时为6至9 log10病毒RNA拷贝/ml。尽管实验性和自然获得的DENV感染结果之间的接种剂量和感染途径（皮下注射与通过蚊子叮咬的皮内接种）不同，但更大的病毒负担可能需要更强大的适应性免疫反应，以防止疫苗接种后出现症状性结果。在基线时血清阴性的个体中，TV003在预防症状性感染的效力点估计，尽管是在接种后2年而不是在接种后6个月的挑战感染时测量的，为57.9%。总体而言，我们认为CHIM是一种极其有用的方式来筛选不太可能实现理想程度效力的疫苗候选物，以避免进一步昂贵的临床开发，但它还没有达到我们可以准确外推真正疫苗效力的阶段。 临床试验提供了假设驱动的、安慰剂对照的实验数据，这些数据来自大样本量；这四项登革热疫苗的第三阶段试验每项都招募了超过15,000名参与者。它们在登革热流行地区进行，野生型DENVs通过自然的伊蚊-人类周期传播。这些试验还普遍使用主动病例检测来确定疫苗效力；所有发热病例都使用最敏感的诊断工具，即逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测DENV感染。因此，第三阶段试验结果和长期随访观察是完善我们对登革热免疫知识的良机。 4.体液免疫 在20世纪40年代和50年代，登革热血清学被开发并用于测试恢复期血清样本，以寻找DENV感染的证据。从血清学检测和恢复期血清研究中获得的经验表明，病毒中和试验，如斑块减少中和试验（PRNT）和焦点减少中和试验，提供了最大的特异性，以确定初次DENV感染的历史。鉴于大多数二次登革热病例是由与初次感染不同的DENV异型引起的，以及在NHPs中的实验研究，人们认为中和抗体对于登革热免疫是绝对必要的。 4.1.中和抗体和PRNT 首先使用在玻璃处方瓶中生长的细胞单层开发了一种用于DENV中和抗体的斑块减少试验。这种“宏观”试验使用0.4 ml的血清与固定接种量的DENV反应，起始血清稀释度为1:10。这种方法最终被“微观”PRNT所取代，后者需要更少的血清体积和在12孔或24孔组织培养板中生长的细胞单层。由于“宏观”试验被用作“微观”PRNT开发的参考点，大多数人继续使用相同的起始稀释度1:10。因此，在起始稀释度1:10时，病毒接种量的50%或更多被中和（PRNT50）被广泛解释为恢复期血清中的阳性发现。 鉴于DENV感染产生对引起感染的DENV的持久免疫力的假设，恢复期登革热患者中和同型DENV的PRNT50滴度为10或更高通常被假定为免疫的指标。然而，最近的研究表明，对于四种DENVs没有单一的保护性中和抗体阈值。一项队列研究表明，与配对的感染前血清相比，恢复期血清中中和抗体滴度下降不到四倍的个体容易再次感染同株DENV；因此，单独可检测的中和抗体滴度不足以防止同型再次感染。此外，似乎保护免受症状性感染所需的中和抗体阈值在所有四种DENVs中并不一致。CYD-TDV第三阶段临床试验的血清学数据分析后表明，与其他三种DENVs相比，需要更高的中和抗体滴度来保护免受症状性DENV-2感染（表2）；即使比较仅限于DENV-1至DENV-3，其中抗体大多不是针对这三种DENVs的特异性，抗体滴度的差异仍然惊人。同样，一项基于登革热群集的调查发现，与病例有密切接触的人由于病例受到DENV-1和DENV-4感染的保护，当他们的PRNT滴度分别为11和16时，有类似的高概率暴露于传染性蚊子叮咬；相比之下，保护免受DENV-2感染需要PRNT滴度为323。这些发现共同表明，不仅没有单一的中和抗体滴度阈值来保护所有四种DENVs，而且与其它DENVs相比，保护免受DENV-2感染需要更高的中和抗体滴度。 4.2.DENV中和的化学计量 四种DENV病毒颗粒共享一个共同的结构：内核壳被病毒E和膜（M）蛋白包围，这些蛋白显示在来源于内质网的脂质膜上。