Cinrebafusp alfa

-01-引言迄今为止，与传统的抗癌治疗策略相比，免疫治疗被认为是最有前景的全身性肿瘤治疗方法，其中，单克隆抗体因其特异性靶向分子的能力，已成为癌症治疗中一种关键而有效的治疗方式。然而，由于肿瘤复杂的疾病发病机制，针对单一靶点的单克隆抗体往往不足以表现出足够的治疗效果。因此，针对多个靶点的双特异性抗体（bsAbs）应运而生，它的发展改变了肿瘤免疫治疗的领域。目前，人们正在研究越来越多的针对癌症治疗的不同类型的bsAbs。这些类型包括双靶向抑制剂，其作用于不同水平的肿瘤增殖、血管形成和转移；以及双特异性抗体偶联药物、T细胞结合器、双特异性自然杀伤细胞接合器（NKCE）和先天免疫细胞接合器。其他类型还包括双特异性免疫检查点抑制剂（CPI）、共刺激bsAbs和融合蛋白、具有联合检查点抑制和共刺激特征的bsAbs、在肿瘤微环境（TME）中特异性激活的bsAb，以及将过继T细胞治疗和治疗性抗体相结合的新方法。目前，有300多项临床试验涉及200多种不同的双特异性抗体分子，其中约75%用于治疗实体瘤，25%用于治疗血液系统恶性肿瘤。有10种bsAb药物已被批准用于癌症治疗，其中9种在美国和/或欧洲获得批准，cadonilimab在中国获得批准。到目前为止，临床中开发的很大一部分bsAbs已经处于后期阶段（II期和III期）。另外，可以发现，治疗实体瘤的bsAbs主要由免疫调节剂主导，包括双CPI（约45%）和TCE（约33%），其次是靶向双途径、ICEs和ADC的bsAb。-02-一、靶向双受体抑制的bsAb许多参与细胞信号传导的细胞表面蛋白，如RTK和相关受体，是基于抗体治疗的有效靶点。尽管靶向一个确定的信号受体的抗体治疗是非常有效的，但疾病相关表型通常由不止一种途径触发。这种冗余允许细胞通过使用其他补偿信号通路，从而耐受药物的生长抑制或细胞毒性诱导。同时调节不同疾病相关信号受体或通路的bsAbs可以减少或克服这一限制。Amivantamab（JNJ-61186372）靶向EGFR和肝细胞生长因子受体（MET），两种受体都能触发非小细胞肺癌（NSCLC）的增殖。因此，阻断两种受体比仅阻断一种途径能够更有效地抑制NSCLC的生长。Amivantamab已被FDA批准用于治疗携带EGFR外显子20插入突变的NSCLC亚型。一项随机III期研究的数据显示，在这部分患者中，与单独化疗相比，Amivantamab联合化疗具有显著优越性。另外一些针对肿瘤不同第二靶点的EGFR的bsAbs也正在临床开发中。例如，petosemtamab（MCLA-158）靶向EGFR和LGR5，LGR5是一种癌症干细胞相关的细胞表面受体。Petosemtamab目前正在包括晚期头颈部鳞状细胞癌在内的实体瘤患者的I/II期试验中进行评估（NCT03526835）。-03- 二、靶向配体受体抑制的bsAbbsAbs可以同时阻断两种不同的配体，或者是配体和受体的组合。VEGF和血管生成素2（ANG2）的双重靶向作用分别阻断VEGFR和血管生成因子1受体（TIE2）的激活，这两种途径涉及血管生成。vanucizumab，一种靶向VEGFA和ANG2的bsAb，在临床前模型中与化疗联合显示出抗肿瘤、抗血管生成和抗转移作用。BI836880是一种三特异性纳米抗体融合蛋白，由三个靶向VEGFA、ANG2和HSA的纳米抗体组成，后者可延长其血清半衰期。目前正在头颈部鳞状细胞癌、NSCLC和其他实体瘤患者的I期研究中进行评估。此外，靶向VEGF可以进一步设计成联合靶向肿瘤细胞上的PD-L1或T细胞上的PD-1，从而将抗血管生成与肿瘤免疫学方法联系起来。例如靶向PD1和VEGF的ivonescimab（AK112），其目前已在中国获批用于。其他bsAbs靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，该药物正在NSCLC患者的II/III期研究（NCT05756972）中进行评估。-04-三、靶向受体激活的bsAb许多抗肿瘤反应是通过激活细胞表面受体介导的，包括通过诱导细胞凋亡的免疫反应或细胞死亡。其中一种方法是靶向递送受体激活配体，如生长因子、细胞因子和（共）免疫刺激配体，将其融合到抗体或抗体片段中，以诱导局部或组织特异性激动活性，从而诱导细胞反应。越来越多的这种抗体-配体融合蛋白正在进入临床试验。受体激活也可以使用激动性抗体来实现。针对靶抗原和肿瘤坏死因子超家族（TNFRSF）成员的bsAbs已被证明是具有强大活性和肿瘤选择性的激动分子。RG7386（RO6874813）是一种四价bsAb，靶向癌症相关成纤维细胞上的FAPα和DR5，在具有FAPα间质表达的小鼠模型中具有效和选择性的肿瘤细胞杀伤，并已进入临床测试。此外，BI905711，一种靶向DR5和CDH17的四价双特异性IgG-scFv融合蛋白，目前处于I期临床研究中。-05-四、靶向递送有效载荷的bsAb存在两种概念上不同的方法来利用bsAbs靶向递送有效载荷，如细胞毒性药物或放射性药物。第一种方法，预靶向治疗，使用bsAb的一个臂特异性靶向肿瘤细胞，另一个臂随后捕获有效载荷到肿瘤细胞。GD2 x DOTA是一种识别GD2的bsAb，并捕获放射性有效载荷177Lu-DOTA，其在TME中组装。在没有四聚化的情况下，由于半衰期，它会被迅速从外围清除。然而，到目前为止，临床试验中很少有bsAbs利用这种MoA，这可能是因为放射性预靶向涉及复杂的导流，限制了其普遍适用性。第二种方法通过递送偶联到双特异性抗体上的细胞毒性有效载荷，实现肿瘤细胞的特异性靶向。目前，bsADC已成为肿瘤药物开发的热点，已有多款bsADC进入临床开发，如ZW49、REGN5093、BL-B01D1等。