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CGT产业何去何从？8月底，北京！九大论坛将直面产业创新与监管挑战。国药集团中国生物副总裁孙京林老师将在本次会议讲解“创新生物药的分段生产管理”。武汉科技大学生命科学与健康学院院长，波睿达生物董事长张同存教授将与会报告“CAR-T细胞治疗现状和展望”。 CAR-T细胞疗法是在体外利用基因工程的方法修饰患者外周血T细胞，赋予T细胞靶向识别肿瘤细胞表面抗原的特性，经体外扩增培养后回输到患者体内进行治疗肿瘤的方法。 自2017年两个CAR-T产品获批，全球CAR-T市场一直在迅速扩大，2024H1年全球CAR-T细胞疗法市场的销售价值达到20.14亿美元，预计在2030年，全球CAR-T市场规模预计达至218亿美元。 1 IN VIVO CAR-T 定义与优势 in vivo CAR-T（体内CAR-T）是一种免疫治疗方法，通过在患者体内直接生成和激活CAR-T细胞，以便更有效地对抗癌症。与传统的CAR-T疗法相比，in vivo CAR-T跳过了体外基因改造和扩增步骤，直接在患者体内完成这些过程，极大的简化了制备过程，有效的控制了成本，可以真正意义上将CAR-T从一种基于细胞的自体药物产品转化为一种普遍适用off-the-shelf的治疗方法。 2 IN VIVO CAR-T递送方式 慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）与脂质纳米颗粒（LNP）是IN VIVO CAR-T常见递送载体，其中慢病毒载体在已获批的传统CAR-T产品中积累了较多CMC以及临床经验，也成为当前IN VIVO CAR-T开发的热门选择。 3 以慢病毒为载体的IN VIVO CAR-T开发公司 01 Umoja Biopharma Umoja Biopharma，Inc.是一家临床阶段的生物技术公司，旨在开发现成的疗法，以提高CAR T细胞疗法在肿瘤学和自身免疫方面的覆盖面、有效性和可及性。Umoja的VivoVec体内基因传递技术旨在增强患者自身的免疫系统以抵抗疾病。 2020年11月，Umoja Biopharma完成了5300万美元的A轮融资:2021年6月，Umoja Biopharma完成超额认购的2.1亿美元B轮融资。 2024年7月31日，Umoja获得美国FDA的绿灯，批准其在研CD19靶向原位生成CAR-T细胞疗法UB-VV111的IND申请，用于治疗血液恶性肿瘤。Umoja预计将启动一期研究，并在2024年底前为试验中的首例患者用药。 “VivoVec™”与“RACR/CAR”是Umoja有两大代表性技术平台，“VivoVec™”主要涉及对对慢病毒载体的改造，“RACR/CAR平台”则是对免疫细胞进行调控。 Umoja的VivoVec已经经历了3代改良，改进的整体思路是通过添加共刺激域加强对T细胞的激活与转导，以及增强T细胞功能与减少给药剂量，并进行了临床前的验证。 VivoVec病毒载体主要包括三个主要组成部分，Cocal糖蛋白假型+共刺激分子+T细胞识别分子，Cocal糖蛋白假型与常规的VSV-G有71.5%序列，可在保证融合能力的同时提高血清抗性，进而改善体内持久性；抗CD3 scFv（T细胞识别分子）与CD80（共刺激分子）的表达则可以介导T细胞的结合、激活和转导。在最新一代的VivoVec病毒颗粒中，多个配体结合域不再分散于颗粒表面，而是整合成单个多域融合（MDF）蛋白，进一步增强粒子结合、激活和传导T细胞的能力。 3代VivoVec平台 Umoja对VivoVec进行了系统的临床前试验，结果显示T细胞共刺激分子可以增强VivoVec粒子与T细胞结合、活化与转导，促使生成更多CAR-T细胞并增强体内抗肿瘤活性，MDF设计还可以可大幅降低给药剂量，提高安全性。 Umoja在2024年6月11日的Blood杂志上在线发表了标题为“In vivo CAR T-cell generation in non-human primates using lentiviral vectors displaying a multi-domain fusion ligand”的文章，介绍了其新一代病毒粒子在非人灵长动物中的疗效，结果显示：结合CD80和CD58共刺激蛋白的VivoVec颗粒（VVP）表现出增强的体内CAR T细胞生成能力，并且与仅显示抗CD3 scFv的VVP产生的CAR T细胞相比，产生的CAR T细胞具有增强的抗肿瘤功能； 将抗CD3 scFv与CD80和CD58的配体结合域结合成单个多域融合（MDF）蛋白，显著增强了粒子结合、激活和传导 T 细胞的能力；结合与NHP T细胞活化和共刺激兼容的MDF的VVP可在体内有效产生抗CD20 CAR T细胞，占循环T细胞的65%，并导致B细胞完全耗竭长达76天。 雷帕霉素可以通过RACR系统激活和增强VivoVec转导细胞活性，与此同时，抑制肿瘤生长。在雷帕霉素存在的情况下，RACR系统可在体内为CAR-T细胞提供促存活和扩增信号，并对雷帕霉素介导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制产生耐药性；FKBP-IL-2Rγ和FRB-IL-2Rβ在与雷帕霉素结合后形成异二聚体，导致细胞内信号模拟IL-2和IL-15促进生长和增殖。 临床前数据显示，UB-VV100表现出良好的生物分布特征，转导发生仅限于经结内或腹膜内给药后的免疫区室，与组织病理学无关，脱靶风险较低，安全性得到一定程度的验证，同时UB-VV100可以成功在动物体内生成CAR-T并进行肿瘤杀伤。 2024年1月3日，Umoja宣布与国内驯鹿生物就新型体外和体内细胞与基因疗法的研发和商业化开展一系列新的合作，这是继2022年11月与驯鹿生物达成协议后的第二笔合作。新的协议深化了双方的战略合作，进一步推动创新即用型细胞与基因治疗方案。 根据协议条款，驯鹿生物将获得Umoja的雷帕霉素激活的细胞因子受体（RACR）平台——合成细胞因子受体技术的独家使用权，用于开发两种体外的iPSC来源的嵌合抗原受体（CAR）细胞疗法，并负责上述两个体外细胞治疗产品在全球范围的研发、生产、注册和商业化。 同时，Umoja将独家使用驯鹿生物经临床验证的两个不同靶点的CAR序列，结合Umoja自研的慢病毒载体体内基因递送技术——VivoVec推进两个体内CAR-T候选产品的研发。驯鹿生物与Umoja将分别负责大中华区与除大中华区以外的其他地区的产品研发、生产、注册和商业化，双方有权在合作中收取相应的开发和销售里程碑付款以及特许权使用费。具体合作金额尚未披露。 2024年1月4日，Umoja宣布与艾伯维达成两项独家选择权和许可协议，使用 Umoja专有的VivoVec平台开发多种应用于多种原位癌的CAR-T细胞疗法候选药物。第一份协议为艾伯维提供了独家选择权，以许可Umoja的靶向CD19的CAR-T候选药物UB-VV111；第二份协议的内容则是为艾伯维提供多达四种额外CAR-T候选药物的选择权。 根据协议条款，Umoja收到了艾伯维的预付款和股权投资；除此以外，Umoja有资格在两笔协议中，获得14.4亿美元的期权行使费、开发和监管里程碑费用，并有望获得额外基于销售的里程碑和全球净销售额的分级特许权使用费。 02 Interius Interius BioTherapeutics是一家领先的生物技术公司，正在开发新型现成的基因疗法，利用靶向慢病毒载体技术在体内生成自体嵌合抗原受体（CAR）细胞。Interius通过对VSV-G的突变克服了VSV-G与低密度脂蛋白（LDL）受体的天然结合，同时维持了pH依赖性的融合。 2021年5月，该公司完成7600万美元A轮融资，本轮融资由CormorantAsset ManagementFairmountFund共同领投。 2024年7月10日，Interius BioTherapeutics宣布，已获得澳大利亚治疗用品管理局（TGA）的人类研究伦理委员会（HREC）批准和临床试验通知（CTN）许可，以进行其在研体内CAR-T疗法INT2104的临床1期试验，用以治疗B细胞恶性肿瘤。Interius计划在2024年第四季度开始试验，并有望在2025年第一季度实现关键里程碑。 Interius即将进行的1期试验INVISE将评估单次INT2104输注在难治性/复发性B细胞恶性肿瘤成人患者中的安全性。这项全球性的试验采用两部分、多中心、开放标签、单剂量设计，剂量递增部分旨在确定试验和未来研究中使用的INT2104剂量。 Interius采用专有的融合原突变阻止了VSV-G与低密度脂蛋白（LDL）受体的天然结合，同时维持pH依赖性的融合，并在病毒表面表达了CD7 Binder，这是一种专有的人类和NHP交叉反应性scFv与基于人类lgG1的柄，可以特异性靶向CD7+细胞，实现靶向递送。 临床前结果显示出INT2104可以靶向CD7+细胞，结合T细胞与NK细胞发挥作用并展现出对B细胞肿瘤小鼠的肿瘤杀伤性。 03 Kelonia Kelonia Therapeutics是一家运用前沿基因递送技术开发体内CAR-T疗法的公司，其技术技术结合了麻省理工Michael Birnbaum博士实验室与法国国家科学研究中心（CNRS）的开创性研究。 