CVnCoV Vaccine (CureVac)

本文对近两年14篇mRNA疫苗的综述文章进行梳理及重构，对mRNA疫苗的历史演进、序列设计、递送系统、免疫机制、生产质控、技术应用、当下挑战及未来趋势进行系统阐述，旨在构建一个覆盖mRNA疫苗从科学原理到产业化应用的全景知识体系。 【执行摘要】 mRNA 技术的成功，远不止于一款疫苗的诞生，它标志着一场深刻的医学范式革命 —— 从 “ 对症下药 ” 迈入 “ 按需编程 ” 时代。 mRNA疫苗技术已演进为一个可快速部署、高度灵活的“生物软件平台”。 以下六大结论支撑这一论断： 1.疫苗研发的范式革命：从 “ 单一产品 ” 到 “ 通用平台 ” mRNA 技术的颠覆性在于其 “ 信息与载体分离 ” 的核心架构。编码抗原的 mRNA 是一条可快速设计的遗传指令，而脂质纳米颗粒（ LNP ）则是模块化的递送系统。 当载体平台（LNP生产工艺）经过验证后，针对新靶点仅需重新设计mRNA序列，便可在数周内完成候选疫苗的构建。 这实现了 “ 一套生产体系，应对多重疾病 ” 的范式飞跃，将药物研发从漫长的定制化过程，转变为敏捷的模块化平台作业。 2.mRNA 疫苗的 技术双核： “ 序列优化 ” 与 “ 递送系统 ” 的协同进化 mRNA 疫苗的成功，建立在对其两大核心组分的系统性设计与工程之上：mRNA序列的精密编程与递送系统的持续革新。 1 ）mRNA的工程化 其基础是诺贝尔奖所表彰的核苷修饰（如假尿苷），它通过 “ 分子伪装 ” 大幅降低了 mRNA 的免疫原性并提升了翻译效率。在此之上，结合 AI 驱动的序列设计与精确的 UTR 调控， 现代治疗性mRNA已成为一条稳定、高效的高度工程化的生物指令。 2 ）LNP的智能化 LNP是功能实现的关键递送系统。 其核心 —— 可离子化脂质的分子设计（尤其是 pKa 值） —— 精准调控了细胞摄取、内体逃逸（ LNP 携带 mRNA 从细胞内吞囊泡中释放的关键步骤）与体内靶向。 新一代LNP正从被动的包裹材料，演进为集主动靶向、可控释放与免疫调节于一体的多功能递送平台。 3.免疫优势：双重信号协同塑造高质量应答 mRNA-LNP 疫苗卓越的免疫原性源于其协同激活两条先天免疫通路： mRNA翻译产生的抗原蛋白，提供特异性的“抗原信号”，而LNP载体则提供强烈的“危险信号”（佐剂信号）。 这种时空上的耦合有效驱动了强大的生发中心反应（即在淋巴器官内进行的、产生高亲和力抗体和记忆 B 细胞的关键过程），是产生长效、高亲和力抗体与免疫记忆的关键生物学基础。 当前的核心挑战在于精细调控这一双重信号的强度与平衡，以在实现强效保护的同时，最小化不良反应。 4.应用分化：在传染病与肿瘤领域引发双重革命 该平台在不同领域展现出迥异的颠覆性逻辑。 1 ）传染病预防（速度革命） 核心是 “ 快速响应 ” 与 “ 广谱防护 ” ，旨在将平台转化为应对未来疫情的公共卫生基础设施。 2 ）肿瘤治疗（个体化革命） 核心是 “ 精准定制 ” 与 “ 免疫微环境重塑 ” 。 “ 个体化新抗原疫苗 + 免疫检查点抑制剂 ” 的联合策略，正迅速确立为肿瘤免疫治疗的新范式，并在临床中取得里程碑式突破。 5.mRNA 技术核心瓶颈：已知原理下的工程攻坚 mRNA 技术的普及面临四大工程化挑战 ① 苛刻的低温储运链 ;② 肝外靶向递送精度不足 ;③ 免疫反应的精细调控 ;④ 个性化疫苗的成本与制备周期。这些问题的攻克是 mRNA 疫苗技术迈向下一阶段的关键。 6.mRNA 技术未来战场：竞争升维，从靶点争夺到平台对决 未来的竞争将超越对单个抗原的争夺，升级至“设计 - 生产 - 转化”全链条平台能力的较量。核心竞争力将体现：在于 AI 与自动化的深度融合、规模化与柔性生产的工艺水平，以及下一代平台技术（如自扩增 mRNA 、环状 RNA ）的临床转化速度。 结论：mRNA技术正在引领一场从 “治疗疾病”到“编程生命功能” 的医学革命。其终极影响将远超疫苗范畴，最终推动医学进入一个可预测、可编程、个性化的新时代。 01 mRNA 疫苗：COVID-19危机催化的生物医学范式革命 【本章TL;DR 】 传统疫苗平台在应对突发性、高变异性的新发传染病时暴露出致命短板。COVID-19大流行作为极限压力测试，催生了mRNA疫苗的全球应用。mRNA疫苗的成功彰显了其作为一种快速、灵活、安全的“平台技术”的颠覆性优势。 1.1 疫苗研发技术的演进与瓶颈 疫苗技术的演进史可分为三个主要阶段： 第一代疫苗（全病毒疫苗） 包括灭活疫苗和减毒活疫苗。其研发依赖于对病原体本身的培养和物理 / 化学处理，存在研发周期漫长（通常需数年）、减毒株毒力回复风险、对某些无法培养的病原体无效等固有局限。 第二代疫苗（亚单位/重组蛋白疫苗） 利用基因工程技术表达病原体的特定抗原蛋白（如乙肝疫苗、 HPV 疫苗）。虽然安全性提高，但其免疫原性往往较弱，需要强效佐剂，且生产工艺复杂，对快速变异的病原体响应迟缓。 第三代疫苗（核酸疫苗时期） 其核心是将编码抗原的遗传信息直接导入人体。主要包括 mRNA 疫苗、 DNA 疫苗，以及以病毒为载体的疫苗。它们利用宿主细胞合成抗原，模拟自然感染过程，能同时激发强大的体液免疫和细胞免疫。 传统疫苗平台在应对突发性、高变异性的新发传染病时暴露出致命短板。 2019 年底暴发的 COVID-19 全球大流行，彻底暴露了传统疫苗研发模式在时效性上的不足。