EBNA1

导读：EBV潜伏蛋白在许多EBV相关癌症中表达，并促进了癌变过程，使它们成为这些癌症的重要治疗靶点。10月27日，中山大学曾木圣研究团队在期刊《ADVANCED SCIENCE》上在线发表题为“mRNA-based Vaccines Targeting the T-cell Epitope-rich Domain of Epstein Barr Virus Latent Proteins Elicit Robust Anti-Tumor Immunity in Mice”的研究论文，研究结果表明，本研究开发的基于mRNA的EBV治疗疫苗为治疗EBV相关恶性肿瘤提供了一种有前景的新策略。然而，还需要进一步研究来评估它们在临床试验中的安全性和疗效，并优化其设计以增强其治疗潜力。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202302116研究背景 01 EBV是人类首个被鉴定为致癌病毒的病毒，已感染全球超过90%的人口。EBV主要感染上皮细胞和B细胞，约占人类恶性肿瘤的约2%。EBV的持续存在是由于其能够在宿主细胞中建立潜伏感染并逃避免疫识别的能力。通常，EBV感染发生在儿童期，并且通常没有症状。随后，EBV可以在宿主细胞中建立潜伏感染并逃避免疫识别，通常可以持续宿主的一生。EBNA1在EBV相关肿瘤中持续表达，并且对于维持和复制EBV基因组至关重要，而EBNA3A在EBV诱导的淋巴瘤中上调表达，并且可以在体外诱导出强效的抗EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。此外，与健康人的对照淋巴细胞相比，EBV诱导的淋巴瘤细胞的LMP2A、EBNA1和EBNA3A的mRNA水平分别增加了38倍、1157倍和1154倍。因此，这些EBV潜伏蛋白是有希望用于治疗疫苗的候选物。基于mRNA的疫苗由于其能够诱导安全、有效和持久的免疫反应，最近已经成为癌症疫苗开发的一种有前途的技术。这些疫苗可以有效地引发细胞和体液免疫反应，并且它们不会产生显著的抗载体免疫力，这使得可以进行重复的接种。此外，mRNA疫苗不含有DNA，消除了基因组整合的风险。它们的良好安全性得以证明，因为在冠状病毒疾病的mRNA疫苗中观察到，它们无法整合到宿主基因组中或重新激活潜伏病毒。此外，mRNA可以在体内直接表达，这使得它成为难以在体外纯化的抗原的有吸引力的替代品。研究发现 02 本研究开发并测试了三种mRNA疫苗，分别编码EBV潜在蛋白的T细胞表位丰富区域，包括Trunc-LMP2A、Trunc-EBNA1和Trunc-EBNA3A。这些疫苗在小鼠中有效激活细胞和体液免疫，并在抑制肿瘤进展和改善携带肿瘤小鼠的生存时间方面显示出有希望的结果。此外，观察到截断形式的抗原Trunc-LMP2A、Trunc-EBNA1和Trunc-EBNA3A比全长抗原更有效地激活特异性抗原免疫反应。综上所述，研究结果表明基于mRNA的治疗性疫苗对EBV潜伏蛋白的T细胞表位丰富区域具有有效性，并为EBV相关癌症提供了新的治疗选择。Trunc-LMP2A-RNP在携带肿瘤的小鼠中提供了更优越的保护 03 我们进一步研究了Trunc-LMP2A-RNP的抗肿瘤效果是否与更强的T细胞免疫相关。首先，我们将2×105表达全长LMP2A的B16细胞接种到C57BL/6小鼠体内，然后通过静脉注射给予RNP疫苗。根据第23天的生物发光信号，与无关对照组相比，Trunc-LMP2A-RNP和FL-LMP2A-RNP在抑制肿瘤进展方面表现出类似的效果。然而，接受Trunc-LMP2A-RNP处理的小鼠的存活时间显著长于接受FL-LMP2A-RNP处理的小鼠。这表明Trunc-LMP2A-RNP在携带肿瘤的小鼠中提供了比FL-LMP2A-RNP更好的保护。此外，我们使用皮下肿瘤模型，在BALB/c小鼠体内皮下接种过表达LMP2A的1×105 4T1细胞。Trunc-LMP2A-RNP和FL-LMP2A-RNP对肿瘤进展的抑制作用明显强于无关-RNP组。在第28天，无关-RNP组中约85%的小鼠死亡。而FL-LMP2A-RNP组有一只小鼠在第28天死亡，而Trunc-LMP2A-RNP组没发生死亡。研究结果 04 综上所述，本研究开发的基于mRNA的EBV治疗疫苗为治疗EBV相关恶性肿瘤提供了一种有前景的新策略。然而，还需要进一步研究来评估它们在临床试验中的安全性和疗效，并优化其设计以增强其治疗潜力。参考资料：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202302116