2022年4月28日，Kelonia宣布完成了5000万美元的A轮融资，A轮融资的投资者包括了Alta Partners、Venrock和维港投资。 Kelonia使用了被称作VSVGmut的工程化fusogen，这是一种改造的水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）。VSV-G可以识别广泛存在于细胞表面的低密度脂蛋白受体，而工程化的fusogen已无法单独感染细胞，而是需要依赖特殊的抗原识别机制。在目标免疫细胞识别出LVV表面特殊抗原并与之结合后，fusogen才会对免疫细胞进行转导，进行治疗基因的递送。而VSVGmut与多种受体和靶向配体兼容，包括免疫细胞表面标记、信号传导和抗原受体。 这种改造的新型LVV通过同时表达靶向分子和fusogen，实现了二者的共同选择，使基因疗法更加精准高效。这种修改有助于减少单次给药的剂量，避免高病毒剂量可能造成的免疫毒性，从而增强基因疗法的有效性和安全性。 临床前数据显示anti-BCMA CAR iGPS小鼠体内给药可实现肿瘤杀伤，且杀伤能力优于体外培养；靶向性良好，在35个主要的组织跟器官均无转导。 anti-CD20 CAR iGPS在NHP中的给药免清淋且没有观察到CRS与神经毒性，安全性似乎优于传统CAR-T。 04 Ixaka Ltd Ixaka成立于2021年，是一家利用体内基因递送技术研发体内CAR-T疗法的企业。 2022年3月，Ixaka Ltd宣布欧洲药品管理局（EMA）授予其体内CAR-T细胞治疗CELTIC-19先进治疗药物认定。 CELTIC-19基于靶向纳米颗粒（TNP）平台开发，用于治疗CD19阳性的血液系统恶性肿瘤。这是一种聚合物纳米颗粒包裹的慢病毒载体。慢病毒编码T细胞特异性启动子和CAR；纳米颗粒表面装上CD3结合分子，允许T细胞的体内靶向和转导。 05 EXUMA EXUMA Biotech是一家临床阶段生物技术公司，开发细胞和基因疗法，以及研发液体和固体的肿瘤输送方案，为全球患者提供可行的解决方案。 在AACR大会上公布的GCAR临床前研究中，研究人员在小鼠体内注射了编码靶向CD19的CAR的自我失活慢病毒载体。这一慢病毒载体的衣壳蛋白经过修饰，能够靶向和激活CD3阳性T细胞。 研究结果显示，慢病毒载体在小鼠体内成功生成靶向CD19的CD3阳性CAR-T细胞。与此同时，小鼠体内B细胞持续下降，在有些小鼠中B细胞被完全清除。研究人员表示，这一结果显示，体内递送感染CD3阳性T细胞的慢病毒载体可以生成具有正常功能的CAR-T细胞，为克服细胞疗法在生产时间、规模和成本上的挑战提供了新机会。 — 结语 — IN VIVO CAR-T作为CAR-T疗法领域发展的一个重要方向，是降低CAR-T成本，实现细胞治疗造福千家万户的重要技术途径，作为核心的载体平台技术发展日新月异，相关临床前数据也展现出肿瘤杀伤活性，曙光初现，让我们也共同希冀着CAR-T能够早日进入“体内时代”！ 参考文献：（上下滑动查看更多） 1.Potent in vivo CAR T cell generation and durable antitumor activity in preclinical models using VivoVec, a surface-engineered lentiviral vector Platform. 2.Potent in vivo CAR T cell generation and durable antitumor activity in preclinical models using VivoVec, a surface-engineered lentiviral vector platform；Vivovec™ Surface-Engineered Lentiviral Particles Mediate In Vivo CAR T Generation with Potent and Highly Durable Activity in Non-Human Primates and Tumor-Bearing Humanized Mice. Blood 2023; 142 (Supplement 1) 3.Michels KR, et al. J Immunother Cancer 2023;11:e006292. doi:10.1136/jitc-2022-006292 4.Precision medicine: In vivo CAR therapy as a showcase for receptor-targeted vector platforms 5.Umoja官网 6.EXUMA AACR-Poster-2023-Final-2 7.CN115298315A 8.Ixaka官网 9.Dobson, C.S., Reich, A.N., Gaglione, S. et al. Antigen identification and high-throughput interaction mapping by reprogramming viral entry. Nat Methods 19, 449–460 (2022) 10.Kelonia-Presentation-2023-ASGCT-.vFINAL 11.CN117203223A. 12.Targeted in vivo generation of CAR T and NK cells utilizing an engineered lentiviral vector platformrm. 13.Interius官网 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓

摘要：癌症仍然是全球主要的死亡原因之一，多年来已经开发了各种针对癌症的疫苗，包括基于细胞的、基于核酸的和基于病毒的癌症疫苗。尽管许多疫苗在体内和临床研究中都显示出有效性，并且一些已经获得FDA批准，但仍需克服重大限制：（1）开发一种针对特定癌症的通用疫苗是困难的，因为不同个体的肿瘤具有不同的抗原，（2）肿瘤抗原可能与身体自身的抗原相似，（3）存在癌症复发的可能性。因此，开发能够区分肿瘤和身体抗原的个性化癌症疫苗是不可或缺的。本文全面回顾了不同类型的癌症疫苗，并强调了开发高效癌症疫苗所需的重要因素。此外，还讨论了其他技术在癌症治疗中的应用。最后，提出了一些见解和结论，例如使用冷等离子体和癌症干细胞在开发未来的癌症疫苗中的可能，以解决癌症疫苗开发过程中的主要限制。 1.引言 疫苗自18世纪末首次发现以来，一直被用来保护人类健康免受传染病的侵害。最近针对冠状病毒疾病的疫苗的成功，鼓励研究人员将这些基本概念扩展到治疗癌症。主动免疫疗法或疫苗接种是有效肿瘤根除的重要方面，治疗性癌症疫苗可以通过两种主要方式刺激和增强：(1)使用非特异性促炎分子和佐剂来改善体内已有的抗肿瘤免疫反应，或(2)在宿主中诱发针对特定肿瘤抗原的新免疫反应。理想的肿瘤抗原和佐剂通常一起递送，以刺激适应性免疫系统，目的是实现树突状细胞(DCs)的最佳激活和效应T细胞的持久反应。天然免疫细胞，如自然杀伤(NK)细胞和吞噬细胞，在肿瘤识别和抑制中也扮演着重要角色。然而，免疫抑制性肿瘤微环境(TME)是肿瘤浸润免疫细胞和免疫疗法的关键障碍之一。治疗性癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的结合已成为提高患者反应率和生存率的新兴方法。癌症疫苗的有效性仍在众多临床试验中受到审查。在这篇综述中，我们探讨了TME中癌症免疫周期的机制，并分析了主要癌症疫苗平台的有效性和局限性。此外，我们为即将到来的癌症疫苗提供了新的见解，以提高其效率。 2.肿瘤微环境和癌症疫苗机制 TME包含大量免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NKs)、树突状细胞(DCs)、淋巴细胞B细胞和淋巴细胞T细胞(CD4+和CD8+)，它们在抗原呈递过程和可能导致肿瘤进展的癌症免疫周期中发挥关键作用；因此，针对TME及其组成部分被认为是有效癌症疫苗的主要机制。TME中的巨噬细胞、B细胞和DCs是被称为抗原呈递细胞(APCs)的一些例子。这些细胞通过摄取来自疫苗注射的各种途径(皮下、皮内或肌肉内)或来自死亡癌细胞的抗原，促进抗原特异性免疫细胞的相互作用和激活（称为启动过程）。然后，APCs使抗原在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类上呈现（在人类中，人类白细胞抗原(HLA)是MHC系统）。这之后是APCs从TME迁移到淋巴结以激活效应T细胞(CD4+或CD8+)。淋巴结是次级淋巴器官(SLOs)之一，为免疫细胞提供三维结构，增强抗原负载APCs与效应T细胞之间的相互作用，以激活T细胞并产生有效的免疫反应。在淋巴结内，成熟的APCs可以通过向效应T细胞呈现MHC-抗原复合物来激活效应T细胞。这之后是激活的效应T细胞渗透到TME中，在那里T细胞可以识别目标癌细胞并将它们杀死。