CVnCoV Vaccine (CureVac)

RNA PLATFORM · INDUSTRY DEEP REVIEW 从质粒模板、IVT、LNP 到 circRNA：下一轮平台突破、产业管线与下游纯化指南 疫情红利消失后，mRNA 进入最关键的第二阶段：用非新冠产品证明临床价值，用纯化与递送证明平台可复制。阅读地图 开场｜沉寂的是新冠红利，不是 mRNA 技术 一、什么是 mRNA 疫苗：可编程的瞬时原位表达 二、为什么这个领域在 2020 年前后突然兴起：五块拼图终于同时到位 三、技术未来会在哪里突破 四、全球与中国管线：从疫情产品转向高价值适应证 五、专利：真正的护城河是‘序列 × 化学 × 递送 × 制造’的组合 六、端到端制造：上游‘做出来’，下游‘把副产物变成药’ 七、下游纯化总论：为什么它比蛋白纯化更‘反直觉’ 八、DNA 模板清除、澄清与第一次 TFF：先降低体系复杂度 九、捕获层析：oligo(dT)、离子交换与混合模式各自解决什么 十、最难的杂质：dsRNA、截短体、无帽体与 poly(A) 异质性 十一、LNP 后处理与无菌过滤：颗粒大小正在逼近过滤器边界 十二、下游工艺的质量源于设计（QbD）与可借鉴实验框架 十三、环状 RNA：更长表达不是免费午餐，纯化对象已经改变 十四、企业是否值得布局：用能力树而不是热点清单做决策 长文导航：前六章回答‘技术与赛道值不值得’，第七至十二章深入制造与下游纯化，第十三章给出企业布局框架。开场｜沉寂的是新冠红利，不是 mRNA 技术 先给结论：mRNA 值得持续了解，也值得企业有选择地布局；但它不再是一条‘只要会做 IVT 和   LNP 就能估值跃迁’的赛道。疫情后的真正竞争，已经从序列合成速度转向四项系统能力：临床可证明的适应证选择、可重复的组织递送、能跨序列迁移的 CMC 平台，以及有自由实施空间的知识产权组合。 COVID-19 让 mRNA 在不到一年内完成了从序列到大规模接种的历史性验证。BNT162b2 与 mRNA-1273 的关键三期试验分别报告约 95% 与 94.1% 的早期保护效力，证明了‘给细胞一段可翻译指令’可以成为可监管、可制造、可商业化的产品模式。[1][2] 但疫情需求退潮后，Moderna 总营收从 2022 年约 192.6 亿美元降至 2025 年约 19 亿美元；这不是平台失效，而是提示投资者：公共卫生紧急需求曾掩盖单品季节性、竞争、接种意愿和产能利用率问题。[3] 平台的第二次证明已经开始。2024 年，美国批准 mRESVIA，成为首款针对非新冠疾病获批的 mRNA 疫苗；2025 年欧盟批准自扩增 RNA（saRNA）疫苗 Kostaive，说明 RNA 架构本身仍在演进。[4][5] 肿瘤领域则进入更困难也更高价值的检验：个体化新抗原疫苗 V940 在高危黑色素瘤随机 IIb 期中与 pembrolizumab 联用改善无复发生存；胰腺癌小样本研究显示，能诱导高强度新抗原 T 细胞的患者复发更晚，但这些结果仍需更大随机试验验证。[6][7] 图 1｜mRNA-LNP 的概念性三维主视觉。LNP 的真实内部并非规则空心脂质体；图像用于传达‘保护—释放—翻译’关系，不作为纳米结构证据。原创生成。一、什么是 mRNA 疫苗：可编程的瞬时原位表达 mRNA 疫苗不是把抗原蛋白直接注入体内，而是递送一条经过工程化的信使 RNA。它通常包含 5′ Cap 1、5′ 非翻译区（UTR）、编码抗原的开放阅读框、3′ UTR 与 poly(A) 尾。进入胞质后，核糖体读取 ORF 合成抗原；抗原经胞内加工进入 MHC-I 通路激活 CD8+ T 细胞，也可经分泌、膜表达或摄取进入 MHC-II 通路，促进 CD4+ Tfh、生发中心与抗体应答。[8][9] 所谓‘可编程’，是因为产品的核心功能可通过数字序列重写：更换病原体抗原、组合多个抗原、加入信号肽或跨膜区、编码细胞因子、抗体甚至基因编辑蛋白。所谓‘短暂’，是因为 mRNA 在胞质中经历正常的去腺苷化、去帽与核酸酶降解；它通常不需要进入细胞核，也不以基因组整合作为作用机制。[10] 这使它在速度与可逆性上不同于病毒载体或 DNA 基因治疗，但也带来表达持续时间短、需要有效递送和稳定性脆弱等代价。 图 2｜线性 mRNA 的结构—功能关系。各结构域既决定翻译，也会改变工艺产率、杂质谱与分析策略。 表 1｜mRNA、重组蛋白与单克隆抗体：不是替代关系，而是不同的产品逻辑 维度 mRNA/LNP 重组蛋白/亚单位疫苗 单克隆抗体 交付对象 编码指令，由人体细胞制造蛋白 已折叠蛋白抗原 具有确定结合位点的成品免疫球蛋白 制造平台 无细胞 IVT + 核酸纯化 + LNP 细胞培养/发酵 + 多步蛋白纯化 哺乳细胞培养 + Protein A/离子交换等成熟平台 开发速度 序列确定后快，适合快速换株与多价 需表达、折叠、构象与佐剂优化 需抗体发现、细胞株、表达与效力优化 体内表达 短暂、由递送部位细胞完成，可同时诱导体液与细胞免疫 剂量即抗原量，通常依赖佐剂与重复免疫 直接提供药理活性，暴露可由 Fc/剂量工程控制 核心风险 先天免疫、LNP 炎症/分布、RNA 完整性与冷链 错误折叠/聚集、宿主细胞杂质、免疫原性 高成本、注射剂量大、靶点逃逸、Fc 相关风险 最适场景 快速变异病原、多抗原、个体化肿瘤、体内表达蛋白 成熟抗原、低成本大规模免疫、稳定冷链 需要立即且可滴定的高亲和功能蛋白二、为什么这个领域在 2020 年前后突然兴起：五块拼图终于同时到位 第一块拼图是‘mRNA 能在体内表达’。1990 年，Wolff 等将体外转录 RNA 注入小鼠骨骼肌，观察到编码蛋白表达；1993 年，脂质体包裹 mRNA 已能诱导病毒特异性细胞毒性 T 淋巴细胞。[11][12] 早期概念成立，却长期受不稳定、翻译低和炎症高限制。 第二块拼图是修饰核苷。Karikó、Weissman 团队在 2005 年证明，假尿苷等天然修饰可显著降低 TLR3/7/8 对 RNA 的识别；随后证明假尿苷能提高稳定性与翻译。[13][14] 现有多款产品使用 N1-甲基假尿苷（m1Ψ）。