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TIS2024第四届自免疾病细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，点击图片查看重磅嘉宾，合作详询：王晨 180 1628 8769 （扫码立即报名获取TIS2024免费票） 本报告对外泌体的结构、分类、工程化技术、纳米递送系统的演变、商业应用、工业制备与质量控制分析、产业链上下游分析、产业驱动因素、市场容量、挑战与问题、代表公司等多方面进行了系统分析，为创业投资和产业发展提供了有力研究基础。 作    者  |  郭允乐、贾心语、王哲 编    辑  |  郭维、胡旭海、杨贺 邮   箱  |  vdcapital@vdcapital.net 刊    号  |  Vol.107 2013年，三位“外泌体“领域的科学家荣获“诺贝尔奖”，这也让“外泌体”这个名词进入大众视角，这是一种30-150nm的纳米级的脂质结构，自身对抗衰、修复、抑制炎症、美容等都具有非常显著的功效，并且它的穿透性极强、吸收更佳、无免疫原性，是一种非常优质的“活性物质递送系统”。 图1. 2013年诺贝尔生理或医学奖-外泌体 目   录 [向上滑动阅览]                  1. 外泌体概述                   1.1 递送系统的演变                   1.2 外泌体结构与形成                   1.3 天然外泌体                   1.4 工程化外泌体                   1.5 外泌体的功能应用              2. 外泌体的商业应用                   2.1 天然外泌体疗法                   2.2 工程化外泌体递送                   2.3 外泌体偶联药物                   2.4 医疗美容与护肤品                   2.5 体外诊断/早期筛查              3. 外泌体的工业制备与质控              4. 外泌体产业链分析              5. 产业驱动因素与挑战              6. 外泌体产业市场分析              7. 国内外代表性公司 Vol.1 外 泌 体 行 业 概 述  1.1  递送系统的演变 随着治疗方式从“小分子”扩展到包括“核酸”、“多肽”、“蛋白质”、“抗体”、“核酸”、“活细胞”，活性物质的递送和吸收能力成为了新的挑战。 图2. 治疗方式的演变 现代药物递送技术始于1952年，诞生了Spansule (缓释胶囊)技术，到20世纪80年代，口服和透皮制剂为小分子药物提供了长达24小时的治疗持续时间，并主导了药物递送领域和市场；1989年，基于Lupron Depot (PLGA聚合物)的批准为长效注射剂和植入剂打开了大门，并出现递送各种小分子、多肽、蛋白质的系统的百花争艳；1990年第一个Adagen (PEG化蛋白)的问世标志着聚乙二醇化药物的新纪元，在过去的30年里已开发约20种聚乙二醇化蛋白药物，该技术从1995年的Doxil (PEG化脂质体)批准开始在纳米制剂中应用，在2018年批准了siRNA药物如Onpattro (PEG化LNP)、2021年批准了mRNA药物如Comiranty (PEG化LNP)；2000年，美国政府推出了“国家纳米技术倡议”(NNI) ，被称为“纳米医学”，Mylotarg (ADC)、Doxil (PEG化脂质体)、Abraxane (白蛋白-紫杉醇复合物)成为纳米医学的典型代表；药物-聚合物复合物和偶联物中的ADC至今备受关注，2009年第一个抗体-药物偶联物Mylotarg (ADC)获批；2018年Onpattro (LNP)的获批打开了LNP递送系统的广泛应用，众多创业公司进入该领域，但还需要进一步的发展，如“内体逃逸”以实现胞质溶胶等；2017年首个眼科AAV基因递送药物Luxturna (AAV)上市，AAV等病毒递送系统进入了爆发期；2021年，exoIL-12(Exosome, 外泌体）率先进入人体临床试验，标志着外泌体递送系统进入了产业化的征途，虽然该产品由于某些原因暂停，但后起之秀ExoFlo™(Exosome, 外泌体)外泌体药物已处于临床III期，外泌体作为活性物质的递送系统将开启纳米医学和细胞与基因治疗的新篇章。 图3. 递送系统的演变 外泌体递送系统不同于传统递送系统，包含天然外泌体和工程化外泌体： 天然外泌体内部包裹了多种调节蛋白、microRNA和mRNA等天然活性物质，具有优异的治疗和美容效果，作为细胞治疗的“无细胞疗法”的重要手段。1）在医美护肤领域：ExoCoBio的干细胞外泌体已经于2018年上市销售，是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的肌肤再生及抗炎效果为主要产品特征；国内“天津外泌体科技”的Y3系列美容产品已经获得欧洲的CE认证，可在欧盟进行大规模销售。2）在治疗药物领域：干细胞天然外泌体药物ExoFlo™中发现了多种蛋白和核酸物质，可替代干细胞治疗，处于美国III期临床试验；CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，有效地杀伤实体肿瘤。 表1 外泌体药物ExoFlo™中发现的调节蛋白 工程化外泌体是通过“基因工程”或“化学工程”对外泌体进行工程化改造以实现活性物质的靶向递送，可广泛递送小分子、多肽、蛋白、抗体、核酸等活性物质，具有增强的载药效率、靶向性、抵抗机体清除率等特点。工程化外泌体领域目前没有产品获批，作为药物治疗处于临床II期阶段，2023年3月，工程化外泌体代表企业Codiak由于产品开发失利而宣告破产保护，该领域开发具有一定挑战性。 1.2  外泌体结构及形成 外泌体(Exosome)是几乎所有细胞均可释放的、直径约30-150 nm的细胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)，由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中。 EV可分为Exosome (外泌体, 30-150 nm)、Ectosome (核外颗粒体, 100-1000 nm)、Apoptotic bodies(凋亡小体, 50-5000 nm)三大类。Exosome由胞吐作用(exocytosis)释放，Ectosome由质膜向外出芽(Outward budding)而分泌，Apoptotic bodies在凋亡后期由程序性死亡细胞释放（图4）。 图4. 细胞外囊泡亚型示意图 (Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170) 在经典分泌途径中，带有蛋白质货物如胞外蛋白的囊泡在高尔基体（GOLGI）中分拣和包装，将其货物运输到质膜（PM），通过与质膜融合，膜蛋白和分泌蛋白都被有效地运输到它们预定的目的地（图5）。 各种类型的货物，如蛋白质、RNA等，也可以通过质膜向外出芽形成脱落的囊泡（核外颗粒体, Ectosome）方式运输到细胞外空间。货物通过细胞内吞作用（受体介导和自由摄取）摄取，形成初级内体（EE）。在初级内体（EE）中，货物要么被回收到质膜（PM），要么被封闭在多泡体（MVBs）的腔内囊泡（ILV，外泌体前体）中（图5）。 外泌体（Exosome）的形成始于初级内体（EE）的膜向内出芽，随后形成多泡体（MVBs）。在胞吐途径①中，多泡体（MVBs）与质膜（PM）融合，将其内容物（外泌体，Exosomes）释放到细胞外空间，外泌体货物运送到受体细胞可以通过直接与受体细胞膜融合（Membrane fusion），胞饮作用/吞噬作用（Pino- or phagocytosis），或配体-受体结合（Receptor binding）等各种机制发生；在降解途径②中，多泡体（MVBs）被运送到溶酶体（LS）进行酶辅助降解。这一途径对于抑制激活的生长因子受体的信号传导尤为重要（图5）。 图5. 不同类型EV形成通路 Extracellular protein-胞外蛋白；Receptor-受体；Cargo-货物: 蛋白、RNA等；Regular protein export/secretion-调控蛋白运输/分泌；Intraluminal vesicle (ILVs)-腔内小囊泡；Exosome-外泌体；Shed vesicle/Ectosome-核外颗粒体；PM-质膜；ER-内质网；EE-初级内体；LE-次级内体；LS-溶酶体；MVB-多泡体；GOLGI-高尔基体；NUCLEUS-细胞核；Exocytic pathway-胞吐途径；Degradative pathway-降解途径；(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170) 在外泌体的生成过程中，有几种蛋白密切参与，包括Rab GTPases、ESCRT蛋白，以及被用作外泌体标记的CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神经酰胺和Alix等。不同来源的细胞生成外泌体的速率、大小、组分(货物)均有异质性。外泌体腔内组分主要由mRNA、miRNA、gDNA片段、以及无数不同的蛋白质组成，这些组分类型取决于细胞的起源（图6）。 图6. 外泌体的组分和鉴定 外泌体作为细胞间物质交流和信号传递的途径，不同细胞间通过分泌携带有不同组分的外泌体实现通讯，这些分泌的外泌体被受体细胞吸收，通过释放内含物实现物质和信号的交流（图5）。 1.3  天然外泌体 使用不同细胞来源产生的“天然外泌体”已经在医美领域实现商业化，同步也正在进行多项药物临床试验，最快已处于临床III期试验，显示出不错的安全性和有效性。布局天然外泌体的代表企业包括ExoCoBio、天津外泌体科技、佰傲医学、Direct Biologics等，这些企业将是外泌体行业最先商业化的企业。 1983年，Pan和Johnstone在研究网织红细胞成熟到红细胞过程的研究里，在体外培养的绵羊红细胞培养液上清液中发现了一种从网织红细胞释放的囊泡，含有网织红细胞来源的脂质、蛋白质和酶，后来命名为“外泌体”。1996年，Raposo等发现B淋巴细胞分泌的外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和黏附因子。2007年，Lotvall和Valadi发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。2013年，诺贝尔生理或医学奖授予从事细胞内囊泡(外泌体)运输调控机制研究的3位科学家——James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，由此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。 图7. 细胞分泌外泌体图示 几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类，外泌体分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。 1.3.1 动物细胞外泌体 天然外泌体 哺乳动物细胞外泌体由几乎所有类型的“健康细胞”和“病理细胞”分泌，存在于不同的体液中，例如血浆、尿液、乳汁、唾液、羊膜、细支气管肺泡、滑膜以及腹水等。在循环外泌体中，80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞，通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。正是基于此，外泌体天然具有活性物质的递送功能(天然递送系统)和作为疾病的特异性生物标记物(诊断标志物)。 图8. 哺乳动物细胞外泌体 目前可通过GMP大规模生产获得动物细胞外泌体的主要包括：牛奶外泌体、人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293细胞外泌体。 图9. 处于临床的外泌体种类和GMP生产 （Tzu Chi Medical Journal 2020, 32, 113-120） 1.3.2 植物外泌体 天然外泌体 植物外泌体（plant exosome）的形成区域通常始于反式高尔基体或者早期内体，随后形成多囊泡内体（MVEs）或者多泡体（MVBS），并选择性地将mRNA、miRNA、其他非编码RNA等多种RNA、脂质、DNA等结合进囊泡中，最终植物外泌体与质膜结合将内含物释放。植物外泌体体积小、组织穿透性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，成为经皮递送、靶向给药、基因传递等递送理想载体。 目前，公开报道的植物外泌体研究包括葡萄外泌体、生姜外泌体、芦荟外泌体、人参外泌体、金银花外泌体、甘草外泌体、红景天外泌体、西兰花外泌体、葡萄柚外泌体、小麦外泌体、大蒜外泌体、蒲公英外泌体、洋葱外泌体等。研究发现，植物外泌体蕴含了植物中90%的活性成分，是植物有效成分浓缩的精华中的精华。1kg植物仅能提取1μg植物外泌体，而其活性却远高于1kg植物提取物。 图10. 植物外泌体或衍生的PELNV的生物功能 （Molecular Therapy. 2021, 29, 13-31） 植物外泌体含有较为丰富的miRNA，为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，来自药用植物外泌体的miRNA可能作为新的生物活性成分与哺乳动物系统相互作用，外泌体作为中药活性成分的应用将越来越广泛。 1.3.3 微生物外泌体 天然外泌体 微生物外泌体的研究主要集中在细菌胞外囊泡(BEVs) ，其发现可追溯到20世纪60年代。BEVs类型多种多样，根据产生方式不同包括：革兰氏阴性细菌来源的外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、古菌和革兰氏阳性细菌来源的细胞质膜囊泡(cytoplasmic membrane vesicles，CMVs)、外-内膜囊泡(outer-inner membrane vesicles，OIMVs)、破裂性外膜囊泡(explosive outer membrane vesicles，EOMVs)。 图11. 不同的途径导致形成不同的膜囊泡类型 （Nat Rev Microbiol . 2019, 17(1):13-24.） BEVs直径范围为20-400 nm，影响多种生物过程，包括毒力因子的运输、DNA转移、噬菌体的拦截、抗生素和真核宿主防御因子、细胞解毒、细胞代谢物输出、细胞间通讯等。 BEVs与哺乳动物宿主细胞的相互作用多集中在肠道微生物菌群。肠道菌群积极促进肠道和远端器官的基本功能（相关阅读: 肠道微生态药物的发展和投资趋势）。在肠道生态系统中，微生物群与宿主之间的双向通讯不涉及直接的细胞接触。越来越多的证据表明，细菌分泌的BEVs通过向宿主细胞运输和传递调节宿主信号通路和细胞过程的效应分子来介导菌群功能，肠道微生物群释放的BEVs可能对健康和疾病有很大的影响。BEVs可能作为预防肠道感染或炎症和免疫相关疾病的治疗、营养策略，使用分离的BEVs将可能克服在免疫缺陷个体中使用活益生菌的潜在风险。肠道微生物群组成和多样性的失衡与包括癌症、神经、代谢和免疫紊乱在内的多种疾病有关，在患者和健康人群的血液和尿液样本中发现了肠道微生物群来源的BEVs，其特征与肠道微生物组高度相关，这为诊断提供了新的策略。 1.4  工程化外泌体 为了拓展其作为纳米递送系统的可能性，科学家通过生物工程、化学工程策略来设计并装载“工程化外泌体”，开发出了基于工程化外泌体的“纳米递送系统”。生物工程 (Biological Engineering)通过膜结合蛋白的遗传融合引入靶向基序，如多肽、蛋白、ASO等，代表企业有Codiak、Evox、唯思尔康、恩泽康泰等。化学工程 (Chemical Engineering)指通过“脂类化学反应”或“膜结合蛋白化学反应”或“脂质-脂质相互作用”安装不同的片段，如抗体、蛋白、适配体、小分子、聚合物等，代表企业有天津外泌体科技等。 图12. 工程化外泌体的表面修饰方式  根据外泌体纯化前还是纯化后进行装载分为三种装载方式： 内源装载 (Endogenous loading)：对来源细胞进行生物工程改造，使其分泌工程化外泌体，也称Pre production； 外源装载 (Exogenous loading)：先分离纯化好高纯度外泌体，进行负载改造，也称Post production； Per production：在外泌体形成过程中，利用物理方法破坏-再造质膜而封装活性物质，挤压出细胞膜过程中装载上目标分子的“类EVs样囊泡”； 图13. 工程化外泌体的装载方式 （Advanced Drug Delivery Reviews. 2021, 178: 113972.）  1.4.1 内源装载 工程化外泌体 内源装载 (Endogenous loading) 是在分泌外泌体的细胞上做基因工程改造，让其产生携带目标分子的外泌体。例如，构建融合表达特定蛋白和外泌体膜蛋白的质粒，通过转染等方式，让该融合蛋白在外泌体来源细胞中大量表达，这些细胞分泌的外泌体就会携目标融合蛋白。RNA、蛋白质、核酸、各种小分子，都可以采用内源装载。不过，与外源装载相比，内源装载的实验难度更大、周期更长。 图14. 内源装载方式 (Crit Rev Biotechnol. 2020, 40(6): 804-820.) 1.4.2 外源装载 工程化外泌体 外源装载 (Exogenous  loading) 的常用方法有孵育、超声透化、电穿孔、脂质体融合、化学偶联(点击化学)。 孵育是让待装载的分子与外泌体在一定条件下充分接触，依靠外泌体膜本身的疏水性被动完成装载。孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，主要适用于疏水小分子，装载效率受药物浓度影响，所需时间较长。 电穿孔是通过外加电场，在外泌体膜上形成临时的亲水性孔道，增加外泌体膜的通透性，使小分子物质能够穿过孔道进入外泌体内部。主要适用于装载亲水分子，过量投入外泌体有助于提高回收率。但会引起外泌体聚集，破坏外泌体膜的稳定性，也可能导致核酸药物本身聚集导致假阳性结果。 超声是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而小分子物质扩散到外泌体中。主要用于装载亲水分子，装载后有些小分子物质也会附着于外泌体膜外侧。装载效率高于电穿孔和孵育，但对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂且实验重复性较差。 脂质体融合外泌体是实现活性物质直接装载的一种有希望的替代方法。为了控制和改变外泌体纳米载体的生物功能，京都大学Katsura通过用冻融技术融合脂质体和外泌体的质膜从而得到杂交的外泌体。特定遗传修饰细胞分泌的外泌体与各种脂质体融合，是非常有效的膜工程方法。如Lipofectamine含有脂质亚基，可在水环境中形成脂质体并捕获核酸，带正电的脂质体表面与带负电的外泌体质膜融合，随后释放核酸完成杂交外泌体的装载。也有研究单位利用穿膜肽（CPP）转染核酸药物到外泌体中，快速简便且高效。维渡纵横认为，脂质体融合外泌体技术与LNP的四组分原理有着异曲同工之妙，为mRNA和siRNA药物的发展提供了更广阔的空间。 图15. 脂质体融合外泌体 (Sci Rep. 2016, 25: 21933.) 化学偶联外泌体是最具商业化潜力的新兴技术，通过“脂类化学反应”或“膜蛋白化学反应”安装多种功能性分子，如多肽、抗体、蛋白、脂质、适配体、小分子、聚合物，在外泌体上进行可控、可调节的多功能化改造。化学偶联技术可控制功能化分子在外泌体上的“装载数量”与“装载位点”，实现多种功能化分子的“多元装载”，用于靶向递送、药物示踪等。值得注意的是，外泌体偶联药物(EDC)的高效Payload装载，突破了抗体偶联药物(ADC)载药率低、安全性有限的瓶颈。根据维渡纵横统计，天津外泌体科技有限公司(简称“天津外泌体科技”)可能是国内唯一掌握该技术商业化的公司，根据已发表文章显示其药物装载率达92.3%、溶解性提高71.4倍、半衰期提高36.2倍、药峰浓度提高3倍、 口服相对生物利用度提升2.6倍；装载Herceptin抗体的外泌体呈现靶向效果相比对照组提升174.5倍。 图16. 外泌体化学偶联技术 1.5  外泌体的功能 不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。 外泌体与受体细胞的信息交流可能通过以下四种途径实现：1）外泌体表面膜蛋白被目的细胞表面受体识别，激活靶细胞；2）外泌体在蛋白酶作用下产生的表面膜蛋白碎片作为目的细胞表面受体的配体；3）外泌体脂膜与目的细胞膜融合，将蛋白质和 RNA等内容物释放进去；4）目的细胞通过胞吞的形式摄入外泌体。 经由以上几种途径，外泌体将其携带的生物信息运输到靶细胞或经体液运输而被远端组织细胞摄取，进而影响目的细胞的基本功能和基因表达，这些外泌体参与了一系列生理和病理过程，如繁殖和发育、抗原呈递、免疫调节、组织愈合、感染、代谢和心血管疾病、神经退行性疾病、癌症发生发展等。 Vol.2 外泌体的商业应用  外泌体在美容抗衰、药物治疗、递送载体、体外诊断和科研试剂方面有着广阔的应用前景，其中美容护肤抗衰产品已率先实现了商业化。本章将详细阐述：天然外泌体疗法、工程化外泌体递送、外泌体偶联药物(工程化外泌体)、医疗美容与护肤、体外诊断早筛的商业化应用。 2.1  天然外泌体疗法 干细胞由于其旁分泌机制发挥治疗作用成为再生应用中最流行的外泌体细胞源。间充质干细胞、胚胎诱导的多能干细胞、组织特异性干细胞、初级前体和成熟细胞等分泌的外泌体都有案例成功应用于再生治疗中。同时，科学家也发现免疫细胞来源和肿瘤细胞来源的外泌体可用于肿瘤免疫治疗和开发肿瘤疫苗。 表2. 天然外泌体疗法全球临床进展 2.1.1 肺部感染和ARDS治疗 天然外泌体疗法 2021年3月，美国FDA批准Direct Biologics公司的干细胞外泌体药物ExoFlo™的IND申请，顺利进入临床I/II期试验。它是从人骨髓间充质干细胞中分离出来的细胞外囊泡型生物产品——外泌体，首发适应症为治疗中度至重度新型冠状病毒感染和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。根据Direct Biologics公司披露，ExoFlo™的II期临床没有出现不良事件(AE)和重大不良事件(SAE)；ExoFlo-15ml组的死亡率具有统计学意义上的降低，与安慰剂组相比，在18-65岁的呼吸衰竭患者中，绝对和相对风险分别降低了30.8%和61.6%；在18-65岁的ARDS患者中，死亡的绝对风险和相对风险分别降低了41.9%和57.7%。2022年7月，ExoFlo™进入临床III期试验，2023年1月，ExoFlo™完成了400例患者的临床III期临床入组，是美国FDA首次批准应用干细胞外泌体用于疾病治疗的重大里程碑。ExoFlo™除了新冠感染治疗和ARDS适应症外，其他适应症包括克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、器官移植排斥、下腰痛，处于临床I期试验阶段。 Direct Biologics公司认为ExoFlo™的成功源自公司的cGMP放大工艺和无菌工艺获得了超纯无菌外泌体；每毫升可提供超过100亿个外泌体带来了优异的功效；完美的质量控制使每一瓶外泌体都具有质量一致性。 图17. ExoFlo产品 西比曼的haMPC-Exos用于肺部感染处于IIT研究，入组了60例志愿者，正在瑞金医院开展（NCT04544215）。 肺损伤相关实验研究表明，干细胞外泌体具有积极的治疗作用。Vitti Labs的外泌体药物EV-Pure用于治疗肺纤维化和女性生殖障碍/原发性卵巢功能不全适应症已经于2022年10月进入临床I期（NCT05387239）。 2.1.2 心血管疾病治疗 天然外泌体疗法 干细胞外泌体的心脏保护机制已成为研究热点，越来越多的研究证实，干细胞外泌体具有与干细胞相似的心脏保护功能，能显著提高心肌细胞的存活率、抗心肌细胞损伤、促进新生血管形成、改善心脏功能、抗炎、抗心肌细胞凋亡、促进心肌细胞再生。外泌体具有较好的稳定性，较少引起受体细胞的突变以及免疫排斥反应，有望成为治疗心血管疾病的有效方法。 间充质干细胞外泌体在治疗心血管疾病如心肌梗死和心力衰竭方面具有巨大的潜力。《Stem Cells journals》发表了相关综述，讨论了间充质干细胞外泌体促血管生成、增强其生物活性改善心脏组织修复的方法。2022年4月，由Tehran University of Medical Sciences发起的Mitochondria and MSC-derived exosomes用于治疗心肌梗塞的临床试验正式开展，入组了20例志愿者来评估疗效（NCT05669144）。 间充质干细胞外泌体在缺血性心脏病中具有很好的疗效。发表在《BioMed Res》杂志的研究发现，间充质干细胞外泌体的注入抑制了缺血性心脏病疾病模型大鼠的心脏的纤维化和炎症反应，并且明显改善了心脏的功能。2021年9月，伊斯法罕医科大学的最新临床研究（NCT03384433）通过5例患者探索了携带miR-124的间充质干细胞外泌体对缺血性心脏病的临床治疗作用。 