SLOs中的初级(静止)B细胞滤泡(称为滤泡B细胞)在抗原结合到初级滤泡上后被激活；激活后，初级滤泡B细胞变成次级滤泡，包含充满B细胞芽的中央生发中心(GC)，并随着抗体成熟，这些B细胞芽经历几个阶段和过程，与抗体成熟相关。这些步骤导致淋巴细胞分化为效应T(Teff)细胞和B记忆细胞，以这种方式，它们迁移到TME，导致肿瘤细胞的根除。然而，根据对TME的研究，抗肿瘤防御的产生不仅在SLOs中发生，而且还直接在称为三级淋巴结构(TLS)的SLO样聚集体中，这些结构通过细胞因子的积累，包括CXCL13、RANKL和白细胞介素(IL)-7，在TME中发展。这些结构与淋巴组织诱导细胞(LTi)以及其他细胞，特别是DCs、NKs或CD8+ T细胞相互作用，导致分泌对高内皮静脉(HEV)形成(介导淋巴细胞向淋巴结的迁移)、免疫细胞招募和细胞保留至关重要的因素。这些前述因素共同招募和激活LTi细胞。所有这些阶段，从抗原吸收到癌细胞死亡，都被认为是癌症免疫周期的一部分，将在下一节中详细讨论。 在TME中存在的各种APCs中，与B细胞和巨噬细胞相比，DCs是最有效的APC。这些细胞通过两种通用机制介导与抗原启动相关的过程：规范(交叉抗原呈递)和非规范(交叉抗原修饰)途径。规范途径更为常见，基于抗原蛋白的类型(外源性/内源性)。APCs(如DCs)可以通过两条主要途径驱动规范抗原呈递机制：(1)细胞质或蛋白酶降解途径(专指内源性蛋白呈递)，在这一过程中，内源性抗原蛋白，无论是来自蛋白酶体还是吞噬体，都被DCs的细胞质蛋白酶切割成肽片段，然后由MHC-I分子呈递并激活效应T细胞，特别是针对肿瘤细胞的抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，或(2)空泡或内吞途径(专指外源性抗原蛋白呈递)，在这一过程中，DCs通过内吞作用摄取外源性抗原蛋白，形成称为内吞体的特殊囊泡结构，然后将与溶酶体融合，在溶酶体的低pH值下降解这些抗原为肽片段，然后呈递在MHC-II分子上，并激活CD4+ T细胞，导致CTL激活、功能和存活。除了上述规范途径外，几篇论文还证明了非规范/交叉修饰途径的存在，通过这些途径，APCs如DCs并不自己呈递抗原。相反，来自其他相邻DCs或肿瘤细胞(供体细胞)的抗原-MHC复合物被转移到APCs，如DCs(受体细胞)，尽管有各种机制，包括咀嚼细胞吞噬、外泌体摄取和隧道纳米管，并在没有进一步的抗原处理阶段的情况下激活相关的效应T细胞。这些过程在图1中显示。 图1. 抗原呈递细胞（APC）呈递机制。肿瘤微环境及其组分：肿瘤微环境（TME）包含多种抗原交叉呈递过程，这些过程可以由树突状细胞通过规范/交叉呈递途径（A）或非规范/交叉修饰途径（B）介导。交叉呈递机制有两种方式：细胞质或蛋白酶体降解（A-1）和通过空泡途径（A-2）。在细胞质途径中，来自内吞体或吞噬体结构的抗原向细胞质移动，形成酸性细胞质蛋白酶体，将抗原切割成更短的肽段。这些肽段有两个命运：(1) 被运送到内质网（ER）进行进一步的修饰。修饰后的抗原肽随后装载到MHC类I分子上，并移动到细胞表面。(2) 切割后的肽段在返回吞噬体/内吞体之前装载到MHC I上，然后移动到细胞表面。在空泡途径中，与抗原装载到MHC类I有关的前述事件在吞噬体或内吞体中发生，随后装载抗原的APCs（DCs）向次级淋巴器官（SLO）移动，以激活T细胞。在非规范/交叉修饰途径中，抗原-MHC复合物在另一细胞上形成，然后转移到APCs，如DCs，DCs最终能够通过不同途径激活相关的效应T细胞：咀嚼细胞吞噬（B-1）、外泌体摄取（B-2）和隧道纳米管（B-3）。在咀嚼细胞吞噬中，包括来自一个细胞（供体）的质膜和细胞质的膜片被转移到另一个细胞（咀嚼细胞）；APCs通过外泌体摄取依赖于外泌体（在内吞过程中形成的小膜基小泡）转移特定物质的能力（这些物质不仅可以被APCs进一步降解和处理以在MHC分子上呈递，而且也可以被视为功能性的MHC-肽复合物）；隧道纳米管是来自细胞膜的长突起，它们不仅促进细胞表面分子和细胞质内容物的交换，而且可以通过在远距离细胞间转移MHC分子来介导远程DCs之间的交叉修饰。 3.癌症免疫周期  癌症免疫周期包括一系列重复和放大的阶段，每个阶段都由特定的细胞因子和趋化因子介导，这些因子将导致有效的抗癌免疫反应和癌细胞死亡。这些阶段如下：(1) 在第一步中，肿瘤形成过程中产生的新抗原从死亡的肿瘤细胞中释放出来，然后由树突状细胞(DCs)携带到邻近的引流淋巴结(DLN)。(2) 第二阶段开始时，DCs通过MHC-I和MHC-II分子将获得的抗原呈递给T细胞，形成MHC-I和MHC-II-抗原复合物，这是通过前面讨论的交叉呈递途径实现的。(3) 效应T细胞随后能够识别抗原并被激活。(4) 存在于DLN中的识别抗原的肿瘤特异性T细胞，表达特定的趋化因子受体以及细胞粘附分子，这些分子对于T细胞的迁移和渗透到肿瘤组织是必需的。借助这些表达的分子，T细胞离开DLN并通过血液流向肿瘤组织移动。(5) 接着是T细胞渗透到肿瘤组织，(6) 通过T细胞受体(TCR)识别和结合MHC-I-抗原复合物，这刺激DCs分泌各种细胞因子，最终激活T细胞。(7) 这些过程共同作用，最终通过各种机制杀死癌细胞，包括直接肿瘤溶解和脱颗粒、抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性；然而，最近报告了一条新的T细胞杀死癌细胞的途径，这条途径独立于MHC-I的抗原呈递及其被T细胞识别。考虑到癌细胞死亡时会释放额外的新抗原，引发免疫反应，并从第一阶段重新开始，新抗原由细胞因子上调，这种机制被称为癌症免疫周期，其步骤在图2中有更详细的展示。癌症患者的癌症免疫周期出现故障，因为至少其中一个步骤是有缺陷的。考虑到这一点，治疗癌症的有效方法之一将是开发能够针对癌症免疫周期中的细胞因子的治疗性疫苗。（图2） 图2. 癌症免疫周期阶段及其调节。癌症免疫周期阶段由广泛的细胞因子和趋化因子调节，其中一些刺激癌症免疫周期以杀死癌细胞，而一些细胞因子则作为抑制剂并降低这些过程。刺激性细胞因子协同作用以介导T细胞激活。激活的T细胞进入肿瘤微环境(TME)并诱导肿瘤杀伤。每个阶段都受到各种细胞因子和其他分子因素的调节，如图中绿色表示诱导剂，红色表示抑制剂。 4.逃避癌症免疫周期 宿主免疫系统由监视部分和保护部分组成；免疫监视系统不断地检查身体，并增强抗肿瘤免疫反应，以识别和摧毁任何存在的肿瘤细胞，最终防止癌症进展。一般来说，癌细胞经历各种遗传和表观遗传修饰，导致特定抗原的产生；这些抗原随后刺激T细胞识别和杀死癌细胞；然而，随着肿瘤细胞的生长，它们开始发展出称为“癌症免疫编辑”的机制来逃避宿主免疫监视系统；因此，免疫系统无法消除这些癌细胞。另一方面，从正常免疫系统的保护部分来看，它由称为“免疫检查点”的特定蛋白质分子组成，这些分子存在于免疫细胞（包括T细胞）的表面，以及它们相应的配体受体，这些受体存在于癌细胞上。这些免疫检查点通过使用基于单酪氨酸的信号基序（特别是免疫受体酪氨酸基序抑制和开关基序）来诱导抑制信号，防止产生任何强烈的免疫反应信号，这些信号会破坏体内的健康细胞。通过这种方式，免疫检查点倾向于保护正常细胞。PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA和TIGIT是一些常见的免疫检查点，它们介导T细胞对肿瘤细胞的识别；当T细胞表面存在的免疫检查点蛋白识别并结合到癌细胞的受体时，它们向T细胞发送一个“关闭”信号，从而防止免疫系统根除癌细胞。考虑到这一点，一些癌细胞倾向于通过上调细胞表面免疫检查点分子的负信号来促进癌症生长和转移，并抑制T细胞激活，而其他一些肿瘤细胞可能激活免疫抑制性白细胞（如嗜酸性粒细胞）来创造一个TME，该TME无法很好地响应抗肿瘤免疫分子。此外，一些肿瘤内在基因，包括YTHDF1，降解MHC-I复合物分子，导致免疫逃逸。根据前面讨论的癌症疫苗的作用机制以及癌症免疫周期，成功癌症疫苗设计的一些关键因素是选择适当的肿瘤抗原以刺激有效的T细胞，实现在APCs中足够的抗原浓度以激活它们，以及通过激活效应T细胞（即CD4+和CD8+）来诱导持久的免疫原性反应。在这方面，选择正确的抗原及其递送方法将非常重要，这将在以下小节中详细讨论。 5.肿瘤抗原分类 肿瘤抗原是在肿瘤细胞中产生的任何抗原物质，它们触发免疫反应，并作为肿瘤识别的生物标志物，可用于开发新的治疗性癌症疫苗。肿瘤抗原可能出现在与蛋白质合成和降解相关的阶段。根据HLAs的表达模式，肿瘤抗原可以分为两个一般组：肿瘤相关抗原（TAAs），其中抗原由主要在肿瘤细胞上表达的HLAs呈递（主要是HLA类I），以及肿瘤特异性抗原（TSAs，或新抗原），其中抗原由不仅在癌细胞上表达，也在正常细胞上表达的HLAs呈递。根据抗原的分子结构和来源，TAAs可以归入以下类别之一：分化（组织谱系）、肿瘤胎儿、癌症-睾丸、异常糖基化和表达、过表达，以及肿瘤病毒抗原。另一方面，TSAs根据观察频率被分类为共享（公共）和个性化（私人）新抗原；共享（公共）新抗原来自特定于肿瘤的变异，这些变异在其他患者/不同恶性肿瘤中观察到，而它们的个性化（私人）对应物是来自不太可能在其他人群/恶性肿瘤中发生的肿瘤特异性变异；因此，个性化新抗原是患者特定的。迄今为止，已经识别出一些公共新抗原，而私人新抗原通常来自非复发的驱动/乘客突变，并构成大多数已知的新抗原。