-06-五、靶向癌症免疫治疗的bsAb癌症免疫疗法中使用的大多数bsAbs通过T细胞驱动的天然或内源性免疫发挥作用，包括免疫检查点抑制（CPIs）效应细胞接合器（包括TCE和ICEs）以及共刺激性bsAb。双免疫检查点抑制许多抑制免疫检查点的单特异性抗体，如CTLA4或PD-1/PDL-1，已被批准用于癌症免疫疗法。将检查点抑制性抗体疗法扩展到bsAbs可以减少不期望的副作用，并增强疗效。大多数双免疫检查点抑制剂靶向PD-1/PD-L1轴和其他免疫抑制分子，如CTLA-4、TIM-3、LAG-3或TIGIT。MEDI5752（PD-1×CTLA-4）抑制PD-1+激活的T细胞中CTLA-4的功能，诱导PD-1的快速内化和降解。与PD-1和CTLA-4单抗联合治疗相比，MEDI5752的活性显著增强。针对其他检查点分子的双功能性抑制剂，包括LAG-3和TIGIT，也正在开发中。效应细胞接合器细胞接合器连接两种不同类型的细胞，主要是肿瘤细胞和T/NK细胞，以诱导肿瘤细胞溶解。细胞接合器由TAA靶向部分和效应细胞识别部分组成，并进一步分为T细胞接受器和NK细胞接受器。T细胞接合器利用TAA和TCR成分（主要是CD3），它们连接肿瘤细胞和T细胞，绕过TCR-MHC-I相互作用。因此，无论抗原特异性如何，T细胞结合器都会触发T细胞活化，产生包括穿孔素和颗粒酶在内的细胞毒性分子，以杀伤肿瘤细胞。BiTE是T细胞结合器的一种形式，通过靶向TAA和CD3的单链抗体将肿瘤细胞和T细胞结合，用于T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。靶向CD19和CD3的blinatumomab是临床上典型的BiTE，2014年，blinatumomab成为第一个被FDA批准的BsAb，用于治疗ALL患者，在随后的几年里，blinatumomab的治疗范围进一步拓宽，2018年，FDA批准其用于首次或第二次完全缓解后MRD≥0.1%的pre-B ALL患者群体的治疗。目前，超过60例BiTE形式的双抗正在进行I/II期临床试验。NK细胞接合器将CD16A+NK细胞重定向至肿瘤细胞，诱导NK细胞活化。与BiTE相比，NK细胞接受者表现出较少的不良反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。多种细胞毒性受体可激活NK细胞：CD16（FcγRIII）、天然细胞毒性受体（NCR；NKp30、NKp44、NKp46）、C型凝集素样受体NKG2D（CD314）和CD94/NKG2C。最近，抗CD30×CD16A的NK细胞接合器（AFM13）在AACR 2022的报告中展示了不俗的抗肿瘤效果。共刺激bsAbs高效、持久和局部受限的抗肿瘤免疫反应需要共刺激和共抑制信号来严格调节细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的激活、分化和维持。TNFRSF家族的成员（如4-1BB、CD40、OX40、GITR、CD27或CD30）以及CD28免疫球蛋白超家族（如CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA)及其相应的配体在介导免疫调节信号中发挥着重要作用。靶向这些免疫调节途径可以增强免疫治疗。PRS-343（cinrebafusp），是一种针对HER2和4-1BB的四价bsAb，在IND研究中其耐受性良好，没有明显和相关的药物相关毒性；在接受有效剂量治疗的患者中（n=33），12%的患者达到ORR，包括1个CR，疾病控制率（DCR）为52%。bsAbs中通过4-1BB进行肿瘤选择性共刺激的其他靶点还包括EGFR、PSMA、CLDN18.2、B7H4、CEACAM5、HER2、PD-L1和FAP。此外，十多种针对PD-L1和4-1BB的不同bsAbs处于I期或II期试验中。-07-六、bsAb的新概念bsAbs的领域仍在进一步探索和扩展技术和应用，可能提供目前正在开发的bsAb尚未解决的治疗概念。三特异性TCE共刺激信号可以与双特异性TCE组合以促进更加有效的T细胞活化。这样的三特异性TCE目前正在针对TAA和CD3的临床试验中，并且进一步包含抗CD28结合位点。SAR443216是一种针对HER2×CD3×CD28的三特异性抗体，能够强力激活CD4+和CD8+T细胞，诱导T细胞增殖、细胞因子和颗粒酶B的释放，以及T细胞介导的对表达HER2的肿瘤细胞的杀伤，其目前处于I期临床研究中。在类似的方法中，SAR442257是另一种CD38×CD3×CD28的三特异性抗体。前药方法一种新兴的方法是在肿瘤处选择性激活的前药，产生具有高度肿瘤特异性功能的bsAbs。前药转化为功能性bsAbs可以通过环境触发因素如肿瘤相关蛋白酶来实现。双重肿瘤靶向的另一种前药方法依赖于来自两个具有分裂CD3ε结合部分的肿瘤特异性组装。这些分子需要被设计为非活性的独立实体并在循环中，使得它们仅在肿瘤抗原结合和随后的原位组装时被激活。PROTAC bsAbs另一个新兴概念和新的MoA利用bsAbs通过靶向降解来抑制增殖相关过程。类似于双特异性或多特异性小分子蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），bsAbs可被设计为触发参与癌症发展或进展的表面蛋白的内化和随后的降解。这样的bsAbs同时与靶向降解的蛋白质和降解的因子结合，并触发内化，如膜上的E3泛素连接酶或转铁蛋白受体。目前，抗体-PROTAC概念仍处于早期开发阶段，迄今为止还没有进入临床研究。