正是在这一历史背景下， mRNA 疫苗以前所未有的速度从实验室走向全球接种，在创纪录的时间内完成了从病毒序列公布到疫苗上市的全过程，成功挽救了数百万生命。 1.2 mRNA 疫苗的登场 1) 两款COVID-19 mRNA疫苗的成功 COVID-19 全球大流行期间， Moderna 的 mRNA-1273 与辉瑞 /BioNTech 的 BNT162b2 两款 COVID-19 mRNA 疫苗在临床试验中展现出超过 94% 的保护效力，并在全球范围内大规模接种。这一成功绝非偶然，它是数十年坚持不懈的基础科学研究在关键时刻的集中爆发。 2) 诺奖里程碑：解决了mRNA疗法的根本性科学障碍 2023 年诺贝尔生理学或医学奖授予卡塔琳 · 考里科（ Katalin Karikó ）和德鲁 · 魏斯曼（ Drew Weissman ），表彰他们发现了核苷碱基修饰（特别是假尿苷）对于降低外源 mRNA 免疫原性的决定性作用。这一发现解决了 mRNA 疗法的根本性障碍： 如何让机体细胞将外来的治疗性mRNA“指令”识别为可执行的“自我信息”，而非需要清除的“病毒入侵信号”。 未经修饰的体外转录 mRNA 会被宿主细胞的模式识别受体（如 Toll 样受体）识别，触发强烈的 I 型干扰素反应，导致 mRNA 被降解并引发有害炎症。 假尿苷修饰成功地将mRNA“伪装”起来，大幅降低其免疫原性的同时，意外且显著地提升了其在细胞内的蛋白翻译效率。 这一突破是 mRNA 技术从理论设想走向临床应用的第一块也是最重要的科学基石。 3) mRNA疫苗研究全面爆发 据文献计量学分析（基于 2015-2024 年全球论文数据）， COVID-19 大流行是 mRNA 研究明确的分水岭，全球论文发表量在 2020 年后呈指数增长。国家竞争力呈现三级梯队：美国与德国在论文总量与影响力（学科规范化的引文影响力， CNCI 分别高达 4.91 和 3.82 ）上均领先全球；中国论文发表总量高居第二，展现了巨大研发活力，但影响力指标（ CNCI 为 1.66 ）仍有提升空间，可能反映了再影响力层面仍有提升空间。 1.3 mRNA 技术的平台化优势 1 ） mRNA 疫苗 平台技术 的颠覆性优势 表 1 ： mRNA 疫苗与传统疫苗平台特性比较 ”  特性 mRNA疫苗 传统灭活/减毒疫苗 重组蛋白/病毒载体疫苗 研发速度 极快（数周） 慢（数年） 中（数月到数年） 生产工艺 标准化、无细胞体系 复杂，需培养活病毒 较复杂，需蛋白表达纯化或病毒培养 免疫应答 全面（强体液+强细胞免疫） 通常细胞免疫较弱 依赖类型，病毒载体可诱导细胞免疫 安全性 高（不进入细胞核，无整合风险） 减毒株有毒力回复风险 病毒载体可能存在预存免疫或罕见不良反应 应对变异 极灵活，仅需更换编码序列 不灵活，需重新培养毒株 较灵活，但需重新设计表达系统 生产规模 易于快速扩大 扩大生产受制于病毒培养能力 扩大生产有一定复杂性 2 ） mRNA 疫苗的平台优势的意义 一旦建立成熟的生产流程，同一套设施和工艺可用于生产针对不同疾病的mRNA疫苗，只需更换抗原编码序列，真正实现了“一个平台，多种疫苗”的愿景。 02 技术基石：mRNA分子的精密编程与工程化艺术 【本章TL;DR 】 一条高效、安全的治疗性mRNA并非天然分子，而是一条经过多重维度精密工程化改造的“精装指令”。 其设计目标是：最大化翻译效率、延长体内半衰期、最小化不必要的免疫原性。其技术核心在于：对5‘帽、UTRs、ORF、Poly(A)尾的逐一优化，以及最关键的核苷修饰（如假尿苷），后者是降低免疫原性、提升翻译效率的诺奖级基石。 2.1 核心结构元件与功能优化 图1 核心结构元件与功能优化 1) 5‘端帽子结构（5’ Cap） 功能： ①翻译起始的 “ 开关 ” ：与真核翻译起始因子 4E 结合，是启动核糖体组装的关键信号。②稳定性的 “ 保护帽 ” ：保护 mRNA 5‘ 端免受核酸外切酶的降解。 类型与选择： Cap0 、 Cap1 、 Cap2 ，其中 Cap1 结构（在 m7GpppN 后第一个核苷的 2‘-O 位甲基化）是哺乳动物细胞中最常见的形式，能有效避免被细胞质传感器（如 IFIT 蛋白）识别，降低先天免疫反应。临床首选 Cap1 。 加帽工艺： “ 一步法 ” （共转录加帽，如使用 CleanCap 技术）和 “ 二步法 ” （转录后酶促加帽）。 CleanCap 技术能将加帽效率提升至 94% 以上，是工业化生产的关键。 降解机制： 5‘ 帽的移除是 mRNA 降解的关键步骤。 DCP1/DCP2 脱帽酶复合物负责经典的 5‘→3‘ 降解途径，而 DCPS 酶则参与 3‘→5‘ 降解途径。 2) 5‘和3’非翻译区（UTRs） 功能 ：不编码蛋白，但作为 “ 控制台 ” ，精细调控 mRNA 的稳定性、翻译效率、亚细胞定位和翻译起始。 设计策略 ： · 5‘-UTR ：应避免上游开放阅读框（ uORFs ），防止错误翻译起始。通常引入优化的 Kozak 序列（ GCCRCCAUGG ）以确保准确起始。长度宜短小，并使用来自高表达基因（如人 α/β- 珠蛋白、热休克蛋白）的稳定 UTR 序列。 · 3‘-UTR ：可引入富含嘧啶的稳定元件，或使用已知能延长半衰期的序列（如人 β- 珠蛋白 3‘-UTR ）。其与 5‘ 帽的协同作用对维持 mRNA 稳定性和高效翻译至关重要。 优化效果 ：通过理性设计或高通量筛选获得的最优 UTR 组合，可使抗原蛋白表达量提升 5-10 倍甚至更高。 