2.1.3 肝肾损伤治疗 天然外泌体疗法 肝脏疾病相关实验研究表明，干细胞外泌体具有保护和治疗作用，Du等研究证明干细胞外泌体通过激活SPhks和s1p信号通路保护肝脏免受肝缺血/再灌注损伤，促进细胞增殖；Li等研究发现干细胞外泌体可以通过抑制肝细胞上皮间充质细胞的转移和胶原蛋白的生成来改善肝纤维化。 肾损伤相关实验研究表明，外泌体中携带的miRNA和蛋白能够减轻肾缺血/再灌注损伤，减少细胞凋亡，促进细胞增殖，从而修复肾损伤。2022年4月，ILIAS Biologics公司的外泌体药物ILB-202进入了临床I期，靶向NF-κB用于治疗急性肾损伤。 图18. ILB-202机制 2.1.4 眼科治疗 天然外泌体疗法 外泌体可在泪液、房水、玻璃体液、血液等眼部体液中稳定存在，在调节眼部细胞迁移、增生、凋亡、免疫反应、血管生成等方面发挥重要作用，与角膜损伤、糖尿病视网膜病变、年龄相关性白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜黑色素瘤等眼病关系密切。 Erciyes University的治疗产品Wharton jelly derived mesenchymal stem cell exosomes处于II/III期临床（NCT05413148），用于治疗视网膜色素变性。该研究于2022年8月开始，入组135例志愿者。 原生生物的间充质干细胞外泌体PSC-MSC-Exo处于IIT研究，用于治疗干眼症。中山大学脐带来源间充质干细胞来源的外泌体也处于IIT研究用于治疗干眼症。 2.1.5 肿瘤治疗 天然外泌体疗法 肿瘤细胞来源的外泌体通常包含一些肿瘤抗原，可以使抗原递呈细胞激活，故而外泌体可用于肿瘤疫苗的开发，且一些研究发现此类肿瘤疫苗具有很好的可行性和安全性。医药魔方数据显示，复旦张江的Chimeric exosomal tumor vaccine（嵌合外泌体肿瘤疫苗）目前处于临床I期研究，用于治疗膀胱癌。 图19. 外泌体在肿瘤免疫中的功能 免疫细胞来源的外泌体能够介导和调节机体对肿瘤的免疫反应，外泌体在肿瘤免疫治疗方面的潜力受到广泛关注。树枝状细胞（DC）产生的外泌体包含大量的MHC-多肽复合物和免疫刺激相关的分子，能够激活相关的T细胞，介导体内抗肿瘤应答，在多个临床试验中表现出良好的抗肿瘤疗效。CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，诱导表达其同源抗原的肿瘤细胞死亡，EV由于体积小，能够跨越生物屏障，可以有效地穿透实体肿瘤，该文章CAR-T-Derived Extracellular Vesicles: A Promising Development of CAR-T Anti-Tumor Therapy发表于《Cancer》(Cancers 2023, 15(4), 1052)。 图20.  T淋巴细胞衍生的细胞外囊泡参与免疫反应 2.1.6 软骨损伤治疗 天然外泌体疗法 骨关节炎是临床常见病，以关节软骨损伤、软骨下骨硬化、滑膜炎症等为特征。近年来大量研究表明，干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进组织修复和再生等作用，是治疗骨关节炎和软骨损伤的新疗法，不同干细胞来源的外泌体对骨关节炎均能起到保护和治疗的作用。SF-MSC-EX用于治疗软骨损伤处于临床II期试验阶段（ NCT05261360），该试验于2022年3月开展，入组受试者30例。Cells for Cells的CelliStem OA-sEV处于临床I期，用于治疗膝骨关节炎。四川大学华西医院的Autologous AdMSC-Exo治疗骨关节炎已开展IIT研究。 2.1.7 其他治疗 天然外泌体疗法 干细胞外泌体可以用于治疗脑卒中、糖尿病、卵巢早衰、克罗恩病、肠易激、皮肤相关疾病、移植物抗宿主病、伤口愈合等疾病。 2.2  工程化外泌体递送 外泌体的作用不断被发掘，广泛作为药物、医美护肤、疫苗的递送载体。外泌体载体作为“新型纳米递送系统”，综合了细胞药物递送和纳米技术的优势，一经发现就备受学术界和工业界关注。 外泌体作为递送载体具有诸多优势：a. 具有天然的靶向能力，通过工程化修饰，可靶向到特定的组织和器官，解决传统递送系统难以解决的靶向问题；b. 无免疫原性，包裹的核酸药物不易降解，降低药物全身暴露毒性；c. 外泌体是纳米级的，并携带细胞表面分子，具有克服生物屏障的能力；d. 可跨越血脑屏障，实现颅内药物递送；e. 奶源外泌体可将易降解药物制成口服制剂；f. 外泌体更容易储存；g. 作为天然纳米颗粒可降低安全风险（相关阅读：纳米递送系统行业研究报告）。 科学家通过内源装载或外源装载的技术手段（1.4 工程化外泌体），构建工程化外泌体，装载递送蛋白类、核酸类、多肽类分子实现创新药和疫苗（1类新药）、装载小分子化学药或中药有效成分实现老药新用（2类新药/505b2），提高患者用药效率、降低用药频率、联合用药提升治疗效果、减少全身暴露的副作用，是全球给予厚望的下一代革命性纳米递送载体。截至目前有5个工程化外泌体药物进入临床试验，1个处于IIT研究（表3）。 表3. 工程化外泌体全球临床进展 2.2.1 装载蛋白 工程化外泌体递送 CovenD24（也称EXO-CD24）由OBCTCD24 Ltd和Elpen Pharmaceutical Co. Inc.联合研制，用于抗新冠肺炎，共计开展了一个临床I期试验和4个临床II期试验（NCT04969172、EudraCT2021-002184-22、EudraCT2021-004259-17、NCT04902183、NCT04747574），先后共入组了526例志愿者，取得积极成果，超过90%的参与试验的新冠重症患者在5天内治愈出院。CovenD24是一种以外泌体为载体、内含CD24蛋白的药物，CD24主要通过与特定细胞受体结合，能够抑制免疫反应及细胞因子释放，抵抗COVID-19。但目前CD24这一靶点尚无新药获批，默沙东以4.25亿美元预付款收购的CD24-Fc融合蛋白药物（MK-7110）终止了新冠肺炎的临床III期试验，实体瘤适应症正在开展临床I/II期试验。所以CovenD24选择CD24或具有较大研发风险。 图21. CD24/Siglec-10信号通路 CD24与巨噬细胞上的Siglec-10互相作用，可抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，敲除CD24或Siglec-10，将促进巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CD24被认为是一种新型肿瘤免疫靶点，与明星分子CD47一样，也是一种肿瘤细胞“别吃我”信号蛋白。 exoIL-12™和exoSTING™由Codiak BioSciences研发，是基于该公司工程化外泌体技术平台engEx™ PLATFORM开发的两款产品，也是全球最先进入临床的工程化外泌体递送药物。该平台使用PTGFRN和BASP1作为支架蛋白，将靶向配体或治疗分子安装到外泌体的表面PTGFRN蛋白上或腔内BASP1蛋白上，达到运输至靶组织靶细胞和治疗疾病的作用。 图22. engEx™ PLATFORM外泌体递送平台 exoIL-12™是一种外泌体治疗候选药物，通过外泌体支架蛋白PTGRFN在表面展示完全活性形式的IL-12。回溯历史，白介素类产品通过激活T细胞和NK细胞具有强大的抗肿瘤免疫反应，但由于无法在局部持续保留、全身暴露引起严重不良事件，导致多个临床试验失败，特别是在刚刚过去的2022年，所以Codiak在外泌体全新领域再叠加风险极高的IL-12或将带来较大的研发风险。 小贴士 白介素临床失败案例 2009年11月，罗氏的重组IL-12（Ro24-7472）宣告II期临床试验失败； 2022年3月，BMS与Nektar合作开发的IL-2受体激动剂NKTR-214联合Opdivo治疗黑色素瘤的III期临床试验宣告失败； 2022年8月，Moderna停止开发靶向IL-2的治疗自身免疫性疾病的mRNA药物mRNA6231； 2022年8月，Codiak宣布暂停推进exoIL-12™的II期临床试验，具体原因未披露； 2022年9月，红细胞治疗先驱Rubius首发的两个产品RTX-224（IL12/4-1BBL）、RTX-240（IL15/4-1BBL）也是触碰了白介素的魔咒宣告I期临床试验失败并破产清算； 2022年10月，赛诺菲宣布终止偏向性IL2疗法SAR444245的II期临床试验； 2022年11月，IL-2/IL-15激动剂NL-201宣布临床I期失败，Neoleukin公司裁员70%； 2023年1月，默克转让IL-12类似物M9241给PDS Biotechnology。该分子于2011年进入临床I期，至今已开发12年，仍处于临床II期试验，可见白介素类产品开发的难度之大； 2023年2月，阿斯利康放弃IL-12产品MEDI9253的推进。 exoIL-12™适应症为皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），给药途径为瘤内注射。2020年12月，Codiak公布临床Ⅰ期试验达到了主要终点，55例健康志愿者中显示出良好的安全性和耐受性，没有局部或系统治疗相关的不良事件，也没有检测到IL-12的全身性暴露。2022年6月，Codiak公布CTCL试验部分，2例患者均得到治疗，每位患者在多个肿瘤病变处接受了20余次exoIL-12注射(6.0 μg)，治疗时间大于6个月，未观察到3级及以上治疗相关不良事件。患者001表现出部分缓解，疾病负担减少61%，注射和未注射的所有皮肤病变CAILS评分的改善范围为20-80%，治疗医生认为不需要再注射。患者002注射了20次，疾病负担降低了43%，注射和未注射的所有病变的CAILS评分均有30-50%的改善。披露数据结果的同时宣布将于2023年第一季度启动II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoIL-12™的临床II期，具体原因未披露。 图23. exoIL-12™的结构 exoSTING™是将STING激动剂纳入外泌体腔内，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白，以促进肿瘤抗原提呈细胞的特异性摄取。该产品依然通过瘤内注射方式治疗头颈部鳞状细胞癌、三阴性乳腺癌、甲状腺间变性癌、皮肤鳞状细胞癌，2022年9月完成27例志愿者参与的临床I/II期试验。在所有剂量队列中，exoSTING耐受性良好，未观察到三级或更高级别的剂量限制毒性或治疗紧急不良事件，但在3例患者中观察到与治疗相关的不良事件(TRSAE)——2例二级细胞因子释放综合征、1例一级发热。在注射肿瘤和远端非注射肿瘤中观察到抗肿瘤活性的迹象。数据支持将exoSTING推进到II期临床，特别是在早期疾病中，与免疫治疗结合可能疗效增强。公司计划2023年第一季度启动临床II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoSTING™项目。 图24. exoSTING™的结构 2.2.2 装载核酸 工程化外泌体递送 exoASO™-STAT6是在外泌体表面装载了针对STAT6转录因子的反义寡核苷酸(ASO)，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白以促进选择性靶向M2极化肿瘤相关巨噬细胞的摄取。该产品适应症为晚期肝细胞癌(HCC)、胃癌转移至肝脏、结直肠癌转移至肝脏，给药方式为静脉注射，处于临床I期阶段，入组30例志愿者，暂无临床数据披露。 图25. exoASO™-STAT6的结构 2.2.3 装载小分子 工程化外泌体递送 将小分子药物装载于外泌体有利于提高药物的稳定性、溶解度、生物利用度、靶向性等, 增强药物的有效性和安全性。小分子既可以装载在外泌体内部，也可以装载在外泌体表面，但需要筛选一些适合装载的小分子，方法有共孵育、挤压、超声、反复冻融、微流控、供体细胞共培养和再分泌以及下文提到的外泌体偶联药物。 目前已经有研究团队研究了外泌体装载紫杉醇、阿霉素、紫草素、青蒿琥酯等分子，表现出优异的效果，为后续新药的开发奠定了坚实基础。 图26. 牛奶外泌体-阿霉素的内部装载 （Journal of Extracellular Vesicle, 2021, 10 (13): e12163） 2.2.4 口服给药 工程化外泌体递送 牛奶是外泌体的可扩展来源，含有来自多种细胞来源的丰富外泌体，已经证明牛奶外泌体(MEs)是进化上保守的细胞外囊泡(EV)，具有良好的稳定性和低免疫原性，显示出优异的跨物种耐受性。牛奶外泌体可以在胃中的强酸性条件和肠道中的降解条件下存活，保持结构的完整性，从而在局部或运输到循环系统后发挥作用。牛奶外泌体穿越胃肠道屏障的能力使其成为一种有前途的口服给药工具，已被广泛接受为运输多种生物分子和化疗药物的有前途的口服药物载体。 2023年3月11日，天津外泌体科技（Tingo Exosomes Technology Co., Ltd）开发出mRNA-牛奶外泌体新型口服递送系统，相关研究成果于发表于《Vaccines》。牛奶外泌体能够保护mRNA免受消化道酶和pH值变化等因素影响，基于这些特性，天津外泌体科技研发团队开发出高效mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗，初步实现SARS-CoV-2 RBD mRNA的口服递送。 图27. mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗 （Vaccines 2023, 11(3), 673） 2.3  外泌体偶联药物 2021年7月26日，Nature子刊Nature Biomedical Engineering在线刊发了中科院魏炜教授团队联合首都医科大学陶勇教授团队和昆士兰大学余迪教授团队共同署名文章，开发出外泌体偶联VEGF单抗，利用Treg来源的外泌体(rEXS)为载体，通过基质金属蛋白酶(MMP)敏感肽段(cL)连接VEGF抗体(aV)，创建了rEXS-cL-aV体系。当玻璃体腔注射后，利用rEXS向炎症部位的趋化性，携带aV富集于眼底新生血管病灶，随后利用病灶部位高表达的MMP酶解敏感肽段cL并释放aV，在小鼠模型中证明其潜在成药性，疗效显著优于VEGF单抗，具备强大的市场潜力。 图28. 外泌体偶联VEGF单抗 (Nat Biomed Eng. 2021, 5(9): 968-982) 天津外泌体科技自主研发的“EXC外泌体生物靶向药物递送平台” (Exosome-Xenobiotic Conjugation) 已经实现Her2抗体负载的外泌体靶向递送，外泌体对Her2抗体的负载阳性率高达76%，抗体负载后的外泌体在37℃与4℃下被Her2阳性细胞摄取率分别高于对照组阴性细胞6.3倍与174.5 倍(相关阅读：天津外泌体实现外泌体外源装载靶向递送)。除了偶联抗体，天津外泌体科技使用小分子青蒿琥酯作为模型药物，实现了超过90%的装载率和包封率，每个外泌体可装载超过7×10E5个青蒿琥酯分子，实现了毫克级药物装载。该公司利用EXC平台设计并制备了首个EDC (Exosome-Drug Conjugation) 模板药物，外泌体表面化学偶联抗体和小分子，突破ADC药物载药率低、安全性有限的瓶颈。 图29. EDC相对ADC的潜在优势 2.4  医疗美容与护肤 “外泌体/细胞外囊泡”携带原细胞分泌的蛋白质、活性因子等高生物活性物质，激活细胞再生功能，渗入皮肤后释放囊泡包裹的营养物质，持续滋养，调整细胞微环境，增强细胞活力，进而促进细胞迁移，促进胶原蛋白及弹性修复损伤、细胞再生，恢复皮肤年轻态，在医疗美容与护肤品领域的应用非常有潜力。 韩国ExoCoBio（ASCE+™、EXOMAGE™ 和 CELLTWEET™）、佰傲医学（芙媄逸、绽媄娅、秘零）、远想生物（凝光E.R.T）、三禾医疗（奥永丽）、捍马医疗（奥本源）、天津外泌体科技（牛奶外泌体原料+Y3）、娇韵诗（光芒小瓷瓶）等公司的产品已陆续实现商业化落地。 图30 ExoCoBio外泌体美容护肤品的机制 2.4.1 皮肤修复 医疗美容与护肤品 2019年，ExoCoBio在Stem Cell Research and Therapy上发表了一篇科学论文，证明干细胞来源的外泌体可以显著改善“特应性皮炎”，抑制多种炎症靶点，促进伤口愈合，在世界上属首次系统化的报道。研究表明，干细胞具有旁分泌的特性，能够修复损伤组织、促进细胞生长及调节免疫反应，其分泌的外泌体作为细胞分泌的关键一环，可以通过大部分毛细血管到达远处损伤部位，并且可以与现有已知活性药物进行组合，增强疗效，促进炎症消除和伤口愈合。 “ASCE plus-SRLV”是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的“肌肤再生”及“抗炎”效果为主要产品特征。产品组成为含有冷冻干燥的外泌体及多种有效成分的粉末安瓶及液态安瓶，使用时将两种安瓶混合后使用。ASCE plus外泌体可以减少55%的炎性细胞因子，促进7倍的胶原蛋白合成，以及增加3倍的弹性蛋白合成，达到皮肤修复再生、延缓衰老、改善痘肌、炎症等作用，从而全方面改善皮肤问题。2021年6月，ExoCoBio公司与biobijou公司合作进入中国市场。 图31. 美容产品ASCE+ 2021年3月，梅奥诊所开展了一项《A Phase I Open-Label Trial to Determine the Safety of PEP on a Skin Graft Donor Site Wound》研究，入组了37例受试者，确定一种被称为PEP（一种源自美国人的聚集血小板的血液制剂）的生物制剂在有皮肤移植供体伤口的人中的安全性（NCT04664738）。 2.4.2 延缓衰老 医疗美容与护肤品 2019年，美国约翰霍普金斯大学科研团队研究发现，高度纯化的诱导多能干细胞来源的外泌体（iPSCS-EXO）用于培养活性氧（ROS）水平升高的衰老间充质干细胞时， 衰老间充质干细胞的ROS水平降低，衰老表型减轻。因此，来自人类干细胞的外泌体可以缓解干细胞在培养中的老化（Stem Cells. 2019, 37(6):779-790.）。 2020年7月7日，英国伦敦玛丽皇后大学Ana O’Loghlen 团队在《Cell Metabolism》（IF=21.567）发表了“Small Extracellular Vesicles Have GST Activity and Ameliorate Senescence-Related Tissue Damage”。研究指出，年轻细胞分泌的细胞外囊泡（sEV）可以通过减少氧化损伤来改善老年个体细胞的衰老，揭示了外泌体通过自身GST活性调节GSH/GSSG而影响细胞和器官的ROS积累，从而调控衰老表型。近期，该研究在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》杂志（IF=55.47）上进行了Highlight推荐（Cell Metab . 2020, 32(1): 71-86.）。 2022年，Science Advances杂志上发表一篇文章，用来自年轻动物的脂肪间充质干细胞(ADSC)的小细胞外囊泡(sEV)治疗老年动物，发现通常随着衰老而改变的几个参数有所改善，例如运动协调性、握力、抗疲劳性、毛皮再生、肾功能、虚弱（Sci Adv. 2022, 8(42): eabq2226）。 图32. 外泌体的抗皮肤衰老作用 2.4.3 敏感肌修复 医疗美容与护肤品 据中山大学附属第三医院皮肤科副主任郑跃介绍，该院皮肤科从 2020年10月开始到2021年7月完成了一项临床试验，招募了44例不同类型皮肤敏感的患者，用涂抹式的外泌体舒缓修复敏感性皮肤。临床研究初步显示，外泌体对皮肤屏障有较好的修复作用，它对敏感性皮肤，特别是有红斑或者是有红区炎症的敏感性皮肤有较好的治疗效果，也就是反映了外泌体的抗炎作用。郑跃表示，临床试验结果认为，外泌体作为皮肤修复的手段之一，可以单独使用或根据皮肤状态和需求联合功效性护肤品、玻尿酸、光电等其他医美手段一同使用。 中山大学附属第三医院皮肤科主任赖维认为：外泌体免疫原性低，还含有抗炎成分等，除了修复敏感肌，还有抗衰老和皮肤美容的功能，可以满足敏感肌和衰老肌肤的修复、抗炎、舒缓及皮肤活力再生。 在科罗拉多州丹佛市举行的2022年美国皮肤外科学会（ASDS）上，梅奥诊所的Saranya Wyles 医学博士团队公布一项外泌体美容研究，招募了56名患者，平均年龄为 54岁，将外泌体产品应用于患者面部，6周后，面部发红的状况得到改善、血红蛋白过程改善 92%、不同年龄组的脉管系统也有所改善。特别是40多岁、50多岁和60多岁的患者，在发红和皮肤老化方面得到了持续改善。 2.4.4 美白淡斑 医疗美容与护肤品 娇韵诗参与的一项发表在Nature子刊上的研究发现：角质细胞释放的外泌体可以调节黑色素细胞的色素沉着，这种外泌体会携带有能力调节色素沉着的微小RNA与黑色素细胞进行交流。基于这项研究，娇韵诗发现了能够通过抑制外泌体中包含的信息来发挥美白淡斑效果的光滑金虎尾果提取物。目前，光滑金虎尾果提取物已在娇韵诗护肤品中使用，即娇韵诗旗下的美白产品光芒小瓷瓶的主打美白成分之一（Nature Communications. 2015, 24(6), 7506)。 2.4.5 生发 医疗美容与护肤品 法国化妆品原料商Silab与法国国家健康与医学研究院INSERM合作的研究发现，成纤维细胞外泌体在毛发生长中具有关键作用：真皮与毛囊之间的外泌体通讯是毛发生长的一条值得关注的生物学通路，来自成纤维细胞的外泌体能促进Norrin（一种能激活参与毛发生长的β-连环蛋白通路的配体）的分泌。Silab据此推出了一款能够作用于“真皮和毛囊之间的外泌体通讯系统”的天然生发成分HAIRGENYL®酵母提取物。 2022年4月，韩国外泌体生物技术公司ExoCobio推出ASCE plus-HRLV，这是世界上首个基于外泌体的防脱生发产品。 图33. ASCE plus防脱和抗皮肤衰老/抗炎作用 （Cells. 2020, 9(5): 1157.） 2.5  体外诊断/早期筛查 外泌体可在多种体液（例如血液、尿液、唾液、脑脊髓液）中检测到，其结构较为稳定、内容物丰富，携带大量特异性细胞因子、功能性mRNA、生长因子、脂类物质等参与细胞间物质运输和信息传递，与多种疾病的发生和发展过程密切相关。特定的蛋白质、核酸、信号分子、脂质等可反映细胞水平的异常，可被用作疾病诊断的无创或微创生物标志物。作为新兴体外诊断技术，在肿瘤肿瘤及其他多种慢性疾病的筛查和诊断等领域应用前景巨大。 2.5.1 肿瘤 体外诊断与早期筛查 外泌体已成为继循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）后液体活检领域研究的热点。相较于CTC、ctDNA两种检测方式，外泌体检测具有样本形式丰富、内含物更稳定两大优势，更易得到理想的检测浓度。 图34. 外泌体应用于肿瘤早筛的检测流程 2.5.2 中枢神经系统 体外诊断与早期筛查 外泌体作为一种由细胞分泌的、能够通过全身循环和局部扩散作用介导细胞间信息交流的载体，对CNS疾病的发生发展和传播以及治疗都有着重要的作用。外泌体源性miRNA能通过血脑屏障，稳定且不易被降解，敏感性高，有望成为CNS疾病早期诊断指标；但是，需要提高脑脊液或血液样本外泌体的获取效率和分离纯化，减少外泌体在提取过程中的分解。此外，外泌体在CNS疾病的发生、发展以及参与疾病的机制等尚需进一步研究。 2.5.3 感染疾病 体外诊断与早期筛查 外泌体参与细胞间信号传递、凝血、炎症和细胞内稳态等多种生物学过程影响感染性疾病的发生发展。越来越多的研究表明外泌体与感染性疾病的关联性，外泌体可能被用作感染性疾病的生物标志物，具有预防感染的可能性，多项研究表明外泌体可作为细菌感染、病毒感染（HIV、肝炎病毒、呼吸道病毒）及其它感染性疾病诊断标记物，揭示外泌体能够为感染性疾病的诊断、治疗及预防提供新思路。 2.5.4 心血管疾病 体外诊断与早期筛查 心血管疾病诊断的生物标志物主要是对已知心肌蛋白的靶向分析，肌酸激酶同工酶、肌红蛋白及肌钙蛋白等生物标志物目前已广泛应用于临床。肌钙蛋白是急性心肌梗死诊断的金标准，但对其他心血管疾病的诊断缺乏特异性。外泌体的成分和生物学内容物对细胞激活和损伤具有特异性，它们具有作为心血管疾病诊断和预后生物标志物的潜力。由于有些外泌体是在特定的应激条件或损伤条件下形成，因此循环系统中的外泌体逐渐被认定是心血管疾病的生物标志物的候选者。近年来研究发现外泌体miRNAs参与心血管疾病的生理和病理机制及外泌体miRNAs的临床应用已成为心血管疾病诊断研究的前沿和热点外泌体miRNAs作为急性心肌梗死、慢性心力衰竭和冠状动脉疾病等心血管疾病新的诊断性生物标志物有很好的研究前景。 2.5.5 呼吸系统疾病 体外诊断与早期筛查 外泌体miRNA在呼吸系统疾病的疾病标志物研究中有着广泛的应用，外泌体miRNA在特发性肺纤维化、慢阻肺、肺结核及哮喘等呼吸系统疾病的发病机制中具有重要意义，且它们具有非免疫原性和快速提取的特点，因此，外泌体miRNA有希望作为肺部疾病的一种新的诊断和治疗的生物标志物。 Vol.3 外泌体的生产与质控  外泌体行业已经到了大规模产业化的前夕，规模化生产和质量控制成为非常重要的一环。 3.1  生产工艺 产量低、回收率或纯度低、靶向特异性差，使得外泌体的大规模生产仍是阻碍其发展的主要瓶颈之一。实验室阶段的外泌体生产具有一定的局限性，一些开放性操作拓展至放大生产时会导致一系列挑战，因此需要一些创新性的技术来衔接，以支持更大规模的生产需求。 图35. 外泌体实工业化生产 外泌体的生产流程包括：外泌体的获取(生产)、分离、纯化、制剂。如果是外源装载外泌体还需要经过工程化后再纯化，再制备成相应制剂。 