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2026年1月6日，《Nature Chemical Biology》发表了一篇由多国科学家联合撰写的前瞻性文章。文章系统阐述了一项革命性技术——基于生物发光共振能量转移（BRET）的探针——在破解细胞内药物靶点结合这一核心难题上的最新进展。传统的结合实验往往在破碎的细胞中进行，忽略了通透性、亚细胞定位等关键生理因素。BRET探针如同一盏高灵敏的“分子探照灯”，能够在活生生的、完整的细胞中，实时、定量地报告小分子药物如何找到并占据其靶标，将药物发现从“盲测”推向“可视化”时代。 一、为何需要窥探细胞内的“黑匣子”？ 药物通过结合细胞内的靶蛋白来发挥作用。然而，在试管中结合能力强，并不代表在复杂的细胞环境中同样有效。细胞膜如同一道安检门，会过滤掉许多化合物；细胞内高浓度的代谢物（如ATP）也会与药物竞争靶点。因此，直接验证药物在活细胞内的靶点结合（Target Engagement, TE），已成为化学生物学工具开发和早期药物发现的“必选项”。 此前，细胞热转移分析（CETSA） 等方法开创了细胞内TE检测的先河，但其依赖高温变性，可能干扰细胞生理，且难以精确定量。BRET技术的诞生，为解决这些痛点提供了理想方案。 二、BRET如何工作？——分子级别的“能量传递”报告 BRET技术的核心原理优雅而简单。它需要两个关键元件： 1.发光“灯塔”：将高亮度的荧光素酶（如NanoLuc）融合到目标靶蛋白上。 2.荧光“侦察兵”：一个能够穿透细胞膜、并特异性结合该靶点的小分子探针，其尾部连接了一个荧光染料。 当探针结合到带有荧光素酶的靶蛋白上时，两者距离极近。荧光素酶催化底物发出的蓝光，会被邻近探针上的荧光染料吸收，并重新发射出波长更长的荧光（如绿光或红光）。这个过程就是共振能量转移。 检测的奥秘在于竞争：当加入我们想测试的未标记药物时，它会与荧光探针竞争结合靶点。一旦药物将探针挤走，能量转移就被切断，荧光信号随之减弱。信号减弱的程度，直接反映了药物占据靶点的比例。 图1 BRET探针在细胞靶点结合研究中的应用图示 ·1a，量化热力学亲和力：通过测量不同浓度药物对BRET信号的抑制曲线，可直接计算出药物在细胞内的半数抑制浓度（IC₅₀），反映其真实效力。 ·1b，评估细胞内可用性：比较药物对靶点的抑制在活细胞与透化细胞中的效力差异。若透化细胞中效力强得多，则表明药物在活细胞中的通透性是其瓶颈。 ·1c，测量靶点停留时间：进行“药物洗脱”实验。洗去药物后，监测BRET信号恢复的速度。恢复越慢，说明药物从靶点解离得越慢，即停留时间越长，这常与更持久的药效相关。 ·1d，解析完整结合动力学：通过更复杂的竞争动力学模型（如Mottlsky–Mahan分析），可同时测定药物与靶点的结合速率（kon） 与解离速率（koff），获得最全面的动力学图谱。 三、应用场景大爆发：不止于“是否结合” BRET探针的价值远不止于确认结合。通过巧妙的设计，它已演变为一个多功能平台，能回答药物研发中一系列更深层次的问题。 1. 激酶组学的“全景扫描仪” 激酶家族是最大的药物靶点类别之一，但成员间结构相似，实现选择性抑制极具挑战。BRET技术为此带来了变革。 图2 BRET探针作为评估激酶组细胞结合与选择性的工具 ·2a-b，广谱覆盖：利用少数几种能结合激酶保守ATP口袋的“广谱”探针，研究人员建立了覆盖近300种人类激酶的高通量筛选平台。树状图和条形图展示了该平台如何系统性地扫描不同激酶亚家族。 ·2c-d，从广谱到精准：图中展示了这些广谱探针的化学结构（如化合物1，5，6）。它们像“万能钥匙”一样初步结合众多激酶，再通过竞争实验，精准筛选出对特定激酶（如PIKfyve）具有高选择性的“专属钥匙”。 其威力在于：可在细胞水平一次性评估一个化合物对数百种激酶的选择性，快速排除脱靶风险，加速安全候选药物的发现。 表1 BRET探针在细胞靶点结合研究中的应用实例 ·本表格系统列举了BRET技术在各大靶点家族中的成功应用，包括： o广谱选择性筛选：用于HDAC、激酶、PARP抑制剂的选择性评估。 o停留时间测定：用于表征溴结构域、GPCR、激酶抑制剂的解离动力学。 o化学探针验证：直接评估候选化学探针的细胞通透性和细胞内结合效力。 o蛋白互作与变构研究：用于研究RAS、激酶等蛋白在复合物中的结合及变构调节。 2. 