3) 开放阅读框（ORF）优化 密码子优化 在不改变氨基酸序列的前提下，将稀有密码子替换为宿主细胞（如人细胞） tRNA 池中丰度 高的同义偏好密码子 。哺乳动物细胞偏好第三位为 G 或 C 的密码子。优化后能显著提升翻译延伸速率和总蛋白产量。 AI驱动设计 传统密码子优化可能忽视 mRNA 二级结构。革命性的人工智能算法（如 LinearDesign ）能同时优化密码子使用和 mRNA 的二级结构稳定性，在数分钟内从海量序列可能性中找出表达最优解。有研究表明， AI 设计的 COVID-19 mRNA 序列，其中和抗体滴度可达传统设计方法的 20倍以上 。 GC含量 提高 ORF 的 GC 含量不仅能优化密码子，还能增强 mRNA 的化学稳定性和二级结构稳定性。 4) 3‘端多聚腺苷酸尾（Poly(A) Tail） 功能 ①协同稳定：与 5‘ 帽协同，保护 mRNA 3‘ 端免受降解，并共同促进翻译。②核质转运：作为 mRNA 出核的标志之一。 长度要求 研究表明，长度在 100-150个腺苷酸 的 Poly(A) 尾能实现最高水平的蛋白表达和稳定性。一旦长度被降解缩减至 10-12 个核苷酸，便会触发脱帽和 mRNA 的快速降解。 制备方法 可通过在 DNA 模板中编码 Poly(A) 序列进行 模板转录 ，获得长度均一的 Poly(A) 尾，有利于工业化质控；也可通过转录后 酶促加尾 。 2.2 诺贝尔奖核心：核苷修饰的革命 1) 机制 ：用 假尿苷（ψ） 或 N1-甲基假尿苷（m1ψ） 完全取代尿苷，使 mRNA 在结构上更类似于哺乳动物内源性 RNA ，从而逃逸多种模式识别受体的监测。 2) 效应 ： a) 大幅降低免疫原性 ：减少 TLR7/8 、 RIG-I 、 MDA5 、 PKR 、 OAS/RNase L 等通路被激活，避免有害的 I 型干扰素风暴和炎症反应。 b) 显著提高翻译效率 ：机制尚未完全阐明，可能与减轻 PKR 等翻译抑制通路的激活有关，使核糖体能更高效地 “ 阅读 ”mRNA 。 c) 增强稳定性 ：修饰后的 mRNA 对核酸酶的抵抗力可能增强。 3) 临床验证 ：未修饰 mRNA 疫苗（如 CureVac 的 CVnCoV ，效力约 47% ）与修饰 mRNA 疫苗（ BNT162b2 和 mRNA-1273 ，效力 >90% ）在临床试验中的显著效力差距，突出体现了核苷修饰对于实现高效保护的关键作用。 4) 其他修饰 ： 5- 甲基胞苷、 2- 硫尿苷等修饰也被证明有助于降低免疫原性。 2.3 下一代mRNA平台：超越线性思维 为克服传统线性 mRNA 表达时间短、需要高剂量的局限，新型 mRNA 平台正在兴起： 1) 自扩增mRNA（saRNA） a) 原理 ：源自甲病毒等，在编码抗原的 ORF 之外，还编码 病毒复制酶 。进入细胞后， saRNA 能以自身为模板进行 自我复制 ，产生大量子代 mRNA 。 b) 优势 ： 极低剂量 （可比传统 mRNA 低数百至上千倍）即可实现 长时间、高产量 的抗原表达，单次接种可能产生更强的免疫保护。例如，研究发现， 1.25 µg 的 SAM 疫苗在诱导对流感病毒的保护水平上，相当于 80 µg 普通非复制 mRNA 疫苗。 c) 挑战 ：序列更长、更复杂，潜在的免疫原性需要精细调控，生产工艺要求更高。 2) 环状RNA（circRNA） a) 原理 ：通过共价键形成闭合环状结构， 没有游离的5‘帽和3’Poly(A)尾 。 b) 优势 ： · 卓越稳定性 ：对核酸外切酶具有极强抵抗力。研究表明，其在小鼠体内的半衰期可达传统线性 mRNA 的 2.5 倍以上，为长效疫苗或治疗提供了可能。 · 低免疫原性 ：环状结构天然免疫原性低。 · 长效表达 ：可通过内部核糖体进入位点（ IRES ）驱动蛋白翻译，适合需要长效治疗的领域。 c) 挑战 ：大规模生产工艺、高效环化技术、翻译效率的优化仍在探索中。 03 递送革命：穿越生物屏障的智能纳米载体 【本章TL;DR 】 裸露的mRNA带负电，无法穿透细胞膜自行进入细胞，高效、安全的递送系统是mRNA疫苗成功的第二基石。 脂质纳米颗粒（LNP）是目前最成功的非病毒递送平台，其四组分（可离子化脂质、辅助磷脂、胆固醇、PEG脂质） 各司其职，通过“内体逃逸”机制释放mRNA。现阶段前沿研究致力于使LNP智能化，实现器官/细胞特异性靶向，并集成免疫调节功能。 3.1 LNP 的经典四组分系统及其功能 1 ） 脂质纳米颗粒（LNP）是目前临床最成功的非病毒递送平台。 其由如下四种核心组分构成。 表 2 经典 LNP 四组分及其功能 组分 典型代表 核心功能与作用机制 可离子化脂质 SM-102, ALC-0315, DLin-MC3-DMA 核心组分。在酸性缓冲液（pH~4）中质子化带正电，通过静电作用高效包裹带负电的mRNA；在生理pH（~7.4）下恢复中性，极大降低系统毒性，延长血液循环时间。其pKa值（通常6.0-6.9）是决定体内行为的关键：影响肝靶向性（pKa 6.2-6.5更优）和局部递送效率。 结构/辅助磷脂 DSPC, DOPE 稳定脂质双层，辅助膜融合。DSPC能稳定颗粒结构；DOPE具有促进膜融合的特性，有助于mRNA从内体中释放。不同磷脂还影响LNP的体内分布（如DOPE倾向于脾脏积累）。 胆固醇 天然胆固醇 “分子胶水”与功能调节剂。填充脂质分子间隙，增强LNP的稳定性和刚性。