3.1.1 外泌体的生产 外泌体的生产工艺 来源于干细胞和293细胞等动物细胞外泌体的收获需要先进行大规模细胞培养，以生产获得含有外泌体的原料。牛奶外泌体的收获不需要细胞培养，直接从新鲜牛奶中即可获取，是一个高效、大量获取外泌体的来源，最容易产业化。植物外泌体需对植物进行提取获得外泌体原料。 干细胞外泌体的获取 干细胞是一种“贴壁依赖细胞”，具有贴壁依赖性，在二维表面上如T型方瓶、烧瓶、多层细胞工厂等培养系统已经相当成熟，但不足以满足未来商业化可行性的需要。贴壁细胞培养平台扩大生产的技术要素主要集中在最大化培养表面积上， Cytiva推荐基于3D微载体贴壁悬浮培养的工艺。微载体（Microcarrier）培养系统是贴壁培养和悬浮培养相结合的一种操作单元，具有比表面积大、允许环境参数监控、方便取样、易于放大、可在无蛋白水解酶的作用下实现细胞迁移等优点，既解决了2D贴附培养技术中的空间问题和在线监控问题，又解决了悬浮的均质问题。 图36. 干细胞3D微载体培养生产外泌体 来自马萨诸塞大学医学院的研究人员开发了一种稳健可放大的符合GMPs的间充质干细胞生产外泌体的方案，即生物反应器中基于3D微载体进行贴壁依赖性细胞培养并结合切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF），使外泌体的产量提高了140倍，在治疗性siRNA转移至原代神经元的能力上具有7倍的活性。 在搅拌式生物反应器（SR）中使用微载体悬浮培养，可明显增加"贴壁依赖细胞"的培养效率及外泌体产量，适用于中试和大规模生产，但保持细胞和外泌体的表型不发生改变方面也存在挑战。当细胞从静态平面培养转移到动态3D环境时，搅拌和通气引起的剪切应力可能导致细胞及外泌体表型改变。有报道称，在转速为180 rpm生物反应器中培养T淋巴细胞引起IL-2受体下调，细胞扩增减少。剪切应力可诱导间充质干细胞p38丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号相关激酶的机械转导途径，导致成骨分化，进而改变外泌体表型。此外，限制高剪切动态系统中的细胞死亡以最大限度减少凋亡小体杂质至关重要（动物细胞来源外泌体生产中的细胞培养工艺. Cytiva思拓凡, 2022）。 HEK293细胞外泌体的获取 HEK293细胞是一种悬浮适应细胞，在病毒载体（如LV、AAV）的生产中被广泛使用，其无血清悬浮培养工艺已相对比较成熟。搅拌式生物反应器（SR）尤其适合悬浮适应细胞的外泌体生产，与其他悬浮适应的细胞系相比，HEK293细胞具有明显的结团倾向，通过使用抗结团剂纠正细胞的结团现象，可使细胞生长得到明显改善，单位体积外泌体产量提高8倍。 牛奶外泌体的获取 牛奶外泌体需从新鲜牛奶中提取制备，采用超速离心法(UC)或多种化学前处理方法去除乳蛋白，切向流超滤技术(TFF)进一步去除残留的乳蛋白，实现牛奶外泌体样品的初纯与浓缩。 植物外泌体的获取 植物外泌体与其他外泌体的提取方式类似，可适用如超速离心法、免疫亲和捕获法等传统分离方法；但由于植物细胞存在细胞壁和机械组织，必要时也可以考虑纤维素酶解等辅助手段。例如浆果类植物，如番茄、荸荠等富含水分，仅需通过传统的机械粉碎结合已有的外泌体提取技术即可实现对外泌体的有效提取。而对于非浆果类植物，如人参、田七等块茎类药用植物，外泌体直接提取较为困难，需采用酶解等样品前处理手段。 3.1.2 外泌体的分离纯化 外泌体的生产工艺 外泌体分布在极其复杂的体系中，单一方法很难获得高纯度的外泌体，需要利用外泌体的不同物理化学和生化特性进行多方法的联合，这使得高产量的外泌体分离纯化非常具有挑战性。对于外泌体的分离纯化，可以通过确定的程序，超速离心法、超滤法、免疫亲和层析、基于电荷中和的聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱、微流体技术、切向流过滤来完成产品的分离纯化（Theranostics 2020; 10(8):3684-3707）。 超速离心法 超速离心法可分为“密度梯度离心法”和“差异超速离心法”两大类，该方法是公认的外泌体分离金标准方法。超速离心法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，特别是对于梯度超速离心。同时，分离的外泌体的结构和生物学功能可能会受到长时间的超离心力的影响，不利于下游应用（例如样品中的高水平蛋白质聚集体和脂蛋白污染不利于外泌体的功能研究和药物开发），超滤和尺寸排阻色谱法可以弥补此类问题。 超滤法 超滤可以使用具有不同分子量截止值（MWCO）的超细纳米过滤膜从样品中分离细胞外囊泡，并通过大小区分外泌体和核外颗粒体。与超速离心方法相比，大大缩短了处理时间并不需要特殊设备。重要的是，通过轻松调整滤光片大小，超滤允许研究人员对具有定义粒径的细胞外囊泡（包括外泌体）的特定亚群进行分类。该方法包括串联配置的微滤器和顺序超滤两种。 图37. A.微滤器；B. 顺序超滤 运行模式包括直流过滤（DFF）或切向流过滤（TFF）。 图38. 切向流过滤示意图 DFF对于采用离心式装置的较小流量（最多30mL）处理过程效果较好，但DFF技术会受到膜堵塞问题的不良影响。为了减少胶质层的形成，可使用浮动式搅拌棒配置（搅拌槽）或通过生成一个受控的层流，在膜片的上游侧生成交叉流。搅拌棒运行可改善超滤效果，但在获得最佳性能方面仍有局限性。因为搅拌速度和时序水平取决于棒体摆动范围，而此范围会随着摆动半径的改变而变化。 切向流过滤（TFF）是一种应用于生物分子分离和纯化的快速有效的方法。该方法可用于各生物领域，例如免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学和微生物学。TFF可用于对容量从10mL到数千升的样品溶液进行浓缩和脱盐处理。此方法可用于分馏大小不一的生物分子、获取细胞上清液，以及对发酵培养基和细胞裂解物进行澄清处理。 图39. 切向流过滤设备 由于效率高、设备成本低、操作快速、便携性良好、可达到中等纯度等优点，超滤越来越受欢迎。但在过滤过程中，其剪切应力会引起的潜在劣化；并且可能由于堵塞和膜捕获而造成原料的损失。 尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱法（SEC）能够以最小的结构损伤分离外泌体，不会影响囊泡结构和完整性，能够保存分离外泌体的天然生物活性。在过去的50年中，各种细小的多孔材料，如葡聚糖聚合物（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、聚丙烯酰胺（Sephacryl或BioGel）等被运用到SEC的优化中。 图40. SEC尺寸排阻色谱法示意图 该方法易于扩展和自动化，用于高通量外泌体制备。但设备成本相对较高，需要额外的外泌体富集方法。 高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，产生疏水性微环境，导致外泌体沉淀。现有的基于聚合物的外泌体沉淀方法通常采用分子量为6000至20000 Da的PEG。该法易于使用、设备需求低、样品量兼容性高、效率高、可分离蛋白质聚集体、其他细胞外囊泡、聚合物污染物的污染物。但所需的处理时间较长，需要复杂的清理步骤，会影响下游分析和定量的结果。 免疫亲和力捕获法 免疫亲和力捕获法是识别外泌体特异性标志物的抗体（固定在固体表面上）和外泌体的流体一起孵育富集外泌体，通过额外的洗脱步骤收集外泌体。外泌体标志物如Rab5、CD81、CD63、CD9、CD82、膜联蛋白和Alix等跨膜蛋白已被广泛用于商业化选择性外泌体分离。该方法具有较高的捕获效率和灵敏度，而且还可容纳较大的起始样品量；此外，该方法可以通过检测分离的外泌体上的疾病特异性标志物如EpCAM，CD133，EGFR直接转化为诊断平台（外泌体纯化工艺挑战盘点. 医麦客, 2022）。 图41. 免疫亲和力捕获法示意图 该方法相关的非中性pH和非生理洗脱缓冲液可能会不可逆地影响所收集的外泌体的生物学功能，寻找对外泌体损伤更低的洗脱液，另外该法产量较低、抗体基成本较高的问题，化学抗体或许是下一步的改进方向。 微流体技术 微流体技术可分为“基于免疫亲和力的微流体分离技术”、“基于尺寸的微流体分离技术”以及“非接触式微流体”。微流体技术结合了外泌体分离和分析，将含外泌体的流体添加到介质中后，根据细胞外囊泡的物理和生化特性，分离外泌体，可以从少量体液中快速分离外泌体，并进行实时外泌体表征分析以进行原位诊断。该方法高效方便，但只适合小样本分离。 3.2  质量控制 作为新型生物制品，目前没有专门针对外泌体质量控制的法规和指导原则。但外泌体是细胞产物，其质量控制与指导原则可参照细胞产品相关原则。针对细胞治疗和细胞相关产品，FDA于2016年发布了“Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)”，该指导原则就细胞库、生产过程中添加的各物料等在生物安全性、产品质量稳定性进行详细指导。此外，ICH发布的Q5A(R1)、Q5A(R2) EWG对细胞产品中外源病毒检测提供了指导意见。国家药品监督管理局于2017年发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》及相关问题解读，该指导原则对细胞治疗及其相应产品在使用血清及其它物料、细胞库等存在风险进行评估指导。外泌体作为细胞代谢过程中的产物，产品的质量与宿主细胞的质量息息相关，诸多文献对外泌体GMP级生产流程进行优化和质量监控，主要包括上游细胞安全生产检测和下游外泌体生产检测。 图42. GMP生产外泌体流程及质量监控图 3.2.1 细胞安全生产 外泌体的质量控制 2022年10月31日，国家药监局核查中心官网正式发布备受关注的《细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）》，指导药品上市许可持有人规范开展细胞治疗产品的生产和质量管理，保证产品质量，同时，这也为细胞治疗药物研发企业提供了更清晰的研发、生产和发展路径。细胞制备应满足《中华人民共和国药典》、《药品生产质量管理规范》、《药品注册管理办法》、《药品生产监督管理办法》、《药品生产质量管理规范》及其附录、《药品注册核查管理规定》、《药品不良反应报告和监测管理办法》、《药品召回管理办法》、《药品说明书和标签管理规定》、《药品生产企业现场检查风险评定原则》、《医疗废物管理条例》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》。 对细胞安全生产的基本要求：有细胞采集、加工、检定、保存和临床应用全过程的标准操作程序(SOP)和完整的质量管理记录；整个过程必须遵循细胞产品质量控制标准(QC)，并拥有与其配套的检测设备和检测方法；细胞库的细胞必须保证可溯源；按照批准的细胞产品质量控制标准对每批次细胞产品进行严格检测，包括细菌、真菌、支原体和内毒素。 3.2.2 外泌体生产检测 外泌体的质量控制 外泌体生产纯化过程中涉及到的关键设备、仪器、耗材及试剂，包括超速离心机、纯化仪、填料、移液管、离心管等，都应由符合GMP要求；同时应定期检查耗材的储存及有效期是否符合要求，保证所用原料、试剂与耗材的安全有效；最终产品质量严格遵循《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》对其进行相应检测。 图43. 外泌体质量控制项目 目前亟需对不同分离方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。科学家使用NanoFCM对不同样品外泌体用不同纯化方法纯化进行了研究，NanoFCM可在单颗粒水平对外泌体的颗粒浓度、大小、纯度、蛋白等进行表征，研究纯化方法对外泌体的影响，优化外泌体的纯化过程，有望为建立标准有效的外泌体分离和质控方法提供表征手段。 Vol.4 外泌体产业链分析  外泌体产业处于起步阶段，尚未形成完善的产业链格局。产业链上游为原材料、设备、服务供应商；中游为外泌体治疗药物、医美产品、诊断试剂供应商；下游为流通和应用终端。 图44. 外泌体行业产业链分布 4.1  产业链上游 产业链上游主要为1）细胞培养、奶源供应、植物原材料、微生物原材料等，通过培养、提取、分离纯化获得外泌体原料的相关企业；2）过程中相关的制造设备、试剂、耗材，以及提供外泌体CRO与CDMO服务的相关企业；3）外泌体检测检测领域的上游供应商还包括提供抗原、抗体等试剂原料及设备部件的相关企业。 目前国内主要制造设备、试剂和耗材仍以进口为主，跨国企业仍处于垄断地位。对于大规模外泌体原料的供应商和CDMO服务商，国内主要以天津外泌体科技（牛奶外泌体、干细胞外泌体、293细胞外泌体）、思珞赛等企业为代表；外泌体CRO服务主要以恩泽康泰、天津外泌体科技、思珞赛、宇玫博生物等为代表。 4.2  产业链中游 产业链中游为利用上游供应商提供的原材料、设备、耗材、试剂进行外泌体相关治疗、美容、诊断等产品的研发、生产、销售。目前外泌体领域处于起步阶段，全球约50余家从事外泌体相关产品开发的公司。 目前，国内外只有医美和护肤品上市销售，国外以韩国ExoCobio为代表，国内以佰傲医学、天津外泌体科技等公司为代表。 新药研发、诊断试剂均处于临床研究和临床前研究阶段，国外以ExoFlo、Codiak、Aegle、Exopharm、OBCTCD24、ILIAS、Evox、Exosome等为代表；国内以唯思尔康、纽兰生物、汇芯生物、安龄生物、亿微生物等为代表。 4.3  产业链下游 产业链下游为流通与终端机构。终端主要包括治疗药物面向的医疗机构、医美产品面向的医美机构、诊断产品面向的三方医检机构和医疗机构，以及护肤品面向的经销商（包括电商平台）和个人消费者。 Vol.5 产业驱动因素与挑战  5.1  产业驱动因素 5.1.1 基础研究突破 外泌体产业驱动因素 随着细胞外囊泡(EVs)运输调控机制研究的清晰，以及“精准外泌体”概念的提出，全球外泌体研发持续升温，有关外泌体载药、外泌体疗法、诊断和早筛等方向的研究成果陆续发表在Science、Nature等各大顶级期刊上，论文发表数量呈近爆炸式增长，近年平均每年外泌体相关论文都在3000篇以上，2019年为3279篇，2020年为4295篇，2021年5074篇，2022年为5204篇；国内2020年度国家自然科学基金申请项目的评审结果中，外泌体相关课题中标达到2000余项。外泌体已成为生命科学和基础医学研究的一大热点，为外泌体的应用与产业化探索奠定了坚实的基础。 图45. 外泌体学术研究成果发表情况 5.1.2 跨国药企布局 外泌体产业驱动因素 外泌体产业的商业运用引起了大型跨国药企的注意，新兴的生物技术公司与大型跨国药企产业化合作的态势逐渐明朗。以礼来、武田、爵士制药为代表的大型跨国药企已经分别与拥有外泌体创新技术平台的公司达成多项高额合作，接连签署数笔10亿美元级大额合作开发协议，共同开发外泌体靶向疗法。 爵士制药：2019年1月，爵士制药与Codiak达成了以外泌体载药为核心的血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的新药研发合作。爵士制药同意向Codiak支付5600万美元的研究经费，并为合作的五个新药项目支付高达2000万美元的临床前开发里程碑付款，若项目实现约定里程碑，则每一个靶标再支付2亿美元款项。在I/II期临床试验结束后，爵士制药将负责后续的临床试验、新药申请以及商业化推广。 礼来制药：2020年6月9日，礼来公司与Evox达成一项12亿美元的合作协议，利用其技术平台开发递送RNA干扰药物和反义寡核苷酸药物(ASO)的工程化外泌体，治疗中枢神经系统疾病。 武田制药：2020年3月，武田也与Evox公司达成一项8.82亿美元的合作，利用外泌体递送蛋白质及mRNA核酸药物，治疗包括C型尼曼-皮克病在内的罕见病。Evox将负责推进临床前研究并进行临床试验的申请。 5.1.3 应用价值驱动 外泌体产业驱动因素 外泌体本身可以做为药物、美容护肤产品的活性成分，又可以做为小分子、蛋白、核酸等活性物质的纳米递送系统，还可以被用于诊断和早筛的无创或微创生物标志物，应用前景非常广阔。开启了纳米医学产业、细胞与基因治疗产业、医美与护肤产业和体外诊断产业的新篇章。 5.1.4 政策驱动 外泌体产业驱动因素 2022年5月10日，国家发改委印发《“十四五”生物经济发展规划》，“外泌体治疗”首次进入国家经济发展规划，在《生物经济创新能力提升工程》专栏关于“关键共性生物技术创新平台建设”中提到：围绕加快创新药上市审批、强化上市后监管，建设药品监管科学研究基地，建设抗体药物、融合蛋白药物、生物仿制药、干细胞和细胞免疫治疗产品、基因治疗产品、外泌体治疗产品、中药等质量及安全性评价技术平台。 5.1.5 商业化驱动 外泌体产业驱动因素 随着细胞与基因治疗产业的不断发展和成熟，外泌体产业的上游商业化技术不断完善，为外泌体产业奠定了商业化基础。 图46. 微载体大规模细胞培养生物反应器 外泌体领域率先在医美和护肤品方面获得突破，产品全球销售，打开了产业化的大门；多种外泌体药物和外泌体诊断试剂也处于人体临床试验阶段，最快已处于III期临床，在安全性和有效性方面获得了一致认可。 5.2  问题与挑战 2023年，张琪、于湄、刘磊、田卫东等在《中国组织工程研究》发表了“工程化外泌体研究现状与临床转化的挑战”， 阐述了外泌体产业面临的一些问题和挑战（中国组织工程研究，2023，27(19):3052-3060）。 5.2.1 亲本细胞选择与培养 外泌体产业问题与挑战 目前，对于外泌体生产的最佳技术暂时还未达成共识。 亲本细胞的选择构成了外泌体生产的首要关键步骤，不同的细胞生产的外泌体生物学特性有差异，研发人员需要根据外泌体的活性和组织归巢特性以及潜在的免疫原性和致癌性来选择亲本细胞。 培养过程中的微小变化可能会改变外泌体的生物学特性。即使来源于相同的亲本细胞，由于培养条件的变化，比如亲本细胞的代数、培养方式、培养基等变化，最后得到的外泌体也有可能不同，这也是外泌体生产过程需要考虑的关键问题。从生产过程安全性的角度来看，最好使用封闭式系统，但这比开放式系统更难监控。牛奶来源的外泌体是获得大量生物相容性外泌体的有效替代来源，从复合牛奶中大规模获取外泌体更加适合工业化生产。 5.2.2 分离纯化工艺 外泌体产业问题与挑战 外泌体的分离纯化也是一个不容忽视的关键程序。不同的分离提纯方法得到的外泌体产量差距悬殊，外泌体亚群也有所不同，这为质量控制带来了挑战。目前亟需对不同分离纯化方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。 5.2.3 成分表征 外泌体产业问题与挑战 外泌体的表征集中在测量颗粒大小和数量，以及检测特定的表面蛋白和货物。透射电子显微镜成像是表征外泌体结构和大小的标准方法。此外，扫描电子显微镜和动态光散射可以对外泌体进行表征。合格的体外表征与量化可以预测载药外泌体系统的预期治疗潜力，但是至今仍然缺乏外泌体量化以及分子和物理特征描述的金标准，寻找开发外泌体最佳表征与量化方式是目前研究中不可忽视的一部分。由于外泌体的大小和复杂性，现有技术可能会限制工程化外泌体产品的物理化学、免疫化学或功能的细节表征，有限的产品表征能力也对工程化外泌体产品的机制理解有一定影响。 5.2.4 质量控制 外泌体产业问题与挑战 外泌体这种复杂程度的物质和构造只能由活细胞产生，面临一定程度的内在生物变异而导致产物的异质性，异质性既受细胞内的生物加工影响，也受制造工艺的影响。如培养条件(细胞传代、细胞密度、外泌体收获频率）会影响产物质量的各个方面，包括产量、外泌体组成、外泌体生物活性。 在外泌体生产过程中检测和评估产品质量的变化比在蛋白和抗体生产过程中更具挑战性。由于微小的变化可能对产品质量和活性产生相当大的影响，外泌体制造过程的稳定性比细胞和抗体生产过程的稳定性要低，但外泌体制造仍可以建立在这些工艺的基础上。外泌体的大小、成分、结构的复杂性是独一无二的，因此需要额外的程序对外泌体生产进行控制。这些过程可能包括测量大小和浓度、排除污染物、识别功能标记物和评估载药量以评估每一数量的外泌体的治疗活性等措施，以确保外泌体终产品满足先前确定的关键质量属性。 5.2.5 存储稳定性 外泌体产业问题与挑战 外泌体建议在-80℃下存储，其大小和数量在-80 ℃下保持不变，潜在问题是有可能造成一些生物活性的改变以及储存和运输的成本相对高昂。另有研究表明，在4℃下储存会对外泌体结构造成聚集和损坏。 科学家们提出了其他的替代方法。WU等提出将外泌体保存在GelMA水凝胶中可减少外泌体聚集，达到保存外泌体的目的。另一种较常见的保存方法是冷冻干燥，冻干的外泌体可以在室温下储存，且能够保持外泌体的囊泡大小和蛋白质含量、结构完整性、生物活性、运送药物分子的药代动力学等关键属性，效果可以与新鲜外泌体媲美。 5.2.6 产品安全性 外泌体产业问题与挑战 纳米药物可能会导致一些不良免疫反应发生，比如过敏反应、细胞因子释放综合征、生物活性的中和、与内源性蛋白对应物的交叉反应和非急性免疫反应等。因此，对工程化外泌体的安全性和有效性加以证明对研究人员来说是一项挑战。 目前，产品制造商被要求注明药物中所有能够引起药理、免疫或新陈代谢作用的物质，并且在最终配方中使用的非活性成分 ( 称为赋形剂 ) 也应予以申报。国际胞外囊泡协会声明，如果整个治疗效果可以归因于外泌体负载的药物，而不是载药外泌体系统中的外泌体，则外泌体可以被视为赋形剂。在这种情况下，仅需要外泌体的安全性描述，而不需要描述其作用方式或机制。如果安全和质量标准均充分达到要求，并且提供了可信的作用方式和机制，则可以允许进行人体临床试验。 同种异体外泌体、异种外泌体要转化为安全有效的临床治疗产品，需要通过持续监测来严格把控亲本细胞的选择、免疫学、致癌效应的评估以及病毒污染的风险等问题。监测方法的选择特别是灵敏度，是确定外泌体药物载体临床转化的关键挑战之一。目前，监管机构尚未发布关于如何测试外泌体的安全性和有效性的指导意见，因此需要对现有的测试方法进行改进或者寻找新方法对工程化外泌体的安全性和有效性进行证明。 5.2.7 工程化外泌体成药性 外泌体产业问题与挑战 天然外泌体已经在美容护肤领域上市销售，药物领域也进入临床III期，其商业价值和成药性确定性很高。 工程化外泌体主要是发挥其递送活性成分的优势，搭载“何种活性成分”直接影响药物的成败，Codiak的临床管线暂停对行业信心影响较大。Codiak作为工程化外泌体载药的标杆企业一直备受关注，先后解决了外泌体骨架蛋白筛选、内源装载技术、规模化生产等难题。2022年Codiak首发进入临床的两个药物管线分别为exoIL-12™和exoSTING™（详见章节2.2.1 装载蛋白），治疗方式为“瘤内注射”。2022年中公布了临床I期实验结果：exoIL-12™安全性良好，临床Ⅰ期试验均达到了主要终点，并且2例患者均得到治疗，表现出部分缓解。exoSTING™未观察到三级或更高级别的剂量限制毒性或治疗紧急不良事件，在3例患者中观察到二级细胞因子释放综合征和一级发热。结果均支持产品推向临床II期，但Codiak于2022年8月宣布暂停推进两个产品的II期临床，股价暴跌，2023年3月27日宣告申请破产保护，引来业界轩然大波，并引来“工程化外泌体作为纳米递送载药系统是否能顺利商业化”的大讨论。 维渡纵横推测，Codiak暂停两个产品的临床II期而导致申请破产保护，可能有以下几方面的原因考量： 破 产 保 护 可 能 原 因 首先，其装载的活性成分具有一定挑战：IL-12的人体临床试验多以失败告终，从2022年至今有8个产品宣告失败被放弃，并且创业公司Rubius因此破产清算，令人望而却步；STING激动剂可能在直接瘤内注射时有散开风险，对后续临床试验失败风险或有顾虑；出于风险考量暂停产品的II期临床开发。 其次，两个产品均为“瘤内注射”产品，或可能存在一定局限性。 再次，Codiak是由风险投资机构Flagship Pioneering推动成立的公司，Flagship同样也是Rubius的大股东。鉴于Rubius刚刚在白介素领域（IL-12和IL-15）的失利导致资金链断裂而破产，或建议Codiak及时止损，申请破产保护并寻求出售其资产，旨在实现股东价值最大化。Codiak首席执行官Douglas Williams博士表示，董事会和管理团队考虑到"财务需求"及"临床研究项目"匹配度后，决定申请破产保护。 虽然Codiak暂停了前两个管线的临床II期，但从目前取得的I期临床结果来看，验证了工程化外泌体递送所起到的作用，在安全性、靶向性、多重搭载上均实现了突破。Codiak本将重点推进exoASO™-STAT6治疗晚期肝细胞癌等临床急需适应证，并改进为“静脉注射”给药，但由于财务问题而寻求出售研发管线。 综上，我们认为，工程化外泌体作为递送系统的安全性是可控的，但是选择装载的活性分子和靶点关乎到整个药物开发的成败。在工程化外泌体产业的发展初期，建议创业公司可以利用工程化外泌体搭载一些成药性高或者已经成药的活性分子，以“创新”结合“守正”的思路降低整个药物研发的风险。 Vol.6 产业市场规模分析  据Grand View Research 2018年的研究报告指出，仅作为药物递送系统，外泌体药物市场规模预计在2030年将达22.8亿美元，目前全球包括罗氏、武田、礼来在内的多家巨头均在积极布局外泌体这一赛道。 商业调查机构Roots Analysis在2023年3月1日发布的《 2022-2040 年外泌体疗法市场报告》称，在新型平台和先进技术发展的推动下，以及相关企业在外泌体疗法研发方面的不懈努力，外泌体治疗市场预计将以41%的年增长率增长。由于未来几年许多外泌体治疗候选药物获得批准，预计数十亿美元的市场。 Vol.7 外泌体代表公司分析  2022年，维渡纵横对外泌体领域公司做了盘点，详见《2022年外泌体行业研究报告》(点击相关阅读：2022年外泌体行业研究报告)。本文将主要对几个具有代表性的重点公司作简要阐述。 