其意义不是‘让 RNA 完全隐身’，而是把先天免疫从不可控干扰变成可设计变量。 第三块拼图是帽结构、UTR、密码子与 poly(A) 工程。Cap 1 帮助招募翻译起始复合物并降低 RIG-I/IFIT 相关识别；UTR 二级结构、uORF、GC 含量和密码子最优性会改变核糖体装载与半衰期；poly(A) 尾通过 PABP 与 5′端形成翻译协同。[15][16] 这意味着‘同一抗原’可以因 RNA 骨架不同而出现数量级表达差异。 第四块拼图是去除 dsRNA。T7 RNA 聚合酶会产生 3′回折延伸、反义转录等双链副产物，它们可激活 TLR3、RIG-I、MDA5、PKR 与 OAS/RNase L，造成炎症、翻译停顿和细胞死亡。[17][18] 2011 年的经典工作表明，HPLC 去除相关污染物后，核苷修饰 mRNA 在原代细胞中的翻译可提高 10–1000 倍，同时显著降低干扰素与炎性细胞因子。[19] 纯化不是收尾，而是药理机制的一部分。 第五块拼图是 LNP。离子化脂质在制备时的酸性条件下带正电，可与阴离子 mRNA 复合；在生理 pH 下接近中性以改善耐受；进入酸性内体后再次质子化，与内体膜阴离子脂质形成非双层结构并促进胞质释放。胆固醇填充并调节流动性，磷脂提供结构，PEG-脂质控制粒径和胶体稳定性。[20][21][22] Patisiran 在 2018 年的获批提前验证了离子化 LNP 的临床可行性，COVID-19 疫苗则把其带到十亿剂规模。 图 3｜mRNA 技术突破时间轴。所谓‘突然成功’，是序列工程、核苷化学、杂质控制、递送和规模化制造长期积累的交汇。 图 4｜mRNA-LNP 的作用机制与主要工程瓶颈。内体逃逸效率低且与炎症耦合，是下一代递送的关键难题。[23][24]三、技术未来会在哪里突破1. 从‘肝脏天然归巢’走向组织选择性递送 LNP 静脉给药后往往富集肝脏；肌内疫苗则依赖局部表达和引流淋巴结。未来价值最高的方向，是把表达可靠地导向免疫细胞、肺、脾、骨髓、肿瘤或其他器官，同时降低肝脏与系统炎症。SORT 通过加入第五种脂质改变器官分布，条形码筛选和机器学习则把离子化脂质发现从经验试错转向大规模结构—功能学习。[25][26] 但动物中的器官选择性不能直接等同于人体靶向，且材料、剂量、给药途径、蛋白冠都会重写分布。2. saRNA、环状 RNA 与更低剂量 saRNA 除抗原外还编码复制酶，进入细胞后可扩增 RNA，从而降低给药剂量并延长抗原表达。Kostaive 的批准给出了首个重要监管锚点。[5] 代价是分子更长、IVT 与纯化更难、复制中间体和先天免疫更复杂。环状 RNA 可通过 IRES 或 m6A 等机制翻译，理论上更耐外切核酸酶，但环化效率、线性前体和 concatemer 去除、翻译可控性仍是 CMC 难题。[27]3. 癌症疫苗：从免疫原性证明走向临床获益证明 肿瘤是 mRNA 最具平台差异化的赛场：一条制剂可以编码多个共享抗原，也可以在肿瘤测序后为每位患者选择新抗原。V940 可编码多达 34 个新抗原；autogene cevumeran 可编码多达 20 个。[6][7] 其优势是多靶点、快速更新和强 T 细胞应答；其困难是新抗原预测并不等于呈递，肿瘤异质性、免疫抑制、制造周转时间和单患者批次放行都会影响价值。最可能率先成功的场景不是大体积晚期肿瘤，而是术后微小残留病灶，并与 PD-1/PD-L1 抑制剂联合。 Case study｜胰腺癌里的‘一个小故事’Rojas 等纳入可切除胰腺导管腺癌患者，术后先给予一次   atezolizumab，再于第 9 周起静脉给予 25 µg 个体化 mRNA-lipoplex 疫苗（7 次每周初免，第 17 周第 8 次，第 46   周加强），随后使用 mFOLFIRINOX。16 名可评估患者中 8 名产生高强度新抗原特异性 T 细胞；18 个月随访时，应答者中位无复发生存未达到，非应答者为   13.4 个月（P=0.003；样本极小，不能视为确证疗效）。一名患者疫苗后出现 7 mm 肝病灶，活检见密集淋巴细胞并检测到与原发瘤相同的 TP53 突变，病灶随后消失；它提供了‘疫苗扩增的   T 细胞可能进入微转移灶’的机制线索，而不是单病例疗效结论。[7] 3.2 年更新进一步观察到长期 CD8+ 克隆，但随机对照验证仍是决定性一步。[28]4. 室温/冷藏稳定与冻干 冷链来自两类不稳定：RNA 水解/氧化与 LNP 粒径、包封状态、脂质降解变化。冻干、可水解离子化脂质、抗氧化体系与更稳定的 RNA 架构都可能提高可及性。中国企业在冻干带状疱疹与 RSV mRNA 疫苗上的布局具有差异化意义，但‘2–8℃稳定’必须由长期/加速稳定性、复溶后粒径与效价、冻干保护剂残留等完整证据支持。[29][30]四、全球与中国管线：从疫情产品转向高价值适应证 截至 2026 年 8 月，Moderna 是最完整的单平台公司：已有 Spikevax、mNEXSPIKE 与 mRESVIA，晚期项目覆盖季节性流感、流感+新冠组合、诺如与个体化肿瘤疫苗；CMV 项目在关键终点上的不确定性提醒行业，复杂病原体并不会因为换成 mRNA 就自动变简单。[31][3][32] BioNTech 的战略重心明显向肿瘤迁移：FixVac 共享抗原项目 BNT111/113/116，与 Genentech 合作的个体化 autogene cevumeran，以及与免疫检查点/双抗等组合构成核心。其优势是癌症免疫学、测序—制造闭环与全球临床网络；挑战是肿瘤疫苗需要跨越比预防性疫苗更高的疗效门槛。[33] GSK 获得 CureVac 多项流感/新冠资产，Sanofi 的 mRNA 资产则反映大型疫苗公司会基于临床与组合价值主动取舍，而非机械坚持某一模态。 欧洲和日本还提供了两条不同路径：CSL/Arcturus 以 saRNA 的低剂量逻辑推进 Kostaive；第一三共依靠日本本土制造与监管体系推出 Daichirona，并持续更新毒株。[5][34][35] 这表明 mRNA 不一定只属于纯平台创业公司，也可以嵌入成熟疫苗企业的供应链和商业渠道。 