此外，根据抗原来源，抗原可以是规范的（来自蛋白质编码基因），或非规范的（来自非蛋白质编码基因）；在规范抗原中，抗原在蛋白质编码基因的开放阅读框（ORFs）内表达，如许多与癌症相关的基因的过表达，包括p53、癌症/睾丸抗原（CTAs）和人类端粒酶逆转录酶。非规范抗原在ORFs之外表达，可能来自抗原在各个水平上的变异，如基因组、表观基因组、蛋白质组、转录组、翻译和抗原处理水平（内含子保留、选择性剪接、密码子读穿和非规范/非AUG翻译启动水平）。肿瘤抗原分类及其属性在图3中总结。 图3. 肿瘤抗原分类。总体而言，肿瘤抗原被分类为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，每一类又细分为几个类别。每个类别根据以下几个方面进行比较：(1) 肿瘤特异性（指特定的免疫反应针对并特异地与肿瘤细胞或其抗原发生作用，同时不伤害正常细胞的程度；因此，高肿瘤特异性是所期望的），(2) 中枢耐受（免疫系统识别肿瘤抗原与自身抗原，在其体内发育过程中消除癌细胞而不对自身抗原产生免疫反应的机制。因此，高中枢耐受是所期望的，这意味着免疫系统对自身抗原表现出强大的耐受水平，包括那些出现在正常细胞和组织上的抗原，并能更好地识别它们），(3) 免疫原性（指癌细胞激发宿主免疫系统免疫反应的能力。这种免疫反应可以涉及免疫细胞的激活，以及对肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的抗体产生；因此，高免疫原性是一个期望的因素），以及 (4) 普遍性（这显示了肿瘤抗原在患者中出现的普遍程度或罕见程度）。 除了抗原类型外，确定一种有效的肿瘤抗原递送方法给APCs不仅可以使抗原介导的APC靶向更加选择性，并诱导T细胞激活，还可以减少系统毒性。由于不同类型的抗原具有不同的物理属性，诱导最佳免疫反应主要取决于选择合适的递送系统[23]。一些主要的递送方法包括使用细胞、抗原、肽、核酸和基于病毒的方法，每种方法将在以下各节中详细讨论。 6.不同的癌症疫苗平台 6.1. 基于肽的疫苗 在基于肽的癌症疫苗中，通常使用20-30个氨基酸来制造广泛的肽，以激活患者的免疫系统，使他们能够通过增强特定肿瘤的T细胞介导的免疫反应来识别和杀死肿瘤细胞，即通过MHC类I和II分子分别激活CD8+和CD4+ T细胞。这些肽通常属于TAAs或TSAs（包括癌症/睾丸抗原和新抗原），用于设计个性化疫苗。基于肽的癌症疫苗不仅可以激活B细胞和T细胞介导的免疫反应，还可以诱导持久的杀瘤效果；然而，为了引发有效的抗肿瘤T细胞反应，癌症疫苗通常递送包括TAAs和TSAs在内的混合肿瘤抗原肽。肿瘤抗原肽的鉴定和发现已在其他评论中讨论。与短肽相比，合成长肽（SLPs）在激活T细胞反应方面更强，因为SLPs需要被APCs处理，并且可以激活细胞毒性CD8+ T细胞和CD4+ T辅助细胞反应。由于免疫原性低，基于肽的疫苗通常与免疫佐剂配制而成。FDA和EMA已批准用于人类的佐剂，包括铝盐、MF59、佐剂系统和CpG 1018。其他正在研究的佐剂包括聚肌苷酸-聚胞苷酸与聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的（poly-ICLC）、葡萄糖基化脂质A、咪唑喹啉、CpG寡脱氧核苷酸、环二核苷酸等。为了进一步提高肽抗原的免疫原性，杂合肽，即经过修改的肽的版本，通过替换具有类似生化属性、整体结构和功能与原始氨基酸序列相比的表位序列中的氨基酸残基；这称为保守氨基酸替代，以增强它们与MHC分子的结合亲和力；通过这种方式，它们可以诱导针对特定抗原的增强免疫反应，使杂合肽成为疫苗开发和免疫疗法的潜在工具，用于癌症等疾病。考虑到游离肽在体内的半衰期短和稳定性差，肿瘤抗原肽通常被纳入其他递送系统中。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米颗粒和脂质体是抗原肽和佐剂的两个代表性递送系统，因为它们已被证明是安全的。Varypataki、Jiskoot等人的比较研究表明，装载SLP的PLGA纳米颗粒和阳离子脂质体比角鲨烯或Montanide基乳液更能在体内刺激T细胞反应。两种载体都可以保护肽免受降解，并促进树突状细胞摄取和淋巴结转运。 在过去十年中，在临床试验中评估的脂质体疫苗包括Tecemotide、DepoVax、ISCOMATRIX、Lipo-MERIT等；然而，它们都没有改善患者的存活率。除了合成纳米颗粒外，树突状细胞衍生的外泌体（DEXs）可以通过向其他免疫细胞转移MHC/肽复合物并直接或间接刺激T和NK细胞，在肿瘤免疫学中发挥重要作用。装载抗原肽的DEXs已作为癌症疫苗在临床试验中进行了评估，但未能在晚期癌症患者中产生足够的适应性免疫。尽管如此，DEXs仍然是组合疗法的一部分的希望。 6.2. 重组（病原体）疫苗：病毒和细菌基础疫苗 重组病毒/细菌疫苗主要分为三大类：(1) 灭活疫苗（使用在实验室培养后被杀死的病毒/细菌），(2) 减毒活疫苗（病毒/细菌被削弱但未完全杀死），以及 (3) 亚单位疫苗（使用类似病毒/细菌蛋白的部分）。所有重组疫苗都基于通过重组/选择方法将重组基因（如编码TAAs、细胞因子或共刺激分子的基因，这些基因被插入到病毒/细菌基因组中）输送到APCs中，以刺激适当的抗肿瘤免疫反应，并通过激活先天和适应性免疫系统来实现。病毒/细菌基础疫苗可以提供有效且持久的免疫反应。这些疫苗通过两种主要机制靶向APCs并启动免疫反应：(1) APCs的间接感染，通过病毒感染介导的细胞损伤发送危险信号以及共刺激分子来激活骨髓中的APCs，以及 (2) APCs的直接感染，基于MHC途径中的抗原处理。后一种机制有助于重组病毒疫苗的修改，以增强抗原呈递。其中一些修改基于表达编码MHC类I限制性肽的最小水平的基因，向编码抗原的基因中插入内体/溶酶体分选信号，以及使用痘病毒激活T细胞，或用作携带特定共刺激分子或细胞因子的载体。最近有效的细菌基础癌症疫苗之一由Wu等人开发；这些研究人员使用了减毒鞭毛细菌（鼠伤寒沙门氏菌株），涂覆有能够结合负电荷抗原的带正电荷的树状大分子纳米颗粒，并且细菌通过基因突变变得不那么免疫原性。 6.3. 基于细胞的疫苗：树突状细胞（DCs）、干细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法 治疗性基于细胞的疫苗基于体外通过病毒肽、基因或使用基因修饰的肿瘤细胞（杀死的肿瘤细胞）激活APCs（如NK细胞或DCs）。在这方面，基于细胞的疫苗可以被分类为肿瘤细胞疫苗和免疫细胞疫苗。在肿瘤细胞疫苗中，整个肿瘤细胞被用作疫苗的来源，其中包含整个TAAs，包括CD4+和Cd8+ T细胞的表位。全细胞癌症疫苗目前正在进行临床试验。使用全肿瘤细胞作为疫苗，其中包含所有可能的抗原，而不是蛋白质/肽肿瘤抗原，不仅消除了识别理想靶标抗原的需要；此外，可以同时针对几种肿瘤抗原，这将诱导对更多肿瘤细胞的进一步免疫反应。然而，仍然需要一种刺激/刺激因子来促进APCs对抗原的吸收过程，以从先天和适应性免疫系统中招募细胞。考虑到这一点，基于细胞的疫苗已经通过基因或通过辐射进行了修改，以便能够在宿主中分泌细胞因子，而不需要进一步增殖。大多数最近开发的癌症疫苗都是基于使用全细胞如DCs，这影响免疫系统中细胞的功能。DCs在抗原吸收和呈递过程中的重要性，以及通过DCs表面存在的广泛受体介导的T细胞激活，包括那些用于抗原吸收、抗原呈递、共刺激分子、细胞因子受体、环境传感器受体、细胞因子产生相关受体以及趋化因子受体，已经使DCs成为开发基于免疫细胞的癌症疫苗中最常用的免疫细胞。为了提高DCs在抗原吸收和T细胞激活中的效率，研究人员已经开始使用干细胞来开发更好的基于细胞的癌症疫苗。干细胞在癌症疫苗领域的应用始于胚胎干细胞（ESCs）；考虑到ESCs通常来自无关供体，它们表达不匹配的MHC和次要组织相容性（miH）抗原（这些是由正常自身蛋白衍生的肽，人类中由HLA呈递），如果移植到宿主中，它们将引起异免疫反应。尽管ESCs表达少量的HLA-I 和几乎没有HLA-II和共刺激分子，但这种数量足以刺激人类ESCs的细胞毒性T细胞介导的异种排斥反应。在对人类ESC系进行表征之后，并考虑到全细胞疫苗能够同时传递多种肿瘤胎儿抗原，以及它们对所有患者普遍适用，无论他们的HLA类型如何，研究人员已经开始将这些ESCs应用于全细胞癌症疫苗，以制造基于ECS的癌症疫苗。使用异种人类ESCs作为可能的癌症疫苗在小鼠和大鼠模型上进行测试，研究发现人类ESCs产生了适度的杀瘤效果，而在使用同种异体或自体ESCs的情况下，他们观察到更强的肿瘤抑制效果。然而，考虑到人类ESCs被注入到小鼠体内，前述免疫反应可能是由于人类ESCs和小鼠细胞之间的MHC抗原不兼容，而不是ESC系；此外，ESCs诱导的肿瘤形成阻碍了它们作为有效的癌症疫苗用于临床应用。这些问题促使研究人员转向使用诱导多能干细胞（iPSCs），因为它们在基因表达和表观遗传特征方面与ESCs非常相似。然而，iPSCs也有一定的肿瘤形成性。已经有多种方法被报道用于克服它们在开发基于干细胞的疫苗时的肿瘤形成性：完全分化或从培养中完全消除残留iPSCs；干扰肿瘤进展基因以防止残留细胞形成肿瘤；以及在患者体内最初形成肿瘤后的肿瘤检测和消除。