7.1  ExoCoBio ExoCoBio成立于2017年1月，总部位于韩国首尔，开发基于干细胞来源外泌体的药妆。公司的融资总额已经达到了约5630万美元，资金来自于韩国的顶级投资者，包括Seven Tree Equity Partners、CSQUARED Global Asset Management、TS Investment Partners、K2 Investment、Intervest、KDB Capital、Atinum Investment、GU Equity Partners、QUANTUM Ventures Korea、Platinum technology Investment等。 ExoCoBio产品包括了ASCE+™、EXOMAGE™和CELLTWEET™，用于皮肤护理、调节皮肤免疫功能、头皮护理。ASCE+是ExoCoBio专利外泌体再生技术，通过5种生长因子、6种肽、19种氨基酸、4种不同类型的辅酶、维生素和矿物质、谷胱甘肽和多种其他活性成分，可实现营养供给和更强大的皮肤再生效果，更高能深度修复，修复创面，净疤除横，改善痤疮。 图47. ASCE+™产品 2021年6月ExoCoBio与LG化学签订用于抗衰老产品解决方案韩国国内共同销售的业务合作保证协议。 7.2  Direct Biologics Direct Biologics是一家拥有开创性细胞外囊泡 (EV) 平台技术的再生生物技术公司，总部位于美国德克萨斯州奥斯汀。在研产品包括ExoFlo和XoFlo两个系列。ExoFlo是利用间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体起到组织再生和修复作用。Direct Biologics 是迄今为止第一家也是唯一一家获得FDA III期临床批准的的外泌体公司，批准产品为ExoFlo™，是一种从人类骨髓间充质干细胞中分离出来的细胞外信号产物，含有生长因子和外泌体。研究表明，BM-MSC来源的细胞外囊泡可以下调人类炎症并上调组织修复。 ExoFlo™ 正用于治疗与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，2022年4 月21日FDA批准该公司使用ExoFlo进行其III期临床试验。 2022年10月13日，上市的特殊目的收购公司 Good Works II Acquisition Corp. (Nasdaq: GWII)  和Direct Biologics宣布签署协议，在满足所有成交条件后，Direct Biologics 将成为一家上市公司。预计将于2023年上半年交易完成，合并后的公司命名为Direct Biologics, Inc.，将在纳斯达克资本市场交易。 图48. Direct Biologics研发管线 7.3  天津外泌体科技 天津外泌体科技孵化自九州通集团天九再生医学，2021年重组成立，以外泌体技术为核心，布局严肃医疗和消费医疗业务方向。 公司已构建四大外泌体技术平台：1）外泌体规模化制备平台，实现牛奶/293细胞/间充质干细胞外泌体规模化制备，单次处理500L以上规模，可大规模、高纯度制备外泌体，突破外泌体工业化应用的第一道瓶颈。2）首创外泌体表面修饰装载平台，特有的BioBIND®技术可将广泛的功能性物质外源装载到外泌体表面，并保证外泌体与活性物质的生物学活性。通过模块化装载，突破ADC药物载药量低、安全风险高的瓶颈。3）优化设计的TAD自组装基因药物装载技术平台，优化基因药物装载系统，用于各种基因药物、mRNA疫苗开发，具有免疫原性低、装载基因片段大、靶向效应突出、可口服给药等优势。4）脂质嵌合装载平台，实现核酸、多肽等生物大分子和小分子的口服递送。 严肃医疗方面，天津外泌体科技开发了“牛奶外泌体原料”，产品经多级超深层过滤层析技术制备，纯度达到99%以上；其平台技术可提供纳米递送系统药物装载CRO与CDMO服务，联合开发基于外泌体的创新药或二类新药，可装载抗体、多肽、小分子、核酸等活性物质。 消费医疗方面，牛奶外泌体原料正式准予纳入国际化妆品原料(INCI)目录，商品名称“ Milk Exosomes ”，INCI编号“35079”，并接续开发了“然”系列外泌体-多肽复合原料。公司同时自主开发用于医美护肤的医疗器械级液体敷料和妆字号功能性护肤品，旗下Y³-EXOSOMES LIQUID BANDAGE获欧盟CE认证，可在欧盟27个成员国及其他认可欧盟CE认证的国家进行销售。 图49. Y3系列美容产品(CE认证) 7.4  思珞赛 思珞赛成立于2019年，专注于新型纳米药物，尤其是外泌体相关创新药物的研发和应用，并致力于外泌体本身及其作为药物递送载体的创新技术开发和临床应用转化。此外，基于专业和完善的TAXY™外泌体研究平台，公司同时对外提供相关领域的科研CRO服务和CDMO服务。 2022年7月，思珞赛完成逾千万美元的Pre-A轮融资，由诺辉创投领投。 思珞赛对外泌体载药技术进行了全方位的创新性研发，独立开发了程序化药物递送系统TAXYTM。建立了拥有自主知识产权的外泌体生产细胞系ExoBoost，该细胞系与现有细胞系（如293T，Expi293F）相比，能将外泌体产量提升20倍。此外，公司开发了外泌体药物装载系统ExoPack，能将蛋白或核酸药物高效地、选择性地装载到外泌体的内部或者表面。根据外泌体进入细胞的不同机制，根据受体配体作用的不同，开发出了不同组织靶向性的外泌体ExoTarget，可以靶向脑部、肺部、肌肉等。 思珞赛拥有近1千平米GMP生产和质控区，在质粒构建、菌种库建立和检定、细胞库建立和检定、工艺开发和优化、QC检测及放行、细胞培养及外泌体纯化领域积累了丰富的开发和生产经验。依托自有的外泌体药物研发平台、生产技术优势、完备的多功能GMP车间和GMP生产体系，公司现已具备制备从实验室级别（<2L）放大到工业级别（200L）样本量的能力。 7.5  Exosome Diagnostics Exosome Diagnostics于2018年6月25日被Bio-Techne以2.5亿美元现金和3.25亿美元的里程碑款项收购。 Exosome Diagnostics专注于研发基于生物流体的诊断技术，可利用血液、尿液、脑脊液等外泌体回收RNA、DNA，对疾病的特定基因特征进行分析。公司已开发出ExoDx Lung(ALK)肺癌诊断试剂盒和ExoDx Prostate(IntelliScore)(前列腺癌)血液/尿液检测试剂盒，患者只要提供一份血液或尿液样本，就能从获取的外泌体中分析内含RNA、蛋白质等成分，从而对癌症进行精准诊断。公司能够开发各种病理学中的新型高灵敏度诊断方法，包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等多种疾病，以及目前尚无诊断解决方案的癌症。 7.6  汇芯生物 汇芯生物成立于2017年，主要致力于探索外泌体在疾病早期诊断和治疗方面的应用，特别是将外泌体与液体活检技术相结合来实现癌症的早期筛查。2021年至今相继完成天使轮、Pre-A轮、Pre-A+轮超亿元融资，投资方包括中南创投、苇渡资本、凯风创投、绿河投资。 汇芯生物推出了全球首台用于外泌体分离纯化的非标记自动提纯系统—EXODUS®。纯化原理为负压振荡系统(NPO)结合双耦合谐波振荡系统(HO)作用于纳米超滤芯片; 样本中的游离核酸与蛋白等杂质通过纳米孔快速去除并截留外泌体，从而纯化富集外泌体。技术特点如下：该系统的应用特点为：适用于多种生物样本，外泌体回收率≥90%；适用的样本体积范围宽，杂蛋白去除率≥99%；完整度高，保留生物活性，能够用于细胞外囊泡亚型的分离。主要用于基因组学和蛋白质组学分析、生物分子的载药研究、体外和体内的功能性分析。基于先进的外泌体纯化技术平台，汇芯生物在泌尿系统肿瘤诊断试剂盒开发、规模化干细胞外泌体制备等领域也取得了积极进展。除此之外，汇芯生物还对外提供外泌体分离与提纯、表征与鉴定及外泌体分析服务。 7.7  Codiak Codiak成立于2015年，是由风险投资机构ARCH Venture Partner与Flagship Pioneering共同推动成立的生物科技公司，2020 年 10 月 14 日在 NASAQ 股票市场上市，股票代码为“CDAK”。Codiak Biosciences 在其 A、B 和 C 轮融资以及 IPO 后的三轮融资中筹集了 2.574 亿美元，受“资本寒冬”和“暂停两个临床II期试验管线”影响，当前市值仅剩余1805万美元（原因见5.2.7）。 Codiak致力于工程化外泌体，用外泌体来介导药物递送以及精准治疗，拥有核心专利平台engEx™，可以生产出工业级别和规模的外泌体。Codiak 发现了天然存在的外泌体蛋白——PTGFRN 和 BASP1，作为支架将靶向配体和活性分子引导至外泌体的表面或内腔。在研管线7条，exoIL-12、exoSTING、exoASO-STAT6处于临床I/II期，但exoIL-12、exoSTING项目已暂停，其余产品处于临床前研究阶段。 图50. Codiak研发管线 7.8  Evox Evox Therapeutics创立于2016年4月，分别于2016年、2018年和2021年进行三轮融资，总融资 1.692 亿美元，聚焦基于外泌体递送载药的罕见病治疗。 Evox开发的DeliverEX™外泌体递送技术平台可设计修饰外泌体，并将蛋白质、RNA药物以及小分子药物加载到被修饰的外泌体中，使其靶向目标组织，尤其是向大脑和中枢神经系统的递送。Evox同时具有其独有的专利支架蛋白TSPAN2，相比Codiak的PTGFRN支架蛋白，在载药量和外泌体特异性方面具备优势。 利用DeliverEXTM平台，Evox正在开发内部和合作伙伴的外泌体治疗品管线，用于治疗危及生命的罕见疾病（溶酶体贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸血症I型等）。Evox与武田制药合作开发外泌体载体的蛋白替代疗法，用于治疗LSD及另一项罕见疾病；与礼来制药合作开发RNAi和ASO药物，用于治疗神经系统疾病。 图51. Evox研发管线 7.9  EVerZom EVerZom 成立于2019年9月，是一家总部位于法国的初创公司，开发符合GMP标准的细胞外囊泡生产平台。作为外泌体领域的CDMO公司，EVerZom旨在通过突破性的专利生产技术，克服外泌体规模化生产的难题。EVerZom的专利创新在于对细胞应用激流刺激来触发大量的外泌体释放，通过改造一个生物反应器来诱导“ turbulence stimulation”，使外泌体的生产速度比传统方法快10倍。 EVerZom为客户提供外泌体制造、表征、分离、工程化服务。同时提供脂肪来源的间充质干细胞外泌体和来自鼠干细胞的外泌体标准品。 图52. EVerZom已服务客户 7.10  Exopharm Exopharm 是一家澳大利亚CRO公司，致力于开发外泌体治疗产品并将其商业化，先后推出产品Plexaris™和Exomeres™。Exopharm可提供从成体干细胞及其他细胞分离纯化外泌体的技术，并克服了现有外泌体纯化工艺的不足。Exopharm与全球20大制药公司Astellas子公司AIRM达成合作服务协议。 Exopharm拥有两项独家专有技术，可实现外泌体的高级定制——LOAD 技术可改善核酸药物加载到外泌体中，而 EVPS 技术可使外泌体定向于选定的细胞类型。LEAP则为外泌体纯化技术平台，解决大规模、低成本临床级外泌体的挑战。这些工程化 EV (EEV) 被设计为适用于遗传疾病、神经变性、病毒感染和癌症等适应症领域的精准药物。 7.11  唯思尔康 唯思尔康成立于2021年7月，作为国内外泌体领域的后起新秀，唯思尔康刚成立即获得亿元天使轮融资资金，由元生创投、联想之星、北极光创投、博远资本、苏州科创基金、苏州中新园创等多家知名投资机构联合参与。目前，唯思尔康已建设完成基础研发中心2000平米，完成外泌体平台的搭建，为外泌体新药研发奠定基础。 modEXO工程外泌体载药平台，是在对外泌体技术深入挖掘理解的基础上，依靠外泌体低免疫原性、多功能、高负载的特点，突出动态模块化设计，以促进组织细胞特异性药物递送、优化医疗窗口、缓释组织药理学、精确的剂量控制、个体定制诊疗方案，实现精确靶向的临床需求。基于该平台已开发多个管线，管线第一梯队是肿瘤免疫方向，第二梯队是免疫方向。 图53. 唯思尔康研发管线 7.12  恩泽康泰 北京恩泽康泰生物科技有限公司成立于2017年6月，该公司是国内首家致力于外泌体技术开发与临床转化的创新型高科技企业，旗下业务板块主要分为：其一，是基于外泌体的创新药研发，主要涵盖肿瘤免疫、罕见病及神经系统疾病等领域；其二，以外泌体为基础的转化医学研究服务，主要与临床专家合作展开科学研究，目前业务已经覆盖全国主要重点城市，已经与国内50多家知名三甲医院和科研单位以及多家精准医学企业建立合作。 恩泽康泰建立了高效的外泌体工程化改造平台，布局了核心平台性IP，并具备成熟的规模化外泌体量产及高纯度分离能力。通过工程化改造的方式对外泌体进行改性，大幅提高了外泌体携带特定有效成分的载量，并实现特定器官的选择性递送。目前，基于自主研发的外泌体技术，恩泽康泰围绕罕见病治疗、肿瘤免疫两个领域展开了管线布局。在罕见病方面，利用基于外泌体的蛋白替代疗法，为缺失特定胞内蛋白的患者（如溶酶体贮积病）补充所需的蛋白，从而起到治疗的效果；在肿瘤免疫方面，利用外泌体激活免疫细胞自身的免疫信号，并配合PD-1/L1单抗药物的使用，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应。 2019年3月，恩泽康泰宣布完成数千万元Pre-A轮融资，由金芒投资领投，澜峰资本、恩然创投跟投。2021年7月，该公司宣布完成近亿元的A轮融资，由隆门资本领投，泰煜投资、火山石投资跟投。2022年，公司宣布完成数千万元A+轮战略融资，由百度风投领投，老股东泰煜投资、火山石资本继续追加投资。2023年3月完成数千万元A++轮融资，本轮融资由中博聚力、延瑞投资共同参与，老股东百度风投继续加持。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TIS2024第四届免疫细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，合作详询：王晨 180 1628 8769

摘要:程序性细胞死亡1（PD-1）信号通路是免疫检查点调节的关键因素，已成为癌症免疫治疗的焦点。在癌症的背景下，肿瘤细胞上上调的PD-L1可能导致T细胞耗竭和免疫逃逸，促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂的出现通过解除T细胞的耗竭显示出临床成功。然而，诸如抗药性和不良反应等挑战促使人们探索创新策略，双特异性抗体（BsAbs）作为有希望的前沿出现。BsAbs通过同时靶向PD-L1和其他免疫调节分子，为癌症免疫治疗提供了一种多方面的方法。我们重点关注PD-1/PD-L1治疗的最新进展，特别强调BsAbs的开发和潜力，尤其是在实体瘤的背景下。讨论了针对PD-1信号的各种BsAb产品，突出了它们独特的作用机制和治疗潜力。值得注意的例子包括抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1、抗VEGF×PD-L1、抗4-1BB×PD-L1、抗LAG-3×PD-L1和抗PD-1×CTLA-4 BsAbs。此外，我们还总结了正在进行的临床研究，评估这些创新BsAb药物的疗效和安全性。通过揭示肿瘤微环境的复杂性并利用抗PD-1/PD-L1 BsAbs的协同效应，有潜力提高癌症免疫治疗的精确性和有效性，最终实现针对个体患者档案量身定制的个性化治疗策略的发展。 1.背景 程序性细胞死亡1（PD-1）信号作为一种基础的免疫检查点机制，能够降低炎症反应并维持免疫稳态。PD-1中的关键结构，即免疫受体酪氨酸基抑制/开关基序（ITIM/ITSM），促进信号传导并在细胞内招募磷酸酶（SHP1/2）。PD-1/PD-L1信号不仅作为预防自身免疫疾病的关键途径，而且显著影响肿瘤免疫监视与免疫耐受之间微妙的平衡。肿瘤细胞或浸润淋巴细胞上PD-L1的增加可能导致T细胞耗竭，抑制肿瘤特异性免疫并促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断负性调节信号，有效释放T细胞的耗竭状态，成为开创性的治疗方法。自2014年FDA批准首个抗PD-1抗体（帕博利珠单抗）以来，PD-1/PD-L1阻断疗法已经彻底改变了临床实践，展现出对难治性肿瘤特别有效的强大且持久的抗肿瘤效果。PD-1/PD-L1抑制剂通过破坏肿瘤利用的免疫抑制信号，使免疫细胞更有效地识别和杀死癌细胞。抗PD-1/PD-L1药物的临床成功强调了免疫检查点阻断在癌症治疗中的重要性。然而，诸如抗药性、有限的响应率和不良反应等挑战促使人们探索创新策略以优化和扩大治疗影响。与此同时，双特异性抗体已成为癌症免疫治疗中有希望的前沿。通过同时靶向PD-L1和参与免疫调节的其他关键分子，双特异性抗体（BsAbs）提供了一种多方面的方法来增强抗肿瘤免疫反应。本综述深入探讨了PD-1/PD-L1阻断的最新进展，并探索了双特异性抗体的潜力，重点关注它们在实体瘤中的开发和应用。通过阐明针对PD-L1 BsAb开发的进步，特别是为实体瘤量身定制的那些，本综述旨在为癌症免疫治疗的不断发展的理解做出贡献，并为更有效和个性化的治疗策略铺平道路。 2.BsAb的进步 2.1.BsAb的开发 针对肿瘤相关抗原（TAAs）的单克隆抗体，如Her2或EGFR，在乳腺癌和肺癌治疗中的成功，促使人们探索创新方法，包括开发BsAbs。BsAbs自20世纪80年代引入以来，因其在癌症治疗中的潜力而受到广泛关注。从功能上讲，BsAbs作为免疫效应细胞和肿瘤细胞之间的有效连接，或同时阻断两种不同的致癌分子。此外，一些BsAbs通过引导各种效应细胞以非MHC限制的方式杀死肿瘤细胞来增强肿瘤杀伤（图1）。技术的进步已经产生了各种BsAb格式，根据Fc结构域分类为非IgG格式和IgG格式。IgG样制剂保留Fc介导的抗体效应功能，而无Fc的BsAbs缺乏这些功能。双特异性T细胞引导剂（BiTEs）和TriomAbs是著名的BsAb格式。BiTEs缺乏Fc结构域，表现出短的血清半衰期，限制了它们的临床应用。TriomAbs具有IgG样结构，显示出更慢的清除率，但面临免疫原性和由于Fc结构域导致的渗透性受损的挑战（图2）。 图1 双特异性抗体（BsAbs）通过非MHC限制性方式引导各种效应细胞向肿瘤细胞，增强了肿瘤杀伤能力。BsAbs促进了T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，触发了一系列导致T细胞激活的事件。活化T细胞在癌细胞裂解中采用的主要机制涉及Granzyme-B和Perforin（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体作用机制”）。 图2 blinatumomab和TriomAbs的杀伤肿瘤机制。Blinatumomab是一种抗CD3×CD19的双特异性T细胞引导剂（BiTE）抗体。Blinatumomab旨在结合B细胞的CD19和T细胞的CD3。通过连接这两种细胞类型，blinatumomab有助于促进T细胞对癌细胞的反应，导致B细胞白血病细胞的破坏。Catumaxomab是基于TriomAbs技术的抗CD3×EpCAM BsAb，结合癌细胞的EpCAM和T细胞的CD3。值得注意的是，Fc结构域可以结合效应细胞（包括NK细胞、巨噬细胞和树突细胞）的Fcγ受体，触发抗体依赖性细胞毒性或吞噬作用，以及对癌细胞的补体依赖性毒性（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体设计”）。 在过去十年中，BsAb的开发主要由BiTEs主导。这些抗体同时结合T细胞的CD3和肿瘤细胞的TAAs，激活T细胞信号级联并启动依赖目标的肿瘤细胞杀伤。与检查点抑制剂不同，BiTEs克服了T细胞受体（TCR）的主要组织相容性复合体（MHC）限制，在临床上通过FDA批准的blinatumomab（抗CD3×CD19）得到了验证。此外，抗CD3×CD20 BsAb mosunetuzumab也已获准用于难治性或复发性滤泡性淋巴瘤。然而，尽管在血液恶性肿瘤中观察到有希望的结果，但在实体瘤中的双特异性抗体治疗效果，这些占所有癌症的90%，仍然是一个挑战，主要是由于抑制性肿瘤微环境（TME）损害了T细胞活性并促进了免疫缺陷。 另一条BsAb研究途径涉及同时靶向肿瘤细胞上的两个表位或TME中的细胞因子（图3）。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条促肿瘤信号通路，产生协同抗癌效果或最小化药物抗性。例如，双功能抗体M7824，靶向PD-L1和TGFβ，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中显示出显著的临床疗效。此外，尽管BsAb在实体瘤中的临床结果与血液恶性肿瘤相比不太令人满意，但正在进行的研究和临床试验，特别关注通常表达的抗原（例如EpCAM、HER2、PSMA和CEA），展示了BsAb在癌症免疫治疗中的巨大潜力。最近，同时靶向PD-L1和其他免疫抑制分子的BsAbs已经开发出来。这些BsAbs在临床前和临床研究中显示出强大的抗肿瘤活性，被视为下一代免疫检查点抑制剂（ICIs）。 图3 同时靶向肿瘤细胞上的两种免疫抑制分子或肿瘤微环境中的细胞因子的双特异性抗体。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条免疫抑制信号通路（4-1BB激动剂抗体除外），产生协同抗癌效果或最小化药物抗性（使用Biorender创建）。 2.2.BsAb在实体瘤中的挑战 在解决实体瘤恶性肿瘤时，BsAbs遇到了阻碍其临床成功的重大障碍。主要挑战包括管理与治疗相关的不良反应，减轻靶向和非靶向毒性，并应对免疫抑制性TME的复杂性。与BsAbs相关的关键问题，特别是那些具有完整Fc结构域的BsAbs，是非靶向毒性的风险，以细胞因子释放综合征（CRS）为例。CRS是一种系统性炎症反应，其临床表现范围从轻微症状到严重的、潜在致命的情况，通常以细胞减少等实验室标志为特征。CRS的病理生理学涉及由活化T细胞释放的IFN-γ触发的免疫级联反应，随后促使巨噬细胞产生过量的炎症细胞因子。这个问题的一个重要贡献者是无意中的T细胞激活，这可能通过非靶细胞上的FcγR结合等机制发生。 标准的缓解策略包括皮质类固醇预处理和优化剂量。此外，针对CRS发病机制中的关键细胞因子IL-6，使用tocilizumab等拮抗剂已显示出在不损害BsAb治疗的抗肿瘤效果的情况下减轻这些不良影响的希望。此外，BsAb设计的创新，如采用无Fc格式或具有修改Fc结构域的抗体，对于减少这些风险至关重要。此外，靶向毒性直接与BsAbs的靶向特异性相关。虽然某些肿瘤相关抗原（TAAs）表现出适用性，但其他由于在正常组织中的存在而带来风险，导致显著的毒性。例如，靶向EpCAM的BsAbs已经显示出这个问题。此外，BsAbs对其靶标的强亲和力可能导致靶向CRS。然而，与组织毒性不同，靶向CRS通常是短暂的，可以通过剂量调节和支持性治疗进行管理。 此外，BsAbs在实体瘤中的有效性受到TME的严重影响。一个重大挑战是免疫沙漠肿瘤中T细胞浸润不足，这限制了BsAb的效力。创新的干预措施，如使用溶瘤病毒，已被用来提高T细胞浸润，将“冷”肿瘤转化为更具反应性的“发炎”肿瘤，从而克服对T细胞参与BsAb治疗的抗性。此外，TME的免疫抑制特性，以BsAb治疗期间PD-1和PD-L1的上调为标志，呈现了另一个障碍。BiTEs在实体瘤中的中等效力导致了探索辅助疗法，如检查点抑制剂和T细胞共刺激因子，以增强其抗肿瘤活性。这些组合在临床前研究中通过克服T细胞耗竭和放大BiTE效果显示出希望。此外，将BiTEs与4-1BB激动剂等T细胞共刺激因子结合使用的策略，在提高BiTE性能方面已经有效。总之，将BsAbs与其他免疫疗法结合可以增强治疗效果，尽管结果因BsAb组成、靶标抗原和肿瘤类型而异。因此，BsAbs与实体瘤TME之间的复杂动态需要多方面和创新的治疗策略，以充分发挥其潜力。 3.抗TGFβ×PD-L1 BsAb 3.1.TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗中的作用 转化生长因子β（TGFβ）信号通路在癌症生物学中表现出双重性质，根据特定的细胞和组织环境，既发挥肿瘤抑制作用，也发挥促进肿瘤的作用。在正常细胞中，TGFβ的功能是维持细胞稳态并防止肿瘤起始，主要通过阻断细胞周期、促进细胞分化和触发细胞凋亡。该途径在不同细胞类型中的响应因Smad蛋白等因子的差异表达而异。相比之下，在癌细胞中，TGFβ的调节作用通常因突变或表观遗传变化而受到干扰或改变，导致从控制增殖转变为促进癌症进展。在肿瘤微环境中，过度活跃的TGFβ信号，通常在正常上皮细胞中具有抑制作用，反常地支持肿瘤生长、侵袭和转移行为。值得注意的是，TGF-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）在癌症发展、侵袭和扩散中至关重要。EMT对TGFβ水平的灵活性和可逆性强调了它作为潜在治疗靶点的重要性，特别是因为它促进了与肿瘤进展和化疗抗性相关的干细胞样表型。全面了解TGFβ在不同癌症类型和组织中的对比作用，以及其对肿瘤微环境的影响，对于设计靶向治疗以遏制癌症进展至关重要。 值得注意的是，越来越多的证据表明，TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗的复杂格局中扮演着核心角色，对肿瘤发生和免疫调节发挥双重作用。