中国赛道经历了从‘国产替代新冠疫苗’到差异化平台的重构。石药 SYS6006 系列形成国内已批准 mRNA 产品锚点；沃森/艾博 ARCoV（AWcorna）完成海外授权与上市探索；艾博把自研离子化脂质和冻干能力延伸到带状疱疹、RSV，并推进 mRNA 编码双特异性抗体等治疗性方向；斯微生物等企业继续探索肿瘤和感染管线。国内优势是工程迭代、供应链和成本；短板仍是全球多中心临床、差异化递送、原始专利与成熟放行分析。 图 5｜疫情后商业收入回落。数据为 Moderna 总营收，来源为公司年报/SEC 文件；不代表全球 mRNA 市场规模。[3] 图 6｜代表性 mRNA 管线与阶段（截至 2026-08-02）。公司项目的阶段与表述可能随试验和监管变化，需以最新注册库和公告复核。[31][33][35][29] 市场判断：短期收入仍由呼吸道季节性疫苗主导；中期增量取决于流感/组合疫苗与带状疱疹、诺如等大人群适应证；长期估值上限由肿瘤、蛋白替代与体内细胞工程决定。企业不应把‘mRNA   市场规模’当成一个数字，而应分别计算可接种人群、给药频率、相对现有标准疗法的临床增益、冷链与渠道成本。五、专利：真正的护城河是‘序列 × 化学 × 递送 × 制造’的组合 mRNA 产品常同时落入四组权利要求：修饰核苷与 RNA 架构；抗原序列/用途；离子化脂质及配方比例；混合、冻干、纯化和分析工艺。Karikó/Weissman 相关修饰核苷家族的优先权可追溯至 2005 年；围绕 SM-102、ALC-0315、专有脂质和配方的专利又形成第二层网络。[36][37] 中国企业也在自研阳离子/离子化脂质、冻干和靶向递送上申请中、美、欧、日同族；例如艾博相关 CN113018449A 家族可作为国内原始递送专利的一条观察线索。[38] 布局时不能只做一次关键词检索。建议按 INPADOC/简单同族聚类，追踪优先权、分案/继续申请、权利要求状态、期限调整、无效/诉讼与许可链；分别在 Google Patents/USPTO、Espacenet/EPO、WIPO PATENTSCOPE、CNIPA 与 J-PlatPat 核对。更重要的是以候选产品的实际序列、脂质结构、摩尔比、N/P 比、生产方法和适应证做 claim chart。下文专利只作技术地图，不构成法律意见或自由实施（FTO）结论。 表 2｜企业专利尽调的五层清单 层级 重点问题 常见误区 RNA 化学 m1Ψ/其他核苷、Cap 1、poly(A)、UTR 和序列优化是否落入权利要求 只看产品名，不看继续申请与区域状态 抗原/用途 特定病原体构象、突变、新抗原选择和组合疗法 以‘天然序列’推断必然无风险 LNP 离子化脂质结构通式、辅脂质、摩尔比、粒径、N/P 与给药途径 只替换脂质名称，不分析 Markush 通式 制造与纯化 混合器、流速比、乙醇去除、冻干、dsRNA 去除与分析 忽略工艺专利和商业秘密 许可与地域 大学—平台公司—药企的许可链及适应证/地域排他 把专利到期等同于所有许可义务消失六、端到端制造：上游‘做出来’，下游‘把副产物变成药’ 典型流程从抗原与 RNA 骨架设计开始，制备质粒或线性 DNA 模板；模板线性化后进行 IVT，使用 T7 RNA 聚合酶、NTP（可含修饰 UTP）、Mg2+ 和缓冲体系，在共转录或后转录步骤完成 Cap 1，并通过模板编码或酶法获得 poly(A)。随后 DNase 消化模板、澄清、TFF/层析纯化 mRNA；纯化的 mRNA 与溶于乙醇的脂质在酸性条件下快速混合形成 LNP，再去乙醇、换至近中性缓冲、浓缩、除菌过滤、灌装与冷冻/冻干。[39][40]1. 质粒不是普通原料：它是 mRNA 质量链的第一块多米诺骨牌 工业 IVT 多以含 T7 启动子、5′/3′UTR、ORF 与编码 poly(A) 的质粒为主种子，经 E. coli 发酵、收菌、温和碱裂解和中和获得澄清裂解液。目标通常是共价闭合超螺旋（CCC/sc）质粒；开环、线性、二聚/多聚体以及宿主基因组 DNA、RNA、蛋白、内毒素、残余抗生素和工艺试剂均需控制。质粒很大且易被剪切，强混合会把 gDNA 拉成难以与 pDNA 分开的长片段；裂解不足则降低回收，因此碱、SDS、停留时间、混合能量与中和顺序都是上游 CPP，而不是“实验室提质粒”的简单放大。2. 经典三步层析与主流两步法：不是固定配方，而是三种正交选择性 经典三步平台的代表是 HIC→AEX→SEC：HIC 借助高盐下单链核酸、变性核酸和内毒素相对更强的疏水作用进行前处理；AEX 以磷酸骨架电荷为主完成捕获和构象精制；SEC 同时去除小分子并换液。Urthaler 等报道该工艺从连续温和裂解后依次使用 HIC、AEX、SEC，可获得最高约 98% 超螺旋构型，并可覆盖临床早期到商业供应。[41] 三步法的代价是柱体积、缓冲液、周期、验证和累计收率损失，尤其 SEC 载量与通量常成为放大瓶颈。 更流行的两步方案通常通过加强前处理把 SEC 的换液功能交给 TFF/UF-DF，再保留两种层析选择性。例如 AEX 捕获 + HIC/混合模式构象抛光，或 HIC 流穿减 RNA/内毒素 + AEX 捕获；也有两套 AEX 利用不同基质和盐窗口，第一步选择性结合 pDNA、第二步去除痕量 RNA/gDNA。[42][43] 因此“两步”不是简单少上一根柱，而是把澄清、Ca2+ 或盐析、TFF 和层析看成一个整体：若前处理不能稳定削减 RNA、gDNA 和内毒素，第二步会迅速被迫承担过多选择性。 表 3｜mRNA 模板质粒的三步法与两步法：选择性、收益与风险 平台 典型顺序 主要任务 放大风险 经典三步 HIC → AEX → SEC RNA/内毒素削减；pDNA 捕获与构象精制；换液/小分子去除 累计收率、SEC 低载量、缓冲与周期 两步 A AEX → HIC/混合模式 先高容量捕获，再区分 sc/OC/线性及疏水杂质 高盐切换、前处理质量影响捕获容量 两步 B HIC 流穿 → AEX 先保留 pDNA 于流穿并截留 RNA/LPS，再 AEX 精制 HIC 条件窗口、硫酸盐去除、构象回收 双 AEX AEX-1 → AEX-2 通过配基/基质/盐窗口正交去 RNA、gDNA 和异构体 两步机理相关，需证明真正的正交性3. 