本期，智荟专线将为大家解读TILs疗法的前世今生以及Cytiva（思拓凡）的TILs疗法整体解决方案。
01
什么是TILS?
肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TILs）是从肿瘤组织中分离出的异质性淋巴细胞群体，以T细胞为主，包括CD8+胞毒性T细胞、CD4+辅助性T细胞、调节性T细胞（Treg）以及B细胞、NK细胞等，作为肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤免疫中发挥关键作用并影响癌症进展【1】。具有识别和杀伤肿瘤细胞的潜力，其数量与表型可作为肿瘤预后标志物或治疗靶点。
浸润到肿瘤组织中的TILs，可以发挥免疫促进或免疫抑制作用，依赖于肿瘤微环境（TME）以及特定的TILs细胞亚群。理想情况下，TILs可以通过细胞毒性、抗原递呈以及细胞因子的释放，发挥抗肿瘤活性，促进肿瘤消退，但其活性经常由于免疫检查点信号、代谢耗竭以及间质排斥等而被抑制【1】，如图1。TILs疗法通过将患者肿瘤组织中的TILs分离并在体外进行T细胞特异性活化和大量扩增，回输患者体内杀伤肿瘤细胞。
图1：肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞TILs【2】
02
TIL疗法发展历史及现状
最早关于TILs的报道描述出现在1976年【3】。1982年，美国国立卫生研究院NIH的Rosenberg SA教授和团队从小鼠肿瘤模型中首次分离得到TILs【4】；
1986年，Rosenberg SA团队从小鼠肿瘤组织中分离TILs，酶解成单细胞后，在含有IL-2的培养基中进行培养扩增，由于免疫细胞增殖速度比肿瘤细胞快，肿瘤细胞逐渐被清除【5】【6】。扩增的TIL与Cy（环磷酰胺）一起静脉注射，有效介导小鼠晚期肺和肝转移转移性肿瘤的消退，同时注射IL-2可以进一步增强效果，相较于外周血单个核细胞（PBMCs）来源的LAK细胞疗法，TIL需要的细胞数量减少近百倍【5】；
1988年，Rosenberg SA等在新英格兰医学杂志发表文章，首次将TILs疗法应用于20例转移性黑色素瘤患者的临床治疗中，在Cy注射后，将体外扩增的TILs与IL-2一起回输患者体内，在既往未经过IL-2治疗的病人中实现了60%的客观缓解。比单独使用IL-2或LAK，应答率更高【7】；
后续，TILs又经过多年的临床试验和开发，包括回输预处理方案的优化和缩短培养周期的“Young”TIL方案。2011年，美国肿瘤免疫疗法公司Lion Biotechnologies获得Rosenberg教授专利授权，率先开发商业化TIL疗法，即合并后的Iovance Biotherapeutics公司。2024年2月，其商品名Amtagvi（Lifileucel，LN-144）历经波折，作为全球首款实体瘤TIL疗法，通过FDA优先审评获批上市【8】，用于治疗既往接受过PD-1抗体治疗的不可切除或转移性黑色素瘤成人患者，整体客观缓解率（ORR）为31.4%（48/153），疾病控制率（DCR）达到77.8%，开启新纪元；
2025年6月，美国临床肿瘤学会（ASCO）年会期间，三款中国自主研发的TIL疗法产品公布了最新数据——
沙砾生物的GT101
基于StemTexp干性TIL扩增技术平台，作为首个在中国进入临床的TIL产品，目标适应症：黑色素瘤、宫颈癌、肺癌。多中心I期试验（NCT05430373）显示，在宫颈癌患者中客观缓解率（ORR）达到45.5%（5/11），疾病控制率（DCR）高达90.9%（10/11）。目前在IND Phase II（临床II期）【9】；
北京大学肿瘤医院
郭军教授团队自主研发的TIL疗法LM103，单药治疗经标准治疗失败的晚期黑色素瘤的单中心I期试验（CTR20233999），也在会上公布。针对亚洲人群高发的肢端/黏膜型黑色素瘤优化培养工艺，标准治疗失败后入组。客观缓解率（ORR）50%（4例PR），疾病控制率（DCR）87.5%（特定剂量亚组达到100%）；
百吉生物
BST02为全球首款针对肝癌的TIL产品，可冻存。多中心I期试验（NCT06526832）结果显示，队列1（5×10^9细胞）中2例可评估患者实现100%疾病控制率（DCR），50%客观缓解率（ORR）。
此外，华赛伯曼的HS-IT101（FAST-TIL）基于自主研发的PowerTexp高效TIL生产工艺平台，入组患者中肢端/黏膜型黑色素瘤占比较大，但ORR仍高达50%；君赛生物的GC101基于自主研发的创新型DeepTIL细胞富集扩增平台，是全球首款无需清淋、无需IL-2注射的天然TIL新药，普通病房即可接受治疗，在晚期实体瘤（不同癌种）治疗中ORR超过35%，目前在临床II期【10】。