鉴于此，大多数最近的iPSCs工作都使用辐射来消除培养中残留的iPSCs，并强烈防止畸胎瘤形成和进一步iPSC介导的肿瘤形成。早期研究对iPSCs转染到小鼠结肠癌表明，尽管iPSCs能够诱导对癌细胞的细胞因子，但没有观察到肿瘤排斥，表明iPSCs需要修改才能诱导对肿瘤细胞的强烈免疫反应；例如，考虑到自体iPSCs与其异种对应物相比具有更准确的肿瘤抗原，它们可以是开发抗癌疫苗的更好选择，因为它们可以最小化异免疫；此外，为了增强它们对癌症的免疫反应，可以与它们一起使用免疫刺激佐剂（如TLR9）。Kooreman等人使用相同的策略来产生针对胰腺导管腺癌的iPSC疫苗，其中自体iPSCs受到刺激，随后添加CPG（一种TLR 9佐剂）以改善免疫反应。另一项研究开发了来自T细胞急性淋巴细胞性白血病患者的自体iPSCs，并在DCs中装载；这在抑制急性淋巴细胞性白血病癌症方面显示出效果。在最近的一项研究中，iPSC衍生的外泌体与DCs（树突状细胞）一起孵化，他们在小鼠黑色素瘤模型中探索了它们的抗肿瘤效果；根据他们的结果，DC+外泌体疫苗显著抑制了体内模型的肺转移，诱导了长期T细胞反应，并没有改变正常细胞和小鼠器官的活性。同样，另一组通过将iPSCs和DC外泌体结合，制备了一种包含抗癌药物多柔比星的纳米结构；这提高了化疗药物的体内效果以及抗肿瘤免疫。除了iPSCs，研究人员还使用灭活的癌症干细胞（CSCs）来开发癌症疫苗。嵌合抗原受体（CARs）是重组蛋白受体，已被设计成使T细胞能够针对特定抗原以产生抗肿瘤免疫反应并杀死特定的肿瘤细胞。这些受体的一般结构由三个主要域组成：(1) 一个细胞外域，用于选择性结合特定的肿瘤抗原，(2) 一个跨膜域，以及 (3) 一个细胞内域；这三个域共同促进T细胞介导的肿瘤死亡，为T细胞的激活和攻击肿瘤细胞提供必要的T细胞信号。CAR-T细胞疗法的一个例子是基于使用表达CD-19的基因修饰自体T细胞。该疗法通过编码CAR的转基因重新编程患者的T细胞，能够识别和摧毁任何表达CD-19的细胞（正常和恶性），在与表达CD19的细胞结合后，CAR发出一个信号，增强T细胞的扩增、激活和目标细胞的消除，以及药物的持久性。前述机制可以在两种基于CAR-T细胞疗法的当前FDA批准的药物中看到，即Tisagenlecleucel（用于治疗急性淋巴细胞性白血病）和Axicabtagene ciloleucel（用于治疗大B细胞淋巴瘤）。然而，仍有一些限制需要克服：存在抗原丢失的可能性，因此用CAR-T细胞治疗的患者可能部分表达抗原或根本不表达；另一个问题是肿瘤抗原可能由正常细胞表达。尽管检查点抑制剂和CAR-T细胞疗法的结合是一种新的治疗选择，但这种治疗可能仍然无法诱导有效的T细胞浸润，并可能导致在几种CAR-T细胞疗法中报告的细胞因子介导的毒性。这就需要寻找一种新的方法来优化基于CAR-T细胞疗法的癌症疫苗。 6.4. DC亚群及其在启动和激活T细胞中的作用 DC起源于骨髓中的巨噬细胞-DC前体（MDP），并产生共同的DC前体（CDP），然后分化成DC，它们包括各种类型的免疫细胞，根据它们的表现型、发育特征、组织分布以及转录相关特征，被分为三个主要组：经典/常规DC（cDCs）（包括cDC1和cDC2）、浆细胞样DC（pDCs）以及来源于单核细胞的DC（moDCs）。这些DC组各自分泌特定类型的细胞因子，专门用于启动和激活各种效应T细胞，并调节癌症免疫周期的特定阶段；因此，它们可以以不同的方式影响免疫反应的结果；例如，cDC1专门用于抗原启动以及它们对CD8+ T细胞的交叉呈递，随后通过MHC I信号识别。另一方面，cDC2主要参与将抗原交叉呈递给CD4+ T细胞，并通过对MHCII的识别，促进Th1、Th2和Th17的极化。根据单细胞分析，通过识别各种类型的cDC2亚群，DCs的复杂性进一步增加。pDC产生I型干扰素（IFNs），参与抗病毒和抗肿瘤免疫反应。最后，由炎症刺激的moDCs，分化并被招募到身体的炎症部位，如TME。在遇到抗原之前，DC不成熟，其特征是细胞内高表达MHC-II，低表达共刺激分子和趋化因子、细胞因子受体。然而，这些未成熟的DC通过交叉呈递或交叉修饰过程摄取抗原，并通过对各种途径，特别是受体介导的内吞作用，成熟为成熟的DC。由于它们表面存在各种类型的受体（图4），DC的成熟可以被不同的因素刺激，从单克隆抗体（mAb）到DC修饰，以及DC在成熟过程中发生的生理变化，使DC能够分泌广泛的刺激性细胞因子和其他化学分子，以阻断抑制信号，并增加共刺激分子、细胞因子产生和抗原呈递。然后，DC处理并呈递来自疫苗细胞的肿瘤抗原，通过在DC上形成抗原-MHC复合物，呈递给效应T细胞（CD4和CD8），T细胞用它们的T细胞受体（TCRs）与这个复合物结合。在成熟过程中，DC发生生理变化，导致表面MHC I和MHC II分子的表达增加，共刺激分子（如B7-1/CD80, ICAM-1/CD54, LFA-3/CD58和Tropomodulin1），趋化因子受体和细胞因子分泌，共同调节T细胞反应。此外，DC成熟导致内吞泡的pH值降低，导致蛋白质水解，肽-MHC分子向细胞表面的运输，以及抗原捕获能力的降低。在各种刺激性分子/受体的表达上调后，DCs向引流淋巴结迁移，与T细胞相互作用，诱导免疫反应，最终通过形成抗原-MHC复合物，将来自疫苗细胞的肿瘤抗原呈递给效应T细胞（CD4和CD8），使T细胞能够与DC表面呈现的这些复合物结合，并通过它们的受体（TCRs）激活；这个过程导致肿瘤被杀死。如果CD8 T细胞被有效激活，加上其他传统癌症治疗方法，如单克隆抗体、化疗和放疗，它们都可以协同作用，提高T细胞介导的肿瘤杀伤效果的效率。从这个角度来看，T细胞激活调节是在开发癌症疫苗时需要考虑的关键因素之一。T细胞激活由激活的DCs产生的广泛其他因素和信号调节，激动剂抗体，共刺激分子受体和共抑制剂（免疫检查点抑制剂）。然而，为了维持免疫稳态和自我耐受，以及减少/预防炎症和自身免疫疾病，必要时需要抑制刺激性信号的效果。在这方面，特定的分子，包括（1）表达Foxp3的异质性CD4+ T细胞亚群，称为调节性T细胞（Tregs），具有免疫抑制特性，以及（2）其他抑制性免疫细胞，如髓系来源的抑制细胞（MDSC），通过分泌各种抑制性细胞因子和分子（如TGF-β, IL-10和IL-35）发挥作用并抑制。化疗和放疗，如果以免疫调节剂量使用，可能会抑制T细胞激活。 图4. 癌症疫苗平台及其作用机制。所有讨论的疫苗平台都倾向于被抗原呈递细胞摄取，最终诱导并增强杀死癌细胞的T细胞介导途径。 6.5. 基于核酸的疫苗：DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗基于使用DNA或mRNA将基因传递给宿主APCs，以编码肿瘤抗原并产生抗原蛋白，从而使表达的肿瘤抗原诱导适当的免疫反应以杀死/抑制癌细胞。 6.5.1. 基于DNA的癌症疫苗 使用DNA癌症疫苗的历史可以追溯到1990年，当时Wolff等人研究了直接注射裸DNA到小鼠肌肉中的效果，结果在表达相应的蛋白质。在1998年，首次报告了DNA疫苗的人体试验，证明了DNA疫苗在治疗免疫缺陷病毒1型（HIV）中的效率。癌症DNA疫苗基于使用编码肿瘤抗原的细菌质粒来激活先天和适应性免疫反应。为了使DNA疫苗发挥作用，它们需要进入细胞核被转录成mRNA；然后，它们被运输到细胞质中被翻译成编码的抗原，然后通过抗原处理和呈递给CD8+ T（通过MHC I）和CD4+ T（通过MHC II）细胞来激活特定的免疫反应。DNA疫苗的作用机制是激活适应性和先天免疫系统。关于适应性免疫激活的机制，有三个主要途径：(1) DNA直接插入到体细胞，如肌肉细胞，然后翻译成抗原，并通过MHC-1分子直接呈递给细胞毒性CD8+T细胞；(2) DNA编码的抗原通过分泌或通过凋亡小体在体细胞中释放，然后通过吞噬作用和APCs处理释放的肽，并通过MHC II分子交叉呈递给CD4+ T细胞；以及(3) DNA直接转染到APCs中产生抗原（这将是内源性抗原）。这些内源性抗原然后被处理并通过MHC I和MHC II分子分别呈递给CD8+ T和CD4+ T细胞，以诱导适应性细胞免疫（通过激活CD8+ T细胞然后分化为CTLs）以及体液免疫（通过激活CD4+ T细胞）；这种DNA直接转染到APCs中，主要以皮内递送的形式进行，是DNA癌症疫苗的重要途径。转向由DNA疫苗介导的先天免疫激活途径，有许多因素调节上述途径，例如CpG（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤）二核苷酸，它们是细菌产生的质粒DNA中的免疫刺激性基序。这些基序通过与关键的先天免疫刺激因子之一，即Toll样受体9（TLR9）相互作用，参与刺激先天免疫激活。接着，TLR9识别细菌DNA中未甲基化的CpG基序，触发巨噬细胞、树突状细胞和B细胞的TLR介导的信号通路，涉及激活NF-κB、IRAK和MyD88信号通路，产生促炎细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白。此外，DNA本身激活STING信号通路，这是控制DNA信号级联的主要途径，该途径在细胞质中独立于TLR发生。体内研究已证实，在缺乏STING途径的情况下，DNA疫苗无法诱导强大的适应性免疫反应。