线性化之后还要不要纯化？答案通常是要 限制性内切酶在线性化位点切开质粒，为 T7 RNAP 提供定义明确的 run-off 末端。此时料液包含目标全长线性模板、未切/部分切的 sc/OC 质粒、错误片段、限制酶、BSA/稳定剂、盐和核酸酶。只做沉淀或通用硅胶柱，可能得到 A260 看似合格但异构体复杂的模板。可选流程是先验证消化终点，再用 AEX 单体柱/膜/整体柱、疏水 C4 整体柱或 SEC/TFF 组合分开完整线性体与未切构型并换入 IVT 缓冲；分析上至少用 AEX-HPLC/CE、凝胶、限制图谱和残余蛋白/内毒素交叉确认。 Case study｜把 dsRNA 问题向前追溯到线性模板Martínez 等比较三种 mRNA 构建体的线性化质粒纯化方式，发现常规树脂处理后仍存在可见模板杂质；使用表面带   C4 丁基链的 CIM 整体柱抛光，AEX-HPLC 与毛细管电泳显示线性模板更均一，后续 IVT 的 dsRNA 水平下降。作者提出残留 DNA 片段或异构模板可被   T7 RNAP 转录为与目标互补的 RNA，进而形成 dsRNA。[44] 这个案例不证明 C4 对所有模板都最优，却证明模板纯度是 dsRNA 的上游因果变量；工艺开发不应把所有   dsRNA 责任都推给 mRNA 精制。 图 7｜从质粒发酵、两/三步层析、线性化抛光到 IVT 的质量传递链。箭头表示杂质可能跨单元操作传递并放大为 RNA CQA 风险。 IVT 的关键变量包括 DNA 模板纯度与末端、T7 RNAP、NTP/Mg2+ 比、反应温度、时间与转录终点。延长反应未必增加可用全长 mRNA，反而可能增加回折和反义副产物。工程化 T7 RNAP 已被证明可显著降低免疫刺激性副产物，提示‘在上游少制造杂质’通常优于完全依赖下游补救。[45] LNP 常用快速微混合：mRNA 位于 pH 约 4 的水相，脂质位于乙醇相；流速比、总流量、离子化脂质:mRNA 比、缓冲离子强度和混合器几何共同决定成核、粒径、PDI 与包封率。放大不能只按体积线性外推，应保持混合时间和局部过饱和历史相似，并验证设备材料吸附、乙醇残留、剪切和批间启动/停机段。[46][47] 图 8｜mRNA-LNP 端到端制造及关键原料、设备和分析。七、下游纯化总论：为什么它比蛋白纯化更‘反直觉’ 下游纯化是本文的重点。mRNA 工艺真正困难的地方，不是去除完全不同的杂质，而是在目标 mRNA、截短体、未加帽体、poly(A)   异构体和 dsRNA 之间寻找极小的物性差异；它们都大、都带大量负电、都容易形成二级结构，而且目标分子本身怕 RNase、热、金属离子与反复剪切。 IVT 粗液包含未消耗 NTP、焦磷酸盐、Mg2+、T7 RNAP、无机盐、DNA 模板与 DNase；核酸类杂质包括短截体、长于目标的延伸体、无帽/错帽 RNA、poly(A) 长度异构体、RNA:DNA 杂交体和不同长度的 dsRNA。[48][49] 相比抗体可依赖 Protein A 的高度专一捕获，mRNA 暂无同样成熟、普适且高容量的单步平台。 开发起点应是杂质地图而不是设备清单。每个单元操作回答一个问题：DNase 是否把模板降至可透过膜/不影响层析的尺寸？TFF 是否能在保持完整性的同时去除 NTP、盐和酶？捕获步骤是否选择 poly(A)+ 全长体？精制步骤是否真正去除 dsRNA、回折体与无帽体？LNP 后处理是否在不改变粒径/PDI/效价的情况下去乙醇和游离组分？只有把 CQA—杂质—机理—检测方法连起来，才可能形成可迁移平台。[50][51] 图 9｜下游单元操作与主要杂质。具体膜截留分子量、缓冲和负载必须以产品数据建立设计空间。八、DNA 模板清除、澄清与第一次 TFF：先降低体系复杂度1. DNase 不是‘加完就结束’ IVT 后加入无 RNase 的 DNase I 将线性 DNA 模板切成小片段。开发需同时确认残余 DNA 总量、片段大小、DNase 残留和反应停止方式。过高 Mg2+、过长时间或不洁净原料会增加 RNA 水解/RNase 风险；过度依赖 qPCR 单一方法也可能因 LNP/基质抑制或引物区段选择产生偏差。建议用 qPCR/ddPCR 与荧光/高灵敏核酸方法交叉，并在必要时区分包封内外残余 DNA。[52]2. 澄清与预过滤：低成本地保护后续高价值介质 粗液可能含焦磷酸镁沉淀、聚集蛋白和颗粒。低速离心、深层/微滤或合适预过滤可以降低 TFF 与层析堵塞，但 RNA 对膜材质存在非特异吸附。过滤器筛选应记录体积通量、压差、回收率、滤前后完整性和可提取物；小规模装置的高表面积/体积比常夸大损失，因此需要按接触面积和停留时间做缩放。3. TFF-1：浓缩与小分子透析，不是精密分辨 TFF 通过切向流降低滤饼形成，适合去除 NTP、盐、Mg2+ 和小蛋白，并为层析调整电导与 pH。文献与行业中常见 100–500 kDa 级膜作为起筛区间，但名义截留分子量不能直接预测大分子 RNA 的保留；mRNA 的线团尺寸、构象和膜孔分布会改变筛分。开发应采用低到中等跨膜压（TMP）和可控剪切，从通量阶梯试验确定临界通量，而不是固定追求最大 LMH。 Case study｜为什么‘更快过滤’反而更差一项 1025 nt mRNA 的 TFF 研究在 300 kDa   中空纤维上观察到：当通量约 30 L·m−2·h−1 时回收率约 70%，通量提高到 70 L·m−2·h−1 以上后回收率低于 50%，并伴随 TMP 随时间上升。2025   年的单程 TFF 研究进一步显示，100 kDa 再生纤维素膜可在 12 小时以上实现约 10 倍浓缩且不见完整性损失。[53] 信息不是‘100 kDa 最好’，而是膜材质、临界通量、流道与构建体必须联合开发。 