bsAb递送bsAb开发中另一个重要的新兴概念是bsAb的局部产生和随后的局部递送，如通过脂质纳米颗粒介导的mRNA递送的CLDN6 TCE、溶瘤病毒或包括CAR-T细胞在内的基因治疗方法。细胞因子模拟抗体最后，bsAbs也可以作为细胞因子模拟物或所谓的合成细胞因子激动剂。scFvs或基于单域抗体VHH的方法可以通过模拟IL-2或IL-15、IL-18、I型干扰素和IL-10来有效地触发细胞因子信号传导。这种基于抗体的细胞因子模拟物可能在癌症免疫疗法中具有各种应用。作为原理证明，使用整合素αVβ3-结合生物素嵌合体靶向生物素结合蛋白NeutrAvidin。该分子含有与生物素共价连接的环状RGD基序（cRGD），在20 h内成功内化A549细胞中的NeutrAvidin。此外，NeutrAvidin的内化与Lyso Tracker共定位，并可被溶酶体抑制剂阻断。BMS-8是一种与PD-L1结合的小分子，BMS-8 cRGD 嵌合体在异种移植物小鼠模型中，与单独的BMS-8相比，显著减少了体重减轻、肿瘤生长和脾脏转移。总体而言，这种基于整合素的降解系统为膜或可溶性蛋白的肿瘤选择性降解显示了令人兴奋的潜力。-08-结语bsAbs领域最近取得了实质性进展，到2023年底，已有十几种bsAbs获得批准，许多不同的方法正在临床上进行测试。尽管如此，由于癌症的异质性和适应性，这些方法中的任何一种都不太可能成为普遍的癌症免疫疗法。相反，抗体需要针对某些应用量身定制，并将依赖于与其他方法的结合，以最大限度地提高其疗效和安全性。在不久的将来，多特异性抗体疗法的发展可能会在以下四个领域出现增长：针对具有明确依赖性的肿瘤相关RTK的bsAbs；用于以增加的选择性靶向肿瘤的bsADC；用于靶向降解适用于各种途径的细胞表面蛋白的双特异性PROTAC；以及用于癌症免疫疗法的多特异性抗体。与其他治疗癌症的药物一样，通过改进的诊断方法和新的开发模式，将bsAbs和多特异性抗体疗法应用于早期患者，对于实现治愈癌症患者的目标至关重要。参考资料：1. The present and future of bispecific antibodies for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov.2024 Mar 6.2. Development of Bispecific Antibody for CancerImmunotherapy: Focus on T Cell Engaging Antibody. Immune Netw. 2022 Feb; 22(1): e4.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

摘要:多特异性抗体能够识别位于同一或不同靶点上的两个或更多表位。然而，这些多特异性分子的开发方法存在许多障碍，需要更好的多特异性分子工作流程。在这里，我们总结了治疗性生物制剂的当前技术现状，尤其是蛋白质和生产工具的模块，这些经验可以用于创建下一代工作流程。同时，本文还讨论了可用于克服蛋白质设计挑战的地方，以及通过机器学习实现快速可靠的多特异性设计的路径。1.引言生物制剂，迄今为止已有约160种蛋白质治疗药物被批准用于临床使用（图1）。生物制剂如免疫球蛋白类单克隆抗体(mAbs)目前是治疗开发中应用最多的药物模式。然而，使用mAbs进行单一靶向治疗的局限性和日益增长的未满足医疗需求激发研究人员进一步发展并构想出具有多重特异性的分子。多特异性抗体(MsAbs)能够识别位于同一或不同靶点上的两个或更多表位。这种多重识别能力扩大了传统mAbs的功能，允许用于多种应用如招募免疫细胞摧毁肿瘤细胞或交联不同的细胞表面蛋白。MsAbs通常在大小、构型、价态、柔性和结合模块的接近角度以及它们的可开发性、分布和药代动力学属性方面不同。这些新的分子实体(NME)迅速暴露了药物开发及其平台的局限性。许多来自技术领域的尖端技术，如机器学习(ML)和人工智能(AI)，正在涌入生物技术领域。在这篇综述中，我们将检查一组选定的蛋白质构建模块(BB)的属性，以及它们如何被利用来预测MsAbs。然后，我们将审视结构和计算引导的蛋白质工程的最新技术，并探讨如何成功地部署这些工具以实现下一代MsAbs的设计。2.构建模块MsAbs提供了比传统抗体更大的优势，包括它们能够靶向具有强大生化属性和新颖功能的多种蛋白质。自然界中存在的能够结合的蛋白质，如抗体和细胞因子，提供了宝贵的构建模块(BB)（图2）。开发类似于自然产生的MsAbs，选择合适的BB及其在蛋白质结构域异二聚体化的兼容性是设计和生成这些高度功能性、多价分子时的关键考虑因素。当正确组合时，许多BB可以产生大量MsAbs的格式。自然界制造的BB包括片段抗原结合(Fab)、单链片段可变区(scFv)、可结晶片段(Fc)、单域抗体(VHH)和细胞因子(图3)。相比之下，人造BB，如小蛋白和从头蛋白质，也可以使用下一代计算工具如Rosetta（图2）。下面，我们将仔细研究每种BB的属性，并考虑在组装MsAbs时，每个BB类别为治疗产品概况(TPP)带来的优势和劣势。2.1 Fab，最常用的构建模块使用IgG的Fab部分设计多特异性抗体是最简单的方法。Fab由重链(HC)的VH和CH1结构域以及轻链(LC)的全部(VL和CL)组成，它们创建了一个非常稳定的异二聚体界面，其中大约有100个残基参与了多种稳定接触，包括氢键、盐桥、疏水相互作用和范德华力。此外，与单链可变区(scFv)相比(见下文)，Fab的表面可以暴露于溶剂中，因此，稳定的蛋白质核心和广阔的亲水表面使Fab成为组装多特异性抗体的流行选择，尤其是对于高浓度配方和/或皮下给药的药物。