冷冻电子显微镜图像显示，外层脂质膜上装饰着180个E蛋白和180个M蛋白，并排列成60个不对称的二十面体单元。当足够的E蛋白与抗体结合时，DENV会被中和，而化学计量取决于抗体如何以及在哪里结合E蛋白。 DENV中和的化学计量可能会受到病毒成熟程度的影响。由于DENV从其复制位点通过转高尔基网络进行细胞排出，M蛋白的pr肽的不完全蛋白水解可能会影响病毒的成熟程度。在培养中，未成熟的病毒颗粒更可能被产生，而在人类感染中则可能低估中和DENV所需的抗体量。然而，目前没有证据表明DENV-2产生的成熟病毒颗粒比其他DENV更多，因此不太可能解释保护所需的更高中和抗体阈值之间的差异。 DENV中和的化学计量要求理论上会偏向于结合由两个或更多E蛋白组成的四聚体表位的抗体；中和每个病毒颗粒所需的抗体会更少。许多从恢复期个体中分离出的DENV特异性单克隆抗体结合了这样的四聚体表位。由于对同型DENV再次感染的保护被认为是持久的，因此这种特异性四聚体表位结合的中和抗体的存在可以逻辑上推断出特异性免疫。 来自第三阶段临床试验的效力结果对这一逻辑提供了混合支持。尽管来自CYD-TDV和TAK003疫苗接种的特异性抗体的存在与各自的特异性疫苗效力相一致，但TV003试验的初步报告则建议更细致的解释。在CYD-TDV和TAK003中，接种后产生的主要特异性抗体分别是针对DENV-4和DENV-2。相应地，这两种不同疫苗提供的最高保护分别是针对DENV-4和DENV-2的症状性感染。相比之下，TV003疫苗接种发现对所有四种DENV产生了可比的特异性抗体滴度，尤其是针对DENV-1和DENV-2。尽管如此，在没有先前DENV感染的个体中，Butantan DV（与TV003类似）对症状性DENV-2的效力低于对DENV-1感染的效力（57.9%对85.5%）。在撰写本综述时，尚不清楚这一差异是否具有统计学意义，因为这些点估计的95%置信区间尚未报告。因此，尽管每种DENV特异性中和抗体提供了一定程度的保护，但保护每种DENV所需的滴度是不同的。 4.3.特异性DENV中和的差异阈值可能反映抗体依赖性感染的倾向 DENV感染髓源性细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。除了通过相应受体介导的内吞作用进入外，抗体装饰的DENV还可能通过激活Fcγ受体（FcγRs）被这些抗原呈递细胞摄取。由于DENVs共享相当大比例的结构抗原，感染一种DENV类型会诱导与其他DENV血清型交叉反应的抗体。因此，亚中和浓度的交叉反应抗体可能通过提供DENV一种替代的激活FcγR介导的进入途径来促进感染。通过激活FcγRs的进入似乎也是一种比相应受体介导的内吞作用更有效的病毒进入途径。这种进入途径与在二次感染中增加严重疾病的风险相关，该二次感染是由与引起初次感染的DENV异型引起的。同样，母体中和抗体浓度的减少到增强感染的浓度也与严重登革热风险的增加相关。这一过程被称为DENV感染的ADE。 在人体中，预防DENV-2感染所需的更高抗体浓度可能反映了四种DENV之间ADE风险的差异。尽管ADE被广泛认为是严重二次登革热的致病机制，但这一过程比人们所理解的要复杂得多。来自尼加拉瓜的一项队列研究观察到，只有在基线感染前抗体滴度处于限制范围内时，严重登革热的最大风险才会出现。泰国的另一项研究使用不同的血清学检测也得出了相同的结论。实验上，活减毒黄热病毒（DENV所属的黄病毒属的原型病毒）感染仅在具有由日本脑炎疫苗接种产生的特定范围的交叉反应抗体滴度的人群中增强。 适合ADE的抗体滴度的限制范围可能是由于对适当大小的病毒-抗体免疫复合物的需求，以便最佳共同结合适当的免疫受体。高抗体浓度会聚集DENV形成大的免疫复合物，这些复合物共同结合了较少的但具有抑制作用的FcγRIIB。