DNA疫苗提供了多种优势，包括高度特异性和安全性、编码广泛的抗原、生产成本低，以及易于运输和储存；此外，DNA疫苗具有较低的插入突变风险，DNA很少与宿主染色体结合。经过优化的DNA疫苗在临床前研究中表现出高效。然而，由于其免疫原性差，DNA疫苗在临床试验中的进展甚微。有几种优化策略来解决免疫原性差的问题，包括优化质粒元素（如Kozak序列、内含子和物种特异性密码子），使用强大的启动子序列进行高效转录（如改良的巨细胞病毒启动子），使用特定的佐剂（如胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CPG）基序、聚合物、纳米颗粒、脂质体和小分子激动剂），以及最后，修改肿瘤抗原的设计。 6.5.2. 基于mRNA的疫苗 体外转录的mRNA疫苗是在1984年使用含有质粒DNA模板、RNA聚合酶以及其他主要成分的体外转录系统中开发的mRNA疫苗的早期版本。尽管最初mRNA疫苗并非用于治疗目的，但早期研究，包括20世纪90年代关于基于mRNA的癌症疫苗的首次体外（使用脉冲RNA的DCs）和体内（在小鼠中）研究，为使用mRNA疫苗治疗疾病，包括癌症铺平了道路。随后的研究集中在使用脂质体将mRNA输送到细胞中，进一步证实了基于mRNA的疫苗的治疗效率，因为mRNA疫苗带来了广泛的好处，如耐受性（副作用可控且暂时）和无需基因组整合的需求（因为与DNA不同，mRNA无需进入细胞核）；因此，消除了插入突变的风险。开发基于mRNA的疫苗不需要使用任何病原体/病毒剂；因此，它是非感染性的。此外，mRNA疫苗易于降解（降低毒性风险），提供体液和细胞免疫，这对于抗肿瘤反应至关重要。此外，mRNA疫苗生产快速且成本低廉。有四种主要类型的转录mRNA：常规mRNA、自增强mRNA（samRNA）、转录增强RNA（tamRNA）和圆形mRNA（circmRNA）。这些体外转录的常规mRNA的一般结构与真核细胞中的天然mRNA相似，即由5'帽、5'和3'非翻译区（UTRs）、开放阅读框（ORF）和聚（A）尾组成。尽管这类mRNA疫苗具有优势，但一些缺点，包括mRNA的固有不稳定性、缺乏良好的生产规范、低蛋白表达效率、高免疫原性，以及与体内mRNA输送到细胞和重复注射剂量维持蛋白表达相关的困难，以及非靶向副作用，阻碍了其作为有效治疗疫苗的发展。考虑到这一点，近几十年来，人们为优化基于mRNA的疫苗做出了巨大努力，通过化学修饰、产品纯化和序列优化提高mRNA稳定性，降低其体外和体内免疫原性，例如5'端（自体）或5'帽（类似物）修饰，通过密码子优化、鸟嘌呤加胞嘧啶（GC）含量富集、保持3'聚（A）尾的长度在120-150个核苷酸内，并添加化学修饰的腺苷。另一种提高稳定性和蛋白产量的方法是开发基于RNA而非mRNA的其他类型的疫苗。例如，自增强RNA（saRNA）、转录增强RNA（taRNA）和圆形RNA（circRNA）在癌症疫苗领域带来了治疗益处。然而，为了使mRNA疫苗在临床应用中使用，它们应该受到酶降解的保护，成功地输送到目标细胞，随后通过内吞作用，并从内体逃逸以防止过早降解。mRNA复合物的物理化学性质应被考虑在内，因为它们影响目标细胞对mRNA的摄取机制。从这个角度来看，有效地将mRNA输送到目标细胞/组织是必要的。为了达到这个目标，已经开发了两种主要方法：(1) 通过电穿孔的体外DC转染，然后重新输注转染细胞，以及(2) 直接注射mRNA，有或没有载体。在第一种方法中，通过电穿孔将mRNA加载到DCs中（在不使用任何载体的情况下实现优化的体外转染）。在生成转染DCs后，它们将被重新输注到患者体内，作为自体疫苗的一部分并诱导免疫反应。由于能够启动适应性免疫反应以及抗体反应（通过向B细胞呈现完整抗原），DCs已经被大量关注，作为体外和体内mRNA疫苗输送的载体。 同样，皮内和淋巴结内注射在提供体内免疫方面是有效的。另一方面，物理方法（使用电穿孔或基因枪）增加了DCs对mRNA的摄取效率，但面临主要限制，这些限制阻碍了它们的进一步发展，例如增加细胞死亡，限制了对目标细胞的可及性；此外，使用基因枪，例如，只在小鼠模型中显示效率，而不是在人类模型或更大的研究规模中；电穿孔增加了免疫原性（只有在自增强RNA疫苗的情况下）。使用病毒载体进行mRNA输送有几种缺点，使它们成为不适当的载体；其中一些缺点包括差的体内效力，刺激由载体介导的免疫反应的可能性，对病毒载体的已有免疫力，以及生物安全问题。这些缺点导致科学家寻找其他mRNA载体，结果利用纳米颗粒，特别是脂质和聚合物基纳米颗粒，为mRNA输送开发了多样化、有效和安全的载体。其中一些基于脂质/聚合物的方法基于使用鱼精蛋白（阳离子肽），阳离子脂质，以及聚合物，包括树状大分子和壳聚糖，以及脂质纳米颗粒，这些颗粒与聚乙二醇（PEG）等其他聚合物结合以增加稳定性。在脂质载体的情况下，已经应用了胆固醇和膜中存在的其他天然脂质来提高疗效。基于脂质的输送载体不仅提高了mRNA输送的效率，并有助于选择性地靶向器官和/或细胞（通过调整脂质纳米颗粒中各种元素的比例），而且这样的脂质载体诱导了佐剂效应，正如一些最近的研究报告所示，脂质纳米颗粒诱导了强大的体内免疫反应，比AddaVax（一种常见的疫苗佐剂）具有更强的佐剂效力；此外，脂质纳米颗粒可以通过激活Toll样受体4（TLR4）信号通路增强mRNA癌症疫苗的抗肿瘤效力。mRNA疫苗可以通过多种途径给药，如皮下、皮内、鼻内、肌肉内、淋巴结内、瘤内和静脉注射等。利用mRNA对自体DCs进行体外工程被认为是肿瘤抗原传递的首选方法，但大多数用于开发mRNA疫苗的方法倾向于使用脂质纳米颗粒载体直接给药mRNA。基于mRNA的疫苗开发旨在诱导或增强有效的抗肿瘤免疫反应。给药后，mRNA通过APCs的细胞摄取进入细胞质，并经历抗原启动和MHC-抗原呈递级联反应，导致通过MHC-I和MHC-II介导的抗原呈递以及CD8+和CD4+ T细胞的激活。除此之外，CD4+ T细胞本身可以通过协同激活抗原特异性B细胞来诱导体液免疫反应，而这些B细胞可以作为APCs在通过MHC类II向B细胞呈递抗原后反过来激活CD4+ T细胞。 6.6.个性化癌症疫苗 个性化癌症疫苗是另一种旨在针对患者特定癌细胞的免疫疗法，基于他们独特的遗传档案来刺激患者的免疫系统更选择性地识别和攻击癌细胞。基于前面讨论的不同癌症疫苗平台，已经开发和使用了几种类型的个性化癌症疫苗，并在临床前和临床研究中使用，如基于肽、全细胞、核酸（DNA和mRNA）和新抗原的个性化癌症疫苗。开发个性化癌症疫苗有几个步骤：(1) 对患者的肿瘤进行基因组分析（以识别肿瘤特异性特征，如突变、新抗原和其他可以被免疫系统针对的特征）；(2) 抗原选择（基于基因组分析，选择肿瘤特异性抗原以包含在疫苗中）；以及(3) 疫苗配方（使用不同的方法制定疫苗，如来自肿瘤抗原的肽、装载肿瘤抗原的DCs、编码肿瘤抗原的DNA或RNA、新抗原或整个肿瘤细胞裂解物）。在个性化癌症疫苗给药后，疫苗中的抗原通过APCs呈递给免疫细胞，并刺激对携带目标抗原的癌细胞的免疫反应。传统癌症疫苗和个性化癌症疫苗都有助于癌症免疫疗法的不断发展，个性化疫苗在改善具有特定肿瘤特征的患者的治疗结果方面显示出前景，因为这种类型的疫苗提供了一种高度针对性和个体化的癌症免疫疗法方法，与其可能针对广泛患者群体中的常见抗原或与癌症相关的抗原的传统对应物相比。个性化疫苗旨在针对患者的特定癌细胞，基于肿瘤的遗传和抗原谱，并刺激免疫系统识别和攻击这些特定的癌细胞，而传统癌症疫苗可能针对几个癌症患者共享的常见抗原或与某些类型的癌症相关的抗原，但不是针对个体的肿瘤。此外，个性化癌症疫苗的抗原是基于患者肿瘤的基因组分析和新抗原选择的，而传统癌症疫苗中的目标抗原在特定类型的癌细胞中更广泛地表达，或者可能与癌症相关但不是针对个体的肿瘤。考虑到生产过程，个性化癌症疫苗有一个定制的生产过程，（测序患者的肿瘤DNA/RNA，识别特定突变，合成或选择基于这些突变的肽或抗原，并制定疫苗）；然而，传统类型是使用标准化的抗原或不针对患者肿瘤的抗原来源生产的。个性化癌症疫苗激活针对患者特定癌细胞的选择性免疫反应；然而，传统疫苗诱导对常见癌症抗原或与特定类型的癌症相关的抗原的一般免疫反应。个性化癌症疫苗通常用于精准医疗，其中治疗根据患者的独特特征量身定制。虽然个性化癌症疫苗在癌症治疗中提供了有希望的潜力，但也有一些需要解决的挑战；例如，它们需要复杂的过程（如肿瘤基因组测序，特定抗原的识别），以及为每个患者定制生产疫苗。考虑到这些过程耗时、资源密集且成本高昂，这些疫苗在患者群体中的可及性有限；这种耗时问题可能导致其他问题，这些疫苗不适合需要立即治疗的患者（那些癌症迅速发展的患者），因为基因组分析、抗原选择和疫苗生产所需的时间可能会延迟治疗开始。肿瘤异质性是另一个挑战；考虑到肿瘤的遗传异质性，它们包含不同遗传突变和抗原谱的不同细胞群体的混合，因此，个性化疫苗可能不会针对肿瘤中存在的所有相关抗原，导致疫苗未针对的癌细胞可能的逃逸机制。此外，个性化癌症疫苗可能面临克服癌细胞免疫逃逸机制的挑战，在某些情况下导致效力有限；其他障碍可以归因于有限的临床证据以及其他后勤挑战（包括存储、运输和给药个性化癌症疫苗）。尽管存在这些挑战，癌症免疫疗法的持续研究和进步继续改善个性化癌症疫苗的开发和利用，旨在解决这些限制并提高其治疗癌症的效力。