其在肿瘤微环境中的作用是多方面的，它不仅有助于促进肿瘤发生，还建立了一个免疫抑制环境，保护癌细胞免受免疫监视。TGFβ的免疫抑制功能通过其能力抑制各种免疫细胞的激活和功能来体现，包括自然杀伤细胞、T细胞和树突细胞。此外，TGFβ增强了免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）的分化和扩增，进一步倾向于免疫逃逸，有利于癌细胞。在癌症免疫治疗的背景下，TGFβ的免疫抑制性质构成了一个重大障碍。旨在中和或抑制TGFβ信号的策略已成为提高免疫疗法效果的有希望途径。值得注意的是，抗TGFβ×PD-L1 BsAb的发展代表了一种开创性的方法，同时靶向肿瘤微环境中的多个免疫抑制途径，从而释放免疫系统对抗癌症的全部潜力。 值得注意的是，TGFβ在癌症中的双重作用强调了理解其在有效患者选择中的情景影响的必要性。TGFβ信号的多效性活动在开发癌症治疗的拮抗剂中提出了挑战，特别是由于缺乏特定的生物标志物和确立的剂量方案。为了将TGFβ阻断剂有效地整合到前线癌症治疗中，未来的临床试验需要专注于生物信息学和识别分子生物标志物，用于患者分层和治疗优化。 3.2.M7824和其他双功能抗体 M7824是一种新型双功能融合蛋白，代表了PD-L1×TGFβ双重阻断疗法的重要进展（表1）。这种创新药物结合了Fab中的抗PD-L1域和Fc中的TGFβ受体，允许同时靶向两种免疫抑制途径。M7824旨在靶向肿瘤细胞上的PD-L1分子，将陷阱分子定位在肿瘤微环境中以捕获免疫抑制性TGF-β。然后，M7824被表达PD-L1的细胞内化，导致去除M7824结合的TGF-β。理论上，由于其物理桥接效应，M7824预计对肿瘤细胞的特异性比两种单克隆抗体的组合要大。在动物模型中，M7824显示出强大的抗肿瘤效果，明显延缓肿瘤生长并延长存活。除了其直接的抗肿瘤效果外，M7824诱导了肿瘤微环境的大量重塑，包括预防或逆转TGFβ介导的癌细胞上皮-间充质转化。这种改变增强了肿瘤细胞对免疫介导攻击和化疗药物的敏感性。融合蛋白增加了细胞毒性淋巴细胞的数量和活性，同时减少免疫抑制亚群的比例，包括Tregs、骨髓源性抑制细胞（MDSC）和M2样巨噬细胞。此外，M7824诱导肿瘤基质重塑，有助于改善免疫细胞浸润，并加强其作为多方面免疫治疗剂的潜力。此外，当与放疗、化疗和其他免疫治疗剂结合使用时，它增强了整体抗肿瘤活性。在1期试验中，M7824提供了有希望的响应，特别是在高PD-L1表达的NSCLC中（NCT02517398）（表2）。 M7824的成功促进了额外的抗TGFβ×PD-L1双功能蛋白的探索和发展。其中，SHR-1701的结构让人想起M7824，结合了抗PD-L1域和N末端截短的TGFβRII。在1期临床试验（NCT05179239）中，SHR-1701在复发性转移性宫颈癌中表现出抗肿瘤活性。同样，由抗PD-L1抗体和TGFβRII外细胞域组成的双功能蛋白BR102，在小鼠肿瘤模型中展示了抗肿瘤活性。这些新兴的抗体，包括SHR-1701和BR102，为潜在的抗TGFβ×PD-L1阻断疗法的不断扩大的武器库做出了贡献，为癌症免疫治疗的复杂格局提供了新的治疗策略。 3.3.YM101和BiTP YM101被誉为世界上首个公开报道的抗TGFβ×PD-L1 BsAb，标志着癌症免疫治疗领域的关键进步。利用Check-BODY™技术平台设计，YM101代表了用于对抗PD-L1和TGF-β双重挑战的创新策略。临床前研究揭示了YM101有效抵消TGF-β和PD-1×PD-L1信号通路效应的能力。此外，在体内证据表明，YM101在抗肿瘤活性方面优于单独的抗TGF-β和抗PD-L1治疗。我们假设这种改善的抗肿瘤效果可能归因于YM101独特的物理桥接效应带来的增强的肿瘤特异性。然而，必须承认，我们目前的推测缺乏实验证据来证实它。在未来的研究中，必须使用同位素标记等技术进一步验证并展示YM101的优势，特别是在其增加肿瘤特异性和相关增强抗肿瘤效果的潜力方面。 此外，YM101在塑造肿瘤微环境方面发挥了变革性作用，促进了以增加的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）数量和活性为特征的炎症肿瘤的形成。YM101还将巨噬细胞的极化平衡转向抗肿瘤的M1表型，进一步增强了其免疫治疗潜力。此外，在临床前研究中，STING激动剂和YM101的组合通过针对三条独立且互补的途径，展示了强大且持久的抗肿瘤免疫保护。STING激动剂诱导树突细胞成熟并激活巨噬细胞，重新点燃免疫学上的冷肿瘤，并增强全身的先天和适应性免疫反应。与YM101结合使用时，STING激动剂协同作用，使肿瘤微环境正常化并阻碍非炎症模型中的肿瘤生长。 受到临床前结果的鼓舞，随后开发了用于临床试验的替代分子（BiTP）。BiTP与YM101具有相似的结构，并使用Check-BODY™平台构建，在小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型中证明了其有效性。在人源化TNBC模型中的有效性实验表明，BiTP显示出比相应单一疗法更好的抗肿瘤效果。BiTP减少胶原蛋白生成，增强T细胞渗透，并增加淋巴细胞向肿瘤的浸润。目前，正在进行多项BiTP的临床试验，包括CTR20211776（用于实体瘤）和CTR20223410（用于胰腺癌）。总的来说，以YM101、BiTP和M7824为代表的抗TGF-β×PD-L1 BsAb的开发，代表了癌症免疫治疗的变革性方法。这些创新药物旨在同时靶向多条免疫抑制途径，在临床前和临床环境中显示出显著的效果。在组合疗法中观察到的协同效应进一步强调了这些抗体克服抗性机制并扩大其在不同肿瘤类型中的适用性的潜力。 4.抗CD47×PD-L1 BsAb CD47在癌症中发挥关键作用，通过与其配体肿瘤细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）结合传递“不要吃我”信号。破坏CD47或其配体的抗体在临床前研究和临床试验中显示出治疗效果。CD47阻断增强了各种肿瘤模型中的抗原呈递、吞噬作用和免疫浸润，支持了CD47阻断免疫治疗药物的开发。此外，CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1信号的双重阻断，分别抑制先天和适应性免疫反应，在多种癌症类型中显示出增强的治疗效果，为刺激免疫系统的两个分支提供了有希望的治疗途径。基于纽扣-入洞（KIH）平台，Wang等人开发了一种抗CD47×PD-L1 BsAb 6MW3211，该抗体设计有一个通用轻链，对CD47具有低亲和力，对PD-L1具有高亲和力。这种独特的亲和力配置文件允许优先结合肿瘤细胞的PD-L1，抑制CD47信号通路。6MW3211在多种小鼠模型中展示了强大的治疗效果，并在体内展示了有希望的药代动力学和安全性。通过多重荧光免疫组化染色确认的多种人类肿瘤上CD47和PD-L1的共表达，支持6MW3211针对PD-L1+ CD47+癌症的临床试验的潜力。 此外，Chen等人构建了一个亲和力调整的抗CD47×PD-L1 BsAb（hBisAb），以提高抗体选择性和治疗效果。hBisAb利用纽扣-入洞技术和通用轻链结构开发，采用IgG1格式。这种人性化抗体对CD47表现出中等亲和力，对PD-L1表现出高度有效的亲和力，这一点通过表面等离子共振和基于细胞的实验获得的动力学速率常数得到证实。特别设计用于优先结合PD-L1，该抗体有效阻断PD-1/PD-L1相互作用，也抑制了CD47/SIRPα轴。这种双重作用机制不仅增强了T细胞功能，还显著提高了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，超过了单独针对任一检查点的单一疗法。体外和体内研究表明，hBisAb对肿瘤细胞具有显著的选择性，超过了红细胞，解决了CD47靶向疗法常见的挑战，通过最小化不必要的血液学效应。这种选择性进一步由抗体在肿瘤微环境中对表达PD-L1的细胞的优先结合所强调，减少了非靶向效应，提高了治疗安全性。特别是IgG1形式的双特异性抗体在促进抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和DC介导的T细胞激活方面显示出优越的效力，导致同种异体小鼠模型中显著的肿瘤生长抑制和提高的生存率。值得注意的是，这种方法通过维持治疗小鼠的正常红细胞计数和体重，减轻了与CD47靶向相关的潜在毒性，突出了双特异性抗体增强的抗肿瘤效果和减少的副作用。 此外，还有一些其他的抗CD47×PD-L1 BsAbs已被报道。例如，IBI322被设计为通过优先结合PD-L1+CD47+肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞吞噬，同时最小化对CD47+PD-L1−细胞（如红细胞）的影响，以提高治疗选择性和效果。同样，一种双重靶向融合蛋白IAB有效地结合了CD47和PD-L1，展示了强大的抗肿瘤活性，并在激活先天和适应性免疫对抗肿瘤中发挥了至关重要的作用。这些创新方法强调了双重检查点阻断的潜力，同时靶向CD47和PD-L1，以改善治疗结果，同时减轻与传统抗体相关的毒性。 5.抗VEGF/PD-1和抗VEGF/PD-L1 BsAb VEGF是由低氧肿瘤微环境诱导的，刺激内皮细胞增殖和血管生成。此外，VEGF具有免疫抑制作用，促进免疫抑制细胞的招募并阻碍免疫细胞浸润。将抗血管靶向药物与ICIs结合使用已在多种癌症中显示出协同抗肿瘤效果，突出了双重治疗策略在癌症治疗中同时解决血管生成和免疫反应的潜力。目前，已有多种抗VEGF×PD-1和抗VEGF×PD-L1 BsAbs成功开发用于癌症免疫治疗。 Hassanzadeh等人构建了一种双价抗PD-L1×VEGF纳米抗体，证明了其在体外有效抑制血管生成。此外，针对PD-L1和VEGF的BsAb HB0025是利用mAb-Trap技术开发的。临床前研究表明，HB0025在抑制肿瘤生长方面比单独使用抗PD-L1抗体或VEGFR1D2融合蛋白更有效。而且，Xiong等人开发了一种全人源双特异性单链双抗体（BsDb），靶向VEGF165和PD-1。这种BsDb展示了高度特异性，抑制了VEGF165诱导的人脐静脉内皮细胞中的活动，并增强了T细胞增殖和IFN-γ的产生。在小鼠模型中，BsDb通过抑制血管生成和激活免疫反应，表现出强大的抗肿瘤活性，表明其作为双重靶向BsAb用于癌症治疗的潜力。重要的是，2期临床试验评估了AK112（一种人源化IgG1抗VEGF×PD-1 BsAb）与化疗联合用于晚期NSCLC的疗效和安全性。该研究包括具有不同治疗历史和基因组改变的三个队列。1、2和3队列中确认的客观反应率（ORR）分别为53.5%、68.4%和40.0%。研究结果表明，AK112加铂类药物显示出有希望的抗肿瘤活性和安全性，为晚期NSCLC患者提供了一种潜在的新治疗选择。 6.抗4-1BB×PD-L1 BsAb 4-1BB（CD137）是一种由活化的NK和T细胞表达的诱导性共刺激分子。4-1BB信号，由其在专职抗原呈递细胞（APCs）上的配体相互作用触发，激活了通路，导致增强的细胞因子产生、存活、增殖和免疫记忆。在肿瘤微环境中，4-1BB作为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的标志物，通常与PD-1共表达。4-1BB激活在临床前模型中显示出有希望的抗肿瘤反应，4-1BB激动剂抗体与PD-1/PD-L1抑制剂的组合协同增强了抗肿瘤免疫。目前，4-1BB激动剂与抗PD-1治疗的组合使用面临重大挑战，尤其是系统毒性。例如，由于系统激活4-1BB途径导致的剂量依赖性肝炎，一种治疗性CD137激动剂抗体的临床开发被中止。从理论上讲，BsAb技术具有潜力，因为它可能通过PD-L1结合激活4-1BB，从而增强肿瘤特异性T细胞反应。这种方法看起来很有前景，因为PD-1和4-1BB都在肿瘤特异性CD8+CTLs上共表达。 为了通过将4-1BB激动剂与这些抑制剂结合来增强ICIs的治疗效果，已经开发了几种抗4-1BB×PD-L1 BsAbs。MCLA-145被设计为一种IgG1分子，对Fc CH3域进行了特定修改以鼓励重链异二聚体化，并对CH2域进行了修改以防止Fc受体结合。体外实验表明，MCLA-145可以有效地激活T细胞，加强T细胞启动、分化和免疫记忆，并显示出比ICI对照组更好的抗肿瘤活性。重要的是，MCLA-145在非人灵长类动物中显示出没有移植物抗宿主病和最小的不良影响。在机械上，MCLA-145通过结合肿瘤细胞上的PD-L1和T效应细胞上的CD137，促进了“免疫突触”的创建。在这个突触中，T细胞可以在接受增强的TCR信号的同时解除PD-1抑制，并且CD137激活得到加强。随后的研究已经证实，MCLA-145通过PD-L1邻近细胞表达超过5000份PD-L1时有条件地激活CD137信号。这种有条件的激活提供了安全性和有效性的潜在优势。重要的是要注意，即使在最大饱和条件下，MCLA-145也不能在没有邻近细胞表达PD-L1的情况下触发CD137信号。另一种双特异性抗体ABL503，仅在PD-L1的背景下选择性激活4-1BB信号，避免了用抗4-1BB激动剂抗体治疗的患者观察到的剂量依赖性毒性。ABL503在临床前模型中展示了强大的抗肿瘤活性和改善的安全性。 PRS-344/S095012是为了阻断PD-1/PD-L1通路并定位于PD-L1阳性的肿瘤微环境中的4-1BB共刺激而开发的。这种双特异性分子有效地将免疫检查点抑制剂(ICI)与肿瘤微环境中定位的4-1BB介导的免疫刺激相结合，在小鼠模型中展示了比单克隆抗体组合更优越的T细胞刺激和抗肿瘤活性。此外，HK010，一种Fc突变的IgG4抗4-1BB×PD-L1 BsAb，通过同时阻断PD-1/PD-L1信号和刺激4-1BB信号，展现出强大的抗肿瘤效果。HK010在临床前模型中显示出强大的抗肿瘤免疫，诱导持久的抗原特异性免疫记忆，并且耐受性良好，为癌症免疫治疗提供了一个有希望的选择。另外，PM1003是一种针对4-1BB的独特表位的单域抗体，用于构建多特异性抗体，例如抗PD-L1×4-1BB BsAbs，以在肿瘤微环境中定位4-1BB激活，导致PD-L1活性和体内抗肿瘤活性的有效抑制以及最小的毒性。 值得注意的是，在1期临床试验(NCT03917381)中，研究了DuoBody-4-1BB×PD-L1 (GEN1046)，这是一种首创的双特异性免疫治疗剂，在晚期难治性实体瘤患者中的潜力。在临床前模型中，GEN1046在T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性功能方面展示了比临床批准的抗PD-1/PD-L1药物更优越的效果。正在进行的人体首项研究揭示了可管理的安全性、与其作用机制一致的药效学免疫效应以及早期临床活性，在患者中观察到的疾病控制率为65.6% (40/61)，包括对先前抗PD-1/PD-L1免疫治疗有抗性的患者。GEN1046的鼓舞人心的临床前和临床结果表明其有潜力填补临床空白，为免疫治疗复发或难治性疾病的患者提供治疗选择，使其成为与其他免疫治疗剂联合治疗的有希望的候选者。总之，这些发展共同为癌症免疫治疗提供了增强的疗效和安全性的新策略。 7.抗LAG-3×PD-L1 BsAb LAG-3是激活的T细胞和NK细胞上的已识别跨膜蛋白，传递抑制信号以抑制T细胞增殖。目前正在评估阻断LAG-3和MHC-II相互作用的单克隆抗体的潜在抗肿瘤效果。然而，LAG-3和PD-1在肿瘤中的共表达意味着它们参与了T细胞耗竭。抗PD-1/PD-L1和抗LAG-3抗体的联合给药显示出协同抑制肿瘤生长的能力，在2/3期试验中，relatlimab和nivolumab的联合使用与单独使用nivolumab相比，显著延长了PFS。目前，relatlimab和nivolumab的联合使用已被批准用于晚期黑色素瘤。此外，如ieramilimab（一种抗LAG-3抗体）和spartalizumab（一种抗PD-1抗体）的组合，在包括非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、肾细胞癌、间皮瘤和三阴性乳腺癌(TNBC)的各种患者群体中展示了持续的积极反应。这些反应在未接受过抗PD-1/L1治疗的患者以及接受过抗PD1/L1治疗的黑色素瘤和肾细胞癌患者中观察到。开发抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的合理性源于在肿瘤中观察到的共表达，表明其在T细胞耗竭中的潜在作用。 IBI323和ABL501是针对LAG-3和PD-L1的有前途的BsAbs，旨在克服在抗PD-1/PD-L1治疗中对晚期肿瘤观察到的有限效果。IBI323不仅保持了其亲本抗体的阻断活性，还引入了一种新的细胞桥接功能。这种创新机制转化为混合白细胞反应中增强的免疫刺激活性和在人源化小鼠模型中更强的抗肿瘤反应，与肿瘤特异性T细胞的增加相关。同样，ABL501是由一种抗LAG-3 IgG4抗体通过(G4S)3连接子链接到PD-L1靶向scFv构建的，具有战略性的S224P氨基酸替换以增强稳定性。它有效地结合其靶标而不引发Fc介导的效应功能，如ADCC和CDC，将其作用集中在检查点阻断上。体外实验表明，ABL501有效地靶向了LAG-3和PD-L1途径，在增强效应T细胞的激活方面优于单独的抗LAG-3和抗PD-L1抗体。ABL501在人源化异种移植模型中展示了引人注目的体内抗肿瘤效果，强调了其潜在的临床意义。对周围血液中的免疫档案的检查突出了在接受了化疗的复发性胆管癌患者中LAG-3+PD-1+记忆CD4+T细胞亚群的增强存在。值得注意的是，这个亚群预示着对ABL501增加的反应性，为其正在进行的人体首项试验(NCT05101109)提供了有价值的支持。在机械上，ABL501促进了DC的成熟和启动T细胞的能力，导致改善的抗原交叉呈递和更强大的CD8+T细胞激活。此外，ABL501直接增加了CD8+T细胞对肿瘤的细胞毒性。其效果取决于LAG-3和PD-L1的同时参与，促进有效的T细胞-肿瘤细胞相互作用。通过作为T细胞引导剂，促进T细胞激活，同时阻断抑制信号，ABL501协调了强大的抗肿瘤免疫反应。 抗LAG-3×PD-L1 BsAb FS118在临床前和临床研究中展现出了有希望的结果，为癌症免疫治疗提供了一种新的方法。在临床前研究中，FS118展示了对LAG-3和PD-L1的高亲和力同时结合，超越了抗LAG-3和抗PD-L1抗体组合的抗肿瘤活性。在同源肿瘤小鼠模型的机制研究中，使用替代的mLAG-3×PD-L1抗体显示了显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，小鼠替代品导致T细胞上LAG-3的丰度降低，而单独抗体的组合增加了LAG-3的表达。此外，替代mLAG-3/PD-L1抗体的结合导致小鼠LAG-3迅速脱落到血液中。在临床研究中，1期试验(NCT03440437)证明了FS118在晚期、抗PD-1/PD-L1耐药癌症患者中的安全性和耐受性。FS118显示了10 mg/kg每周的推荐2期剂量，持续的药效学活性，以及46.5%的总体疾病控制率，特别是在对PD-1/PD-L1靶向治疗获得性耐药的患者中。这项研究支持了对难治性癌症患者FS118的持续研究，突出了其作为有效的双重PD-L1×LAG-3阻断策略的潜力。除了实体瘤，针对LAG-3的BsAbs也在血液肿瘤中展示了有希望的疗效。在1期临床试验NCT03219268中，探索了抗LAG-3×PD-1 BsAb Tebotelimab在实体瘤或血液肿瘤患者中的疗效。值得注意的是，34%的患者显示肿瘤缩小，包括对抗PD-1治疗有抗性的各种癌症类型的积极反应。 8.抗PD-1/CTLA-4 BsAb CTLA-4和PD-1是抑制各种T细胞功能的免疫检查点，它们的激活通过多种机制导致T细胞功能抑制。CTLA-4在激活时诱导，与CD28介导的激活竞争，并从APCs中移除共刺激配体。PD-1在T淋巴细胞表达时，作为抑制剂减少细胞毒性和细胞因子生成。这两个检查点都被肿瘤用于免疫逃逸。阻断CTLA-4或PD-1的抗体在临床前和临床环境中都显示出抗肿瘤活性，并且组合疗法在各种癌症中展示了改善的反应。此外，TME分析揭示了与正常组织相比，肿瘤中PD-1+CTLA-4+细胞的比例更高，支持了针对PD-1+ CTLA-4+细胞的合理性，以选择性地在TME中阻断检查点，同时避免对正常组织的影响。 PD-1/PD-L1轴的系统阻断在癌症免疫治疗中是基础性的，特别是考虑到其临床意义和良好的安全性。因此，一个优越的组合疗法应该确保它保留了PD-1阻断的效果，而不影响其阻断PD-1与其配体相互作用的能力。然而，CTLA-4的系统性抑制带来了更高的不良反应风险。为了降低这些风险，抗PD-1×CTLA-4 BsAb提供了改进的CTLA-4抑制功能，专门针对在TME中共同表达PD-1和CTLA-4的细胞。例如，MGD019是一种先进的BsAb，设计用于同时靶向PD-1和CTLA-4。这种BsAb具有独特的四价结构，使用高亲和力的抗PD-1单克隆抗体，以及具有类似于众所周知的ipilimumab阻断配体特性的抗CTLA-4单克隆抗体。MGD019的构建在Dual-Affinity Re-Targeting平台上，采用2×2对称格式，结合了铰链稳定的IgG4骨架。MGD019的独特结构允许对PD-1进行强大的阻断，并适应性地抑制CTLA-4，专门针对TME。它模仿了其抗PD-1前体体外阻断PD-1的效果，同时调节CTLA-4阻断，使其在表达PD-1和CTLA-4的细胞中最有效。这种特异性确保了TME中CTLA-4的局部抑制，通过避免广泛的Treg耗尽可能提高了安全性。值得注意的是，MGD019阻断PD-1与其配体的相互作用的能力，结合其适应性CTLA-4阻断策略，在晚期实体瘤患者中显示出显著的抗肿瘤活性和可管理的安全性。 此外，MGD019的IgG4 Fc区域赋予了降低的Fc介导的ADCC能力，从而减少了无意中消除活化的T细胞和Treg。Treg耗尽对ipilimumab的治疗效果和安全性的影响仍在考察中，然而，抗CTLA-4抗体的Fc区域诱导这种耗尽的潜力在临床前研究中与有益和有害的结果都有关联。通过避免Treg耗尽，同时在TME中保持有效的CTLA-4阻断，MGD019旨在提高患者安全性并维持CTLA-4拮抗的有益效果。Treg的免疫抑制作用主要涉及CTLA-4介导的T细胞耗竭。因此，MGD019在TME中对CTLA-4的阻断预计将足够强烈，以补偿缺乏Treg耗尽。这种策略，防止Treg减少，并确保在TME中强烈CTLA-4抑制，旨在优化这些免疫检查点在癌症免疫治疗中的关键功能，可能比传统抗体治疗提供增强的治疗益处，同时最小化不良反应。 抗PD-1/CTLA-4 BsAb QL1706在1/1b期研究中对标准治疗无效的晚期实体瘤显示出可管理的安全性。在推荐剂量下的所有患者中，客观反应率为16.9%，反应的中位持续时间为11.7个月。值得注意的是，未接受过免疫治疗的患者，特别是那些患有非小细胞肺癌、鼻咽癌和宫颈癌的患者，显示出有希望的抗肿瘤活性，反应率分别为24.2%、38.7%和28.3%。QL1706目前正在随机2/3期试验中进行进一步的疗效评估。此外，MEDI5752，一种新型单价双特异性抗体，通过选择性抑制PD-1+活化T细胞上的CTLA4来增强PD-1阻断。它减少了所需的剂量，以分泌IL-2，并迅速内化和降解PD-1。MEDI5752偏好肿瘤定位，与抗PD-1和抗CTLA4抗体组合相比，在体内显示出更优越的活性。两名晚期实体瘤患者对MEDI5752治疗显示出强大的部分反应。这代表了癌症免疫治疗的重大进步，通过选择性靶向PD-1+T细胞上的CTLA4提供独特的好处。 Cadonilimab是一种四价双特异性IgG1抗体，具有创新的Fc-null设计，旨在消除Fc介导的效应功能，以考虑安全性和有效性。它展现出与CTLA-4和PD-1抗体组合相当的生物活性。值得注意的是，Cadonilimab在高密度PD-1和CTLA-4环境中显示出更高的结合亲和力，为肿瘤样环境提供了潜在的优势。在1b/2期试验NCT03852251中，探索了Cadonilimab在晚期实体瘤中的疗效。Cadonilimab显示出令人鼓舞的疗效，宫颈癌的客观反应率为32.3%，食管鳞状细胞癌为18.2%，肝细胞癌为16.7%。这些发现强调了Cadonilimab在实现多种晚期实体瘤类型的积极肿瘤反应中的潜在有效性。目前，Cadonilimab已在中国获得批准，用于治疗铂类化疗后的复发或转移性宫颈癌。 9.其他靶向PD-1/PD-L1信号的BsAbs 除了上述的药剂外，其他BsAbs已经开发并在临床试验中进行评估，如抗PD-L1/CD3、抗PD-1/PD-L1和抗TIM-3/PD-L1 BsAbs。例如，针对现有T细胞引导剂的关键挑战，抗PD-L1/CD3 BsAb的发展取得了最新进展。一个值得注意的创新是Protease-Activated PSTAGylated BiTE (PAPB)，它为实体瘤设计。PAPB结合了一个屏蔽多肽域(PSTAG)、一个蛋白酶激活的链接器和一个带有针对PD-L1和CD3的scFvs的BiTE核心。PAPB展示了BiTE核心对PD-L1和CD3的剂量依赖性结合，能够响应TME中的MMP2释放核心，显著延长其血浆半衰期。此外，一种新型基于纳米抗体的抗PD-L1/CD3 BiTE在与PD-L1表达水平相关的黑色素瘤细胞上显示出细胞毒性活性，突显了其在治疗PD-L1过表达黑色素瘤中的潜力。总的来说，这些进展标志着在实体瘤免疫治疗领域提高抗PD-L1/CD3抗体的安全性、作用持续时间和有效性的有希望的步骤。 TIM-3作为癌症免疫学中的一个关键角色，作为免疫反应的负调节器。在癌症中，TIM-3表达特别识别了最功能障碍的CD8+ T细胞亚群，表明它们的耗竭。在临床前癌症模型的研究中，联合阻断TIM-3和PD-1途径在实体瘤和血液肿瘤中显示出显著的疗效。