FcγRIIB含有一个细胞质免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM），其信号传导阻止病毒进入，从而抑制ADE（图2A）。激活FcγRs，如FcγRIIA，含有一个细胞质免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），促进DENV-抗体复合物的摄取。它还迅速诱导抗病毒功能的干扰素刺激基因（ISGs）的表达，并限制病毒复制（图2B）。 图2. 抗体依赖性增强（ADE）需要抗体与DENV的最佳比例以适当地结合细胞受体。 A) 较高的抗体：DENV比例导致DENV聚集并共同结合抑制性Fcγ受体IIb（FcγRIIB），该受体通过其免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）细胞质尾部发出信号，以抑制免疫复合物的摄取。 B) 在中等抗体：DENV比例下，免疫复合物的大小足以共同结合激活FcγR，此处描绘为FcγRIIA，它具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）细胞质尾部。在这种情况下，DENV感染仍然受到抑制，要么是通过抗体结合足够数量的表位以防止DENV与内体膜融合，从而将RNA释放到细胞质中（左），要么是通过ITAM介导的信号传导上调干扰素刺激基因（ISGs），在髓源性细胞中诱导抗病毒状态（右）。 C) 在亚中和抗体：DENV比例下，DENV与白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）之间的额外相互作用，该受体具有ITIM信号传导细胞质尾部，抑制ISG的诱导，从而促进一个更有利于增强DENV感染的细胞质环境。 这张图说明了ADE过程中抗体与DENV相互作用的复杂性。不同比例的抗体与病毒结合可能导致截然不同的结果，从抑制感染到促进感染。这种理解对于开发能够有效预防DENV感染和ADE的疫苗至关重要。 为了使ADE发生，DENV必须在不触发ISG表达的情况下，通过激活FcγR介导的摄取。它通过结合白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）实现这一点，该受体发出信号以抑制宿主髓源性细胞中ISGs的上调（图2C）。抗体-DENV复合物在进入髓样细胞时的相互作用使病毒能够逃避宿主抗病毒反应，这是仅通过非ADE进入途径无法实现的。鉴于这些相互作用的需求，四种DENV可能具有不同的固有ADE倾向。 长期以来，人们一直怀疑四种DENV以不同的方式利用FcγR介导的进入途径。在DENV-2流行的时期进行的研究发现，在母体抗体减弱时，婴儿患严重登革热的风险增加。相比之下，当主要流行病毒为DENV-3时进行的研究没有显示出类似的风险增加。在泰国Khampaeng Phet进行的研究发现DENV-1和DENV-3是症状性初次登革热的主要原因。相比之下，通过母体抗体增强，婴儿中DENV-2感染的症状性感染率增加，二次感染中DENV-2感染也是如此；症状性二次感染与初次感染的比例在DENV-4中也更高，尽管在这个队列中症状性DENV-4感染的总体比例最小。对1994年至2006年在曼谷报告的登革热病例进行的纵向分析也发现了类似的趋势：DENV-1和DENV-3更常与初次登革热相关，而二次感染的DENV-2更常与登革热出血热相关。DENV-2也更常与登革热休克综合征相关。最后，对越南6年报告的登革热病例进行的建模也发现DENV-2是二次感染中症状性登革热的最大风险因素。 来自最近一项研究，该研究涉及超过5600例登革热病例，发现高血浆病毒血症、二次感染和DENV-2感染是与严重登革热风险增加相关的因素。