还有多家企业正加快I期临床研究进展或推进IIT。截止目前，clinicaltrials.gov中仍有近百个临床项目在患者招募中，包括靶向免疫“热”实体瘤以及“冷”实体瘤的TIL疗法【11】。
03
TILS市场分析
T细胞的过继性细胞疗法（Adoptive cell therapy，ACT）主要有Car-T、TCR-T以及TIL疗法，如表1。
表1：肿瘤免疫疗法分类与比较【15】
根据国家癌症中心（NCC）2022年全国癌症统计数据，结合国际肿瘤研究机构（IARC）联合测算【12】，中国发病前五位的癌症类型依次为肺癌、结直肠癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌，占新发癌症病例的57.42%，均为实体瘤。根据IARC统计测算的2022年全球发病率最高的前五种癌症依次为肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌和胃癌，有三种和中国相同，且同样均为实体瘤【13】。
从外周血T细胞通过基因修饰改造而来的Car-T疗法，在血液系统恶性肿瘤捷报累累，但因实体瘤的复杂肿瘤微环境、归巢低效、浸润障碍、毒性反应更强、实体瘤异质性（特异性肿瘤抗原TSA的缺失）、脱靶风险而面临挑战，需要结合多种技术平台或联合其他疗法破局。同样来自于外周血单核细胞的TCR-T疗法也因靶点单一、脱靶毒性、HLA亚型限制、制备流程复杂而有一定局限性【11】。
TILs疗法则是通过从肿瘤组织中直接提取免疫细胞，进行体外培养和扩增，之后回输病人体内。由于其T细胞受体（TCR）多样性、高效的肿瘤归巢能力以及低脱靶毒性，识别肿瘤新抗原（neoantigen），成为过继性细胞疗法中实体瘤治疗的新星。TILs疗法也从最初的黑色素瘤，扩展到更多实体瘤的临床试验，包括非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部肿瘤、胆管癌、肝癌、结直肠癌、肾癌、肉瘤、间变性甲状腺癌等【11】【14】。
目前，免疫疗法成为继手术、放化疗、靶向药之后的第四大癌症治疗技术。根据弗若斯特沙利文在2024年12月发布的《肿瘤浸润林巴细胞（TIL）疗法行业现状与发展趋势白皮书》【15】，预计2025年全球细胞治疗市场规模将达到104亿美元，2030年进一步增长至374亿美元，即年复合增长率达到29.1%。其中，全球细胞治疗市场中CAR-T细胞疗法的年复合增长率为19.2%，以TILs和TCR-T疗法为主的Non-Car-T特异性免疫细胞治疗的年复合增长率将达到66.4%。2025年中国细胞治疗市场规模将达到88亿人民币，预计2030年达到501亿人民币，年复合增长率41.6%。其中，以TILs和TCR-T疗法为代表的Non-Car-T特异性免疫细胞治疗板块将以高达135.3%的复合增长率，成为增速最快的领域，如图2。
图2：中国细胞治疗市场预测（沙利文）【15】
04
TILS细胞扩增工艺路线
第一代TILs扩增技术通常具有较长的预扩增阶段，即用自体肿瘤细胞或肿瘤细胞系对TILs进行特定抗原筛选，之后进行快速扩增【16】。2008年，Rosenberg SA教授团队基于多年临床经验，创新性提出缩短培养周期的“Young”TIL培养方案【17】，不再进行肿瘤特异性T细胞筛选，将培养周期从5周以上缩短到约20天，保护了TILs端粒、提升CD27和CD28表达量，且“Young”TIL与以往经过特异性筛选后的TIL（Selected TIL）具有相当的肿瘤反应性，并在黑色素瘤临床治疗中得到验证【18】，成为当前TIL疗法的主流和改造基础，即为第二代TILs扩增技术。
首先通过手术分离患者的部分肿瘤组织，使用机械方法或酶解【16】【17】消化成单细胞并进行初步培养，使用高浓度IL-2（6000 IU/ml）激活TIL，过程中，淋巴细胞会首先裂解贴壁（肿瘤）细胞，之后进行自我扩增。
通过低密度预扩增强化TILs的活性和功能后，不用像传统方法那样筛选肿瘤抗原特异性T细胞，而是直接进行高密度的快速大量扩增（REP），通过——
辐照后的异体PBMCs滋养层细胞（可通过Cytiva Ficoll-Paque分离液搭配Sepax C-pro全自动细胞处理系统分离外周血获得【19】）
anti-CD3抗体（OKT-3）
高浓度IL-2
刺激淋巴细胞快速增殖并高度激活，使用Cytiva Xuri W25 细胞扩增系统实现REP。在Day 14，将TILs与自体肿瘤细胞过夜孵育，检测上清中IFN-γ的分泌来测定TILs的反应活性。之后和高剂量IL-2回输经过非髓性清淋的病人，促进肿瘤细胞的清除，如图3。通常可实现从2E7扩增到1E11个TILs，即两周内实现5000倍扩增。Lovance中国专利（201880094012.1）工艺中，pre-REP小于11天，REP扩增11天，TILs制剂在≤-150度冷冻保存。