通过模拟低密度脂蛋白（LDL）成分，有助于介导细胞通过LDL受体摄取LNP。其衍生物（如β-谷甾醇）可改变LNP形态，提升递送效率。 PEG化脂质 DMG-PEG2000, ALC-0159 隐形与稳定外衣。锚定在LNP表面，通过空间位阻效应防止储存时聚集，减少注射后血清蛋白吸附和非特异性免疫细胞（如巨噬细胞）的快速清除，从而延长体内循环半衰期。 2 ） LNP 的作用机制（ “ 特洛伊木马 ” 策略）： 包裹与保护 在酸性条件下，可离子化脂质带正电，与 mRNA 结合并自组装成纳米颗粒，形成物理保护层。 细胞摄取 主要通过网格蛋白或小窝蛋白介导的 内吞作用 进入细胞，形成内体。 内体逃逸（关键步骤） ： 内体酸化（ pH 降低）使可离子化脂质再次质子化，诱发脂质相变或形成非双层结构， 破坏内体膜 ，将 mRNA 释放到细胞质中。 翻译与降解 释放的 mRNA 利用宿主细胞翻译机器合成抗原蛋白，随后被天然代谢途径降解。 3.2 从递送载体到集成平台：LNP的智能化升级 新一代LNP正从单纯的“运输工具”进化为集递送、靶向、免疫调节于一体的“智能化平台”。 1) 组分精细化与新型脂质发现 可离子化脂质库 通过组合化学与高通量筛选，已发现 cKK-E12 、 C12-200 、 3060i10 等一系列高效脂质。可电离磷脂（ iPhos ） 如 9A1P9 的出现，其递送效率远超传统磷脂（ DSPC 的 40 倍， DOPE 的 965 倍）， 并能实现器官选择性靶向。 胆固醇工程 ：用 β- 谷甾醇替代胆固醇，可使 LNP 从球形变为多面体形， 显著提高细胞摄取和内体逃逸效率。 将部分胆固醇替换为 7α-羟基胆固醇 ，可调节内体运输通路，将 T 细胞的 mRNA 转染效率提高 2倍 。 PEG替代策略 ：为应对 抗PEG抗体 引起的加速血液清除和潜在超敏反应，研究人员开发了 聚肌氨酸脂质 等新型隐形材料， 在保持稳定性的同时避免免疫原性问题。 2) 器官与细胞特异性靶向技术 静脉注射的 LNP 天然倾向在肝脏富集（ >70% ）。为实现 mRNA 在肝外组织的精准递送，尤其是将疫苗靶向免疫器官，发展出多种策略： SORT技术 在经典四组分 LNP 中添加带有永久正、负或可电离电荷的 第五种脂质分子 ，通过精确调控 LNP 的最终表面电荷，可实现将 mRNA 选择性递送至 肺、脾 等器官。 脂质结构工程 设计具有特定化学结构的可离子化脂质。例如，含 酰胺键 的脂质倾向于靶向肺；基于 咪唑 的脂质倾向于靶向脾脏和 T 细胞。 配体修饰（主动靶向） 在 LNP 表面通过化学偶联或后插入法，连接 抗体、抗体片段、肽段或小分子配体 。例如，用抗 CD4 抗体修饰可靶向 CD4+ T 细胞；用靶向 EGFR 的配体修饰可靶向实体瘤细胞。 3) 佐剂 - 递送一体化系统 LNP 不仅是递送载体，其本身也是 强效的固有免疫激活剂（内在佐剂） 。在此基础上，可将外源免疫刺激分子直接整合，实现协同增效。 a) 内在佐剂效应 ：空载 LNP 即可激活免疫细胞，诱导 IL-6 等细胞因子产生，促进生发中心 B 细胞和滤泡辅助性 T 细胞反应，增强疫苗效力。 b) 外源佐剂整合与理性设计 ：将 Toll 样受体激动剂等免疫刺激分子共包封于 LNP 中是常见策略。更具创新性的是 理性设计兼具免疫调节功能的脂质分子 。例如，研究将含有 PD-1 抑制肽段的新型脂肽 SQ18 掺入 LNP ，形成 LP-LNP 。该系统不仅高效递送 mRNA ，其 SQ18 组分还能在体内发挥免疫检查点抑制功能，主动促进树突状细胞成熟和抗原交叉呈递，在小鼠模型中显著提升抗肿瘤免疫效果。这代表了从 “ 简单混合 ” 到 “ 分子水平功能集成 ” 的下一代疫苗载体设计思路。 3.3 其他递送技术谱系 1 ）各类技术的特点对比 尽管 LNP 在临床上占据主流，但多元化的递送方案为不同应用场景（如局部给药、特定细胞靶向、成本控制）提供了重要的补充和未来潜力。 表 3 不同递送系统分类与概述 递送系统大类 代表技术 核心原理 主要优势 主要局限性 物理方法 电穿孔， 基因枪， 微针 通过物理能量（电、压力）或机械方式临时打开细胞膜或皮肤屏障。 转染效率高（电穿孔）， 无需复杂载体， 微针无痛。 可能损伤细胞/组织， 体内应用受限，   设备依赖。 脂质系统 LNP， 阳离子脂质体， 脂质多聚复合物 脂质分子通过静电和疏水作用包裹mRNA，形成纳米颗粒。 LNP：临床验证、高效、相对安全、可规模化。 LNP肝靶向为主， 稳定性挑战， 潜在炎症反应。 聚合物系统 聚乙烯亚胺， 聚β-氨基酯，   树枝状聚合物 带正电的聚合物凝聚mRNA，通过“质子海绵效应”等促进内体逃逸。 结构可调， 易于修饰， 某些聚合物可生物降解。 毒性可能较高， 体内行为复杂， 临床转化较少。 蛋白质/肽系统 鱼精蛋白复合物， 病毒样颗粒， 细胞穿透肽 利用蛋白质/肽的阳离子性或特殊结构结合并递送mRNA。 生物相容性好， 鱼精蛋白有佐剂效应，   VLP仿病毒入侵。 负载量有限， 可能引发免疫反应， 大规模生产挑战。 无机纳米颗粒 金纳米粒， 介孔二氧化硅， 磷酸钙 无机材料吸附或包封mRNA，利用其独特理化性质。 稳定性好， 易于表面功能化， 某些材料（如磷酸钙）有佐剂性。 生物降解性存疑， 长期安全性需评估， 递送效率通常较低。 2 ）新型递送系统案例 除了 LNP ，新型材料不断涌现。