此外，在疾病早期发热阶段通常检测到的病毒血症范围内（血浆6至9 log10病毒RNA拷贝/ml），血浆渗漏（图3A）和严重登革热（图3B）的风险在二次感染DENV-2的患者中最高。总的来说，这些发现表明DENV-2对感染的保护免疫学要求最高。 图3. 二次DENV-2感染与血管渗漏和严重登革热风险最高相关。 A) 显示了经历二次DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4感染的登革热患者的血浆渗漏概率。 B) 显示了经历二次DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4感染的患者的严重登革热概率。每个图表中虚线之间的区域代表了在疾病发热阶段通常在登革热患者中检测到的病毒血症量。 这些图表说明了在二次感染时，DENV-2感染与血浆渗漏和严重登革热风险之间的关联性。虚线区域表示在登革热患者发热期间通常检测到的病毒血症水平，这强调了在这一阶段控制病毒血症的重要性，以减少严重并发症的风险。 4.4.抗NS1抗体 尽管主要针对DENV的PrM和E蛋白的中和抗体在疫苗效力中起着重要作用，但一些人提出有效的登革热疫苗也应该引发针对NS1的抗体。NS1是DENV在急性感染期间唯一从细胞分泌的蛋白，在DENV病理学的实验模型中被认为是内皮功能障碍和血管渗漏的直接原因，也是从免疫细胞释放促炎细胞因子的驱动因素。相应地，抗登革热NS1抗体似乎在小鼠感染模型中发挥保护作用。接种NS1疫苗的小鼠受到致命病毒挑战的保护，最近，两种针对黄病毒NS1的单克隆抗体被证明可以减少病毒血症、内皮功能障碍和血管渗漏，从而提高DENV感染小鼠的存活率。重要的是，与E蛋白的交叉反应或亚中和抗体不同，抗NS1抗体不能诱导ADE。 尽管一些研究发现NS1抗原血症与严重疾病之间存在关联，但其他研究显示了相互矛盾的结果。二次感染DENV-2的患者比初次感染的患者更可能有不可检测的NS1浓度，尽管同一研究也发现高NS1浓度与血小板减少的低谷相关。尽管NS1的致病作用和抗NS1抗体的保护功能尚未在临床上得到证明，但登革热疫苗引发抗NS1抗体可能对潜在调节突破性症状性感染的疾病严重程度有一些益处。 5.细胞免疫 迄今为止，登革热疫苗的开发主要集中在诱导高滴度和平衡的中和抗体，以预防DENV引起的症状性疾病。然而，中和抗体只是适应性免疫反应的一个组成部分。由CD4+和CD8+ T细胞驱动的细胞免疫在病毒控制和预防疾病方面也起着重要作用。辅助CD4+ T细胞通过分泌如IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子，支持免疫系统的其他部分，如B细胞和巨噬细胞，而细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死病毒感染的细胞。因此，中和抗体和细胞免疫反应在控制感染和减轻疾病严重程度方面发挥互补作用。 T细胞在DENV感染中的角色一直存在争议，既有病理学作用也有保护作用。以前认为，初次DENV感染期间诱导的抗原特异性T细胞会在二次异型感染期间导致低亲和力、交叉反应记忆T细胞的扩增，由于清除病毒的能力较低和分泌炎症细胞因子，导致免疫病理学增加，这一现象被称为原始抗原罪。在泰国儿童登革热住院治疗的研究中发现，二次感染中DENV特异性T细胞对感染血清型的亲和力较低，对可能负责先前感染的其他血清型有更强的亲和力。这些T细胞研究是在患有严重登革热的儿童的感染急性阶段进行的。因此，这种“原始抗原罪”解释可能只代表一部分二次登革热患者。与疾病急性期不同，在从登革热中恢复的人中进行的研究发现了强烈的交叉反应T细胞反应。现在越来越认为T细胞在登革热中可能发挥保护作用，DENV特异性T细胞反应与保护效力相关。