正在进行的临床试验，特别是在实体瘤中，正在探索抗TIM-3与抗PD-1联合使用的潜力，展示了其作为癌症免疫治疗目标的前景。在1期研究NCT03752177中，评估了TIM-3/PD-L1 BsAb LY3415244在晚期实体瘤患者中的安全性和有效性。虽然一些患者显示出有希望的结果，例如PD-1耐药NSCLC患者(-29.6%)接近部分反应，但试验面临挑战。值得注意的是，16.7%的患者经历了临床意义的过敏性输注相关反应。所有患者都发展出治疗出现的抗药物抗体(TE-ADA)，影响了可溶性TIM-3目标参与，并导致研究提前终止。尽管存在这些挑战，患者结果，特别是在PD-1耐药癌症的背景下，突显了LY3415244的潜在临床影响，值得在未来的研究中进一步探索和考虑。 10.结论和展望 针对PD-1/PD-L1轴以及其他免疫调节分子的BsAbs的出现和临床验证标志着癌症免疫治疗领域的一个关键发展。本综述深入探讨了BsAbs领域的创新进展，特别关注了它们在开发、作用机制以及治疗潜力方面对实体瘤管理的贡献。探索如抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1等BsAbs，突显了扩大抗肿瘤免疫、克服免疫逃逸以及解决单一疗法固有局限性的战略努力。尽管这些药物的治疗前景得到了临床前和新兴临床成功的强调，但将它们最佳整合到癌症护理中的旅程将需要仔细的研究和对细节的关注。 首先，未来的研究必须集中于提高BsAbs的特异性、有效性和安全性。这包括开发下一代BsAbs，具有减少的免疫原性、改善的肿瘤穿透力和定制的药代动力学特性。先进的分子工程技术可以促进设计在肿瘤微环境中选择性积累的BsAbs，最小化系统暴露和相关的毒性。此外，肿瘤微环境的复杂性仍然是免疫疗法有效性的巨大挑战。能够调节抑制性肿瘤微环境、增强抗原呈递、并促进肿瘤内T细胞的浸润和激活的新型BsAbs尤其令人感兴趣。将BsAbs与破坏肿瘤微环境中物理屏障或中和抑制性细胞群体的药物结合起来的策略，可能会产生协同的抗肿瘤效果。此外，识别对BsAb治疗反应的预测性生物标志物至关重要。对肿瘤进行全面的基因组、蛋白质组和免疫学分析可能会揭示预测治疗反应的生物标志物，指导患者选择，并促进个性化治疗方法。这种精准医疗方法将优化治疗结果并降低不良反应的风险。此外，将BsAbs与其他治疗方式相结合，包括化疗、靶向治疗、放疗和其他免疫疗法，有着巨大的前景。基于机制合理和临床前证据的组合策略可以增强抗肿瘤效果，对抗耐药机制，并扩大BsAbs的治疗窗口。 BsAbs在癌症免疫治疗中的探索为我们对抗癌症开辟了新的前沿，承诺增强免疫介导的抗肿瘤反应的精确性、效力和持久性。BsAbs在癌症治疗中的未来预示着一个范式，其中针对多个免疫检查点的协同或将免疫调节与其他治疗策略相结合，可以为全球患者提供持久、有效和更安全的治疗选择。BsAbs在癌症护理中的实质性前景不仅突出了有希望的治疗途径，也强调了我们通过免疫手段共同致力于扭转对抗癌症的潮流。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：癌症治疗中最大的挑战是以最小的损伤正常细胞来根除癌细胞。靶向治疗已经发展起来以应对这一挑战，与传统癌症治疗相比，显示出显著增加的治疗指数。由于其对目标抗原的非凡高特异性，抗体成为靶向治疗代理家族中的重要成员。治疗性抗体使用一系列机制直接或间接杀死癌细胞。早期的抗体被开发出来直接对抗癌细胞上的目标。随后是连接技术的进步，使得抗体-药物偶联物（ADCs）的生产成为可能，这些偶联物将细胞毒性有效载荷引导到癌细胞。我们对T细胞生物学的理解的提高，导致了免疫检查点抑制抗体的生产，这些抗体通过激活T细胞间接杀死癌细胞。甚至最近，双特异性抗体被设计合成，以重定向患者的T细胞杀死癌细胞。在这篇综述中，我们总结了治疗性抗体用来靶向癌细胞的不同方法。我们讨论了它们的作用机制、目标特异性的结构基础、临床应用以及正在进行的研究以提高疗效和减少毒性。 1. 引言 在过去的一个世纪中，发展了诸如化疗和放疗等有效的治疗手段来治疗癌症。不幸的是，这些方法通常缺乏足够的特异性，无法在不引起难以忍受的毒性的情况下，使用足够高的剂量来根除癌细胞。单克隆抗体可以提供所需的特异性水平，从而大幅扩大治疗窗口，有些抗体甚至能够区分相差一个氨基酸或经过翻译后修饰的两种抗原。20世纪70年代发展的杂交瘤技术首次允许生产和筛选针对人类抗原的高度特异性小鼠单克隆抗体。其次，将人类抗体恒定区嫁接到小鼠抗体可变区的能力，产生了具有更好治疗效果和较少副作用的嵌合抗体（图1）。第三，20世纪90年代转基因小鼠模型和噬菌体展示系统的应用，使得能够针对癌症靶点产生全人源抗体。随着这些技术进步和临床需求的增加，过去25年见证了基于抗体治疗的爆炸性增长。自1997年以来，已有50多种基于抗体的肿瘤治疗药物获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准（补充表1）。除了基于抗体的治疗外，抗体片段也被用来生成嵌合抗原受体（CARs）进行T细胞工程。在这篇综述中，我们专注于FDA和EMA批准的基于抗体的治疗以及正在临床前和临床开发中进展的抗体。我们讨论了用于产生嵌合、人源化和人源抗体的相继使用的方法的演变。我们详细说明了正在开发用于靶向癌细胞的一系列格式，如单特异性抗体、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体和偶联抗体。最后，我们总结了为应对当前癌症靶向抗体开发中的挑战而进行的新兴研究。 2. 抗体生成 用于识别针对肿瘤抗原的治疗性单克隆抗体或抗体片段的一系列技术。这些技术包括使用目标抗原对啮齿动物进行免疫、噬菌体或酵母展示技术、从人类和小鼠中克隆单B细胞，以及从骆驼科动物中识别单域抗体（称为纳米抗体）。抗体的进一步临床应用开发涉及抗体工程，使其与人类免疫系统越来越兼容。 2.1 嵌合抗体和人源化抗体 单克隆抗体传统上是通过1975年Cesar Milstein和Georges Kohler开发的杂交瘤技术生产的。在这个过程中，B细胞是从免疫特定抗原的小鼠脾脏或淋巴结中分离出来的，然后与Sp2/0这样的骨髓瘤细胞系融合，形成称为杂交瘤细胞系的杂交细胞。通常通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选杂交瘤克隆以检测蛋白结合，并通过流式细胞术检测细胞结合。杂交瘤技术能够稳健且成本有效地生成一系列小鼠单克隆抗体。然而，注入人体的小鼠抗体会产生人抗鼠抗体（HAMA）免疫反应，限制了它们的疗效并增加了不良反应。因此，获得监管批准的大多数小鼠抗体后来都被撤回（图1）。Blinatumomab（一种双特异性T细胞激活剂，靶向CD19），使用两个小鼠衍生的单链可变片段（scFv）格式，缺乏可结晶片段（Fc），是唯一在临床上广泛采用的小鼠抗体。 为了减少在患者中诱导免疫反应，小鼠抗体的恒定区被替换为人类恒定区，以产生嵌合抗体（图1）。利妥昔单抗（抗CD20）和西妥昔单抗（抗表皮生长因子受体（EGFR））（表1）是最早通过将小鼠抗体2B8和225的可变区连接到人类免疫球蛋白G1（IgG1）重链和人类κ轻链恒定区而产生的嵌合抗体之一。然而，带有小鼠可变区的嵌合抗体仍可被识别为外来物质，导致可能清除治疗性抗体的人抗嵌合抗体（HACA）免疫反应。这可能限制了嵌合抗体的重复应用并阻碍了它们的临床开发。为了进一步减少不必要的免疫反应，通过1980年代开发的称为“人源化”的过程增加了小鼠单克隆抗体的人类含量。人源化涉及将小鼠抗体的互补决定区（CDR）仅嫁接到人类抗体的框架区域（图1）。曲妥珠单抗是通过将小鼠人类表皮生长因子受体2（HER2）抗体mumAb4D5的CDR移植到人类抗体框架中而开发的首批人源化抗体之一，类似的策略被用于开发奥比妥珠单抗（抗CD20）、帕博利珠单抗（抗程序性细胞死亡蛋白1（PD1））和阿特珠单抗（抗PD1配体1（PDL1））（表1）。 除了小鼠杂交瘤技术外，还开发了兔杂交瘤技术，用于生产针对肿瘤抗原（如间皮素）的兔单克隆抗体。CDR嫁接方法已被调整以人源化兔单克隆抗体，如针对间皮素的YP218，用于临床开发。监管机构批准的大多数治疗性抗体是使用杂交瘤方法生成的，随后工程化成嵌合或人源化形式，并广泛用于癌症治疗（图1）。 2.2 全人抗体 1990年代开发的两种技术使得生成全人抗体成为可能：人类抗体噬菌体展示和表达人类抗体的转基因小鼠模型。为了生成产生人类抗体的转基因小鼠，人类Ig基因座或可变区被插入到小鼠基因组中，同时破坏小鼠Ig基因。从小鼠中分离出免疫目标抗原的B细胞，用于单B细胞克隆和测序。转基因小鼠平台XenoMouse（Abgenix/Amgen）、VelocImmune（Regeneron）和HuMab（Medarex/Bristol Myers Squibb）产生了9种获批的针对癌症靶标的人类抗体：daratumumab（抗CD38）、ipilimumab（抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4））、nivolumab（抗PD1）、ofatumumab（抗CD20）、panitumumab（抗EGFR）、durvalumab（抗PDL1）、cemiplimab（抗PD1）、tisotumab（抗组织因子（TF））和relatlimab（抗淋巴细胞激活基因3（LAG3））（表1）。这些抗体的成功临床开发导致了KyMouse（Kymab）、OmniRat（Ligand）、H2L2 Mouse（Harbour Antibodies）、Trianni Mouse（Trianni Inc/AbCellera）和RenMab（Biocytogen）等多个转基因小鼠平台的快速崛起。 图1 | 抗体组分。a, 抗体由两个相同的轻链和重链组成，它们通过二硫键连接在一起，呈现出Y字形结构。每个轻链和重链都包含一个可变区（VL和VH），负责抗原结合，以及恒定区（CL和CH），决定抗体的半衰期和效应功能。酶促处理可以将抗体分解成两个片段，分别命名为片段抗原结合（Fab）和可结晶片段（Fc）。轻链和重链的可变区共同构成可变片段（Fv），是保留抗原结合能力的最小片段。制造的Fv片段通过柔性肽连接起来，形成一个称为单链可变片段（scFv）的单一链。根据来自每个物种的肽序列量，抗体被分为小鼠、嵌合、人源化和人类抗体。a Belantamab mafodotin 被撤回，但可能会根据正在进行的试验重新获得批准。Teclistamab（一种人源化和人类抗体的组合）在此图中被视为人源化抗体。CDRs，互补决定区。 展示技术为人类抗体开发提供了另一种平台。使用噬菌体展示，可以从多样性超过10^10的大型文库中分离出人类单链可变区（scFv）或片段抗原结合（Fab）片段（图1）。噬菌体展示技术通常使用M13丝状噬菌体来表达与噬菌体pIII外壳蛋白融合的抗体片段，如scFv。噬菌体文库用固定在微孔板或珠子上的目标抗原进行筛选。非特异性噬菌体结合物被洗去，剩余的特异性结合物被收集用于下一轮筛选。通常需要3到5轮筛选来分离特异性结合物。这个过程称为噬菌体淘选，它模仿体外免疫选择。使用下一代测序的新方法有助于快速识别稀有结合物。Dyax生产的噬菌体展示系统产生了三种获得监管批准的全人抗体：ramucirumab（抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2））、necitumumab（抗EGFR）和avelumab（抗PDL1）（表1）。此外，由Dyax、Cambridge Antibody Technology、MorphoSys等产生的多个噬菌体展示衍生的人类抗体目前正在进行临床试验。转基因小鼠和噬菌体展示技术都有其独特的优势。通常，转基因小鼠平台倾向于产生具有更理想生物物理特性和在临床试验中表现更好的抗体，而噬菌体展示允许选择针对特定表位的抗体。除了噬菌体展示，细胞表面展示（酵母、细菌和哺乳动物）、核糖体展示和mRNA展示技术已被用于抗体生成。酵母和哺乳动物细胞表面展示允许在真核细胞的细胞表面表达重组抗体片段。这使得可以通过流式细胞术分离抗原特异性细胞，并发现高亲和力结合物。Sintilimab，一种特异性针对PD1的人类IgG4抗体（表1），是通过酵母细胞表面展示分离的，目前正在接受FDA监管审查以获得批准。 2.3 比较嵌合、人源化和全人抗体 生产嵌合、人源化或全人抗体的目标是减少针对抗体的免疫反应，这种反应带有中和风险和不良反应（例如，输注反应和过敏反应），并随着重复给药而增加。对各种抗体治疗的人类临床试验的大规模分析显示，使用嵌合、人源化和全人抗体时，免疫原性逐渐下降。然而，该研究没有检查较低的免疫原性是否会导致更好的肿瘤消退或患者生存。几种FDA批准和EMA批准的嵌合、人源化和全人抗体针对常见的癌症抗原，如CD20、HER2和EGFR，尽管它们在不同的表位上具有不同的结合特性（表1）。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用；ASPS，肺泡软组织肉瘤；BCC，基底细胞癌；CDC，补体依赖性细胞毒性；dMMR，错配修复缺陷；HCC，肝细胞癌；HNC，头颈癌；IgG，免疫球蛋白G；MCC，默克尔细胞癌；MSI-H，微卫星高度不稳定性；NA，数据不可用；PMBCL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤；RCC，肾细胞癌；SCC，鳞状细胞癌；TNBC，三阴性乳腺癌。 比较针对CD20（利妥昔单抗与奥比妥珠单抗或利妥昔单抗与奥法木单抗）、HER2（曲妥珠单抗与马格图珠单抗）和EGFR（西妥昔单抗与帕尼图珠单抗）的抗体的III期临床试验已经证明，总生存率相似，治疗相关治疗中断的比率也相似，表明具有等效的治疗效力。然而，大量的HAMA免疫反应阻碍了针对二唾液神经节苷GD2的小鼠抗体的开发，并且在使用利妥昔单抗治疗自身免疫性疾病的患者中观察到了强烈的HACA免疫反应。对HACA免疫反应的担忧，加上简化了人源化和全人抗体生成的技术进步，增加了这两种格式的使用。进入当前临床试验的抗体要么是人源化的，要么是全人产品（图1和补充表2），根据以前的试验结果，人源化和全人抗体在患者中倾向于展示相似的治疗效力。 2.4 不同格式的抗体治疗 根据它们的结构和功能机制，抗体治疗可以分为三种主要格式——单特异性抗体、双特异性抗体和与有效载荷（如药物、毒素或放射性同位素）偶联的抗体（图2）。 2.5 单特异性抗体格式 单特异性抗体格式涉及全长免疫球蛋白，它们结合到目标抗原上。在五种免疫球蛋白亚型（IgG、IgM、IgA、IgE和IgD）中，只有IgG能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），从而带来长半衰期（大约21天）。针对癌症的抗体利用IgG亚型来利用这一延长的半衰期，通常每21天给药一次。大多数FDA批准和EMA批准的抗体以及正在开发的抗体都使用单特异性IgG抗体格式（见图1自然发生的IgG抗体的基本结构）。IgG抗体有四个亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4），大多数治疗性抗体使用IgG1亚类。单特异性抗体格式的目标抗原是细胞表面蛋白，主要是在实体癌中过度表达的生长因子受体（例如，在乳腺癌、胃癌和胃食管癌中过度表达的HER2；在结肠癌中过度表达的EGFR；在肺癌中过度表达的MET）。对于血液恶性肿瘤，抗体通常针对由不同免疫细胞亚群表达的细胞表面糖蛋白（也称为簇分化（CD）标记），例如B细胞恶性肿瘤中的CD19和CD20；T细胞恶性肿瘤中的CD52和CC基序趋化因子受体4（CCR4；也称为CD194）；浆细胞恶性肿瘤中的CD38和B细胞成熟抗原（BCMA；也称为TNFRSF17）。目标及其相应的抗体列在表1中。 2.5.1 作用机制 抗体与癌细胞结合通过多种机制导致癌细胞死亡。直接阻断生长因子的生存信号和阻断血管生成导致肿瘤血液供应中断是这些抗体对实体肿瘤消退的两个主要机制。相比之下，血液恶性肿瘤中针对的CD标记通常在促进癌细胞存活方面没有重要作用，尽管一些研究表明针对CD20或CD52的抗体可以诱导非caspase依赖性的程序性细胞死亡。相反，抗体通过招募和激活免疫效应细胞来诱导细胞毒性。每个IgG抗体亚类赋予抗体不同的效应功能。IgG1亚类Fc片段对巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞表达的激活Fcγ受体（FcγRs；FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb）有很强的亲和力。FcγR结合导致巨噬细胞和NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），直接杀死癌细胞（见图2）。最早获得FDA批准的两种抗体是针对恶性B细胞表达的CD20的利妥昔单抗和针对过度表达HER2的乳腺癌细胞的曲妥珠单抗，这两种抗体都使用常见的IgG1亚类。IgG1诱导ADCC和ADCP的能力最终导致癌细胞死亡，并且可以通过Fc工程进一步增强。支持这一作用机制的是，例如携带FcγRIIIa等位基因中纯合子158缬氨酸/缬氨酸的患者对利妥昔单抗和曲妥珠单抗的反应更高。IgG1亚类还结合补体蛋白C1q，导致通过补体依赖性细胞毒性（CDC）的癌细胞死亡。 图2 | 抗体格式和作用机制。a, 根据结构和作用机制，治疗性抗体可以分为三种不同的格式：单特异性抗体、双特异性抗体，以及与药物、毒素或放射性同位素偶联的抗体。b, 单特异性抗体结合癌细胞上的抗原，通过多种机制导致细胞死亡，包括破坏生长因子受体（如人类表皮生长因子受体2（HER2））的生存信号，激活免疫细胞（如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的自然杀伤（NK）细胞介导的杀伤和通过抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的巨噬细胞介导的杀伤），以及通过激活补体级联反应（补体依赖性细胞毒性（CDC））。免疫检查点阻断抗体结合并激活免疫细胞，如T细胞，导致免疫介导的癌细胞死亡。双特异性抗体结合两种不同的抗原。大多数双特异性抗体设计为结合T细胞（T细胞激活剂）和癌细胞，并将T细胞重定向以杀死癌细胞。非T细胞激活的双特异性抗体结合癌细胞表面的两种不同抗原，导致直接杀死癌细胞。抗体-药物偶联物（ADCs）、免疫毒素和放射性同位素偶联抗体携带有毒载荷，增强了抗体杀死癌细胞的能力。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；gp100，糖蛋白100；GPRC5D，G蛋白偶联受体家族C组5成员D；FcγR，Fc γ受体；PD1，程序性细胞死亡蛋白1；PDL1，PD1配体1；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体。 尽管大多数直接介导癌细胞死亡的癌症靶向抗体更倾向于使用IgG1亚类（见表1），但一个例外是帕尼图珠单抗，一种IgG2 EGFR抗体。IgG2抗体只能弱激活NK细胞和补体，而是通过招募髓系细胞来介导癌细胞死亡。目前市场上的单克隆抗体主要是IgG1。除了效应功能外，IgG亚类的选择还基于结构稳定性、循环半衰期、制造经验以及监管批准、缺乏免疫原性或意外副作用，以及公司开发组合中特定IgG亚类的可用性。 研究了曲妥珠单抗的Fab片段与HER2胞外域复合物的结构，为治疗机制提供了首个结构基础。曲妥珠单抗结合HER2的第四个亚域，阻止其同源二聚体形成，进而减少细胞增殖（蛋白质数据银行（PDB）：1N8Z；见图3a）。结构技术的进步促成了首个应用冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的HER2与两种靶向HER2的抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗复合物的结构[61]。与曲妥珠单抗不同，帕妥珠单抗通过与HER2的第二亚域相互作用，抑制HER2与HER3配体诱导的异源二聚体形成，破坏下游信号传导（见图3a）。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合表位相隔约60埃（Å），HER2-曲妥珠单抗-帕妥珠单抗复合物结构指导了双特异性抗体Zanidatamab的设计，该抗体与两种HER2表位相互作用，具有改善的治疗效力。 结构生物学技术也被用来理解利妥昔单抗的治疗机制；具体来说，利妥昔单抗如何促进CD20的聚集。在最初的高分辨率结构中，似乎CD20形成了同源二聚体，利妥昔单抗的Fab片段结合到每个CD20单体的胞外区域（PDB：6VJA；见图3b）。利妥昔单抗两个Fab片段之间的距离表明单一利妥昔单抗IgG分子无法结合CD20同源二聚体。使用全长IgG利妥昔单抗进行的额外电子显微镜研究提供了首个证据，表明利妥昔单抗交联两个CD20同源二聚体，结果形成一个大的超分子复合物，确立了利妥昔单抗的结合机制。 2.5.2 单特异性抗体Fc工程 大多数IgG1抗体的效应功能由Fc域介导。数十年的研究增进了我们对Fc域与不同Fc受体相互作用的理解，并协助工程化具有理想效应功能的抗体。在临床前研究中显示增加活性的常见Fc域修饰包括去岩藻糖基化（从Fc区域去除岩藻糖以增加FcγRIIIa结合）或关键残基的氨基酸替代（例如S239D和I332E，增加与Fc受体的结合），两者都导致增强的ADCC和ADCP。两种在临床使用的抗体具有去岩藻糖基化的Fc（靶向CD20的奥比妥珠单抗和靶向CCR4的莫加木单抗）以增强它们的免疫效应功能（见表1）。随机临床试验（GALLIUM和GOYA研究）评估了利妥昔单抗（未经Fc修饰的CD20抗体）或奥比妥珠单抗（Fc去岩藻糖基化的CD20抗体）在不同淋巴瘤亚型中的益处。在GOYA研究中，两组患者的结果相似。GALLIUM研究显示接受奥比妥珠单抗治疗的患者有更好的无进展生存期（PFS），但未能证明总体生存益处，这是肿瘤学中的重要基准。此外，GALLIUM研究也因使用比利妥昔单抗更高剂量的奥比妥珠单抗而受到批评，这可能混淆了PFS结果。两种在Fc域具有氨基酸替代以增加ADCC的抗体已获得FDA批准：HER2抗体Margetuximab和CD19抗体Tafasitamab（见表1）。III期试验比较了Margetuximab与曲妥珠单抗（Fc未经修饰的HER2抗体）在乳腺癌患者中的疗效。尽管早期分析显示Margetuximab减少了癌症进展，但最终分析中两组的总体生存率相同。基于这些临床试验结果，Fc工程化抗体治疗癌症患者的益处仍然不清楚。 2.5.3 免疫检查点抑制剂 在过去十年中，另一组靶向免疫细胞调节检查点的单特异性抗体对癌症患者显示出显著的临床疗效。目前11种FDA批准和EMA批准的免疫检查点抑制抗体现在被用于治疗20多种不同类型的癌症，包括肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌（见图4a,b），预计近期将有更多的这些抑制性抗体获得批准（见表1）。免疫检查点抑制剂在大多数癌症类型中显示出20-30%的响应率。然而，某些恶性肿瘤如霍奇金淋巴瘤和皮肤癌、微卫星高度不稳定性（MSI-H）癌症、PDL1表达升高的癌症、突变负担高（每兆碱基≥10个突变），以及与病毒相关的一些癌症的响应率显著更高。 2.5.4 作用机制 免疫检查点阻断抗体抑制了对T细胞起负向调节作用的途径，从而重新激活细胞毒性T细胞以杀死癌细胞（见图2）。在临床试验中正在研究的20多个免疫检查点中，治疗性抗体已经获得FDA或EMA批准的三个蛋白或途径是CTLA4、PD1-PDL1和LAG3。免疫检查点抑制剂的作用机制已在其他综述文章中广泛讨论，因此这里只简要提及。CTLA4、PD1和LAG3的表达是在T细胞刺激后诱导的，其主要目的是限制T细胞激活的程度。PD1与其配体PDL1和PDL2相互作用，这在癌细胞表面经常过度表达。PD1与其配体的结合导致招募酪氨酸磷酸酶，该磷酸酶去磷酸化T细胞受体（TCR）下游的信号分子。这阻止了TCR介导的T细胞增殖（信号1），并减弱了T细胞对癌细胞的响应，使肿瘤能够逃避免疫系统。CTLA4与T细胞共刺激受体CD28竞争结合抗原呈递细胞（APCs）上的CD80和CD86。CTLA4与这些配体的结合阻止了CD28共受体信号传导（信号2），从而抑制T细胞激活并损害对癌症的免疫反应。同样，当LAG3与主要组织相容性复合体（MHC）II类分子或纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）结合时，LAG3表达对T细胞和NK细胞功能的负向调节作用。破坏这些相互作用的抗体通过降低激活阈值允许增强的T细胞激活，使耗尽的T细胞“重新激活”，并将新的T细胞克隆招募到肿瘤中。免疫检查点抑制剂也可能对调节性T细胞（Treg细胞）有不同的影响，这是一群在肿瘤微环境中抑制免疫活动的T细胞亚群。一些使用小鼠模型和人类体外模型的研究表明，PD1和CTLA4阻断可以选择性地耗尽Treg细胞并增强抗肿瘤免疫。然而，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中并未观察到这种Treg细胞耗竭，因此，与Treg细胞失活相比，细胞毒性T细胞的压倒性重新激活可能是推动免疫检查点抑制剂介导的肿瘤回归。 图3 | 抗体-抗原相互作用的结构基础。a, 针对人表皮生长因子受体2 (HER2) 的抗体结合不同的HER2表位。冷冻电镜 (cryo-EM) 结构显示了与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的片段抗原结合 (Fab) 域结合的HER2胞外域 (ECD)（PDB ID: 8Q6J）。