最有效的方法是开发基于新抗原的个性化癌症疫苗。总的来说，所有当前的癌症疫苗平台都有优点，如诱导体液和适应性免疫系统、长期稳定性、灵活性、高免疫原性、临床安全性等，以及缺点，如抗原丢失、低MHC表达、不适当的APC摄取和抗原呈递等，在表1中详细总结。 7.结合人工智能和冷等离子体技术作为开发癌症疫苗的新型模式工具 目前，有几家大公司是生产治疗性癌症疫苗的领导者，包括Imatics、BioNTech、AstraZeneca、纪念斯隆凯特琳癌症中心、默克、马萨诸塞州总医院、F. Hoffmann-La Roche、Bristol-Myers Squibb、Regeneron Pharmaceuticals和诺华。尽管上述公司拥有众多专利并开发了各种癌症疫苗，但开发有效和通用癌症疫苗存在几个主要挑战，例如不同人群中肿瘤的变异性、肿瘤抗原与身体自身抗原的相似性，以及癌症复发的可能性（由免疫抑制性肿瘤微环境或肿瘤异质性引起）。考虑到这一点，优化当前的癌症疫苗以覆盖广泛的肿瘤抗原、区分肿瘤抗原与身体的对应物，并预防癌症复发是不可或缺的。 如表1所示，所有疫苗平台都有自己的特定优缺点，这导致科学家通过结合这些不同平台来优化癌症疫苗，目的是加强优势和减少劣势，并提出更好的治疗性癌症疫苗。这种组合疗法的例子包括使用基于脂质的递送（脂质体、脂质纳米颗粒、猫离子脂质），特别是PEG等各种聚合物，以增强mRNA稳定性，将聚合物注入目标细胞，肿瘤特异性，放大肿瘤抗原反应，并减少可能的毒性。此外，为了克服免疫抑制性肿瘤微环境（这可能阻止功能和激活对摧毁癌细胞必需的免疫细胞），研究人员已经将mRNA疫苗的使用与免疫检查点抑制剂结合起来。肿瘤异质性指的是存在基因多样性的亚群，具有不同的表型特征，导致遗传突变的多样性。肿瘤的同质性可以在肿瘤之间或同一肿瘤内部看到；肿瘤的同质性使得在亚群中发生的突变难以检测，并阻碍了适当治疗策略的设计。在肿瘤异质性方面，有空间（肿瘤进展过程中的动态基因组演变）和时间（肿瘤由具有不同基因组的亚克隆组成，这使得患有相同癌症和肿瘤亚型的人对治疗的反应不同）异质性，两者都需要克服。一些策略基于通过组织多点采样在肿瘤区域看到的变异设计个性化mRNA癌症疫苗；这些策略能够同时针对在各个肿瘤区域表达的多种抗原（以针对空间异质性），并监测疾病的进展，然后可以根据监测结果调整治疗计划（以解决时间异质性）。然而，这些策略和组合疗法使疫苗设计和给药途径更加复杂，并增加了患者的治疗成本和持续时间。随着人工智能（AI）应用在包括医学在内的各个领域的扩展，科学家已经利用AI算法（如MHC结合预测工具、突变转录物表达量的量化、突变的克隆性、确定肿瘤特异性T细胞表位）来预测基于肿瘤基因组数据的肿瘤抗原及其属性。基于诱发T细胞反应的可能性，科学家可以选择一些特定突变作为疫苗候选物。AI工具可能提高疫苗设计的准确性，并克服与肿瘤异质性相关的挑战。 使用AI算法似乎是一个有前景的工具，可以帮助解决癌症疫苗开发的主要挑战。另一种可能与AI相关工具一起使用的技术是冷等离子体相关系统。冷等离子体（CAP），也称为非热或冷物理等离子体，是一种由部分电离气体组成的介质，它引发各种活性氧和氮物种的生成。CAP已在包括医学在内的广泛行业中应用，特别是在癌症治疗中；CAP在摧毁癌细胞以及固体肿瘤方面显示出有希望的结果，同时影响各种相关机制，如诱导凋亡，特别是在肿瘤细胞而非正常对应物中，减少细胞迁移，阻止细胞周期在S阶段，损伤DNA，以及增加肿瘤微环境中的ROS浓度，减少肿瘤免疫抑制，并提高抗原性。CAP已获得FDA批准用于癌症治疗。然而，这项技术尚未用于癌症疫苗开发。根据CAP在癌症治疗中的应用方式，我们建议CAP技术可以直接或间接应用于癌症疫苗开发。直接方法可以包括直接暴露癌细胞以及疫苗给药（例如，同时给药脂质纳米颗粒mRNA癌症疫苗和冷等离子体暴露癌细胞），间接方法可以包括先将细胞培养基中的细胞（如CAR-T细胞中的患者T细胞，或iPSCs）或仅培养基暴露于CAP，然后让细胞在介质中生长。这可能有助于通过阻止肿瘤进展中的基因突变来减少肿瘤异质性，提高治疗在杀死癌细胞而不影响正常细胞时的选择性，并防止正常细胞表达肿瘤抗原。其他方法可能包括尝试开发其他新的CAR-T细胞，而不是CD19和BCMA，这些细胞能够识别不同的肿瘤抗原，并应用冷等离子体。考虑到CAP可以增强肿瘤抗原性（癌细胞与正常细胞被免疫细胞识别的差异程度）并上调MHC-I和II等免疫原性细胞表面分子，将CAP引入这一领域可能会导致有趣的结果。其他方法可能包括将非活化的全肿瘤干细胞与含有抗癌剂的脂质纳米颗粒一起装载，或将肿瘤干细胞与含有iPSCs的脂质体一起装载，然后注射；这可以提高DCs的效率，从而提高免疫原性反应。此外，这种方法可能同时针对几个因素；例如，非活化的肿瘤干细胞和iPSCs本身都涵盖了广泛的肿瘤抗原，这些抗原免疫原性较差（不会逃避癌症免疫周期），如果它们在系统中一起使用，这种覆盖范围可能会增加，并有助于解决肿瘤异质性问题。此外，这种组合系统可以进一步提高免疫原性反应，以防止癌症复发。最后，如果将冷等离子体与这样的组合系统集成，该组合系统甚至可以进一步改进，因为CAP本身选择性地破坏肿瘤细胞。同时，含有iPSCs的脂质体穿透DCs并增强肿瘤抗原呈递的变异性，然后被T细胞检测并产生免疫反应。这些是需要未来研究的一些方法，可能会开辟治疗性癌症疫苗开发的新颖有效途径。 8.总结和结论 总之，我们强调了四大疫苗平台的最新研究进展及其局限性。我们认为，全面了解免疫抑制性肿瘤微环境对于开发有效的癌症疫苗至关重要。此外，基于颗粒的递送系统在过去几十年中已用于癌症疫苗的深入研究，这些系统对于提高疫苗的免疫原性和促进淋巴结运输具有巨大的前景。已有共识认为，如果癌症疫苗与其他免疫调节或标准化疗法结合使用，可能会实现更大的治疗效果。然而，仍需要持续努力以鉴定肿瘤特异性新抗原、有效的佐剂和优化递送平台。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

- First landmark, peer-reviewed publication of successful in vivo CAR T-cell data in an immune competent NHP model -- Data validate the VivoVec™ platform in a translationally relevant model and support its transition into human clinical testing, offering a potential paradigm shift in the field of CAR T-cell therapies - SEATTLE, June 13, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Umoja Biopharma, Inc. (Umoja), a transformative immunotherapy company creating off-the-shelf treatments that aim to extend the reach and effectiveness of CAR T-cell therapies in oncology and autoimmunity, today announced that pre-clinical non-human primate (NHP) data on its VivoVec in vivo CAR T delivery system was published in Blood, the flagship journal of the American Society of Hematology. Results showed that in the absence of lymphodepleting chemotherapy, VivoVec lentiviral particles successfully generated CAR positive T (CAR+ T) cells targeting CD20 in vivo leading to the complete and durable depletion of B cells in excess of 10 weeks. Key Study Findings VivoVec particles (VVPs) incorporating CD80 and CD58 costimulation proteins exhibit enhanced capacity for in vivo CAR T-cell generation and produce CAR T-cells with increased antitumor functionality compared to those produced from VVPs displaying anti-CD3 scFvs alone.Combining the anti-CD3 scFv together with the ligand