例如，基于核苷 ( 酸 ) 的脂材（如 DNCA ）通过与核酸的氢键作用自组装，联合阳离子脂材（ CLD ）可在小鼠模型中高效递送 COVID-19 mRNA ，诱导强烈的体液和细胞免疫，展示了作为新型可离子化脂质替代物的潜力。 3 ）递送系统的未来方向 开发更高效、更安全、更稳定且能实现精准靶向的新型递送系统，是突破当前 LNP 局限、拓展 mRNA 疗法疆域的关键。 3.4 给药途径比较 目前获批疫苗普遍采用肌肉注射，以平衡安全性、有效性与便利性。 1) 肌肉注射操作简便，是多数获批疫苗方式； 2) 皮下注射可直接靶向淋巴结树突状细胞； 3) 皮内注射可利用皮肤丰富免疫细胞； 4) 静脉注射虽能实现全身快速分布，且常报道可获得最高的总蛋白表达量，但系统性反应可能更强。 04 免疫解码：mRNA-LNP疫苗激活免疫系统的免疫机制 【本章TL;DR 】 mRNA-LNP疫苗卓越的免疫原性源于其协同激活双重先天免疫信号：mRNA作为“抗原指令”，LNP作为“危险信号”。这共同驱动了抗原提呈细胞成熟与生发中心反应，从而产生高质量抗体和记忆细胞。mRNA-LNP疫苗卓越的免疫原性源于其能协同激活两条强大的先天免疫信号通路，共同塑造高质量、持久的适应性免疫应答。 4.1 双重先天免疫信号的激活 1) 信号一：mRNA作为“病原相关分子模式”（PAMP） 识别受体 ：外源 mRNA 可被多种模式识别受体（ PRR ）在不同细胞区室识别： i. 内体中 ： TLR7/8 识别单链 RNA 。 ii. 细胞质中 ： RIG-I 和 MDA5 识别双链 RNA （ dsRNA ）结构； PKR 被 dsRNA 激活后磷酸化 eIF2α ，抑制翻译； 2‘-5’ 寡聚腺苷酸合成酶（ OAS ） /RNase L 通路被激活可降解 RNA 。 修饰的核心作用 ： 假尿苷等核苷修饰的核心价值在于精细调控此信号。它并非完全消除，而是抑制这些通路的过度激活，从而将细胞资源从强烈的抗病毒防御状态，转向高效的抗原蛋白生产。适度的 I 型干扰素和促炎细胞因子（如 IL-6 ， TNF-α ）产生，实际上有利于抗原提呈细胞（ APC ）的成熟、迁移和共刺激分子表达，起到 “ 自我佐剂 ” 作用。 2) 信号二：LNP作为“损伤相关分子模式”（DAMP） 固有免疫激活  LNP载体本身是强效的固有免疫激活剂 。 研究表明，注射 空载的LNP 即可在局部引发炎症细胞浸润，并快速诱导一系列趋化因子（ CXCL1, CXCL10 等）和细胞因子（ IL-6, IL-1β,      GM-CSF ）的产生。 潜在机制  LNP 可能通过激活 TLR4 、 NLRP3 炎症小体、 STING 等通路被免疫细胞感知。 关键细胞因子IL-6 LNP 诱导产生的 IL-6是滤泡辅助性T细胞早期分化和生发中心形成的必需因子 。动物实验证实， IL-6 缺陷小鼠或使用抗 IL-6 抗体阻断后， LNP-mRNA 疫苗诱导的 Tfh 和 GC B 细胞反应显著受损。 4.2 适应性免疫应答的精确塑造 两条先天信号共同创建了一个富含细胞因子和成熟APC的促免疫微环境，进而精确驱动适应性免疫，最终形成免疫记忆。 1) 抗原加工与提呈 ： mRNA 在 APC （主要是树突状细胞）胞质中翻译的抗原蛋白，被蛋白酶体降解为肽段，通过 MHC I 类途径提呈给 CD8+ T 细胞，诱导 细胞毒性T淋巴细胞（CTL） 反应。同时，部分抗原可通过自噬或交叉提呈等途径进入 MHC II 类途径，激活 CD4+ 辅助性T细胞 。 2) 生发中心反应与抗体成熟 ：活化的 CD4+ T 细胞在 LNP/ 细胞因子（特别是 IL-6 ）驱动下，分化为 滤泡辅助性T细胞 ，迁移至淋巴滤泡，帮助 B 细胞活化、增殖，并在生发中心内发生抗体类别转换、亲和力成熟，最终产生 长效、高亲和力的中和抗体 以及 记忆B细胞 。 3) 免疫记忆形成 ：上述过程最终产生抗原特异性的 记忆性CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和记忆B细胞 ，为机体提供长期免疫保护。 这种“抗原特异信号”（mRNA编码的抗原）与“危险佐剂信号”（mRNA修饰残留的免疫刺激+LNP的强效激活）在时空上的紧密耦合，是mRNA-LNP疫苗能够诱导平衡、强大且持久免疫保护的分子基础。 图2 mRNA-LNP疫苗免疫机制概要 05 mRNA 技术应用全景：从人类健康到动物疫病 【本章TL;DR 】 mRNA平台的应用正快速扩张。在传染病预防领域，其核心价值是“快速响应”，未来方向是广谱疫苗。在肿瘤治疗领域，核心是“个体化新抗原疫苗”，其成功依赖于与免疫检查点抑制剂的联合。此外，在蛋白替代疗法和兽医传染病防控方面也展现出巨大潜力，后者虽处早期，但针对口蹄疫、流感等疫病的研究已显成效。 5.1 传染病预防：快速响应与广谱保护 1) 成功典范——COVID-19 ：全球首次大规模验证了 mRNA 平台的 极限速度 （从序列到临床仅数月）和 卓越效力 （ >90% ）。多款疫苗（ BNT162b2 ， mRNA-1273 ， 国产 SYS6006 等）上市，其中 SYS6006 的独特优势在于可在 2-8°C 稳定至少 6 个月。 2) 未来挑战与突破 ： 流感 研发多价或 “ 通用流感疫苗 ” ，编码多个保守抗原，以应对病毒快速变异。 Moderna 的 mRNA-1010 （季节性四价）和 “ 泛流感 ” 疫苗已进入临床。 