然而，由两个不同的多肽链组成的构建模块需要一个异二聚体组装，这对于包含两个或更多不同Fabs的多特异性抗体来说是一个重要的考虑因素(例如Hetero-IgG)，因为每个重链(HC)和轻链(LC)的正确配对是必要的(图2)。许多工程策略已经被构想出来以强制执行正确的链配对(电荷配对突变(CPMs)、旋钮进入孔(KiH)、单链Fabs(scFabs)等)。这些轻链（cLCs）可以与两个或更多不同的重链（HCs）配对，几乎不会干扰结合，这种结合是由非同源重链驱动的，并且可以通过使用转基因小鼠[cLC]进行体内检测、展示，或者简单地测试给定的轻链（LC）。根据Cortellis的数据，目前在临床试验中的大约300种单克隆抗体（MsAbs）中，大约58%至少包含一个Fab作为构建模块（BB）（图3）。此外，获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局批准的首批单克隆抗体之一是用于治疗血友病的艾美珠单抗，它包含两个共享一个共同轻链的Fab片段。2.2 ScFvs，最具诱惑力的构建模块却隐藏着潜在的缺陷ScFvs是通过使用通常柔性的连接链将重链(VH)和轻链(VL)的可变区连接起来而产生的分子。已有几种Fv连接链成功应用到临床，最常见的是(Gly4Ser)3。此外，scFv分子中VH-VL或VL-VH的取向会影响该构建模块的结合能力和可开发性属性。这使得scFv成为制作多特异性抗体的有吸引力的构建模块，因为单一多肽链避免了链配对的复杂性（见上文Fabs），并且大约是Fab大小的一半（约25 kDa）（图2）。此外，它们可以通过各种连接链串联融合到Fc的N端和C端，或串联连接，数量从两个到四个不等。然而，由于这个构建模块缺少CH1和CL，即Fab的恒定区，原本存在于CH1-CL界面C末端的天然二硫键也不存在。尽管蛋白质连接链可以帮助克服Fv在纯化和储存过程中的固有不稳定性，但由于VH/VL界面的动态性，其热稳定性平均而言低于父代Fab。为了解决这个问题，已经成功地添加了二硫键来加强这个界面并提高热稳定性。然而，当改进平台二硫键解决方案时（例如VH40-VL100），许多Fabs在转换为scFv时无法保持功能。可以通过计算蛋白质设计识别出提高稳定性的定制二硫键。scFv的产生导致CH1/CL区域被截断，大约25%的Fv表面暴露于溶剂中（图2）。因此，与paratopes相反的区域成为一个关键区域，有聚集倾向。由于聚集通常与分子浓度相关，含有scFv的多特异性抗体在受到类似抗体的浓度时可能表现出较差的单一分散性，因此限制了治疗产品概况(TPP)。2.3 VHH：一种新近获批的构建模块，有望取代scFvs除了IgGs，骆驼科动物和鲨鱼自然产生只有重链的抗体，其中抗原结合区域由重链的单个可变区（VHH）组成（图2）。此外，VHH也可以在表达人源化VHH的转基因小鼠模型中生成，也可以通过展示技术生成。这些VHH，也称为纳米抗体或单域抗体（sdAbs），作为MsAbs组装的构建模块提供了巨大优势，绕过了像Fabs那样需要同源重链/轻链配对的需要，并避免了像scFvs那样需要添加连接链。此外，由于其紧凑的结构大约为12-15 kDa（图2），VHHs可能显示出理想的可开发属性，包括高产量、在高蛋白质浓度下高应力时低聚集、高热稳定性和低粘度。由于它们最佳的生物物理属性，VHHs也可以通过吸入安全地输送，因为它们的小尺寸确保了在系统循环中的半衰期短。VHH的结合亲和力可以高达皮摩尔级，即使没有VL表位，也与最好的Fab或scFv分子相匹配。尽管最初VHH的非人框架存在安全问题，但这个问题在2019年FDA批准caplacizumab后很快得到缓解。2.4 Fc，多功能构建模块2.4.1 抗体工程中的Fc角色Fc作为生物制剂中关键构建模块的角色早已得到认可。Fc异二聚体化的两种流行方法是使用旋钮进入孔(Knobs-into-holes, KiH)突变和电荷配对突变(Charge Pairing Mutations, CPMs)。KiH突变在一条链上引入一个空间体积大的氨基酸，如色氨酸或酪氨酸，并在另一条链上引入小氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸，分别创建突出部和孔洞。虽然这种方法特别有效地减少了旋钮-旋钮同源二聚体，但孔-孔同源二聚体仍可形成，并且必须通过额外的纯化步骤与所需的异源二聚体分离。相比之下，CPMs在一条链上引入带正电荷的残基，在另一条链上引入带负电荷的残基，以利于异源二聚体的形成。在这里，带有相同电荷的链预期会相互排斥，而相反的电荷则有利于异源二聚体的形成。这使得不同的构建模块可以添加到Fc的N端和C端，从而生成需要非对称格式的分子（图2）。此外，Fc可以识别多种细胞表面上的几种受体，这可以被操纵以改善治疗指数(TI)（图2）。目前约83%的约300个处于临床试验阶段的MsAbs包含一个Fc（图3）。2.4.2 Fc生物学Fc与多种效应蛋白相互作用，这些效应蛋白可以改变体内的免疫反应或延长抗体的半衰期。新生儿Fc受体(FcRn)除了其他功能外，负责延长含有Fc的MsAbs的半衰期，因为它是内体循环过程中的关键部分。C1q也与Fc结合，并负责通过形成膜攻击复合体来激活补体系统，最终导致补体依赖性细胞毒性。因此，每种Fc包含的治疗性生物制品中的相互作用都必须被仔细调控制，以防止不必要的免疫反应。2.4.3 FcγRFcγR家族通过细胞内信号事件调节细胞毒性和吞噬作用，这些信号事件是与抗体结合的反应。这些蛋白由FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb组成。每个FcγR被分类为激活型或抑制型。FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa在人类中被认为是激活型的，并且它们的细胞内结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。这些受体，除了FcγRI外，对Fc的亲和力较低，并且最适于与IgG复合物相互作用。ITAM基序的聚集导致涉及SRC激酶、SYK激酶、Rho GTP酶和肌动蛋白聚合酶的信号级联反应，引起吞噬作用。MAP激酶、RAS途径和MEK也通过这个信号级联反应被激活，导致细胞因子的表达。信号级联的结果具有细胞类型特异性，并且取决于每个细胞上表达的受体类型。相比之下，FcγRIIb是唯一含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的抑制家族成员。ITIM和ITAM之间的相互作用导致SHIP-1和SHIP-2的招募和激活，导致IP3前体的耗尽并阻止下游信号。因此，Fc与FcγRs的相互作用为我们提供了一个独特的机会，可以编程含有Fc的MsAbs以设计一种可以在肿瘤学、炎症和病毒学中识别局部组织引发免疫细胞反应的抗体。2.4.4 FcRnFcRn是一个独特的Fc受体，因为它不直接参与导致免疫反应的信号级联。它以与β2-微球蛋白(β2m)二聚体的形式与Fc相互作用，并且在结构上类似于MHC1。FcRn在细胞内发现，并通过内体循环来延长IgG的半衰期。在弱酸性条件下，FcRn通过Fc上位于CH2和CH3交界处的His310和His435残基的质子化，对Fc表现出高亲和力。一旦IgG进入这些内体，酸性条件导致组氨酸质子化和随后的FcRn结合。然后，FcRn-IgG复合物在内体中保留，而其他分子被运输到溶酶体进行降解。一旦内体与质膜融合，pH的变化导致FcRn-IgG复合物的解离。这种作用机制也负责将IgG转运到多种组织中。通常，进一步延长Fc提供的半衰期是有益处的。因此，增加Fc在低pH下与FcRn亲和力的突变可以具有临床相关性以减少剂量频率。2.4.5 C1qC1q由六个三聚体球形区域组成，这些区域通过α-螺旋连接到一个中央束。这些六个球形区域中的每一个都与IgG和IgM抗体的Fc的CH2-铰链区域相互作用。因此，补体激活取决于C1q与多聚IgM或IgG的结合，分别形成五聚体或六聚体结构。这些相互作用触发补体系统的激活，最终导致形成膜攻击复合体，导致补体依赖性细胞毒性。2.5 细胞因子，并非为持久而设计的现成构建模块免疫系统利用一类分泌型的细胞外信号蛋白——细胞因子，精确控制着各种细胞类型，细胞因子通常小于30 kDa，每种都在细胞特定刺激方面有所不同（图2）。开发含有细胞因子的多特异性抗体可以用来解决癌症免疫疗法和许多自身炎症性疾病。例如，IL2，一种15 kDa的四螺旋束，是一种强效的促炎性细胞因子，它在效应T细胞（Teff）和自然杀伤细胞中刺激干扰素γ的产生，正在被探索用于治疗癌症患者，而结构与IL-2同源的IL-4则通过诱导未激活的辅助T细胞分化，具有潜在的抗炎作用。迄今为止已经鉴定出100多种不同的细胞因子，每种都在其免疫学领域内具有独特的作用。毫不奇怪，目前约14%的约300个处于临床试验阶段的多特异性抗体携带一种细胞因子（图3）。然而，首批在临床上评估的细胞因子是野生型（WT）（例如IL2和IL12），它们显示出狭窄的治疗窗口，主要是因为具有很高的毒性特征。要改善其毒性特征，可以通过设计这个构建模块本身或通过与其他构建模块的智能组合来尝试。2.5.1 细胞因子的开发性当重组表达时，许多细胞因子表现出诸如聚集等缺陷，反过来又影响工程的可开发性和潜在的免疫原性。这可能是由于大多数细胞因子由螺旋束结构组成，并展示多个结合界面，从而导致聚集。另一个问题是游离半胱氨酸的情况。IL-1家族，一组具有β-三叶草折叠的11种细胞因子（例如IL-1、IL-18、IL-36），显示出多个游离半胱氨酸，使它们倾向于通过非规范二硫键聚集，或者在暴露于氧化环境时降低效力。例如，大多数临床中的IL-2分子包含一个C125S突变，这对于避免开发过程中的聚集至关重要。在其他情况下，这些半胱氨酸参与形成分子间二硫键，以确保功能性二聚体的组装和稳定性（例如IL12异二聚体的p35和p40亚基）。2.5.2 调节细胞因子的细胞类型选择性细胞因子受体在不同细胞类型上的表达水平不同，为调节细胞因子受体亲和力以偏向刺激某些细胞类型提供了机会，当这些细胞类型被刺激时，它们为特定发疾病提供有利的结果。与WT序列相比具有几个突变的细胞因子，称为“muteins”，其中每个结合界面都通过引入点突变来仔细调节亲和力。例如，在IL2的情况下，减弱与亚基IL2Rα的结合减少了免疫抑制Treg细胞的激活，导致更高的T效应器激活，并且因此扩大了治疗指数(TI)，因为需要更低的剂量。一个例子是Garcia及其同事的工作，他们通过一系列定向进化由酵母展示产生了一个增强版的IL2，称为“超级细胞因子”。这种分子虽然像许多其他IL2 muteins一样显示出与IL2Rα的结合减少，但也表现出比WT更高的与IL2Rβ的亲和力。Neoleukin Therapeutics开创了一种新策略，通过设计具有定制功能和增强开发性概况的细胞因子，开发比天然细胞因子更好的细胞因子。Neo2/15，一个IL2细胞因子模拟物，是使用Rosetta设计的，将一个从头设计的螺旋嫁接到天然IL2骨架上，完全取消了与IL2Rα的结合，同时在这个螺旋束蛋白上构建了额外的稳定性。这个案例研究展示了应用计算工具设计细胞因子以从头改进的潜力。2.5.3 靶向细胞因子来自系统性细胞因子信号的毒性激发了将这些构建模块与其他构建模块（靶向臂）结合的想法，目的是减少外周细胞因子活性。