图3：TIL的产生和注射
a：全部或部分切除肿瘤，将肿瘤组织切碎，使用24孔板培养组织碎片（或细胞），培养后部分用于冻存（自体治疗或实验），另外的部分用于通气瓶或反应器（如Cytiva Xuri W25）的快速扩增（REP），细胞体外质检后，回输清淋治疗后的病人体内，并随后注射IL-2【20】
下一代（next-generation）TILs技术在培养阶段【11】通常涉及：
筛选法强化表型：例如扩增患者特异性的“克隆新抗原（clonal neoantigens）”反应性T细胞（cNeT），如Achilles Therapeutics公司开发的ATL001【21】【22】，也可以使用半个体化或共享新抗原【23】；或基于分子表型进行筛选【11】；
使用分子诱导高潜能TILs扩增，如抗4-1BB【24】或抗OX40抗体激动剂【25】、CBL-B抑制剂【26】等；
基因工程改造如基因编辑，引入或敲除部分基因促进TILs体外扩增效率、归巢、存活（包括恢复干性）以及抗肿瘤活性，如通过工程化TILs可使其表达IL-7、IL-15、IL-12等；也有用于规避IL-2风险的如美国Obsidian Therapeutics公司开发的基因工程改造TIL疗法OBX-115，通过cytoDRiVE技术调节膜结合型IL-15（mbIL-15）的表达，不依赖IL-2从而降低了毒副作用，2022年7月通过FDA的IND审批，ORR达到44.4%，DCR则达到100%；基于肿瘤新抗原neoantigens，TIL也可以被CAR修饰成CAR-TILS【27】。
05
Cytiva TIL整体解决方案
为了提高安全性和可及性，TIL的生产需要遵循严格的GMP条件，其制备工艺也在不断优化，以缩短生产周期，降低成本并提高安全性、有效性，减轻毒副作用（如优化培养工艺，减少IL-2的使用和依赖性）。在此过程中的技术进步，包括TILs的有效分离、筛选、扩增、基因修饰、冷冻运输和回输，都备受关注。
Cytiva可以提供TILs分离培养的全流程、标准化、封闭式工艺解决方案，如图4【28】，包括用于细胞程序性冷冻的VIA Freeze和复苏的VIA Thaw、细胞分离和清洗的Sepax C-pro、REP快速扩增的Xuri W25波浪式生物反应器，2024年上市的Sefia expansion系统可用于细胞的激活、转导和扩增培养，以及全自动云端管理系统Chronicle自动化软件。
图4：Cytiva TILs整体解决方案【28】
Cytiva通过上述流程开发了应用方案：无菌收获0.25-0.5 g肿瘤组织，剪碎并分离获得细胞。pre-REP阶段，向培养基中加入6000 IU/mL的Xuri IL-2，培养7-21天，获得1E7 TILs细胞。
之后进入快速扩增的REP阶段，使用抗CD3抗体以及辐照处理的PBMCs在GRex100M CS系统中培养，通过IFN-γ分泌的增加验证了T细胞功能活化，之后转移到Cytiva Xuri W25波浪式生物反应器中进一步扩增7-14天，至1E10 TILs细胞，如图5。
图5：Cytiva整体解决方案成功实现TILs扩增
扩增后的细胞使用Sefia S-2000细胞处理系统（处理初始体积最大为10 L）进行收获、清洗和制剂，维持了高活性（94.1%），具有高收率（89.52%）【28】【29】。由此，Cytiva解决方案成功搭建了端到端、可放大、封闭式、可重复的TILs生产流程，助力TILs疗法CMC工艺落地。
06
TILS疗法展望
新一代TIL产品的开发，需要更高的特异性、持久性、安全性和强化的功能，并伴随监管的进一步完善。创新的解决方案，都有望克服肿瘤微环境的抑制并提高TIL的存续能力、浸润和胞毒性：
工程化TIL如基因编辑，如前所述；
靶向肿瘤微环境的调节剂，如趋化因子招募更多的TILs；
随着mRNA-LNP递送系统的逐渐火热，细胞治疗领域也掀起一股细胞原位改造的浪潮。2024年，Yoon J等【30】发表文章，使用LNP递送αCD3 mRNA至小鼠局部肿瘤微环境（瘤内注射），有效改造了肿瘤相关巨噬细胞TAMs（炎性巨噬细胞）和肿瘤细胞，诱导原位多克隆TILs激活和扩增，尤其是CD8+TILs的多克隆扩增和抗肿瘤活性，实现了“原位TIL疗法”；也可以和ani-PD-1抗体联用，有效延长生存期；
联合疗法，包括免疫检查点抑制剂【31】【32】、DC疫苗、溶瘤病毒等【15】。
提高TILs疗法的可及性及患者依从性。
图6：下一代TIL疗法【33】
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