呼吸道合胞病毒（RSV）  Moderna 的 mRNA-1345 于 2024 年获 FDA 批准，成为首款 RSV mRNA 疫苗。 HIV等复杂病原体 利用 mRNA 平台进行 “ 种系靶向 ” 顺序免疫，引导免疫系统产生广谱中和抗体，代表疫苗设计的最高复杂度。 其他 针对巨细胞病毒、狂犬病、寨卡病毒、疟疾等的 mRNA 疫苗均在积极研发中。 5.2 肿瘤免疫治疗：个性化医疗解决方案 这是mRNA技术最具颠覆性的领域，其核心是利用患者自身的肿瘤突变作为靶点，实现“量体裁衣”。鉴于肿瘤免疫抑制微环境的复杂性，mRNA疫苗与免疫检查点抑制剂等疗法的“联合治疗”已成为标准甚至必要的临床策略，而非简单的增效选择。 1) 抗原策略 mRNA 癌症疫苗的核心是利用肿瘤抗原激活特异性免疫。根据抗原来源，策略可分为四类，精准度与个体化程度递增： 编码病毒抗原的疫苗： 针对由病毒直接引发的癌症，如 HPV 相关宫颈癌（疫苗如 BNT113 ）、 EBV 相关鼻咽癌等。 编码肿瘤相关抗原的疫苗： 靶向在肿瘤中过表达但在某些正常组织也存在的自身抗原（如 NY-ESO-1, MAGE-A3 ）。代表产品 BNT111 在黑色素瘤患者中显示出良好的免疫原性，但因可能引发免疫耐受，常需与免疫检查点抑制剂联用。 编码肿瘤特异性新抗原的疫苗： 针对肿瘤细胞独有的基因突变产生的抗原，是真正“个体化”治疗的体现。例如，针对 KRAS G12D 等突变的 mRNA-5671 ，以及明星产品 mRNA-4157 （ V940 ）。后者在联合帕博利珠单抗用于黑色素瘤术后辅助治疗的临床试验中取得突破性成果，已于 2023 年获 FDA 批准，确立了“术后 mRNA 新抗原疫苗 +PD-1 抑制剂”防复发的新范式 编码免疫调节因子的疫苗： 不直接编码抗原，而是通过表达细胞因子（如 IL-12 ， IL-23 ）或共刺激分子（如 OX40L ）来重塑肿瘤微环境，增强抗肿瘤免疫。例如， mRNA-2752 （编码 OX40L/IL-23/IL-36 γ）正用于实体瘤或淋巴瘤的临床试验。 2) 临床突破性进展： mRNA-4157（V940）    + 帕博利珠单抗 用于高危（ III/IV 期）黑色素瘤术后辅助治疗。 IIb 期数据显示，联合疗法将复发或死亡风险降低 49% ，远处转移或死亡风险降低 62% ，已于 2023 年获 FDA 批准。这确立了 “ 术后 mRNA 疫苗 +PD-1 抑制剂 ” 联合防复发的全新治疗范式。 BNT122 + 阿特珠单抗+化疗 用于胰腺导管腺癌术后辅助治疗。最新数据显示，疫苗诱导的免疫反应可持续长达 3年 ，且与新抗原特异性 T 细胞反应和复发风险降低相关。 广泛探索 针对非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等实体瘤的 mRNA 疫苗临床试验广泛开展，多数采用联合治疗方案。 3) 联合治疗范式： 为克服肿瘤免疫抑制微环境， “mRNA 疫苗 + 免疫检查点抑制剂（ PD-1/PD-L1 抗体） ” 已成为标准策略，并可联用化疗、放疗、细胞疗法等，形成协同抗肿瘤免疫。 5.3 mRNA 蛋白替代疗法与遗传病治疗 mRNA 可作为 “ 临时基因 ” ，指导细胞生产其自身缺失或功能缺陷的蛋白质。 1) 原理 ：将编码功能性蛋白的 mRNA 递送至靶器官（如肝脏），实现体内瞬时蛋白生产。 2) 应用 ：治疗甲基丙二酸血症（ mRNA-3927 ）、囊性纤维化（ VX-522 ）、心脑血管疾病、代谢性疾病等。此外，也可用于体内生产治疗性抗体或细胞因子。 5.4 应用扩展：兽医传染病防控—一个潜力巨大的前沿领域 mRNA 平台快速、灵活的优势，在应对重大动物疫病及人兽共患病方面展现出巨大战略潜力。尽管目前兽用 mRNA 疫苗研发整体尚处早期，但已在多个关键病原上取得鼓舞人心的进展： 1) 优势 ：快速响应、能激发全面免疫、易于构建多价疫苗。 2) 研发现状 口蹄疫（FMD）mRNA疫苗： 基于 O 型口蹄疫病毒结构蛋白 VP1 的 mRNA 疫苗，在小鼠模型中可同时诱导体液免疫和细胞免疫，为开发新一代稳定、高效的 FMD 疫苗提供了新思路 狂犬病mRNA疫苗： 非复制型 mRNA 疫苗 CV7201 编码狂犬病毒糖蛋白，在小鼠和家猪的试验中，所有剂量组均成功诱导出中和抗体，证明了其有效性。自扩增型 mRNA 疫苗也已在临床前探索中。 高致病性禽流感（HPAI）多价mRNA疫苗： 研发可同时编码 20 种甲型和乙型流感病毒亚型血凝素抗原的多价 mRNA-LNP 疫苗，展示了利用 mRNA 平台应对病毒快速变异、实现广谱预防的可行性。 其他人兽共患病： 在弓形虫病防治中， LNP 包裹的自扩增 mRNA 疫苗可诱导小鼠产生持久保护（攻击后 6 个月内无临床症状）。针对猴痘病毒，已有研究机构成功研发了候选 mRNA 疫苗（如 VGPox 系列），并在小鼠模型中验证了其诱导中和抗体与有效免疫保护的能力。 3) 挑战与前景 兽用领域对疫苗成本极为敏感， 且需适应大规模免疫的给药方式（如口服、气雾）。当前研究相对人类传染病领域仍较缺乏，但 mRNA 疫苗在应对非洲猪瘟等突发烈性动物传染病方面的潜力已获公认。 06 mRNA疫苗的生产工艺与质量控制体系 【本章TL;DR 】 mRNA疫苗的产业化依赖于一套标准化、可放大的生产体系，涵盖质粒制备、IVT转录、LNP包封、制剂灌装五大环节。微流控混合和dsRNA杂质去除是关键工艺点。