这些与细胞因子融合的构建模块试图将细胞因子定位到感兴趣的组织（即肿瘤微环境）上，并通过识别选定的肿瘤相关抗原(TAA)来减少外周活性。然而，TAA的选择可能因患者多样性、抗原拷贝数、不同组织中的表达水平和内化率而面临挑战。Amgen的肿瘤靶向IL-21 muteins在与针对PD-1的抗体融合时表现出成功，PD-1是在已知会聚集在肿瘤微环境中的活化T细胞上高度表达的。Roche展示了几个成功的TAA融合到IL2 muteins的例子，包括PD-1、肿瘤抗原癌胚抗原(CEA)和成纤维细胞激活蛋白-α，这是一种参与细胞外基质重塑并在肿瘤微环境中高度表达的蛋白。因此，该蛋白设计的关键是确保对TAA构建模块的结合亲和力显著高于细胞因子构建模块。这通常导致使用细胞因子muteins与靶向臂技术结合，因为根据定义，muteins具有减弱的结合亲和力。尽管如此，选择最佳mutein构建模块和目标构建模块组合需要全面考虑，以产生符合治疗产品概况(TPP)要求的临床候选药物。2.5.4 有条件的细胞因子激活有条件的激活描述了一种蛋白质设计策略，该策略试图通过依赖组织特异性信号（例如蛋白酶切割、目标重构、pH变化、小分子诱导的变构）的蛋白质生物传感器来减少系统性活性。例如，通过将一个肽或甚至其受体融合到这个构建模块上来“掩盖”一个促炎性细胞因子的活性。一旦这些分子到达目标组织，掩蔽物就会释放，细胞因子活性就会完全恢复。有趣的是，他们最初使用具有相同IL2和IL2RB融合到每个Fc链的N末端的Fc同源二聚体的方法没有显示出抗肿瘤效果，并且不能被MMPs消化，突显了在这些情况下产生的四元结构的复杂性。2.5.5 目标重构另一种有条件激活的形式是，细胞因子不是通过组织特异性信号激活，而是被分割成单独剂量的亚单位，只有当它们被带到目标组织上并组装时才形成活性分子。这首先由Neri和同事通过将IL12疗法分割展示，p35和p40异二聚体亚单位分别融合到针对肿瘤坏死因子scFv的抗体上，目的是只有当抗体融合蛋白结合到表达这种特定TAA的细胞时，才组装分离的亚单位。分割的IL12表现出对两种分裂存在的依赖性，尽管整体效力相对于内源性p35-p40复合体来说较低。最近，一个从头设计的IL2模拟单体，Neo2/15，通过在螺旋-环-螺旋连接处删除环来将其单体4螺旋束分割成1螺旋和3螺旋异二聚体。通过将每个分裂融合到抗HER2或抗EGFR DARPin上，证明了每个分裂的活性都依赖于它的另一半，并且与未融合和融合到靶向构建模块的Neo-2/15相比，改善了肿瘤缩小效果。2.6 小分子蛋白虽然基于抗体的治疗性生物制剂一直是主要追求的生物制剂类别，但其他类别的蛋白类制剂也在探索之中（见图2）。历史上，使用非Ig或“替代”构建模块（BBs）的动机通常是为了克服天然构建模块的局限性，例如稳定性差、组织穿透性差、无法靶向细胞内蛋白质或次优的药物递送途径（例如静脉注射）等。除了提供解决这些不足的方案外，作为治疗性生物制剂的非Ig构建模块本身，可能提供不同的药代动力学和药效学特性，并且能够进入天然构建模块无法到达的目标结合界面。除了对替代构建模块潜在的优越生物学和生物物理特性的吸引力外，新的支架还可能为治疗性生物制剂提供额外的知识产权保护。在多特异性抗体（MsAbs）的背景下，非Ig构建模块提供了具有不同大小、表面几何形状和生物物理特性的多样化结合界面（见图3）。这些区分因素有可能提供针对难以靶向分子的新结合剂和新的机制。关键的是，将小分子蛋白构建模块整合到MsAbs中可以绕过或简化链配对问题，并在减轻MsAbs整体分子量增加的同时构建额外的靶向臂。2.6.1 单域抗体、蛋白连接体和亲和体与Ig构建模块最相似的是单域抗体、蛋白连接体和亲和体。每个都包含一个由七个反平行β链通过灵活的环连接组成的β-三明治Fibronectin类型3（TNF3）结构域。通常，这些环中的三个被多样化，并用于体外结合，类似于抗体CDRs。与Fabs不同，已经制作了库来使反平行β面而不仅仅是环暴露于多样化溶剂中。此外，分子两端的柔性环也被设计用于结合。这些特性使单域抗体能够作为多样化目标的结合剂，也可能有助于双特异性设计。2.6.2 AnticalinsAnticalins基于脂质运载蛋白家族，参与细胞外疏水性货物的运输。它们展示了一个原型的β-桶结构，具有一个内部腔室和四个非常灵活的环。脂质运载蛋白与免疫球蛋白可变区的结构相似性激发了通过技术将灵活环工程化以针对各种治疗性靶点（首先是CTLA4）。由于Anticalin的环比抗体的CDRs长，前者展示的总结合位点表面积（2380 Ų）显著高于典型的抗体-抗原结合表面积（平均为1550 Ų）或与同一表位结合的α-CTLA4抗体（1664 Ų）[图3]。这可能导致具有更高亲和力和/或特异性的结合剂。一个值得注意的MsAb例子是PRS-343，一种41BB/HER2靶向的双特异性，目前正在进行II期临床试验。2.6.3 AffibodiesAffibodies是金黄色葡萄球菌蛋白A的衍生物，是少数具有细菌起源的构建模块之一。它是一个高度稳定的三α螺旋束，其螺旋表面被重新设计用于结合，通常也是通过展示技术。Affibodies的分子量约为6.5 kDa，是最小的构建模块之一。事实上，一个表征的抗HER2 affibody已被证明可以与pM亲和度结合一个独特的表位。这种减小的尺寸可能使affibodies能够靶向其他较大构建模块无法到达的表位。此外，调节MsAbs的分子量可能是控制分子药代动力学特性以及其穿透实体瘤能力的一个途径。一个示例性的MsAb结合了抗EGFR affibody和曲妥珠单抗融合，称为affimab，与曲妥珠单抗相比显示出优越的疗效。