在与减少严重疾病易感性相关的人类白细胞抗原（HLA）等位基因的个体中，发现了更强大和多功能的抗原特异性CD8+ T细胞反应。同样，DENV感染诱导细胞溶解性DENV特异性CD4+ T细胞，与保护性HLA DR等位基因相关。在泰国学龄儿童的巢式病例对照研究中，具有更高频率的分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的DENV特异性T细胞的儿童更有可能发展为无症状而不是症状性DENV感染。这些观察结果表明T细胞在登革热中具有保护作用。 CD8+ T细胞对DENV的反应主要针对NS3蛋白，其次是C、NS5和NS4A/B，而CD4+反应主要针对C，其次是E、NS3、NS2A/B和NS5。这些DENV反应性T细胞的细胞免疫可能在中和抗体滴度不足以灭菌感染时迅速清除感染方面尤为重要。T细胞的功能作用在异体肾移植受者中得到了证明，他们接受了T细胞抑制治疗以预防移植排斥。由于T细胞计数低，这些患者的DENV感染过程延长，最终只有在T细胞计数恢复到接近正常值下限时才清除感染。 5.1.登革热疫苗接种引发的T细胞反应 CYD-TDV使用黄热病（YF17D）骨架，因此缺乏包含大部分CD8+ T细胞表位的DENV NS蛋白（图1）。尽管YF17D疫苗接种诱导的T细胞对DENV有一定程度的交叉反应，但这些反应往往有限且幅度小得多。例如，尽管基线时对登革热不了解的个体接种CYD-TDV后对YF17D NS3产生了强烈的CD8+ T细胞反应，但对DENV NS3的交叉反应性CD8+反应却很弱。这种缺乏强烈的DENV特异性T细胞反应可能是CYD-TDV对DENV-1和DENV-2效力不佳的原因之一。 TAK003则使用减毒DENV-2病毒PDK53作为DENV-1、DENV-3和DENV-4构建的骨架。在对TAK003接种的登革热不了解和接触过登革热的青少年中，针对DENV-2 NS1的IFN-γ分泌CD4+和CD8+ T细胞的频率最高，对DENV-1、DENV-3和DENV-4 NS蛋白也观察到可检测的，尽管较低的交叉反应性反应。在黄病毒不了解的成年人中也报告了类似的发现。TAK003诱导的T细胞反应反映了其效力概况，对DENV-2的临床效力最高，与其他三种血清型相比：DENV-2为97.7%，DENV-1为73.7%，DENV-3为62.6%；由于病例不足，DENV-4的效力结果不确定。 TV003诱导了一种广泛且多功能的CD8+ T细胞反应，反映了自然二次DENV感染的情况；超过90%的反应针对保守的DENV序列，表明TV003诱导的T细胞反应应该能够识别所有四种血清型。这种四价疫苗接种后的T细胞反应与单价疫苗接种后的反应形成对比；保守序列在DENV1∆30中只占46%，在DEN2/4∆30中占16%，在DEN3∆30/31中占54%，在DEN4∆30中占7%。此外，单价疫苗诱导的T细胞既针对结构蛋白也针对NS蛋白，尽管四种DENVs的CD8+ T细胞免疫优势模式存在差异。例如，51%的CD8+ T细胞反应在DENV-3感染后针对结构蛋白，而在DENV-2感染后只有19%针对结构蛋白。这些差异可能是由于不同DENVs感染期间抗原处理和呈现的差异所致。因此，尽管几乎所有由四价疫苗诱导的CD8+ T细胞反应都被观察到针对NS蛋白（主要是NS3和NS5），类似于二次感染后的反应，但目前尚不清楚仅针对保守表位的T细胞是否在不同血清型中同样具有保护作用。 5.2.常规测量细胞免疫 现在很清楚，有效的登革热疫苗应能够诱导DENV特异性细胞免疫，但目前尚不清楚这一最小阈值需要是多少。细胞免疫很少作为DENV疫苗开发的保护相关因素进行评估，疫苗开发商和监管机构几乎完全依赖于抗体滴度来识别疫苗候选物。一个促成因素是缺乏标准化的T细胞检测，这些检测既简单易行又易于解释。