作为鼻咽癌筛查的新型生物标志物，P85-Ab比当前标准的双抗体检测拥有更高的灵敏度、特异性以及阳性预测值，且两者联合使用效果更佳。这有助于提高人群对鼻咽癌筛查的接受程度，降低鼻咽癌相关死亡率。 鼻咽癌是一种发生于鼻咽粘膜的上皮类恶性肿瘤，与EB病毒（EBV）感染密切相关，在全球的地理分布极不平衡。我国鼻咽癌每年新发病例占全球的47.7%，男性发病率是女性的2.5倍，且南方属于高流行地区[1]，这使得越来越多的中国学者关注鼻咽癌研究领域。 厦门大学的夏宁邵教授、葛胜祥教授和中山市人民医院的季明芳教授等人，找到了鼻咽癌筛查新型生物标志物P85-Ab，并在超过2.5万人的队列中对其性能进行验证。结果显示，P85-Ab检测的灵敏度、特异性、阳性预测值分别为97.9%、98.3%、10.0%，明显优于当前标准的双抗检测方法。更重要的是，P85-Ab与双抗体检测相结合，能够将鼻咽癌筛查阳性预测值从当前的大约5%提高至44.6%。 论文于今日发表在《新英格兰医学杂志》期刊上[2]。 论文首页截图 目前，EBV DNA检测或者双抗体（EBNA1-IgA+VCA-IgA）检测被广泛用于鼻咽癌筛查，将鼻咽癌早期诊断率从约20%提高至70%以上，但临床应用受限于低阳性预测值。其中，双抗体检测的阳性预测值仅为4.8%，这意味着筛查得到的高危人群里，有95%以上的人需要接受不必要且耗时的临床检查和随访，加剧了假阳性者的医疗负担和焦虑心理。 因此，迫切需要高灵敏度和阳性预测值的新生物标志物或策略，以提升鼻咽癌筛查效果。 此次，研究者们成功合成87个具有高免疫识别性的B细胞表位多肽，并结合健康人与鼻咽癌患者的血清样本对比结果，从中找到了最佳生物标志物，即P85-Ab。P85是EBV表达的BNLF2b蛋白上的一个片段，P85-Ab是血清中识别P85的总抗体，鼻咽癌患者的P85-Ab水平明显高于健康对照组。 基于一项回顾性病例对照研究，研究者们对71名鼻咽癌患者和250名健康对照参与者的血清样本进行分析，初步验证P85-Ab检测的性能，并且与EBNA1-IgA+VCA-IgA双抗体检测进行比较。 结果显示，P85-Ab检测，与EBNA1-IgA或VCA-IgA单项检测以及双抗体检测相比，灵敏度相近，比率为1.02，但特异性更高。 不同抗体检测的性能 有了这些结果，研究者们研发了高通量P85-Ab检测试剂盒，并于2020至2021年期间在广东中山市开展大型的前瞻性队列研究。 研究共招募25340名参与者，利用试剂盒对P85-Ab检测与双抗体检测的筛查性能进行“头对头”比较。P85-Ab阳性或鼻咽癌高危人群进一步接受内窥镜检查。 中位随访时长为250天，47人被确诊鼻咽癌。 结果显示，相较于双抗体检测，P85-Ab检测的灵敏度更高，为97.9% vs 72.3%；特异性更高，为98.3% vs 97.0%；阳性预测值更高，为10.0% vs 4.3%，是双抗体检测的二倍多（2.3；95%CI，1.8-2.8）。 当P85-Ab检测与双抗体检测联合使用时，筛查性能提升。 具体来看，利用双抗体检测对P85-Ab检测为阳性的人群进行风险等级进一步分层后，特异性为99.6%，阳性预测值为29.6%，灵敏度略微降低，为70.2%。随着P85-Ab阳性高危人群转诊接受后续检查，特异性、阳性预测值、灵敏度提高到99.8%、44.6%、72.3%。 不同抗体生物标志物及其组合在鼻咽癌筛查中的性能 总而言之，作为鼻咽癌筛查的新型生物标志物，P85-Ab比当前标准的双抗体检测拥有更高的灵敏度、特异性以及阳性预测值，且两者联合使用效果更佳。这有助于提高人群对鼻咽癌筛查的接受程度，降低鼻咽癌相关死亡率。 参考文献： [1]Chen Y-P, Chan ATC, Le Q-T, Blanchard P, Sun Y, Ma J. Nasopharyngeal carcinoma. Lancet 2019;394:64-80. [2]Li, T., Li, F., Guo, X., Hong, C., Yu, X., Wu, B., Lian, S., Song, L., Tang, J., Wen, S., Gao, K., Hao, M., Cheng, W., Su, Y., Zhang, S., Huang, S., Fang, M., Wang, Y., Ng, M. H., Chen, H., … Ji, M. (2023). Anti-Epstein-Barr Virus BNLF2b for Mass Screening for Nasopharyngeal Cancer. The New England journal of medicine, 389(9), 808–819. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2301496

Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV），也被称为人类巨细胞病毒4（Human herpesvirus 4，HHV-4），是一种广泛存在于人类群体中的病毒，据统计，全球90%以上的人口都有感染。大多数人都是在儿童时期就被感染，通常不会引起症状，并在人体内潜伏持续一生，不过有时会在年轻人身上引起俗称“接吻病”的传染性单核细胞增多症，表现为发热、咽喉疼痛、淋巴结肿大等症状。然而，EBV的危害并不局限于此。过去，科学家发现EBV与多种类型的癌症相关，包括淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌等。还有证据表明EBV与系统疾病多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）之间存在联系，然而，EBV为何在某些人身上表现得如此凶险，其背后的分子机制尚不明了。 EBV编码的蛋白诱导11q23断裂 4月12日，美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校的博士后Julia Su Zhou Li及同事在Nature上发表论文“Chromosomal fragile site breakage by EBV-encoded EBNA1 at clustered repeats”。论文指出，EBV编码的蛋白质EBNA1（Epstein–Barr nuclear antigen 1）可通过与人类11号染色体上的特定区域结合并触发断裂，从而导致基因组不稳定。图1 研究成果（图源：[1]）EBNA1是在所有EBV相关癌症中表达的唯一病毒蛋白，能够与EBV基因组中的多个特定序列结合，使之能够持续存在和复制。之前的生物化学和结构研究已经确定了EBNA1的DNA结合域与18碱基对回文DNA序列的相互作用。这一发现促使人们思考，EBNA1是否也能够识别宿主DNA中的特定序列并与之结合。过去通过对EBV感染的淋巴细胞的研究，已经发现了许多可能的靶序列，其中包括在11号染色体上位于FAM55D和FAM55B基因的一组高亲和力EBNA1位点。然而，学界尚未达成共识。Li及其同事在原代细胞系和癌细胞系等几种EBV阴性细胞系中表达EBNA1并进行观察。他们发现，EBNA1在原代细胞系和癌细胞系细胞核中的两个不同位点高度富集。将EBNA1结合位点映射到11q23的一个21kb的重复序列区域后，Li发现该区域存在一个18bp序列的300多个拷贝。该序列与病毒上的18碱基回文DNA序列非常相似，而破坏这一位点则会消除EBNA1的富集。图2  EBNA1蛋白结合并破坏人类11号染色体（图源：[2]）通过进一步的观察，Li及其同事发现11号染色体上的这一区域存在DNA脆性位点。在EBV潜伏感染的细胞中，将EBNA1的蛋白质浓度提高两倍，就足以触发11q23断裂。而且，11q23的这个EBNA1区域位于肿瘤抑制基因ATM和原癌基因MLL之间，断裂如果发生，细胞分裂后子细胞中的这些基因的拷贝数就极易发生改变。Li及其同事还发现，EBNA1的另一个区域能与一种名为泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7，USP7）的细胞酶相互作用。USP7能够刺激EBNA1的DNA结合活性，ENBA1又反过来促进了USP7的募集，同时，USP7还能去除核小体蛋白质中的泛素修饰。这提示了USP7在染色质结构改变中的双重作用。Li及其同事还调查了11q23断裂在EBV相关癌症中的发生率。结果发现，在人类鼻咽癌中，81%的肿瘤样本中在11号染色体上表现出结构变异。另外作者还考察了2000多种不同类型癌症的全基因组测序数据，发现与EBV阴性肿瘤相比，EBV阳性肿瘤的11号染色体结构变异有所增加。