然而，作为一个细菌蛋白，affibodies可能比其他构建模块更具免疫原性。2.6.4 DARPin锚蛋白重复序列是模块化蛋白，由两个反平行α螺旋单元组成，相邻单元通过β发夹连接。每个模块单元由33个残基组成，全长蛋白可以由多达29个连续重复单元组成，尽管最常见的长度是四到六个单元。通过使用共识序列设计过程生成的设计锚蛋白重复序列（DARPins）稳定个体单元，并使它们更适合于随机突变和单元洗牌，以释放它们作为结合支架的潜力。这些蛋白与通常在脊椎动物先天免疫系统的Toll样受体中发现的富含亮氨酸的重复序列蛋白有关。与其他构建模块的结合界面相比，DARPins界面非常刚性，形状最凹总结合表面积超过2300 Ų），使DARPins可能更适合作为某些靶标的结合支架。这种构建模块作为别构抑制剂的能力，以及与其有利的Tm相比mAbs也归因于其刚性结构。一个完全由DARPins组成的独特的多特异性的例子是MP0250，一个由四个DARPin构建模块组成的单链三特异性分子。目前正在针对多种适应症进行II期临床试验。2.6.5 KnottinsKnottins是一类通常由30到50个氨基酸组成的短肽，具有一个高度稳定的保守折叠结构，由三个二硫键固定。这创造了一个刚性的支架，带有多个在库中多样化的柔性环。由于它们的小尺寸，knottins在体内可以被迅速清除。Knottins是用于生成结合剂的最小的构建模块（BBs），这创造了靶向蛋白质上通常无法接近的表位的潜力，类似于affibodies。鉴于它们的小尺寸，它们可能在需要高亲和力的多价分子中很有用。然而，到目前为止，绝大多数knotin结合剂由于半衰期短，一直被用作诊断剂，尚未在多特异性抗体（MsAbs）中使用。这种构建模块的一个限制是在某些情况下二硫键形成中观察到的异质性。2.7 从头设计的小蛋白从头设计的小蛋白使用基于预测算法的计算工具来生成人造蛋白质或具有在自然界中未发现的氨基酸序列的整个蛋白质（图2）。在这篇综述中，从头设计的小蛋白被定义为在硅中设计的能够结合特定靶标的构建模块。首先，通过结构洞察或实验确定功能相关的结合基序（例如2-3个关键残基用于结合相互作用），其次，通过计算筛选各种大小和拓扑结构（例如螺旋-螺旋和螺旋-链）的从头设计蛋白质支架，将其最优化地嫁接到结合基序上。这种方法的成功在很大程度上通过设计针对H1N1大流行病毒的流感A H1血凝素(HA)的保守区域的中和结合剂来证明。类似的方法，从头设计的小蛋白被设计来模仿SARS-CoV-2的受体结合域(RBD)的ACE2结合基序，通过封闭病毒上的RBD结合位点来阻止膜融合，从而实现对该病毒的中和。与HA从头结合剂不同，这些RBD结合剂是通过设计一个包含关键RBD-ACE2相互作用残基的ACE2衍生骨架，然后在其下方引入完全从头设计的支撑螺旋来掩盖其暴露的疏水下侧而设计的。从头设计的小蛋白具有不存在于自然界的结合界面。这些纯粹人造的结合基序是通过使用表示目标界面上侧链旋转体的综合图的旋转体交互场来生成的。在这种情况下，84690个由螺旋束和螺旋-链拓扑结构组成的支架被对接以适应每个目标的数十亿可能的侧链相互作用，产生了14个具有纳摩尔亲和力的结合剂，针对包括CD3δ、TGFβ、EGFR和IL7Ra在内的多种目标。从头设计的小蛋白是一种新颖且快速发展的构建模块类别，有潜力加速发现功能性结合剂。然而，从头设计的小蛋白应该被视为双刃剑：一种高度动态的构建模块，具有更快时间表、优化的开发性、新颖功能或定制的条件激活的潜力，但也是一种由几乎没有人类同源的氨基酸序列组成的构建模块。最体内特征化的从头设计小蛋白之一，Neo2/15，模仿人类IL2。它在小鼠中超过14天的研究中显示出与hIL2和mIL2几乎相同的IgG产生，这归因于小尺寸(约10 kDa)和分子的高稳定性。然而，由于每个从头设计的小蛋白在序列上差异显著，免疫原性风险将因每个从头设计的小蛋白而异。3.治疗模式的组装尽管如BiTE、XmAb、DART和CrossMAb等平台已经报告了初步成功，生成了众多的临床候选分子甚至市场批准的分子（例如，blinatumomab），但它们的限制也很明显。最初的多特异性抗体格式专注于非常特定的生物靶点和非常特定的表位。然而，相同的格式/配置在应用于不同的靶点和/或表位时可能不会显示出相同的性能，这突显了所选构建模块的多特异性抗体格式/配置与表位识别之间的独特关系。单一格式驱动的平台往往具有固定的价态，如1:1或2:2，当需要混合价态时可能是一个限制因素。然后，追求许多高价值的治疗靶点需要偏离所谓的对称格式。格式/配置分歧的进一步例子是三特异性抗体。在这种情况下，分子被设计为同时或有组织地识别三个靶标，旨在提高治疗指数（TI）。在T细胞接合器领域，将2xTAAs与CD3链接时，可以比单个TAA链接到CD3时带来更好的细胞靶标选择性，降低毒性，同时提高整体TI。此外，当单个TAAs的表达不广泛时，2xTAAs三特异性方法可以被设计为扩大患者群体。因此，将三个不同的结合剂组装成一个单一实体，每种可能的变量价态（1,1,1, 1,1,2, 1:2:1, 2:1:1等）可能创造出数百种配置。此外，三特异性分子的成功组装更加依赖于所选的模块，因为随着结合识别次数的增加，分子几何、分子分布和半衰期以及开发性属性的复杂性更大。最近，合理选择构建模块作为预测多特异性抗体组装成功的一种手段已经在Hetero-IgG格式中报告。识别表征构建模块的生物物理和生化属性将直接有助于设计智能且与格式无关的平台，我们可以控制它们，并且可以预测它们的成功（图4）。这样的平台更有可能以多特异性抗体为中心，最初的格式考虑将通知诸如免疫原设计等步骤，这将丰富具有必要要求的构建模块的选择。