推荐监测：质量平衡（进料、渗透、截留、冲洗）、UV/荧光 RNA、CE/电泳完整性、A260/280、NTP/盐清除、TMP—通量曲线、剪切暴露时间和膜吸附。若 mRNA 先包封成 LNP，再做 TFF，则关注点转为粒径、PDI、包封率、游离 RNA、脂质回收和颗粒融合。九、捕获层析：oligo(dT)、离子交换与混合模式各自解决什么1. oligo(dT) 亲和：最直观的 poly(A)+ 捕获 固定化寡聚 dT 与 mRNA 的 poly(A) 尾杂交，使未加 poly(A) 的短 RNA、NTP、蛋白和大部分 DNA 在流穿/洗涤中去除，再通过低盐、升温或变性条件解离。它的优点是机理明确、序列无关、可富集具有 poly(A) 的目标；缺点是树脂昂贵、动态结合容量受大分子传质限制，且所有带足够 poly(A) 的截短体仍可能共同结合。高温/尿素等有助于打开二级结构，却增加 RNA 水解与材料兼容性风险。[48] Case study｜传质比配基密度更重要Davis 等用 1900–4300 nt 的四种 mRNA 比较   oligo(dT) 电纺纤维介质、CIM 整体柱和 POROS 颗粒树脂。Fibro 原型的动态结合容量约为 CIM 的 2–4 倍、POROS 的   2–13 倍；CIM 对停留时间与 mRNA 尺寸最不敏感。[54] 这说明大 RNA 的介质选择不能照搬蛋白树脂经验：可对流的大孔道、可接近配基和压降常比静态容量更关键。 开发建议：使用真实长度与真实 poly(A) 构型的 mRNA 测 DBC10%；同时考察停留时间、温度、盐、尿素、载量、回收液体积和多循环清洗。用 CE/LC 方法确认是否富集了长 poly(A) 而引入偏倚；对个体化肿瘤小批次，还要权衡一次性膜/纤维介质与可循环树脂的切换和验证成本。2. 阴离子交换（AEX）：利用电荷密度相近条件下的构象与有效电荷差 RNA 磷酸骨架强负电，可在弱/强阴离子交换介质上结合，以盐或 pH 梯度洗脱。AEX 能去除蛋白、DNA、短 RNA，并在优化条件下分开部分 dsRNA/截短体；但长 RNA 电荷密度都很高，常需尿素、升温或有机改性剂破坏二级结构，压缩并稳定选择性。颗粒树脂受扩散限制，膜、整体柱和纤维介质更适合大核酸的对流传质。 AEX 方法开发应先用分析尺度建立载量—分辨率—回收率三维关系，再向制备尺度迁移。梯度峰看似漂亮不等于适合生产：要验证可接受的柱体积、缓冲消耗、池切割稳健性、峰拖尾、CIP 对 RNase 控制以及盐/尿素后续去除。若产品每次序列不同，保留时间漂移必须通过平台化池切规则、PAT 或正交放行吸收。3. 混合模式/核心珠流穿：把大 RNA 排除在孔外 一种实用思路不是让 mRNA 结合，而是利用孔径排阻让 mRNA 流穿，配基捕获小分子、蛋白与核酸杂质。公开的早期临床制造平台采用多模式核心珠层析后接 UF/DF 和 0.2 µm 过滤，强调平台可转移与温和回收。[39] 其选择性对 dsRNA 和同尺寸截短体有限，因此更适合作为负载削减/抛光，而非唯一的关键精制。4. 陶瓷羟基磷灰石（CHT）：可利用，但应放在‘探索性混合模式’而非成熟平台 CHT 的晶体表面同时具有可与磷酸基配位的 Ca 位点和可参与阳离子交换的磷酸位点，因此不是单纯 IEX；核酸的磷酸骨架、碱基暴露、链长和构象会共同影响吸附。早期 RNA 纯化专利提出使用约 20–80 µm CHT 颗粒、约 0.05–0.13 µm 标称孔径，以磷酸盐梯度洗脱，并将 250–350 cm/h（实例约 300 cm/h）作为高流速工艺窗口，显示其耐压、可重复使用和规模化潜力。[55] 但另一组专利比较数据又报告 CHT 未能有效区分某些 ssRNA 物种。[56] 两者并不矛盾：CHT 可能擅长去蛋白、DNA、小片段或作为负载削减步骤，却未必天然具有目标 mRNA 与近似 RNA 的分辨率。 CHT 开发应从小型机制实验开始：以磷酸盐浓度、pH、Ca2+/Mg2+、电导、上样密度和停留时间为因子，分别测目标回收、dsRNA、DNA、蛋白和完整性；尤其要检查磷酸盐与金属离子对 RNA 构象、后续 TFF 和 LNP 配制的影响。若作为流穿抛光，应证明杂质结合而目标不结合；若作为结合-洗脱，应建立再生/CIP 后 Ca/P 溶出、微粒、容量衰减和 RNase 控制。当前公开证据以专利和核酸吸附研究为主，成熟度低于 oligo(dT)、AEX 与 IP-RP。5. 无孔弱阳离子交换微球与 batch 模式：先把术语说清 公开资料显示 UniCore10cm纯化mRNA。采用聚合物微球吸附洗脱的静态方式纯化mRNA，仅需一步纯化即可在短时间内将mRNA从反应液中快速分离，能够有效去除底物及相关聚合酶等成分，回收率可达90%以上，过程使用的溶剂安全，无毒性，适用于药物纯化及生产过程，相较于柱层析实验，其纯化更加灵活且步骤简单。乙醇、PEG及二价金属离子在整个纯化中都起到了很重要作用。 batch 模式是把介质直接加入 IVT/TFF 中间液搅拌接触，再沉降、离心或过滤回收微球；它减少装柱和压降限制，适合一次性、小批量或高黏度料液。美国 mRNA AEX 专利明确把 batch chromatography 与膜吸附器列为可实施形式。[58] 然而它不是自动获得高分辨率的捷径：需建立固液比、混合功率、接触时间、温度、盐度、微球回收率、细粉/可提取物、RNA 在搅拌与过滤中的损失，以及多批次 carry-over 风险。若目标是 dsRNA/截短体精分，装柱梯度通常更易控制；若目标是批量捕获或流穿去杂，batch 才更有竞争力。 无孔 PS-DVB 颗粒还常用于离子对反相（IP-RP）。其优点是大 RNA 不必进入孔道、峰展宽小；经典 matched-ion 专利即强调非多孔颗粒与离子对条件。[59] 但高压、低制备载量、有机溶剂/离子对残留和热负担依旧存在。需要把“无孔 AEX batch 微球”和“无孔 PS-DVB IP-RP 柱”分开评价：前者以电荷吸附和工艺简化为主，后者以分析/高分辨精制为主。十、最难的杂质：dsRNA、截短体、无帽体与 poly(A) 异质性1. dsRNA：为什么必须单独看待 dsRNA 既可能是与目标相近长度的互补双链，也可能是 3′端回折后被 T7 RNAP 延伸形成的长发夹。