破解PROTAC等大分子药物的“通透性密码” PROTAC等新兴疗法分子量大，传统规则难以预测其细胞通透性。BRET是实证其“内功”的关键。 核心方法（呼应图1b）：同时用BRET检测PROTAC在活细胞和裂解细胞中对靶点（或E3连接酶）的结合。显著的“效力偏移”直接量化了通透性限制。通过此方法，可系统优化PROTAC的连接链（Linker），快速获得兼具良好结合能力与细胞通透性的高效降解剂。 3. 窥探蛋白质复合物的“协同世界” 许多药物的作用依赖于其与蛋白质复合物的相互作用，而非孤立蛋白。BRET通过分子工程，得以窥探这一复杂维度。 图3 使用BRET探针分析蛋白质复合物结合与药物变构 ·3a，区分二聚体中的“兄弟”：在癌症中，RAF蛋白（BRAF， CRAF， ARAF）会形成二聚体传递信号。研究者将NanoLuc拆分成两半，分别标记到不同的RAF上。仅当二聚体形成时，NanoLuc才发光成为BRET供体。利用此系统，他们发现某些RAF二聚体抑制剂对BRAF/CRAF的结合强于ARAF，揭示了亚基选择性。 ·3b，捕捉KRAS的变构口袋：类似策略用于难成药靶点KRAS。用变构抑制剂竞争结合在邻近位点的BRET探针，直接在细胞中证实了变构抑制剂对多种KRAS突变体的结合，挑战了其仅对单一突变有效的传统认知。 ·3c，验证变构抑制的“远程操控”：用结合ATP口袋的BRET探针，可反向检测结合在远端“肉豆蔻酰口袋”的变构抑制剂（如GNF2）。因为两者结合互斥，变构剂的结合会导致ATP探针信号下降，直观证明了变构机制。 图4 细胞中三元复合物的协同靶点结合 ·4a，锁定“增效”的复合物：抗癌药曲美替尼的作用可能依赖于其与MEK-KSR蛋白复合物的结合。基于曲美替尼开发的BRET探针（Tram-bo）显示，其在MEK-KSR复合物上的停留时间远长于游离MEK，从动力学角度解释了其持久疗效。 ·4b，代谢物协同的精准打击：在MTAP基因缺失的癌细胞中，代谢物MTA累积。抑制剂MRTX1719能协同MTA，特异性抑制PRMT5-MTA复合物。BRET实验显示，外源MTA可极大增强MRTX1719的结合效力，为基于生物标志物的精准疗法提供了机制依据。 四、挑战与未来：让“探照灯”更亮、照得更广 尽管功能强大，BRET技术仍需进化以释放全部潜力。其当前局限与未来机遇主要集中在以下几个方面： 表2 BRET探针的局限性与新机遇 ·挑战：覆盖“暗蛋白质组” o现状：开发BRET探针需要已知的先导化合物，对于缺乏配体的靶点无能为力。 o机遇：整合DNA编码化合物库（DEL） 筛选和化学蛋白质组学发现的苗头化合物，快速将其转化为BRET探针，探索全新靶点。 ·挑战：实现内源性检测 o现状：多依赖过表达标记蛋白，可能与内源生理状态不符。 o机遇：利用CRISPR等技术将微小的荧光素酶片段（如HiBiT）敲入基因组，在内源性水平进行检测；开发更亮的荧光素酶和染料以检测低丰度靶点。 ·挑战：解析事件驱动药理学 o现状：对于PROTAC等降解剂，简单的结合检测可能因“钩状效应”产生误导。 o机遇：发展直接检测三元复合物形成或泛素化事件的BRET新方法。 ·挑战：知识与资源共享 o现状：探针信息分散，重复开发耗时耗力。 o机遇：建设如tracerDB.org这样的开源数据库，共享已验证的探针结构、协议和数据，通过社区力量加速创新。 五、总结 从验证化学探针的细胞内活性，到优化临床候选药物的动力学特性；从评估激酶抑制剂的全局选择性，到揭示变构抑制剂在蛋白复合物中的精准作用模式——BRET探针已从一个创新的检测概念，成长为贯穿药物发现价值链的多功能定量平台。 它不仅能回答“药物是否结合了靶点”，更能阐明“结合了多久”、“在何种生理背景下结合”以及“是否在正确的分子机器中结合”。随着化学生物学、蛋白质工程和计算方法的深度融合，下一代BRET技术必将照亮更多细胞内的“未知地带”，引领我们开发出更精准、更有效的疾病治疗药物。 文献来源： Capener, J.L., Schwalm, M.P., Vasta, J.D. et al. Advances in BRET probes for intracellular target engagement studies. Nat Chem Biol (2026). DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-025-02103-y