DENV特异性T细胞只占体内所有T细胞的一小部分，通常需要复杂的功能性检测才能被检测到。目前使用的检测方法，如IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）和基于流式细胞术的检测，劳动强度大，耗时长，需要高度专业化的技术专长和设备。此外，这些检测通常在需要大量血液的外周血单核细胞上进行；这使它们不适合大规模部署，特别是在儿童人群中。幸运的是，现在有了更用户友好的T细胞检测方法。例如，最近开发的一种快速细胞因子释放检测只需要少量的全血（<1 ml），在评估严重急性呼吸综合征冠状病毒2特异性T细胞反应方面显示出良好的敏感性和特异性。这种标准化检测的使用可以扩展到DENV疫苗开发，并能够定义结合抗体和T细胞测量的保护相关因素。 6.登革热疫苗的未来 从第三阶段临床试验中可以学到的教训是，登革热疫苗需要引发全面的适应性免疫反应。中和抗体可以提供保护，但可能需要在没有先前DENV感染的人群中达到过高的滴度。此外，尽管中和抗体可以预防感染，但维持这种抗体的持续滴度可能需要反复接触DENVs。引发针对NS1蛋白的体液反应，以及针对C和NS蛋白的CD8+ T细胞反应，可能会产生预防登革热和严重登革热所需的多层次免疫反应。缺乏这种多层次反应可能解释了在没有先前DENV感染的CYD-TDV疫苗接种者中观察到的住院和严重登革热风险增加。相比之下，至少部分是由于这种多层次的DENV导向反应，尽管在没有先前DENV感染的TAK003疫苗接种者中缺乏对症状性DENV-3感染的效力，但避免了登革热住院人数的增加。TAK003的第四阶段临床研究应该能够进一步阐明这些适应性免疫反应在预防登革热和严重登革热中的作用，特别是在没有先前DENV感染的情况下由DENV-3引起的登革热。 理想的登革热疫苗应该能够预防症状性感染和DENV传播。这样的疫苗需要强有力地引发中和抗体和T细胞的反应，鉴于它们在免疫中的互补作用。然而，即使登革热疫苗不能在所有四种血清型中实现高滴度的中和抗体，能够诱导广泛和持久的T细胞反应的疫苗仍然可能在预防登革热住院和严重疾病方面非常有效。从我们对2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗的经验中可以得出类似的教训；尽管目前的COVID-19 mRNA疫苗由于抗体逃逸突变而无法持续保护免受Omicron变体的感染，但通过保留病毒特异性T细胞反应，仍然维持了对严重疾病的保护。此外，疫苗接种在群体水平上也带来好处：在世界卫生组织建议进行预接种以确保只对有先前DENV感染的人进行疫苗接种之前进行的CYD-TDV疫苗接种的建模表明，如果这种疫苗定价有竞争力，对于高登革热流行国家，这种疫苗具有成本效益。因此，TAK003和TV003疫苗接种的改善总体结果可能会为流行国家带来更大的成本效益。因此，一种疫苗即使不能完全保护免受症状性感染或传播，但能预防住院和严重登革热，可能不是完美的，但仍然是群体水平登革热控制的有用解决方案。 最后，我们建议，在一种能够完全保护免受所有四种DENV疾病侵害的单剂量疫苗可用之前，异源初免-加强策略可以利用每种疫苗的优势，同时克服它们的局限性。临床观察表明，在两次感染后，第三次和第四次DENV感染大多是无症状的。因此，例如，先用TAK003进行一次剂量的初免，然后用CYD-TDV进行加强，可以模拟连续感染，因为疫苗病毒血症研究表明这些疫苗的感染类型不同；TAK003显示可测量的DENV-2疫苗病毒血症，而疫苗病毒血症主要从CYD-TDV的DENV-4其次是DENV-3组分中检测到。也可以设想与TV003的类似组合。因此，异源初免-加强策略可以消除多年疫苗开发的需求，使登革热不再仅仅是理论上的，而是真正可以通过疫苗预防的疾病。