binding domains of CD80 and CD58 into a single multi-domain fusion (MDF) protein markedly augments the particles’ ability to bind, activate, and transduce T-cells.VVPs incorporating MDF compatible with NHP T-cell activation and costimulation potently generate anti-CD20 CAR T-cells in vivo, comprising up to 65% of circulating T-cells, and results in complete B-cell depletion for up to 76 days. “Currently approved ex vivo CAR T-cell therapies have significantly improved treatment outcomes in cancers like non-Hodgkin's lymphoma and multiple myeloma. However, their adoption and patient access are limited by the need for extensive infrastructure such as apheresis facilities, and the lengthy process of manufacturing patient-by-patient lots of CAR T-cells,” said Byoung Ryu, Ph.D., Executive Vice President of Vector Biology and In Vivo Sciences at Umoja Biopharma added, “We are excited to move several VivoVec drug candidates into initial human trials later this year, aiming to address these challenges.” “We are encouraged by these data that show continued validation of our VivoVec platform demonstrating the successful generation of CAR+ T-cells directly in vivo, eliminating the need for external cell collection, genetic modification, and extensive testing,” said Christopher Nicolai, Ph.D., lead author of the publication. The VivoVec platform utilizes advanced lentiviral particles that are surface engineered with a multidomain fusion protein to drive particle binding to T-cells, and subsequent activation and transduction, resulting in CAR expression. The CAR transgene is delivered to reprogram the T-cells to target specific cancer cells. The data published in Blood were collected in collaboration with the Washington National Primate Research Center. Umoja plans to initiate first-in-human trials of VivoVec-generated candidates in the second half of 2024. About VivoVec Umoja’s VivoVec gene delivery platform combines third generation lentiviral vector gene delivery with a novel T-cell targeting and activation surface complex. VivoVec is designed to enable T-cells in the body to manufacture their own cancer-fighting CAR T-cells in vivo. This has the potential to eliminate many challenges associated with traditional CAR T approaches, including reliance on gathering a patient’s own or donor cells which are modified externally before being delivered back to the patient, the associated time lag and manufacturing challenges of ex vivo cell modification, and the need for patient’s lymphodepletion. About Umoja Biopharma Umoja Biopharma, Inc. is a clinical-stage biotechnology company aiming to develop off-the-shelf therapeutics that improve the reach, effectiveness, and access of CAR T-cell therapies in both oncology and autoimmunity. Umoja’s VivoVec in vivo gene delivery technology is intended to empower a patient’s own immune system to fight disease. Enabling its core technology is the Company’s state-of-the-art lentiviral vector development and manufacturing facility in Louisville, Colorado. Umoja believes its approach can provide broader access and improved effectiveness of the most advanced immunotherapies, enabling more patients to live better, fuller lives. To learn more, connect with Umoja on LinkedIn and visit http://umoja-biopharma.com/. Umoja Forward-Looking Statements: This press release contains forward-looking statements about Umoja Biopharma, Inc. (the “Company,” “we,” “us,” or “our”). The Company has based these forward-looking statements largely on its current expectations, estimates, forecasts and projections about future events and financial trends that it believes may affect its financial condition, results of operations, business strategy and financial needs. In light of the significant uncertainties in these forward-looking statements, you should not rely upon forward-looking statements as predictions of future events. 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