虽然尚不清楚EBNA1诱导的11q23断裂是由于DNA结合域引起了DNA的结构变化，还是USP7造成了染色质结构变化，或是出于其他可能，但可以确定的是，EBNA1在促进癌症发展中的直接作用。EBNA1与CRYAB之间交叉抗体反应引发MS瑞典卡罗林斯卡学院临床神经科学系的博士后研究员Olivia Thomas和同事则在5月17日在Science Advances发表题为“Cross-reactive EBNA1 immunity targets alpha-crystallin B and is associated with multiple sclerosis”的论文。他们在文中指出，EBNA1和CRYAB之间的抗体交叉反应，会使得身体中的某种抗体错误地攻击大脑和脊髓，导致引发MS。图3 研究成果（图源：[3]）研究人员分析了700多名MS患者和700多名健康人的血液样本。结果发现，在MS患者身上，抗CRYAB蛋白的自身抗体增加。CRYAB蛋白全称αB-结晶蛋白（Alpha-B Crystallin），是一种热休克蛋白，存在于人体的细胞中，并参与细胞的保护和应激响应。当高EBNA1抗体反应和抗CRYAB血清阳性在一个人身上同时发生时，疾病风险尤其增加。分析EBNA1和CRYAB的氨基酸序列，研究人员发现，CRYAB第8至20位氨基酸与EBNA1第399至408位氨基酸之间存在高度序列同源性，而在血浆中掺入对应的EBNA1肽可降低对CRYAB 肽的反应性，这表明CRYAB 自身抗体与EBNA1之间存在交叉反应。图4 EBNA1和CRYAB氨基酸序列的比对（图源：[3]）在小鼠身上，研究人员还发现存在EBNA1和CRYAB 之间的T细胞交叉反应。在使用那他珠单抗（Natalizumab）治疗的MS患者身上，发现T细胞对CRYAB和EBNA1的反应增加且高度相关，这表明EBNA1引发了T细胞对CRYAB的敏感。值得注意的是，抗CRYAB蛋白的自身抗体存在于大约23%的MS患者和7%的健康个体身上。“这表明，虽然这些抗体反应不是在疾病进展过程中必然发生的，但仍可能与多达四分之一的MS患者有关。”Olivia说，“这也证明了患者之间存在高度差异性，开发针对性的个性化疗法是十分必要的。”论文的共同第一作者、卡罗林斯卡医学院临床神经科学系附属研究员Mattias Bronge表示：“我们将扩大当前的研究，包括T细胞如何对抗EBV感染，以及这些免疫细胞是如何损害MS患者的神经系统并促进疾病进展的。”目前，现有的疗法仅能减少MS复发，但不能阻止疾病进展。责编|风立宵校对|风立宵End参考资料：[1Li, J.S.Z., Abbasi, A., Kim, D.H. et al. Chromosomal fragile site breakage by EBV-encoded EBNA1 at clustered repeats. Nature 616, 504–509 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05923-x[2]https://www.nature.com/articles/d41586-023-00936-y [3]Thomas OG, Bronge M, Tengvall K, et al. Cross-reactive EBNA1 immunity targets alpha-crystallin B and is associated with multiple sclerosis. Sci Adv. 2023 May 19;9(20):eadg3032. doi: 10.1126/sciadv.adg3032. 本文系生物探索原创，欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载，须在正文前注明来源生物探索。   往期精选 围观 ‍把病毒困在“陷阱”里！海德堡大学探明病毒渗透最后一步，或将带来预防新手段！ 热文基因振荡器：在两种衰老模式间来回切换，细胞寿命延长了82%！ 热文用超声波突破皮肤屏障！MIT科学家为皮肤给药提供可穿戴解决方案 热文新发现：加速癌症发展的染色体外DNA，甚至出现在癌症之前，推动组织癌变！ 热文 在基因组中“跳来跳去”的转座子，有望成为免疫疗法抗击肿瘤的新靶点！点击“阅读原文”，了解更多~