b, CD20同源二聚体与两个利妥昔单抗Fab域复合物的冷冻电镜结构（PDB ID: 6VJA）显示每个CD20分子与一个利妥昔单抗Fab结合。利妥昔单抗通过交联CD20二聚体形成大的超分子复合物来促进CD20的聚集。c, 针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD1) 的抗体结合不同的PD1表位。Pembrolizumab Fab（橙色和金色；PDB ID: 5GGS）和Nivolumab Fab（洋红色和粉色；PDB ID: 5GGR）与PD1配体1 (PDL1)（白色）在PD1（青绿色）上的结合位点重叠，阻止了PD1-PDL1相互作用。所有蛋白质分子都显示了表面表示。d, PD1-PDL2（PDB ID: 6UMT）和PDL1抗体Atezolizumab（PDB ID: 5XXY）结构的对齐。结构分析表明，PDL2的残基Trp100适合PD1内部的口袋并有助于PD1-PDL2结合。PDL2中同样的残基（Trp100）扰乱了Atezolizumab与PDL2的结合。e, Ipilimumab（PDB ID: 5TRU）和Tremelimumab（PDB ID: 5GGV）Fab域与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)的复合物结构显示出具有大的埋藏表面积的类似结合表位，有效地竞争天然配体CD80和CD86的结合。f, p53(R175H)多肽-主要组织相容性复合物 (MHC) 结合抗体平行于MHC分子内部的肽结合槽结合（PDB ID: 6W51）。相比之下，p53(R175H)特异性T细胞受体 (TCR) 垂直于肽结合槽结合（PDB ID: 6VQO）。 PD1阻断抗体是目前使用最广泛的免疫检查点抑制剂。七种获批的PD1阻断抗体（nivolumab、pembrolizumab、cemiplimab、dostarlimab、retifanlimab、tislelizumab和toripalimab）和两种目前正在临床试验中的抗体（见表1）使用IgG4格式，该格式不能有效地激活补体级联反应，并且与IgG1亚型相比具有较弱的Fc受体结合。因此，IgG4格式可能保护表达PD1的效应T细胞不被意外地通过ADCC或CDC杀死。针对LAG3的抗体relatlimab也使用类似的IgG4格式。所有IgG4抗体都带有S228P突变以防止Fab臂交换（见表1）。在获批的PD1抗体中，只有pembrolizumab的全长结构已被确定。该结构揭示了Fc域内CH2域旋转，完全暴露了糖蛋白。与其他报道的Fc域结构相比，这种CH2域构象是这些IgG亚类的分子灵活性的新描述，并且可以进一步研究以了解这种构象如何有助于较弱的Fc受体结合。相比之下，PDL1和CTLA4阻断抗体使用IgG1格式。尽管atezolizumab和durvalumab使用修饰过的Fc域限制了FcR介导的效应功能，avelumab和ipilimumab使用未修饰的Fc域保留了CDC和ADCC活性。尽管在临床试验中没有PD1和PDL1阻断抗体的直接比较以确定它们的效力，但对PD1途径阻断抗体的临床试验的荟萃分析得出结论，PD1抗体比PDL1抗体略为有效，可能是因为PD1抗体阻断了PD1与PDL1和PDL2的相互作用。值得注意的是，使用具有功能性Fc区域的IgG1格式的avelumab在肺癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌患者中未能表现出益处，尽管其他免疫检查点抑制剂在这些相同癌症类型的患者中表现出成功。因此，使用IgG1格式及其介导效应T细胞杀伤的潜力可能导致其次优的试验结果。 已经确定了本文描述的几种免疫检查点抑制剂抗体与其目标蛋白复合物的结构基础。这些结构揭示了表位界面的多样性、复合物的埋藏表面积以及抗体结合后目标蛋白的构象变化。两种PD1阻断抗体，pembrolizumab（PDB ID：5GGS）和nivolumab（PDB ID：5GGR），尽管每种抗体与PDL1配体结合位点广泛重叠，但它们在不同的表位结合PD1（见图3c）。PDL1靶向抗体（atezolizumab、durvalumab、avelumab）与PDL1和PDL2复合物的晶体结构鉴定了一个关键残基PDL2（Trp100），它阻碍了抗PDL1抗体与PDL2的结合，并提供了PDL1和PDL2之间选择性的机制[92,95,96]（PDB ID：5XXY）（见图3d）。PDL1中相应的残基是丙氨酸，允许PDL1与atezolizumab结合。与PD1结合抗体相比，两种CTLA4靶向抗体，ipilimumab（PDB ID：5XJ3）和tremelimumab（PDB ID：5GGV），共享类似的结合表位，有效地与天然配体CD80和CD86竞争（见图3e）。与CD86相比，抗体与CTLA4复合物更大的埋藏表面积（约600 Ų）有助于这种作用机制。 2.5.5 免疫检查点抑制剂的毒性 免疫检查点阻断抗体通过普遍的免疫激活介导癌细胞的死亡，但有时这种激活可能会错误地针对健康组织。免疫检查点抑制抗体具有非常明显的不良反应谱，被称为免疫相关不良事件（irAEs）。这些irAEs包括各种表现，如皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌、肺和心脏事件。尽管不常见，但严重的甚至可能致命的毒性偶尔可能会由于免疫检查点抑制而产生。在许多情况下，需要暂时使用糖皮质激素、肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂、麦考酚酸莫非尔或其他免疫调节剂进行免疫抑制以管理irAEs。 2.6 双特异性抗体格式 第二种格式包括多样化的双特异性抗体类别。与单特异性抗体不同，双特异性抗体结合两种不同的抗原或表位。这些抗原可以位于相同的目标细胞上，也可以位于不同的细胞上。针对两种不同细胞的双特异性抗体主要是T细胞激活剂，将癌细胞与效应T细胞交联；因此，它们被称为T细胞激活剂（TCE）双特异性抗体。在交联后，效应T细胞被激活，通过释放细胞毒性颗粒和淋巴因子来杀死结合的目标癌细胞（见图2）。另一类双特异性抗体作用于同一目标细胞表达的不同抗原，如两种不同的生长因子受体。这样的双特异性抗体通过阻断目标生长因子受体的增殖信号，并通过激活NK细胞和巨噬细胞对抗癌细胞来杀死目标细胞。 2.6.1 双特异性T细胞激活剂 2014年Blinatumomab的监管批准导致这种基于抗体治疗的类别爆炸性增长。原型TCE双特异性Blinatumomab是一种小型54-kDa融合蛋白，大约是IgG抗体的三分之一大小（见表2）。Blinatumomab由双特异性抗体所需的最小元素组成；一个针对癌症的scFv（抗CD19）通过甘氨酸-丝氨酸肽连接与一个T细胞结合scFv（抗CD3）连接。Blinatumomab通过抗CD19 scFv结合B细胞，并同时通过抗CD3 scFv连接并激活T细胞，导致B细胞死亡（见图2）。Blinatumomab在一系列B细胞恶性肿瘤中显示出活性（见图4c,d），并获得批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。随后获得监管批准的TCE双特异性抗体采用了Blinatumomab的基本设计（见图5a）。 图4 | 使用免疫检查点抑制剂或双特异性抗体重新激活或重新定向T细胞对癌细胞的治疗效果。a,b, 来自一位患有头颈鳞状细胞癌（HNSCC）并涉及左侧舌边缘的个体的氟脱氧葡萄糖（FDG）-正电子发射断层扫描（PET）图像（a）和用苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤切片（b）。该患者接受了免疫检查点抑制剂nivolumab和ipilimumab的治疗，并经历了肿瘤负担的大幅减少。治疗中的H&E切片显示角蛋白碎片（KD）和周围的多核巨细胞（箭头）以及治疗中的FDG-PET图像显示舌边缘FDG摄取的减少。c, 一位患有B细胞淋巴瘤的患者的CT扫描，在治疗前和接受靶向CD19的双特异性抗体T细胞激活剂blinatumomab治疗4周后。该患者对blinatumomab有部分反应。箭头指向纵隔中受累的淋巴结肿瘤。d, 另一位患有B细胞淋巴瘤的患者的骨髓活检样本，在治疗前和接受blinatumomab治疗15天后。肿瘤细胞以蓝色显示（苏木精染色），T细胞以棕色显示（CD3染色）。部分a和b改编自，Springer Nature。部分c和d经，AAAS许可转载。 制药公司经常为使用不同架构和组装双特异性抗体的方法的独特TCE格式注册商标。常见的格式包括双特异性T细胞激活剂（BiTE）（Amgen）、Duobody（Genmab）、DART（MacroGenics）和Xmab（Xencor），Blinatumomab使用BiTE格式。Tebentafusp是一种独特的TCE双特异性格式，名为ImmTAC，它将针对黑色素瘤细胞中表达的糖蛋白-100（gp100）-人类白细胞抗原（HLA）-A02复合物的亲和增强型TCR与抗CD3 scFv连接。Tebentafusp在转移性葡萄膜黑色素瘤患者中显示出优越的总生存率，导致其在2022年获得批准。在过去的2年中，有六种针对血液恶性肿瘤的新型双特异性抗体获得了监管批准。这些包括teclistamab和elranatamab（BCMAxCD3），以及talquetamab（G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）xCD3）用于多发性骨髓瘤，以及mosunetuzumab、epcoritamab和glofitamab（CD20xCD3）用于B细胞淋巴瘤（见表2）。然而，TCE双特异性抗体在实体瘤中的批准落后。然而，针对实体恶性肿瘤的TCE双特异性抗体的临床试验激增，让人们看到了这一策略将增加其效用的广度的希望。最近有关针对小细胞肺癌中delta样蛋白3（DLL3）的TCE双特异性抗体的I期试验的积极报告令人鼓舞，并表明实体瘤障碍将被突破。 2.6.2 双特异性抗体靶向同一细胞上的不同抗原 双特异性抗体也被设计为结合目标癌细胞上的两种不同的抗原或表位，而无需与效应T细胞结合。它们的抗癌效果是通过阻断两条增殖信号通路来介导的，从而最大化了抗肿瘤活性。除了它们的受体阻断活性外，这些双特异性抗体还可能被设计为包含一个功能性的IgG1 Fc域，使它们能够通过非T细胞的免疫效应途径如ADCC、ADCP和CDC杀死癌细胞。Amivantamab是首个靶向癌细胞表达的EGFR和MET（表2）的受体阻断双特异性抗体，并获得监管批准用于治疗带有外显子20插入突变的非小细胞肺癌。Amivantamab阻断了EGFR和MET通路的信号传导，这些通路驱动了一部分肺癌，比单一受体结合抗体的组合更有效。此外，Amivantamab的IgG1 Fc域被设计为低岩藻糖水平，这增强了FcγRIIIa的结合和NK细胞介导的ADCC。Zanidatamab采用了类似的双特异性设计，它用每个Fab臂结合两种不同的HER2表位（表2）。这些臂针对HER2的第二个和第四个亚域，分别是已批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的HER2靶向抗体帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的结合位点。临床前研究表明，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，Zanidatamab增强了HER2聚集、受体下调，并增加了CDC介导的HER2阳性癌细胞的杀伤。在I期临床试验中，Zanidatamab对一系列HER2阳性实体瘤显示出令人鼓舞的活性。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；CRS，细胞因子释放综合征；Ig，免疫球蛋白；irAEs，免疫相关不良事件；IV，静脉注射；kDa，千道尔顿；scFv，单链可变片段；TLS，肿瘤溶解综合征。带有Fc的双特异性抗体还带有Fc突变，这些突变使得异源重链能够配对（未显示）。 2.6.3 双特异性抗体Fc工程 Blinatumomab的血清半衰期很短，大约为2小时，因为这种小多肽可以快速被肾脏清除，并且缺乏FcRn介导的循环所需的Fc域。由于其半衰期短，Blinatumomab通过连续静脉输注给药，以维持一致的血清浓度。连续输注装置需要额外的医疗资源，增加成本，并且与间歇输注相比，对患者来说不够方便。在Blinatumomab之后获得监管批准的双特异性抗体具有更高的分子量，大多数包含一个延长半衰期的Fc域（见表2）。具体来说，Tebentafusp的分子量约为75kDa，高于肾脏滤过的截止值，因此不会被肾脏快速清除。然而，Tebentafusp缺乏Fc域，因此具有相对较短的半衰期为7.5小时。Mosunetuzumab、Teclistamab、Epcoritamab、Glofitamab和Elranatamab包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域（见表2），这增加了它们的分子量超过Tebentafusp（约145kDa），并使FcRn能够结合。这些修改延长了血清半衰期，并允许间歇（每周）剂量。添加这样的Fc域倾向于被包括在所有即将到来的双特异性抗体设计中。由于IgG1 Fc片段对巨噬细胞和NK细胞上的Fcγ受体有很强的亲和力，带有IgG1 Fc片段的TCE双特异性抗体可能通过抗CD3 scFv与巨噬细胞或NK细胞（通过IgG1 Fc片段）交联，导致巨噬细胞或NK细胞无意中杀死T细胞，反之亦然。已经在Fc域引入了氨基酸替代（例如，在Mosunetuzumab中的N297G或在Glofitamab中的P329G、L234A和L235A）以消除FcγR结合并减少无意中的免疫细胞杀伤（见表2）。使用IgG2或IgG4 Fc域的TCE双特异性抗体可能不需要这样的Fc域沉默，因为它们与FcγRs的相互作用较弱。 2.6.4 双特异性抗体的毒性 TCE双特异性抗体由于使用相同的抗癌机制——通过T细胞激活来杀死目标细胞（表2），因此具有类似的不良反应。毒性水平与携带TCE双特异性抗体靶标的细胞（肿瘤或正常细胞）的总身体负担有关。TCE双特异性抗体可诱导全身性炎症，特征为发热、不同程度的缺氧、低血压，偶尔多器官衰竭，统称为细胞因子释放综合征（CRS）。神经毒性是与TCE双特异性抗体相关的另一种独特的不良反应，表现为意识混乱和震颤，以及言语和行为的改变。CRS和神经毒性的病理生理学尚不完全清楚，可能与干扰素γ（IFNγ）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1和IL-10等细胞因子水平升高有关。接受TCE双特异性抗体治疗的患者需要密切监测，可能需要使用糖皮质激素或抗细胞因子药物如IL-6中和抗体tocilizumab进行免疫抑制。此外，为预防或减少CRS和神经毒性，已实施了几种策略，包括逐渐增加TCE双特异性抗体剂量、预防性糖皮质激素，以及在开始TCE双特异性抗体治疗前使用化疗减少肿瘤负担。受体阻断双特异性抗体无法激活T细胞，因此不会引起TCE双特异性抗体通常观察到的CRS或神经毒性。受体阻断双特异性抗体的不良反应与它们的单特异性抗体类似，如amivantamab引起的皮疹（也见于靶向EGFR的抗体cetuximab和panitumumab）和zanidatamab引起的心力衰竭（也见于靶向HER2的抗体trastuzumab）（表2）。 图5 | 双特异性抗体和偶联抗体的发展时间线。a, 双特异性抗体的时间线。b, 药物偶联、免疫毒素偶联和放射性同位素偶联抗体的时间线。a Catumaxomab，一种上皮细胞黏附分子(EpCAM)xCD3双特异性抗体，于2009年获得欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗恶性腹水，但后来因商业原因被制造商撤回。ADC, 抗体-药物偶联物；ALL, 急性淋巴细胞性白血病；B-ALL, B细胞前体急性淋巴细胞性白血病；BCMA, B细胞成熟抗原；AML, 急性髓系白血病；CEA, 癌胚抗原；EGFR, 表皮生长因子受体；FDA, 美国食品药品监督管理局；gp100, 糖蛋白100；HCL, 毛细胞白血病；MRD, 最小残留病；NHL, 非霍奇金淋巴瘤；NSCLC, 非小细胞肺癌；OS, 总生存期；PFS, 无进展生存期；TCR, T细胞受体。 2.7 偶联抗体格式 第三种主要格式涉及与有毒载荷连接的抗体，如细胞毒素（抗体-药物偶联物（ADCs））、细菌或植物毒素（免疫毒素）或放射性同位素，这增强了抗体杀死癌细胞的能力。在这一组中，ADCs迄今为止是最广泛使用的形式，而毒素偶联和放射性同位素偶联抗体尚未得到广泛采用（见图5b）。 2.7.1 抗体-药物偶联物 ADCs是通过将肿瘤靶向抗体与细胞毒素连接而构建的（见图2）。ADC分子与细胞表面抗原的结合导致它们的内化，随后在细胞内释放细胞毒素。这允许选择性地将细胞毒素输送到癌细胞，同时保留大部分健康组织。ADC的关键组成部分包括肿瘤靶向抗体、细胞毒素和连接抗体与细胞毒素的连接子（表3）。ADC的成功取决于这些关键组成部分的最佳选择，以及用于将连接子连接到抗体的偶联方法，这通常决定了药物-抗体比率（DAR）。 大多数ADC使用人源化或人类IgG1作为肿瘤靶向抗体（除了brentuximab使用嵌合IgG1，以及gemtuzumab和inotuzumab使用人源化IgG4）。如上所述，使用IgG1的普及是由于其长的血浆半衰期约为21天（例如，与IgG3的半衰期为7天相比），以及其能够结合Fc受体，通过ADCC和ADCP增强靶细胞的杀伤（例如，与在ADCC和ADCP中效率较低的IgG2和IgG4相比）。两种ADC，gemtuzumab和inotuzumab，使用IgG4，其对FcγRII和FcγRIII的亲和力较低，从而限制了ADCP，同时可能由于减少了ADC通过Fc受体进入免疫细胞的非特异性吸收，而减少了毒性。 大多数连接子将细胞毒素连接到IgG1抗体主链上的随机赖氨酸或半胱氨酸残基上。一个有效的连接子在血液中最小化细胞毒素的早期释放，同时促进在首选目标位置的活性药物的控制释放。连接子通常被分类为可裂解和不可裂解。十二种获批的ADC中有十种使用可裂解连接子，如肽连接子、腙连接子、二硫键连接子或CL2A连接子（表3）。最早开发的用于药物附着的连接子之一是使用腙键的可裂解连接子。这种连接子用于将抗肿瘤抗生素calicheamicin连接到gemtuzumab和inotuzumab ADCs。腙键设计为在靶细胞溶酶体内部的酸性条件下分解，以释放calicheamicin。然而，腙键可能在血浆中发生水解，导致药物分子的非预期释放，从而引起系统毒性。第二种可裂解连接子是肽连接子，需要在溶酶体内部通过cathepsin B选择性裂解。四种ADC使用mc-VC-PABC二肽连接子，由Seagen首次开发用于生成使用CD30靶向抗体连接到微管抑制剂单甲基auristatin E (MMAE)的ADC brentuximab（表3）。Brentuximab与化疗结合在几种不同类型的淋巴瘤患者中显示出显著的疗效，并被认为是霍奇金淋巴瘤和CD30+外周T细胞淋巴瘤的一线治疗标准。Brentuximab的成功导致了mc-VC-PABC二肽连接子的广泛采用。Seagen与Roche、Astellas和Genmab合作，分别使用mc-VC-PABC二肽连接子开发了靶向CD79B、nectin-4和TF的ADC。第三种可裂解连接子是二硫键连接子，其中连接子裂解是通过细胞内部高浓度的谷胱甘肽介导的。带有二硫键连接子的ADC包括mirvetuximab，在卵巢癌患者的III期临床试验中显示了生存益处。与可裂解连接子相比，不可裂解连接子对各种分解机制都有抵抗力。有效载荷在靶细胞的溶酶体内降解抗体后释放。两种ADC，trastuzumab emtansine和belantamab mafodotin使用不可裂解连接子进行药物附着。临床前研究表明，由于不可裂解连接子的血浆稳定性增加，对非靶细胞的毒性较低。然而，可裂解和不可裂解连接子尚未在临床试验中直接比较，一个比另一个的优势仍然不清楚。 肿瘤细胞杀伤过程由附着在肿瘤靶向抗体上的细胞毒素执行。药物通常是一种具有高细胞杀伤效力的小分子（半数最大抑制浓度（IC50）≤5纳摩尔），通过三种机制之一诱导细胞死亡——直接DNA损伤、破坏微管网络或抑制拓扑异构酶活性（表3）。目前使用的药物IC50差异很大，从5纳摩尔（Dxd，一种拓扑异构酶抑制剂）到5皮摩尔（pyrrolobenzodiazepines (PBDs)，一类DNA损伤剂）。然而，ADC的效力取决于药物的IC50和DAR。因此，带有强效PBD载荷和相对较低DAR约2.3的loncastuximab tesirine，以及带有效力较低的载荷Dxd但相对较高DAR约8.0的trastuzumab deruxtecan，都能在几种体内模型中诱导完全的肿瘤回归。在临床试验中也观察到了带有高DAR的ADC结合新型连接子设计的益处。Trastuzumab emtansine和trastuzumab deruxtecan共享相同的HER2靶向抗体。然而，尽管trastuzumab emtansine携带微管抑制剂DM1（IC50为2纳摩尔，DAR 3.5）通过不可裂解连接子结合，trastuzumab deruxtecan使用药物Dxd（IC50为5纳摩尔，DAR 8.0）与可裂解连接子结合。在比较两种ADC的III期临床试验中，trastuzumab deruxtecan显示出更高的反应率（79.7%对34.2%）和总生存率（94.1%对85.9%，在12个月时）。此外，trastuzumab deruxtecan延长了表达低水平HER2的乳腺癌患者的生存期，使其成为第一种在HER2低表达乳腺癌中有效的ADC。最近，fam-trastuzumab deruxtecan在一系列高HER2表达的实体瘤中显示了肿瘤回归，并获得了FDA对肿瘤不可知论HER2导向治疗的首次批准。 2.7.2 ADCs 的毒性 ADCs被认为是靶向药物，比传统的细胞毒素化疗药物有更好的耐受性。然而，大多数患者在使用ADCs时会经历某种形式的毒性。大多数ADCs共有的毒性包括输液反应、细胞减少症、感染、肝酶升高、胃肠道症状（腹泻、呕吐和便秘）和胚胎-胎儿毒性（表3）。 DM1和DM4是美登素1的衍生物。DXd是Exatecan的衍生物，用于ADC。SN38是伊立替康的活性代谢产物。ADC，抗体-药物偶联物；ALL，急性淋巴细胞性白血病；AML，急性髓系白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；DAR，药物-抗体比率；FRα，叶酸受体α；GSK，葛兰素史克；HER2，人表皮生长因子受体2；mc，马来酰亚胺己酰；mc-VC-PABC，马来酰亚胺己酰-缬氨酸-对氨基苄氧羰基；MMAE，单甲基奥瑞他汀E；MMAF，单甲基奥瑞他汀F；PBD，吡咯并苯并二氮杂环；PTCL，外周T细胞淋巴瘤；SMCC，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸酯；TF，组织因子；TNBC，三阴性乳腺癌。 a 2023年，FDA撤销了belantamab mafodotin的生物制品许可，EMA建议不更新其市场授权，因为确证性DREAMM-3试验未能证明无进展生存期的改善。正在进行的试验表明，belantamab可能会重新获得批准。b Trastuzumab deruxtecan获得FDA批准用于HER2低表达乳腺癌（免疫组织化学评分1+）和所有高HER2表达的实体瘤（免疫组织化学评分3+）。 某些毒性与使用特定有效载荷有关，例如与微管抑制剂（MMAE、DM1、DM4）相关的周围神经病变和与calicheamicin相关的肝毒性。其他毒性是针对共同抗原的ADCs共有的。例如，靶向HER2的ADCs可能导致心力衰竭和介导间质性肺病。 2.7.3 免疫毒素偶联物或免疫毒素 免疫毒素有两个组成部分，一个靶向抗体或抗体的Fv片段，以及通常来自细菌或植物毒素的细胞毒素。靶向抗体或Fv片段结合到目标细胞，允许选择性地输送毒素。毒素来自细菌，如假单胞菌外毒素A（PE）和白喉毒素（DT），或来自植物，如蓖麻毒素。从理论上讲，任何用于生成ADC的靶向抗体都可以用于免疫毒素。然而，尽管在过去几年中有12种ADC获得批准，只有一种免疫毒素，moxetumomab pasudotox，获得了FDA和EMA的批准，用于治疗毛细胞白血病（图2和5b）。Moxetumomab是一种融合蛋白，结合了CD22结合Fv与截断的假单胞菌外毒素A（PE38），由国家癌症研究所（NCI）的I. Pastan开发。当进入目标细胞时，PE38毒素与延伸因子2（EF2）结合并阻断蛋白质合成。Moxetumomab在毛细胞白血病患者的临床试验中展示了41%的高完全反应率，并在2018年获得监管批准。然而，由于临床采用率低，moxetumomab的生产在2023年停止。Moxetuzumab和其他研究性免疫毒素面临了几个挑战，包括高免疫原性导致治疗效力丧失和狭窄的治疗窗口导致毒性，如毛细血管渗漏综合征（CLS）和溶血性尿毒症综合征（HUS）。Moxetumomab的低采用率也可能是由于其复杂的管理过程，包括毒性预防、预处理和后处理水化、需要安全监测以避免不良反应以及在毛细胞白血病中有替代疗法的可用性。尽管过去几年的几项临床试验已经评估了靶向BCMA、间皮素和其他与癌症相关的抗原的免疫毒素的疗效，但目前没有一种正在进行监管审查，也没有预计将在不久的将来获得批准。 2.7.4 抗体-放射性同位素偶联物 抗体-放射性同位素偶联物由一个靶向抗体与一个放射性同位素链接而成。