它不仅是‘纯度’问题，还会通过 TLR3、RIG-I/MDA5、PKR 和 OAS 触发干扰素、eIF2α 磷酸化、RNase L 与翻译抑制。[17][60] J2 抗体点杂交便于筛查，但对长度和构象的响应不同、定量区间有限；应与色谱、CE、数字免疫检测或功能性先天免疫报告细胞法正交。2024 年的 BLI 法展示了以 dsRNA 结合分子建立更定量检测的可能性。[61]2. 纤维素法：低成本的选择性来自乙醇条件下 dsRNA 吸附 Case study｜16% 乙醇、100 mg 规模与体内结果Baiersdörfer 等在含 16%（v/v）乙醇的缓冲液中使   dsRNA 选择性结合纤维素。微量离心柱使用约 0.14 g 纤维素处理 100 µg 样品；方法对 1–4 kb、U 或 m1Ψ mRNA 均有效，报告至少   90% dsRNA 去除和高于 65% 的 mRNA 回收。团队还用 FPLC 纤维素柱处理 100 mg、2.2 kb mRNA。经两轮纤维素纯化的   m1Ψ-mRNA 在小鼠中提高蛋白表达，且血清 IFN-α 不再可测。[62] 这是极具吸引力的工艺起点，但放大时仍需控制乙醇易燃性、床层压降、纤维素批间差异、微粒与残留，并验证短   dsRNA 的清除下限。3. RP-HPLC/IP-RP：分辨率高，但溶剂、温度和规模是代价 离子对反相通过阳离子离子对试剂屏蔽 RNA 磷酸负电，使其与疏水固定相相互作用，再用有机溶剂/温度梯度分离。它能高分辨分开目标和 dsRNA/异长体，是研究和分析的强工具；经典研究也证明其去杂可极大提高翻译。[19] 但制备规模面临柱容量、压力、有机溶剂、离子对试剂残留、RNA 热稳定与 EHS 负担，通常更适合高价值小批次、分析或作为平台早期的效力标杆。4. 专一 dsRNA 亲和：最接近‘核酸版 Protein A’的想法 2025 年报道的一种 dsRNA 特异性亲和树脂可将 dsRNA 降低超过 100 倍，低至总 mRNA 的约 0.00007%（w/w），且不显著损害完整性；纯化后的未修饰核苷 RNA 在先天免疫报告体系中炎症低、表达高。[63] 若能在配基泄漏、容量、寿命、清洗和成本上验证，它可能成为高度选择性的流穿抛光步骤。但单一论文结果尚不能替代跨序列、跨规模和 GMP 介质供应验证。5. 截短体、无帽体与 poly(A) 异构体 截短体可能仍含 poly(A)，会逃过 oligo(dT) 捕获；无帽体与正确 mRNA 的主体物性几乎相同；poly(A) 尾长度则形成连续分布。解决策略常是‘上游预防 + 正交分析 + 有限精制’：优化模板末端和 IVT 终止，采用高加帽效率的共转录方法，模板编码均一 poly(A)；用 RNase H/特异核酸酶切下 5′或 3′片段，再以 LC-MS/HPLC 测帽和 poly(A)；用 AEX/IP-RP/CE 监控异构体。[64][52] 不应期待一个放大步骤同时把所有近似体完全分开。 图 10｜三个纯化案例的量化结果。注意：不同研究的构建体、分析方法和规模不同，不可横向作为供应商性能排名。[62][19][54] 图 11｜纯化技术相对决策矩阵。评分为基于公开机制与文献的概念性比较，真实工艺须以 DoE 和质量风险评估校正。十一、LNP 后处理与无菌过滤：颗粒大小正在逼近过滤器边界 快速混合后的 LNP 通常处于酸性、含乙醇体系，需要立即稀释并 UF/DF 至近中性制剂缓冲，去除乙醇和游离脂质/未包封 RNA，同时浓缩。这里的控制目标从‘RNA 完整性’扩展为粒径、PDI、包封率、mRNA 完整性、总/游离脂质、脂质降解物、pH、渗透压和体外表达。剪切或局部浓缩可能引起融合、泄漏或颗粒结构重排。 0.2 µm 除菌过滤尤其具有挑战，因为典型 LNP 约 50–200 nm，与除菌级膜孔径分布重叠。2025 年工艺研究强调以不同膜材、流速和 TMP 建模容量；后续膜表征工作发现，即便都标称 0.2 µm，不同膜真实孔径分布与 LNP 容量差异显著，0.8/0.2 µm 双层膜或 400–800 nm 预滤可提高容量。[65][66] 因此不能从额定孔径推导工艺能力，必须做小规模恒压/恒流过滤、堵塞模型与放大安全系数。 建议把过滤开发当成产品—膜相互作用研究：记录单位面积处理量、差压、回收、滤前后粒径/PDI/效价，进行预冲洗与产品追洗优化，并把批次最差粒径尾部纳入挑战。无菌保障不应由最终过滤单独承担；上游封闭操作、低生物负载、短持液时间和可完整性测试的系统同样重要。十二、下游工艺的质量源于设计（QbD）与可借鉴实验框架 一个可执行的开发框架可以从四个 mRNA 构建体开始：短/长 ORF 各一条，低/高二级结构风险各一条，覆盖计划平台边界。对每条构建体建立统一粗液杂质谱，再以小型 TFF、oligo(dT)、AEX/混合模式和 dsRNA 抛光组合进行并行筛选。评价不能只看 A260 回收，应至少包括全长完整性、帽效率、poly(A) 分布、dsRNA、残余 DNA/蛋白/NTP、体外翻译和先天免疫报告。 表 4｜建议的下游开发 DoE 因子与响应（工艺起点，不是通用处方） 单元操作 可筛选因子 关键响应 DNase/澄清 酶:DNA 比、时间、温度、Mg2+、预过滤材质 残余 DNA/片段、RNA 完整性、浊度、回收 TFF 膜材/截留、TMP、切向流、浓缩倍数、透析体积、温度 通量衰减、质量平衡、完整性、NTP/盐清除、吸附 oligo(dT) 介质形态、停留时间、载量、盐、温度、尿素、洗脱 DBC10、回收、poly(A) 偏倚、短截体与 DNA/蛋白清除 AEX/混合模式 pH、电导、尿素/有机改性、梯度、载量、池切 分辨率、峰拖尾、dsRNA/异长体、缓冲消耗 dsRNA 抛光 纤维素/亲和介质、乙醇、接触时间、载量、循环 J2/BLI/功能法 dsRNA、回收、配基/微粒残留 LNP UF/DF/除菌 膜材、TMP、预滤、浓度、缓冲、温度、通量 粒径/PDI、包封率、效价、乙醇/游离脂质、过滤容量 跨序列平台的判定不应是‘三批都合格’，而应证明关键参数对不同长度、GC、二级结构和 poly(A) 构型具有可预测影响。