质量控制的全球监管框架已初步建立，需重点关注mRNA完整性、LNP理化特性及无菌保障。 6.1 生产工艺全流程与关键工艺 1 ） mRNA 疫苗生产关键关节 表4 mRNA疫苗生产流程描述 生产环节 核心步骤与描述 关键工艺与设备 1. 质粒DNA模板制备 工程菌发酵培养 → 菌体裂解 → 质粒纯化 → 线性化酶切（产生IVT模板）。 发酵罐、层析色谱系统、超滤系统。 2. mRNA体外转录与纯化 IVT反应（以线性化质粒为模板，在无细胞体系中合成mRNA，可共转录加帽） → DNA酶消化去除模板 → 色谱纯化去除杂质（酶、核苷酸、关键杂质dsRNA）。 生物反应器、层析系统。dsRNA去除是关键纯化目标。 3. LNP包封（最核心工序） 微流控混合技术：将溶解于酸性缓冲液的mRNA水相，与溶解于乙醇的脂质有机相，以精确比例和流速混合，自组装形成mRNA-LNP。随后透析/超滤除去乙醇、置换缓冲液。 微流控混合设备（芯片或射流混合器）。控制参数：流速比、总流速、温度、浓度。 4. 制剂中间体与成品配制 向mRNA-LNP中间体中加入缓冲液、冷冻保护剂（如蔗糖）、稳定剂等，配制为半成品。 混合罐、超滤/渗滤系统。 5. 无菌灌装与包装 半成品经除菌过滤后，在无菌环境下进行灌装（可能包括冻干步骤以提升稳定性） → 加塞、压盖、包装。 无菌灌装线、冻干机。 2 ）关键工艺点： 质粒线性化效率 需完全线性化以确保转录出正确长度的 mRNA 。 IVT原料质量控制  T7 RNA 聚合酶、核苷酸、帽类似物等原料的纯度至关重要。 dsRNA杂质的去除  IVT 副产物 dsRNA 是强效的先天免疫激活剂，会抑制抗原翻译并增加不良反应，必须通过 高效纯化工艺 将其控制在极低水平。 微流控包封的均一性 确保不同生产批次间 LNP 的 粒径、多分散系数（PDI）、包封率 高度均一，是保证疫苗效力和安全性的核心。 无菌与容器密封性 全程无菌操作，并对最终容器进行密封性验证。 6.2 全球监管框架与质量控制标准 随着 mRNA 疫苗上市，全球监管机构已建立起初步的指导框架。 表 5 mRNA 疫苗质量控制相关指南 监管机构/组织 核心指南文件 主要特点与关注点 中国NMPA 《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》（2020） 中国首个mRNA疫苗专门指南，明确了应急状态下研发的药学要求。提出了“制剂中间产物”质控概念。 WHO 《传染性疾病预防用mRNA疫苗质量、安全性和有效性评价的监管考虑》（TRS 1039附录3， 2022） 首部全球性mRNA疫苗法规指南，为各国监管提供重要参考。 美国FDA 针对COVID-19 mRNA疫苗的问答文件及指南 基于首批上市产品的审评经验，提出了详细要求。 美国药典（USP） 《mRNA疫苗质量分析方法》草案（第1、2版） 提供了具体的检测方法细节和操作规范，致力于建立全球统一的分析标准。 国际GMP PIC/S 附录1（无菌药品）、附录2B（生物制品） mRNA疫苗生产需符合国际药品生产质量管理规范（GMP）的相关要求。 6.3 全链条质量控制要点（基于多指南文件） 1 ）关键质控项目：贯穿从起始物料到成品的全过程 表6：mRNA疫苗关键质控项目梳理 检测阶段 核心质控属性 关键检测项目举例 常用检测方法 质粒DNA模板 鉴别、纯度、安全性 序列确认、超螺旋含量、宿主DNA/蛋白残留、内毒素、无菌。 测序（NGS）、HPLC/CE、qPCR、ELISA、LAL。 mRNA原液 鉴别、含量、完整性、纯度、效力 序列确认、浓度、完整性、5‘加帽率、3‘ Poly(A)尾长度、dsRNA残留、DNA模板残留、游离核苷酸、蛋白表达效力。 测序、qPCR/UV、CE/CGE、RP-LC-MS/MS（加帽率）、IP-RP-HPLC（Poly(A)尾）、ELISA/HTRF（dsRNA）、细胞效价分析。 制剂中间体(mRNA-LNP) 物理特性、包封效率 粒径 & PDI、Zeta电位、mRNA包封率、外观、pH。 动态光散射（DLS）、RIBOGreen等荧光法（包封率）。 mRNA疫苗成品 鉴别、含量、物理特性、纯度、效力、安全性 mRNA序列确认、脂质鉴别、浓度与包封率、粒径 & PDI、可见异物、脂质氧化产物、体内/外效价、无菌、内毒素、容器密封性。 测序、RP-HPLC-CAD（脂质）、荧光法（浓度）、DLS、SEC-HPLC（聚集）、细胞/动物效价、培养法/快速微生物检测。 2 ）特殊挑战： 标准品与参比品 目前尚缺乏全球统一的 mRNA 疫苗标准品，各企业自建标准，给质量对比和监管带来挑战。 分析方法的标准化 如 dsRNA 检测、加帽率分析等方法学需进一步统一和验证。 实时放行检测 由于 mRNA 产品稳定性挑战，开发快速、可靠的实时放行检验方法尤为重要。 07 当前挑战与未来战略方向 【本章TL;DR 】 mRNA技术迈向更广泛应用面临的核心挑战已从科学原理转向工程实现，主要包括：稳定性（冷链依赖）、靶向递送精度、免疫反应精细调控、免疫持久性以及个性化生产的成本与速度。未来突破将依赖于AI与自动化的深度融合、新型平台技术（如环状RNA）的临床转化，以及构建柔性生产体系和全球健康基础设施。 7.1 核心科学与技术挑战 1) 稳定性与苛刻的冷链依赖 现状 ：现有 LNP-mRNA 疫苗多需在 -20°C至-70°C 下储运（如 BNT162b2 在 2-8°C 仅稳定 5 天），严重制约了全球，特别是资源匮乏地区的公平可及性。 