放射性同位素发射α粒子或β粒子，导致目标细胞DNA链断裂，从而导致细胞死亡。抗体-放射性同位素偶联物不需要内化就能诱导细胞死亡，这提供了与ADCs和免疫毒素相比的独特优势，包括旁观者效应。α粒子是大型带正电荷的粒子，由两个质子和两个中子组成，具有相对短的有效范围约为50-100微米。相比之下，β粒子是小型带负电荷的电子（比α粒子小约8000倍），具有较长的有效范围约为0.5-10毫米，但具有较少的DNA损伤能量。β粒子发射体的例子包括碘-131、镥-177和钇-90。两种获得FDA批准和/或EMA批准的抗体-放射性同位素偶联物，90Y-ibritumomab和131I-tositumomab，将β粒子发射放射性核素连接到靶向CD20的抗体上（图2和5b），用于治疗B细胞淋巴瘤。90Y-ibritumomab和131I-tositumomab在临床试验中展示了65-80%的总反应率和20-30%的完全反应率。两项研究都观察到了一些可预测的治疗相关不良效果，包括由于健康骨髓暴露于辐射而导致的长期严重细胞减少症，131I-tositumomab的放射性碘引起的甲状腺功能减退症，以及继发性恶性肿瘤，如骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病。尽管有高反应率，这些药物并未得到广泛的临床使用，2012年只有75名患者接受了131I-tositumomab治疗。因此，131I-tositumomab在2013年自愿撤回。90Y-ibritumomab仍然适用于复发或难治性低级别B细胞淋巴瘤患者，但报告表明只有少数患者正在接受这种治疗。批准数量有限和临床采用率低可能是因为需要一个多学科团队，包括医学肿瘤学家、放射肿瘤学家、药理学家和物理学家，来开发并在临床上部署这些分子。很少有中心具备这样的能力，因此，抗体-放射性同位素偶联物的使用落后于ADCs。 3. 挑战与未来展望 肿瘤药物开发是一个艰难的过程，成功率为3-7%。目前尚缺乏针对肿瘤学中抗体基础治疗的成功率数据，但大约18%进入I期临床试验的治疗性抗体（包括肿瘤学在内的所有适应症）会继续进行药物上市146。这些低数字反映了药物开发过程中遇到的众多障碍。治疗性抗体的开发是一个资源密集型的多步骤操作。它需要针对目标抗原生成一定数量的抗体，然后选择几个具有理想结合和生物物理特性的领先候选物。然后，领先的抗体会在体内使用小鼠模型进行有效性测试，使用非人灵长类动物进行毒性和药代动力学测试，随后进行人体首次临床试验。尽管在小鼠模型中显示出有希望的有效性，但多种抗体由于在非人灵长类动物或人体首次临床试验中的毒性而未能通过临床开发。尽管存在这些障碍，但以下描述的几种抗体显示出令人鼓舞的临床前和临床数据，可能会在未来几年改变患者护理。 3.1 新靶点  实体瘤构成了新癌症患者的大多数。与实体瘤相关的患者中有相当一部分以转移性疾病出现，需要系统性治疗，这种治疗很少是治愈性的。因此，转移性肺、结肠、胰腺、乳腺、前列腺、肝脏和胆管癌共同导致了大多数癌症死亡（见图6）。然而，与血液恶性肿瘤相比，实体瘤的抗体开发滞后主要是因为缺乏可靶向的抗原。不同的淋巴瘤亚型约占所有癌症死亡的3%，并且有五种肿瘤抗原（CD19、CD20、CD79b、CD30、CCR4和PD1）被治疗性抗体靶向。相比之下，约占癌症死亡21%的肺癌只有一个可靶向的肿瘤抗原（EGFR-MET）。此外，约占癌症死亡8%的胰腺癌、6%的前列腺癌和3%的脑癌完全没有FDA批准和/或EMA批准的治疗性抗体。这种差异很大程度上是因为淋巴瘤和骨髓瘤起源于正常的B细胞，这些细胞表达明显的可靶向抗原（见图6）。此外，正常的B细胞可以在不产生不可忍受的后果的情况下被根除。不幸的是，在实体瘤中，目标抗原的发现很少带来线索。因此，新的靶点鉴定可能需要涉及对大量患者样本进行单细胞测序，以寻找在癌症和正常组织中差异表达的抗原。 图6 | 常见实体瘤和血液瘤的抗体靶点。这些图表显示了美国前15位癌症类型的死亡百分比与批准的抗体及晚期临床试验中的抗体所靶向的独特抗原数量。抗原靶点在每种癌症组织旁边展示。注意，非小细胞和 小细胞肺癌被归类在“肺”下；霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和中枢神经系统（CNS）淋巴瘤被归类在“淋巴瘤”下；急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和其他白血病被归类在“白血病”下。不论组织类型，微卫星高度不稳定（MSI-H）癌症都有资格接受免疫检查点抑制剂治疗，HER2阳性实体瘤有资格接受HER2导向治疗的trastuzumab deruxtecan，并未包括在分析中。镥Lu177 vipivotide tetraxetan用于前列腺癌的治疗没有被包括在内，因为靶向部分不是抗体。癌症死亡百分比和批准的靶点数量的数据分别来自 https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2023-cancer-facts-figures.html 和抗体协会。a 程序性细胞死亡蛋白1（PD1）治疗仅在霍奇金淋巴瘤中获批。b B7-H3被认为是肿瘤相关抗原，可能是免疫检查点抗原。 此外，最近针对claudins、HER3、成纤维细胞生长因子受体2B (FGFR2B)、DLL3、结缔组织生长因子（CTGF，亦称CCN2）和前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)的临床试验显示出令人鼓舞的结果。目前正在II/III期临床试验中的抗体靶点列在图6和补充表2中。最后，一种创新的方法来绕过缺乏肿瘤特异性抗原是通过多种抗原的组合靶向。大多数癌症缺乏在健康组织中不存在的真正特异性抗原的表达。因此，靶向只在肿瘤中共同表达而不在健康组织中表达的抗原组合，可能提供一条可行的治疗途径。利用布尔逻辑AND门的临床前研究，需要两个或三个目标激活细胞毒性机制，已经展示了肿瘤回归，但它们尚未在临床试验中得到测试。 一些细胞表面蛋白聚糖，如软骨素和肝素，是癌症和其他人类疾病中信号通路的重要调节因子。软骨素蛋白聚糖已被证明促进肿瘤血管化，并调节与肿瘤生长相关的信号传导途径，它们在多种癌症类型中表达。糖磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定的细胞表面HSPGs，如glypicans，在癌症中过度表达，表明它们是潜在的肿瘤相关抗原。已经开发了针对GPC1、GPC2和GPC3的抗体和CAR T细胞，分别用于治疗胰腺癌、神经母细胞瘤和肝癌。 3.1.1 肿瘤特异性抗原 大多数目前批准的基于抗体的治疗针对肿瘤相关抗原或组织特异性抗原。肿瘤相关抗原，如HER2，在癌细胞中过度表达，但也由正常组织的一个亚群表达，尽管表达水平较低。癌症和正常组织之间表达水平的差异提供了治疗窗口。组织特异性抗原，如CD20，在癌细胞（B细胞淋巴瘤）和正常细胞（B细胞）中表达水平相似。针对这类组织特异性抗原的治疗旨在同时消除正常细胞和癌细胞，因为正常B细胞的耗尽可能在临床上是可以接受的。针对B细胞谱系癌症的CD19、CD20、CD38和BCMA的治疗代表了组织特异性治疗性抗体最成功的例子。对于起源于较少可有可无的组织如T细胞的癌症，针对TCR β链恒定区 (TRBC) 和TCR β链可变区 (TRBV) 的抗体已经开发出来，以靶向所有克隆性癌细胞，但只针对正常T细胞的一部分，从而保留足够的正常组织以执行其功能。一些新兴的抗体靶点包括肿瘤特异性抗原，这些抗原仅由癌细胞表达，不由正常细胞表达。肿瘤特异性抗原的主要例子是新抗原，它们是由MHC分子呈递的突变肽。这些突变肽是携带来自癌症细胞标志性突变（点突变、小插入/删除、移码突变、融合和剪接变体）的蛋白质的氨基酸变化的短蛋白质水解产物。来自诸如BRAF、RAS、PIK3CA、TP53和异柠檬酸脱氢酶（IDH）等突变癌症驱动基因的公共新抗原，为癌细胞提供了极其独特的靶点，可以用来造福患者。这些公共新抗原目前正在被双特异性抗体靶向，并且在针对携带TP53和RAS突变的癌症的临床前研究中显示出令人鼓舞的活性。已经有多方面的努力描述了抗体识别新抗原的结构基础。p53(R175H)突变肽-MHC与p53(R175H)特异性TCRs和抗体复合物的晶体结构已经确定。TCRs共享一个明显的“规范”垂直结合取向至肽-MHC分子，偏向突变位点。相比之下，p53(R175H)新抗原特异性抗体使用一种非规范的并行结合模型沿肽的长度（见图3f）。此外，抗体对p53(R175H)新抗原的亲和力比相应的TCR高约100倍。不同的结合模式可能有助于抗体的特异性和高亲和力。 3.1.2 细胞内抗原 抗体无法穿透细胞膜，因此只能靶向细胞表面抗原。细胞内抗原可以与MHC分子相关联地呈现在细胞表面，使它们成为可靶向的。以这种方式，tebentafusp靶向细胞内抗原gp100，该抗原在黑色素瘤中过度表达，并与HLA-A*02:01相关联呈现在细胞表面。目前正在开发抗体以靶向诸如人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、MUC1、NY-ESO1、TCR γ替代阅读框蛋白（TARP）、p53、WT1和黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）等癌细胞特异性过度表达的细胞内蛋白，其中针对PRAME的靶向在临床试验中显示出令人鼓舞的初步结果。 3.1.3 肿瘤微环境中的抗原 癌症发展于一个复杂的免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质的混合物中，这被称为肿瘤微环境。早期基于抗体的针对癌症相关成纤维细胞或细胞外基质的靶向尝试未能产生临床效益。目前的研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突细胞和骨髓源抑制细胞（MDSCs）是众所周知的驱动对免疫检查点抑制剂的抗性的因素。因此，耗尽或阻断这些免疫抑制细胞的功能可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。早期阶段的临床试验已经证明了通过靶向巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）、髓细胞表达触发受体1（TREM1）和TREM2的抗体介导的TAMs抑制的安全性和可行性。临床前研究也表明，使用激动性CD40单克隆抗体增强肿瘤微环境中树突细胞的功能可以增强T细胞介导的肿瘤回归。针对胰腺癌患者的CD40抗体的临床试验患者耐受性良好，并已显示出增强的T细胞激活和渗透到肿瘤中。T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3（TIM3）受体由一系列免疫细胞如淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞表达，TIM-3拮抗性抗体同样可以通过调节肿瘤微环境促进肿瘤杀伤。TIM-3拮抗性抗体与目前批准的免疫检查点抑制剂联合在实体瘤患者中展示了可控的安全概况。所有这些抗体抵消肿瘤微环境中的免疫抑制状态，目前正在进行II/III期试验，将确定它们的最终效用。 3.2 针对低密度抗原 目前批准的ADCs和双特异性抗体靶向相对丰富的抗原，如CD19、CD20和BCMA，每个癌细胞上有大约1,000到50,000份拷贝。针对新抗原的主要挑战来自于它们在癌细胞表面的低丰度，有些细胞表达的靶标抗原只有1-10份拷贝。除了新抗原，有效的靶向肿瘤相关或组织特异性抗原也可能因为它们可变的细胞表面密度而受到影响。此外，治疗压力也可能选择表达靶标抗原低的癌细胞克隆。临床前研究表明，双特异性抗体能够杀死每个细胞表达低至1-10个抗原的癌细胞，而ADCs需要1,000份或以上才能杀死细胞。未修饰的全长抗体可能需要更高目标抗原表达。针对这种低密度抗原仍然是一个挑战，优化的抗体工程使得在临床前研究中有效地靶向个位数水平的新抗原成为可能。 3.3 新型免疫检查点抑制剂 2011年ipilimumab的批准标志着免疫疗法时代的到来。免疫检查点阻断剂具有在一些复发的实体瘤患者中诱导长期缓解的前所未有的能力，这导致了大量临床试验的开展。FDA和EMA已经批准了11种不同的针对CTLA4、PD1和PDL1的抗体，用于20多种癌症类型的65多个不同的适应症。继CTLA4、PD1和PDL1靶向初步成功后，还有许多其他免疫检查点如LAG3、T细胞免疫受体含有免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、V型免疫球蛋白抑制T细胞激活(VISTA)、TIM3、PVRIG、自然杀伤组2A(NKG2A)和OX40等被探索它们在多种癌症类型中诱导缓解的能力。除了针对黑色素瘤的LAG3的relatlimab外，其他都尚未在III期试验中展示所需的治疗活性以获得监管批准。同样，针对CD47的巨噬细胞检查点抑制剂magrolimab在早期试验中显示出令人鼓舞的活性，但在MDS和急性髓系白血病(AML)患者的III期试验中因缺乏效力而停止。目前新型免疫检查点阻断剂的表现低于预期，导致制药行业专注于PD1-PDL1领域，除了现有的九种抗体外，还有五种新的药物正在进行监管审查。尽管PD1-PDL1靶向取得了成功，但只有少数(~20%)的患者对免疫检查点阻断剂有反应，甚至更少的比例(~13%)实现持久缓解。此外，目前的免疫检查点抑制剂与相当大的并发症相关，其中约1%是致命的，约40%是慢性毒性。因此，我们需要超越PD1-PDL1抑制。这将需要改变癌症生物学研究方向和监管机构对抗体药物的批准方法。我们应该优先考虑针对新型免疫检查点调节剂的基础和转化研究，如B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、B7-H3(亦称CD276)、CD27和4-1BB，而不是重新审视已经广泛探索的PD1-PDL1轴和联合疗法。监管机构可能考虑修订批准流程，使新的PD1-PDL1阻断剂在初步III期试验中展示与竞争产品相当的疗效和毒性概况后，获得所有现有适应症的批准。 3.4 新型抗体格式 3.4.1 IgM抗体 所有全长治疗性抗体使用IgG亚型。临床前研究和早期试验正在探索五聚体IgM格式，与IgG格式中可用的两个结合位点相比，它有十个抗原结合位点。这比针对同一表位的IgG抗体提供了更高的结合亲和力。一个例子是IGM-8444，一种高亲和力的五聚体IgM激动剂抗体，针对死亡受体5 (DR5)，在小鼠模型中展示了肿瘤回归，并已进入I期试验。 3.4.2 新型双特异性格式 TCE双特异性格式不断发展，旨在提高疗效，同时减少不良反应。现在有200多种双特异性抗体正在进行临床开发，大多数使用TCE方法针对实体瘤。Glofitamab(一种CD20xCD3双特异性抗体，用于淋巴瘤)和xaluritamig(亦称AMG 509)(一种STEAP1xCD3双特异性抗体，用于前列腺癌)在临床试验中都显示出疗效，并共享一个独特的2:1 T细胞结合双特异性格式，对目标双价结合，对CD3单价结合。这种格式可能比传统的1:1目标至CD3结合设计提供增加的肿瘤细胞杀伤能力。IgM格式的TCE双特异性抗体由于使用五聚体IgM，有一个更令人印象深刻的10:1目标至CD3结合比率。高目标至CD3结合比率设计允许高亲和力目标结合，可能引发增加的目标细胞毒性，同时减少细胞因子分泌。Imvotamab(亦称IGM-2323)，一种CD20xCD3 IgM双特异性抗体的I期试验，在晚期B细胞恶性肿瘤患者中展示了几个完全反应。 3.4.3 双特异性免疫检查点阻断剂 双特异性格式也被用于同时抑制两个免疫检查点，以增强T细胞激活，超出两种单一免疫检查点阻断剂组合所能实现的。针对PD1xLAG3、PD1xCTLA4和PDL1xCTLA4的双特异性免疫检查点阻断剂在早期临床试验中显示出令人鼓舞的疗效。尽管最初的双特异性免疫检查点阻断剂组专注于抑制临床确立的免疫检查点，临床前研究正在调查是否类似的双特异性免疫检查点阻断剂可以通过靶向新型免疫受体如OX40、TIGIT和C型凝集素结构域家族9成员A (CLEC9A)来诱导抗肿瘤免疫。 3.4.4 三特异性抗体 三特异性抗体具有同时与三种不同抗原相互作用的能力。这一功能使三特异性抗体能够与两种不同的癌症相关抗原，如B细胞恶性肿瘤背景下的CD19和CD20，同时通过第三个结合域结合CD3，与细胞毒性T细胞相互作用。这种创新方法有助于减轻由于单一抗原如CD19或CD20的丢失而引起的治疗抗性，因为癌细胞必须同时下调两种抗原才能逃避杀伤。或者，三特异性抗体被设计为与两种T细胞受体，如CD3和CD28相互作用，从而对癌细胞提供更强的激活信号。 3.4.5 纳米抗体 可能引领抗体工程领域重要范式转变的一个研究领域是单域抗体（也称为纳米抗体）的开发。纳米抗体主要来源于驼类重链抗体，它们体积小、易于生产、稳定，并且能够穿透肿瘤或病毒抗原中的隐蔽位点。纳米抗体通常从驼类衍生的噬菌体展示库中分离出来，最近也从转基因小鼠如RenNano和nanomouse中分离得到。纳米抗体有一个长的CDR3环，可以穿透抗原表面的空腔。首个基于纳米抗体的靶向BCMA的CAR T细胞已获得FDA批准，并与基于抗体的CAR T细胞相比显示出改善的疗效。针对CD19或CD20和HER2的纳米抗体衍生药物目前正在临床试验中，分别用于治疗淋巴瘤和乳腺癌患者。纳米抗体是否会提供比当前基于抗体的药物更好的疗效，还有待观察。 3.4.6 可激活抗体 肿瘤微环境通常表现出较低的pH值，含有活跃的蛋白酶酶，并具有在正常组织中缺乏的特定抗原组合。这些独特的属性被用来利用可激活抗体选择性地靶向癌细胞，这些抗体会根据其环境条件的变化而获得或失去功能。在抗体序列的特定位置添加组氨酸残基，使其能够根据pH值的变化与其目标抗原结合。这一原理被用来生成一种靶向HER2的抗体，与正常组织相比，在实体肿瘤的酸性微环境中与HER2的结合更强。类似的工程导致了在酸性溶酶体内从目标抗原（HER2和CTLA4）增加抗体解离，从而促进抗原再循环和在细胞膜上的呈现，并增强抗肿瘤效果。可激活抗体还使用蛋白酶可切割的掩蔽基团来阻断表位结合位点。在肿瘤微环境中掩蔽基团的切割使抗体-抗原结合和抗肿瘤活性成为可能。具有这种掩蔽机制的抗体通常被称为前体疗法，并且正在被用来改善PDL1、CTLA4、EGFR、CD166和CD71在多种实体瘤和血液瘤中的靶向。 最后，癌细胞经常显示一种独特的抗原组合，可以区分癌细胞和非癌细胞组织。正在设计一系列抗体或类似抗体的肽，以实现针对半相合骨髓移植后产生的CD45+ HLA-A2+癌症，以及EGFR+ HER2+乳腺癌的组合性抗原靶向。 3.5 新型偶联抗体 提高ADCs的效力。目前的研究正集中在改进ADC的组成部分（靶向抗体、连接子和药物载荷），以提高ADC的疗效。临床前研究表明，IgG抗体的大分子量（约150 kDa）可能会降低组织穿透力。因此，使用缺少Fc片段的抗体或用小肿瘤靶向肽替换抗体，可能提高ADC的活性。调节连接子设计和增加药物-抗体比率（DAR）可能增强治疗效益。例如，针对细胞表面糖蛋白TROP2（sacituzumab govitecan）的ADC，由于具有高DAR，是首个提高三阴性乳腺癌患者生存率的ADC。Daiichi Sankyo开发的创新四肽连接子，用于trastuzumab deruxtecan，掩盖了载荷DXd的疏水性，并允许均匀连接大量药物，同时保持有利的药代动力学，并最小化药物过早释放到血浆中。这种连接子-载荷组合现在正被几个即将获批的ADC（datopotamab deruxtecan和patritumab deruxtecan）或正在进行临床试验的ADC（ifinatamab deruxtecan）采用。针对叶酸受体α（FRα）的Rinatabart sesutecan，也使用一种新型可裂解连接子来掩盖更具疏水性的有效载荷，即拓扑异构酶-1抑制剂exatecan，从而允许生成更强效的ADC。正在进行晚期临床试验的ADC列在补充表2中。预计这种连接子-载荷组合可以改善对肺癌和结直肠癌患者的HER2靶向，这些患者对HER2靶向ADC trastuzumab deruxtecan的反应率较低。最后，新的药物载荷，如蛋白质降解剂、RNA聚合酶抑制剂、BCL-xL抑制剂、Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激因子（STING）激动剂，预计将通过使用新的杀伤机制来改进ADC。连接子和偶联技术的进步有助于推动ADC相对于其他偶联格式（如毒素或放射性同位素偶联物或双特异性TCE格式）在临床上的更多采用。目前正在进行临床试验，测试新型ADCs作为单一药物或与化疗或免疫疗法联合使用，其中一些已经取得了有希望的结果。 3.5.1 免疫毒素偶联物 免疫毒素的一个明显限制是产生针对毒素的免疫反应，这降低了半衰期和效力。目前的工作集中在通过去除被宿主免疫细胞识别的表位来减少假单胞菌外毒素的免疫原性。这样的改良免疫毒素可能会提高效力，并允许免疫毒素靶向多种恶性肿瘤。白介素-毒素偶联物的产生是该领域的另一个发展，它利用癌细胞中白介素受体的过度表达。白介素-毒素偶联物的行为类似于抗体-毒素偶联物。Tagraxofusp是一种针对白介素-3受体亚单位α（IL3RA；亦称为CD123）的细胞毒素，由IL-3与白喉毒素融合而成，已被证明对患有浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）的患者有效。同样，denileukin diftitox（2014年撤回以进行制造改进），一种针对IL-2R的细胞毒素，由IL-2与白喉毒素融合而成，对患有皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的患者有效。然而，这些IL-毒素偶联物不被视为基于抗体的药物，因为它们使用受体配体而不是scFv进行肿瘤靶向。 3.5.2 放射性同位素偶联物 在小分子偶联和肽偶联放射性同位素在实体瘤中的成功后，对放射性同位素偶联物重新产生了一些兴趣。将镥-177与一种结合前列腺特异性膜抗原（PSMA）的小分子或与生长抑素受体结合的肽类似物偶联，在前列腺癌和神经内分泌肿瘤患者中展示了显著的肿瘤回归，分别获得了FDA的批准。这种肿瘤靶向小分子-放射性同位素或肽-放射性同位素偶联物的行为类似于抗体-放射性同位素偶联物，但具有不同的结构和药代动力学特征。目前正在进行临床试验，测试针对肾细胞癌患者的碳酸酐酶IX（CAIX）的肽-放射性同位素偶联物，以及针对脑肿瘤患者的GD2、AML患者的CD33、前列腺癌患者的PSMA以及血液恶性肿瘤患者的CD45和CD37的抗体-放射性同位素偶联物。其他方法涉及将肿瘤靶向抗体与α粒子发射体如锕-225（225Ac）偶联。α粒子具有更高的DNA损伤能量加上较短的范围，可能会增加肿瘤特异性细胞毒性，同时限制对周围健康组织的辐射引起的不良反应。 3.6 选择最佳格式 目前批准的基于抗体的治疗针对由癌细胞和正常细胞亚群表达的肿瘤相关抗原。这些抗体需要一个治疗窗口，允许杀死癌细胞，同时限制对正常细胞的非肿瘤毒性。需要谨慎选择抗体格式来利用这个治疗窗口，使用不当的格式可能由于降低的治疗效力或不可接受的毒性而无效。尽管缺乏明确的定量研究和直接比较，但人们普遍认为未经修饰的抗体杀死细胞需要高抗原表达（每个细胞>10,000份拷贝），而ADCs（每个细胞>1,000份拷贝）和TCE双特异性抗体或CAR T细胞（每个细胞>10-100份拷贝）可以杀死表达较低抗原的细胞。因此，对于给定目标，从未修饰的抗体转换为ADC或TCE双特异性抗体格式可以提高效力，但也可能同时增加毒性。这种效应在HER2靶向上得到了体现。HER2由一部分乳腺癌和小胃癌以及一系列正常人类组织表达。使用裸抗体（曲妥珠单抗和帕妥珠单抗）以及后来的ADC（曲妥珠单抗emtansine）对HER2进行靶向治疗，患者耐受性良好，并在HER2高表达的患者中导致肿瘤回归。最近，trastuzumab deruxtecan，一种具有高DAR的HER2靶向ADC，甚至在对以前的HER靶向抗体无反应的低HER2表达癌症中诱导了肿瘤回归。然而，进一步降低HER2靶向阈值的抗HER2 CAR T细胞由于对肺部低HER2表达细胞的靶向、非肿瘤毒性，导致致命的呼吸衰竭。抗HER2 CAR T细胞的致命毒性提出了可能性，即可以类似地靶向低水平HER2表达细胞的HER2靶向TCE双特异性抗体，也可能带来不可接受的毒性。因此，通过双特异性抗体zanidatamab进行HER2靶向采用了双HER2结合策略，而不是TCE方法，并已证明在没有致命毒性的情况下有效。因此，“干净”的目标，即在至关重要的组织中表达最小非肿瘤（如CD19）和低密度目标（如肽-MHC分子）是TCE基础治疗的最佳选择。在非可有可无组织中有一定水平的非肿瘤表达（如HER2）的目标，最好通过未修饰的抗体、ADCs或非TCE双特异性抗体进行靶向。 需要注意的是，特定设计的非肿瘤毒性和效力也取决于目标和药物载荷。例如，DLL3由一部分小细胞肺癌患者表达。在这种情况下，由于与PBD载荷相关的高水平毒性和缺乏生存益处，rovalpituzumab tesirine，一种DLL3靶向ADC的临床开发被停止。然而，I期试验表明，通过TCE双特异性抗体tarlatamab进行DLL3靶向会导致肿瘤回归，并且患者耐受性良好。最终，选择的目标及其抗原密度可能对最佳治疗格式至关重要。 4. 结论 总结来说，由于抗体在与其目标结合时可以提供精确度，基于抗体的治疗在肿瘤领域具有巨大前景。尽管仍存在重大挑战，但新目标以及各种新设计和工程策略预计将为这些挑战提供许多解决方案。更有效的基于抗体的治疗获得监管批准的爆炸性增长可能会继续遵循过去25年的趋势。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。