可用分层模型或响应面将构建体属性作为协变量，建立平台正常操作范围；一旦新序列落在边界外，就触发增强表征而不是默认沿用。EMA 2025 年草案已明确关注平台先验知识、多价/换株与 saRNA 的额外质量问题。[51] 分析上，建议把‘结构’和‘功能’并列：CE/微流控电泳或 IP-RP/AEX 看完整性与异构体；LC-MS/核酸酶切片段看帽与 poly(A)；qPCR/ddPCR 看 DNA；ELISA/LC 看酶和蛋白残留；RiboGreen 结合裂解前后测总/游离 RNA；DLS/NTA/cryo-EM/SAXS 看颗粒；细胞表达、抗原构象/活性和先天免疫报告给出功能锚点。[52][46]十三、环状 RNA：更长表达不是免费午餐，纯化对象已经改变 circRNA 通过 5′与 3′端共价闭合，天然抵抗外切核酸酶，不依赖传统 5′帽和   3′poly(A) 维持稳定；它可能延长表达、降低给药频次并适配疫苗、蛋白替代和细胞重编程。但闭环也取消了 oligo(dT) 这一通用捕获把手，并制造了线性前体、切口环、内含子、二聚体/串联体与   dsRNA 共存的新杂质谱。1. 结构与翻译：没有自由末端，如何招募核糖体 蛋白编码 circRNA 通常由 IRES、开放阅读框、间隔区和环化接头组成，也可依赖 m6A 或新型内部 cap 机制启动翻译。闭环消除了 5′/3′外切降解入口，却不意味着绝对稳定：单个磷酸二酯键被切开后即变为全长线性 RNA，随后快速降解。IRES 的细胞类型依赖性、相邻二级结构、起始密码子语境和先天免疫识别共同决定表达；因此不能把“更稳定”简单等同于“更高效”。 2018 年的工程化 PIE 研究通过 9 或 19 nt 同源臂促进长前体折叠，报告不同构建体接近完全环化；经 HPLC 纯化的 GLuc circRNA 在 HEK293 中 24 h 表达高于所用线性对照，并将蛋白产生半衰期由约 43–45 h 延长至约 80 h，但作者同时观察到 Mg2+ 相关切口和先天免疫反应。[67] 这些数据是平台可行性的经典证据，不应被当作所有序列、所有递送和体内组织的普遍倍数。2. 如何制造：PIE、自剪接、酶促连接与化学环化 PIE 将 I 类内含子拆分并重排在外显子两侧，GTP/Mg2+ 驱动两次转酯生成共价环；优点是一步反应、可处理 kb 级 RNA，缺点是残留外显子/内含子“scar”、构建体依赖和副产物复杂。RNA/DNA splint 配合 T4 RNA ligase 可更精确控制接头，却要求末端化学状态和高有效局部浓度；化学连接适合较短 RNA，试剂残留和位点选择限制治疗级放大。2024 年的转剪接方案已展示超过 8 kb circRNA，并在纯化中比较先磷酸酶、再 RNase R、后 SEC-HPLC 等顺序，说明合成与纯化必须共同设计。[68]3. circRNA 纯化阶梯：先放大物性差，再做精密分离 第一层是酶法“放大差异”。RNase R 为 3′→5′外切酶，可优先消化多数线性前体和片段；碱性磷酸酶先去除线性 RNA 的 5′磷酸可改善某些组合流程。问题是强二级结构、G-rich 区域和短突出端会使部分线性 RNA 抗 RNase R，而 circRNA 在较高酶量、较长时间或不利 Mg2+/温度下可能先产生切口再被消化。因而 RNase R 适合作为富集和鉴别，不能单独作为“纯度证明”。[69] 第二层是按尺寸/构象分离。经典工作将 30 µg RNA 在 65°C 加热 3 min、冰浴 3 min后，上 4.6×300 mm、5 µm、200 Å SEC-HPLC 柱，以 RNase-free TE（10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 6）0.3 mL/min 分离；SEC-HPLC 后接 RNase R 得到约 90% 环状、约 10% 切口体，且细胞表达优于单用 RNase R。[67] 这套条件是机制案例，不是直接放大处方：长 circRNA 与线性前体水动力尺寸接近，SEC 分辨率随上样体积/浓度恶化，UV 暴露、柱表面吸附和长运行时间均可能诱发损失。 第三层是利用构象与疏水/电荷差异做 AEX 或 IP-RP。2025 年化学环化研究并行比较 IEC、SEC 与 RP，IP-RP 可把约 578–598 nt 的线性前体、环状体和线性二聚/串联体分开，并报告纯化后回收约为粗料的 75–90%；但短 RNA 的成功不能直接外推到多 kb 疫苗 circRNA。[70] AEX 更易水相放大，却可能因所有核酸高负电而分辨不足；IP-RP 分辨率高但有机溶剂、离子对残留、温度和压力成本较大。 Case study｜超滤为何能反超 SEC-HPLC2025 年研究用 30–300 kDa PES 膜测量   circRNA、线性前体与切口体的筛分系数并建立临界通量窗口；在研究尺度实现约 86% 纯度、超过 50% 收率，而同一研究中的 SE-HPLC 对照约为   41% 纯度、45% 收率。[71] 关键不是按名义分子量“一刀切”，而是闭环和线性构象具有不同水动力尺寸与膜传递；不过该方法仍需在更长序列、高浓度、膜批次、浓差极化和   RNase 控制上验证。 图 12｜circRNA 制造与纯化决策树：先用酶法扩大线性/环状差异，再以 SEC、AEX、IP-RP 或 UF 解决构象近似体；每条路线都需正交确认闭环与切口体。 