突破方向 ： · 制剂优化 ：开发 冻干制剂 是最有前景的路径，相关研究和技术（如优化冻干保护剂）正在推进。国产疫苗 SYS6006 已在 2-8°C 实现长期稳定，验证了可行性。 · LNP与mRNA结构优化 ：筛选更稳定的脂质配方，开发高稳定性的 mRNA 平台（如 环状RNA ）。 2) 靶向递送精度不足 现状 ：静脉给药的 LNP 主要富集于肝脏，将 mRNA 高效、特异递送至其他靶器官（肺、心、脑、实体瘤）或特定免疫细胞仍面临巨大挑战。 突破方向 ：深化 SORT技术、新型靶向脂质设计、细胞特异性配体修饰 等策略，并加强其转化研究，这些正是当前递送系统研究的 创新前沿 。 3) 免疫平衡的精细调控 挑战 ：如何在 足够强的佐剂效应 （驱动有效免疫）和 过度的先天免疫激活 （抑制翻译、增加发热等不良反应）之间找到最佳平衡点，是核心科学问题。个体差异（如老年人免疫衰老）也会影响反应强度。 突破方向 ：通过 AI 建模，理性设计 mRNA 序列（修饰度、 UTR ）和 LNP 配方，实现免疫反应的 可预测、可编程 。 4) 免疫记忆形成挑战 免疫记忆会随时间衰减，且受年龄、递送系统等因素影响，实现持久保护是当前核心挑战。 挑战： 免疫记忆衰减与再激活难题： mRNA 疫苗诱导的免疫保护并非一劳永逸。记忆 B 细胞和 T 细胞的反应可能在数月内减弱，即“免疫记忆衰减”。通过加强免疫（再接种）可重新激活记忆细胞，但此策略存在周期长、可能伴随不良反应及成本较高等问题。 影响记忆的关键因素： · 宿主内在状态：年龄增长、代谢性疾病、肠道微生物群失衡及神经退行性疾病等因素可导致“免疫衰老”，削弱免疫细胞功能，降低疫苗应答能力和记忆再激活效率。 · 递送系统的影响：递送系统不仅决定初始免疫的强度，也影响记忆形成。例如，某些病毒载体可能引发针对载体本身的免疫记忆，干扰后续加强接种效果；而细胞特异性递送策略若不当，也可能影响特定记忆 T 细胞的活性。 · 疫苗设计本身： mRNA 的修饰程度、剂量、接种途径等均对记忆形成的质量有直接影响。 突破方向： 未来的 mRNA 疫苗研发不仅追求强大的初始免疫，更需致力于通过优化疫苗设计、递送系统和接种策略，实现更持久、更稳定且可高效再激活的免疫记忆。 5) 生产成本与个性化制备 挑战 ：个体化新抗原疫苗需要 “ 测序 - 设计 - 生产 - 回输 ” 的快速闭环（目标 <6 周），对生产工艺的灵活性、速度和成本控制提出极高要求。 突破方向 ：建立 模块化、自动化的柔性生产平台 ；优化工艺降低原材料成本；利用 AI 加速新抗原预测和疫苗设计，这正是 文献计量分析指出的创新前沿方向 。 7.2 产业化与监管挑战 1) 大规模生产的质控与均一性 ：确保微流控包封等关键步骤在大规模生产中的批间一致性。 2) 全球监管标准的协调 ：推动关键质量属性（ CQA ）和分析方法的国际协调，建立通用标准品。 3) 长期安全性的监测 ：继续积累大规模人群接种后的长期安全性数据，尤其关注罕见不良反应。 7.3 mRNA 技术的未来战略方向 1) 技术平台持续升级 ： 推进新型平台临床转化 加速自扩增 mRNA 、环状 RNA 的临床验证，开辟新治疗窗口。 AI与自动化深度融合 利用人工智能进行抗原预测、序列设计、 LNP 配方优化，并结合自动化机器人平台进行高通量合成与筛选，彻底改变研发范式。 2) 适应症持续扩张 ： 从预防性疫苗，向 治疗性疫苗 （慢性感染、自身免疫病、过敏脱敏）、 体内编程疗法 （体内生成 CAR-T 细胞、体内基因编辑）等领域进军。 3) 构建全球健康基础设施 ： 通过开发室温稳定制剂、建立分布式快速生产网络，将 mRNA 技术打造为全球应对流行病和癌症负担的 核心公共卫生基础设施 。 4) 践行“一体化健康”理念 ： 推动人用技术向兽用领域转化，加强在人兽共患病防控中的协同研发，保障人类和动物共同健康。 08 关于mRNA疫苗及技术的总结：迈向可编程的医学 以 mRNA 疫苗的成功为起点， mRNA 技术作为一种可编程、平台化生物医学工具，正在引领一场从治疗疾病到编程生命功能的深刻变革。 从破解核苷化学密码到构建智能纳米载体，从阻击全球瘟疫到攻击个体肿瘤， mRNA 技术已清晰地勾勒出一条从深邃科学发现到宏大产业变革的完整路径。其核心力量源于将生命的通用语言（核酸序列）直接转化为治疗工具（功能蛋白），并通过递送系统控制其表达。 随着对 mRNA语言 的书写能力（ AI 设计）、 纳米载体 的工程精度（靶向递送、佐剂一体化）和 免疫程序 的调控水平（平衡免疫）达到新的高度，以数字化、模块化的方式应对复杂的健康挑战成为可能。 mRNA 平台有望与基因编辑、细胞治疗、合成生物学等前沿技术深度融合，共同推动医学从 “ 对症治疗 ” 向 “ 根源治愈 ” 、从 “ 标准化用药 ” 向 “ 个性化编程 ” 的深刻转型。 mRNA技术正在引领我们，走向一个更加精准、灵活、高效的可编程医学与健康新时代 。这场始于疫苗的革命，终将惠及人类乃至整个生命健康的方方面面。 09 参考文献 [1] 厉宇婷， 孙裕龙， 赵海春， 等 . mRNA 疫苗技术在传染病中的应用：进展与挑战 [J]. 中国生物工程杂志， 2024, 44(6): 90-103. 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