一旦确定了符合设计目标的构建模块，就可以将工作重点放在测试格式多样性上，其中不同的结构排列和价态将决定最佳的生物学和其他治疗产品概况(TPP)属性。因此，因为多特异性抗体的领先候选分子被仔细选择以满足表达和纯化配置文件的平台要求，导致选择最终临床候选分子的后期优化阶段很可能变得可预测（图4）。4.多特异性抗体应展现的属性多特异性抗体的工程通常只关注结合和细胞功能。然而，为了使这种新分子实体(NME)作为治疗药物成功，还必须满足许多其他属性。实际上，货物成本、分子稳定性、半衰期、安全性以及为患者舒适度而设计的指定给药途径是目标候选分子概况中同样关键的部分。因此，需要采取全面的方法以解决这些问题。首先，如上所述，所选构建模块的属性将不可避免地转化为最终的多特异性抗体分子。例如，表达水平低、分子稳定性次优或纯化性能不佳的Fabs通常会使得多特异性抗体产量低且稳定性差。其次，由于我们设计的分子的四元结构在自然界中并不存在，我们预测半衰期和安全性概况（如抗体-药物-抗体反应）的能力通常降低。在这种情况下，可能需要测试几种相同的构建模块的排列，以确定最终的多特异性抗体格式。然而，目前基于细胞的检测和临床前模型的限制损害了我们预测多特异性抗体在给药后在患者体内概况的能力。5.蛋白质计算设计的成就与走向基于机器学习的多特异性抗体(MsAb)设计之路自从其诞生以来，基于物理的方法，最好由Rosetta软件套件来示范，已经取得了显著的成就（图1）。这些成就包括设计首个从头算蛋白质折叠（TOP7）、酶、膜蛋白、离子通道和自组装纳米笼。在治疗相关方面，计算设计已成功用于提高抗体亲和力、创建新的重链-重链(HC–HC)和重链-轻链(HC–LC)链配对技术，并优化开发性。例如，von Kreudenstein及其同事应用计算设计和分子动力学力场能量计算来驱动多特异性抗体的重链配对，与之前建立的实验方法相比，取得了改进的结果，并且只需更少的经验测试。还开发了工作流程，如使用RosettaAntibody和ABodyBuilder，用于模拟未知结构的抗体-靶标复合物。近期基于机器学习(ML)的蛋白质结构预测工具，如AlphaFold和RosettaFold，正在对蛋白质设计产生深远影响。虽然同源建模以前可能需要数周时间，并且需要对蛋白质有深入的了解，但这些工具使用户能够在几分钟或几小时内生成高度精确的模型。更新的工具甚至可以在几秒钟内完成。基于ML的工具还已经被创建用于优化开发性以及功能。同样，ML技术已经被用于预测药物属性，包括抗体表位、稳定性和免疫原性。基于物理和基于ML的工具都旨在最小化所需的经验实验，并加速药物发现流程，以到达最终的治疗分子。计算蛋白质设计已经可以取得上述成功，只需要少数几个经过实验验证的设计。然而，多特异性抗体设计面临许多挑战。重要的是要注意，绝大多数的计算设计已经应用于构建模块(BBs)，而不是多特异性抗体的组装。目前，药物发现过程中的许多步骤需要经验筛选，以发现和确定最佳的领先候选分子，就多特异性抗体格式、功能性活性、开发性、免疫原性和药代动力学而言。从构建模块组装多特异性抗体是一个组合问题，随着考虑的构建模块和格式的增加，这个问题呈指数增长。很可能只有一小部分可能的构建模块组合在有限的多特异性抗体格式中会被实验测试。ML提供了探索可能格式的天文空间，并以整体水平优化多特异性抗体属性的机会。此外，由于缺乏专门针对这些分子的大型数据集，当前的ML模型对多特异性抗体的适用性仍然不确定。不足为奇的是，目前大多数可用的数据来自单克隆抗体或构建模块。虽然单个构建模块的许多属性可能与多特异性抗体格式相关，其他特别是与多特异性抗体人为的四元结构以及构建模块之间潜在的相互作用相关的属性，又产生了独特的挑战。例如，通过柔性连接链将多个构建模块连接起来，可能会引入新的动态性、空间障碍和表面斑块，影响表达水平、纯化性能、稳定性、半衰期和免疫原性等属性。为了应对这些挑战并为预测多特异性抗体属性开发可靠的模型，系统地收集和整理具有不同构建模块的各种多特异性抗体格式的数据至关重要。几家公司已经开始将ML整合到他们的药物发现工作流程中。例如，GenerateBiomedicines(https://generatebiomedicines.com/)和AAlphabio (https://www.aalphabio.com/)结合使用ML、蛋白质设计和大规模实验测试来发现新的蛋白质结合剂。其他公司，如Nabla Bio (https://www.nabla.bio/)，使用ML来预测和优化单克隆抗体的开发性。随着越来越多的生物制药公司接受ML，利用这些技术变得越来越重要，以保持竞争力。生成和整理所需的实验数据集是该过程的第一步。6.结论在这里，我们提供了关于多特异性抗体工程的现状和挑战的综述，以及实现下一代多特异性抗体的见解。自从2009年第一个多特异性抗体被批准以来，十多年前，行业开始接受单一格式方法将无法满足大多数未满足的医疗需求。相反，多特异性抗体格式的不断增加的变异性成为可用于开发针对各种适应症的生物制剂的多样性的宝贵来源。要达到这样的阶段，重点必须放在表征构建模块以及指导它们成功组装成新的NMEs的规则上。因此，提高多特异性抗体总体成功率的一个决定性步骤是选择其构建模块。了解每种构建模块为最终分子带来的优势和劣势至关重要，以便其满足治疗产品概况(TPP)。虽然最初的多特异性抗体格式应基于预期的生物学效果，但选择构建模块需要考虑构建模块属性（例如Tm、溶解度、表达水平）以及构建模块兼容性（例如pI）。此外，基于ML的工具革命正在转变为药物发现，这些已整合到工作流程中的计算步骤将带来更智能的工作流程和更高的成功率。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。