表 5｜circRNA 纯化路线的适用边界 方法 主要选择性 优势 关键失败模式 RNase R ± 磷酸酶 自由末端/外切酶敏感性 简单、可先放大差异 抗酶线性体残留；环被切口后损失 变性 PAGE/琼脂糖 长度与拓扑 研发级分辨率高、直观 难放大、胶提取损失、残留与剪切 SEC-HPLC 水动力尺寸/构象 全水相、经典证据充分 低载量、近尺寸分辨不足、周期长 AEX 有效电荷与构象 水相、膜/整体柱可放大 电荷密度相近、强结合和拖尾 IP-RP 构象、疏水与离子对 高分辨，可拆分前体/环/串联体 溶剂、温度、残留、压力与容量 UF/TFF 构象相关筛分 设备简单、可连续和放大 浓差极化、临界通量、膜/序列依赖 放行分析必须证明“闭环”而不只是“看见一条带”：建议组合 junction 特异 RT-qPCR/测序、RNase R 前后质量平衡、RNase H 定位切割、变性/非变性 CE 或凝胶、SEC/AEX/IP-RP、dsRNA 免疫法和细胞翻译/先天免疫报告。对长 circRNA，还应把切口率、串联体、残余内含子、5′三磷酸线性体和环化接头序列列为独立 CQA。十四、企业是否值得布局：用能力树而不是热点清单做决策 值得布局的不是‘又一条通用 mRNA 新冠管线’，而是能积累复用能力的楔子：差异化脂质与组织递送；高选择性、高通量核酸纯化介质；稳健的帽/poly(A)/dsRNA   分析；冻干与常温稳定；个体化小批次数字化制造；或拥有明确临床优势的病原体/肿瘤适应证。 对已有抗体/重组蛋白平台的企业，mRNA 最有价值的切入点可能不是独立建一座完整工厂，而是把现有抗原结构、生物分析、临床与商业渠道嫁接到外部 RNA/LNP 能力；先用 1–2 个适应证验证，再决定纵向整合。对上游原料和设备企业，机会集中在非动物源高纯酶、帽类似物/修饰 NTP、低 RNase 一次性系统、对流型核酸介质、LNP 混合/在线检测和标准品。 对纯平台创业公司，融资与组织设计必须承认 mRNA 是‘材料科学 + RNA 生物学 + 免疫学 + CMC + 临床’的耦合系统。单项体外转染最高不等于候选物最好；应尽早以目标给药途径、重复给药、组织分布、炎症与可制造性联合淘汰。专利上要把脂质结构、配方、用途和工艺形成交叉保护，而不是依赖一件宽泛申请。 表 6｜三档企业布局策略 策略 适合企业 24 个月里程碑 止损信号 能力观察型 传统疫苗/蛋白企业、产业资本 建立内部评价模型；完成 2 个构建体委外 CMC；形成专利/管线数据库 无法定义相对现有产品的临床优势 楔子平台型 原料、耗材、设备、CDMO、递送创业公司 在 3–5 个序列证明容量/回收/效价；完成可放大与客户验证 性能只在报告基因成立，跨序列/放大失效 产品纵深型 具备临床与商业能力的生物药企 完成候选物、IND CMC、人体概念验证与许可边界 递送毒性/免疫原性无窗口，或疗效不优于标准治疗 最终判断可以浓缩成一句话：mRNA 已经被证明是一种药物平台，但尚未被证明能在每个适应证里成为最佳模态。未来赢家不会只拥有‘写信息’的能力，还要能把信息送到对的细胞、在对的时间表达、把错误 RNA 清除到足够低，并以可承受成本稳定放行。疫情给了赛道第一次规模验证；下一轮突破，将由递送、纯化和临床选择共同决定。说明与证据边界 证据边界：本文为技术与产业研究，不构成医疗建议、投资建议或专利法律意见。公司阶段与监管状态截至   2026-08-02；实验条件来自公开研究，只能作为工艺开发起点。涉及公司新闻稿的前瞻性表述已尽量与论文、监管或注册信息区分。参考文献与官方资料（共 71 项） 论文条目由 PubMed 元数据自动核验，优先提供 PubMed 与 DOI 链接；官方资料提供原始监管、年报、管线或专利页面。访问日期：2026-08-02。 1. Fernando P Polack, Stephen J Thomas, Nicholas Kitchin, Judith Absalon, Alejandra Gurtman, Stephen Lockhart et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England journal of medicine (2020). PubMed | DOI 2. Lindsey R Baden, Hana M El Sahly, Brandon Essink, Karen Kotloff, Sharon Frey, Rick Novak et al. Efficacy and Safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine. The New England journal of medicine (2021). PubMed | DOI 3. Moderna / U.S. SEC. Moderna 2025 Annual Report (Form 10-K) (2026). Official source 4. Eleanor Wilson, Jaya Goswami, Abdullah H Baqui, Pablo A Doreski, Gonzalo Perez-Marc, Khalequ Zaman et al. Efficacy and Safety of an mRNA-Based RSV PreF Vaccine in Older Adults. The New England journal of medicine (2023). PubMed | DOI 5. European Medicines Agency. Kostaive EPAR (2025). Official source 6. Jeffrey S Weber, Matteo S Carlino, Adnan Khattak, Tarek Meniawy, George Ansstas, Matthew H Taylor et al. Individualised neoantigen therapy mRNA-4157 (V940) plus pembrolizumab versus pembrolizumab monotherapy in resected melanoma (KEYNOTE-942): a randomised, phase 2b study. 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