Pegaptanib sodium

1 简介关于寡核苷酸药物开发相关的储存稳定性讨论，包括药物活性成分（API）和制剂产品（DP）在储存期间可能发生的理化变化以及用于检测这些变化的方法。ICH稳定性指导原则Q1为正式注册稳定性研究的条件和储存时长提供了框架，但并未就寡核苷酸特有的理化性质变化以及稳定性指示方法提供任何指导。ICH-Q5C关于生物技术产品稳定性研究指导原则为合成寡核苷酸提供了更有价值的指导，其中涵盖的主题，如二级/三级结构、生物活性以及使用多种方法确定纯度，可为寡核苷酸治疗药物提供有益的指导。以下关于寡核苷酸储存期间的稳定性主要关注点在于纯度和二级结构是否发生变化，是否会影响药物产品的安全性和/或有效性。与蛋白质治疗药物类似，寡核苷酸的降解可分为化学降解和高分子量物质的形成，高分子量物质通常为聚集体，是由多条寡核苷酸链作用结合形成的更大更稳定的结构。化学降解物质指所有通过化学反应形成的降解产物，这些反应导致共价键的断裂和/或形成。如图1所示例的官能团，在特定环境条件下容易发生化学降解。图1 化学不稳定的寡核苷酸基团    2 二级结构考虑    二级结构（即正确的三维结构）对某些寡核苷酸药物的生物活有着重要作用，如适配体（Aptamers）的二级结构，决定其与治疗靶点结合的选择性和亲和力。双链和单链寡核苷酸的二级结构不像对适配体那样重要，其对安全性和有效性的影响，也并不能像降解杂质和纯度变化那样直接。但它们的二级结构对其活性也可能很重要[4, 5]，应尽量了解每种寡核苷酸二级结构在稳定性过程的变化。 序列设计是非适配体类寡核苷酸的二级结构的关键因素。例如对于ASO，需要避免使用可能导致链内杂交（折叠）的序列，双链siRNA应设计为具有理想结合亲和力的互补双链结构，以达到最佳的生物活性[6-12]。另外，寡核苷酸二级结构的形成是一个热力学过程。寡核苷酸的多阴离子骨架结构使得在磷酸酯或硫代磷酸酯之间产生静电排斥作用，反离子的存在（如钠离子）可以屏蔽这种排斥作用，从而使碱基之间的相互作用增强。因此，盐浓度、温度以及溶液中离子的类型对于形成和维持最佳二级结构至关重要[11–13]。碱基电离状态的改变会影响氢键的形成，溶液的pH值也是一个重要因素，寡核苷酸二级结构的形成也是一个可逆过程，即当溶液条件（如温度、盐浓度和pH值）发生变化时，二级结构会以可逆的方式相应地改变。所以，在生产时需要明确的生产工艺条件，并严格控制（如盐浓度和温度变化速率），以确保退火形成正确的双链寡核苷酸。如不严格遵循既定生产工艺条件，形成的是非优双链结构[11, 12]。已有多个文献提到，双链siRNA溶液冷冻干燥过程可能导致聚集和/或形成超级结构。富含鸟嘌呤（G）的寡核苷酸超滤过程也可能导致聚集结构的形成。[11, 12, 14]    同样，诸如pH值、温度和离子浓度等因素也可能会影响或改变寡核苷酸在储存期间的二级结构。当然，最终是需要确认在给药时的二级结构形式，以及是否对生物活性/有效性和安全性有影响。所以，在进行二级结构分析相关的样品制备时，都应模拟临床使用时样品的浓度和溶液状态。例如，使用微量热法分析寡核苷酸的水溶液药物制剂的二级结构时，应选择在水中进行，而不是缓冲溶液。对于适配体，需要具有与靶标特异结合的二级结构，因此酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays）应为评估二级结构的理想方法。其他单链和双链寡核苷酸，梯度温度的紫外-可见光谱法、微量热法、核磁共振（NMR）光谱法和圆二色谱法等技术也可能指示二级结构的变化情况。二级结构的变化也可能与聚集物的形成有关，聚集物作为一类杂质/降解产物，将在下一节中更详细地讨论。3  降解产物分类    3.1 化学降解    .寡核苷酸在某些环境条件下易发生化学降解。Calvitt等人[16]建议, 应在开发过程早期通过强制降解试验来研究寡核苷酸降解产物的形成途径。表1列出了一些已知寡核苷酸降解产物的类型和结构，以及导致这些降解产物形成的条件。为了提高寡核苷酸结构的抗核酸酶稳定性和体内稳定性进行的化学修饰，如用硫代磷酸酯代替磷酸酯，以及2'- O-甲氧基乙基（2'-OMOE）、2'- O-甲基（2'-OMe）或2'-氟（2'-F）代核糖或脱氧核糖。这些修饰能明显提高稳定性，同时也引入了其他的化学降解产物。硫代磷酸酯修饰可以通过脱硫反应回到磷酸酯，而2'-F修饰在热或酸性条件下可以形成2,2'-脱水核糖核苷酸。2'-位吸电子基团的结构修饰，与脱氧核糖相比，则会降低酸或氧化催化脱嘌呤的风险。核糖结构中的2'-OH在碱性条件下会发生链断裂。如表7.1所示，酸性、碱性、热、氧化和光照条件，都可以加速寡核苷酸的降解。 通常与序列无关。   表 1 已知寡核苷酸的降解途径以及影响因素 3.2  聚集体    通过非共价相互作用形成降解产物，表现为聚集体或更高级寡核苷酸结构（如二聚体、三聚体或四聚体）的形成。聚集体杂质可能与观察到的免疫原性反应有关，因此与其他寡核苷酸杂质相比，风险更高，需要仔细评估原料药或制剂产品中聚集体产生的风险[26, 27]。目前为止，对于在生产或储存过程中引发聚集体杂质形成因素的了解不多。对于双链寡核苷酸，聚集体在固态下比溶液态下更容易形成，且双链的熔解温度（Tm值）影响聚集体的形成，Tm值较低的双链易产生更多的聚集体[28]。这也说明寡核苷酸的序列是形成聚集体杂质的重要因素。已有报道表明，具有连续四个鸟嘌呤（G-四联体）的单链寡核苷酸序列更容易形成聚集体[29]。具有自身互补杂交序列的单链寡核苷酸，在生产或储存过程中也容易形成聚集体杂质。在开发用于检测/定量聚集体杂质的方法时，应注意样品制备和分析方法的条件会显著改变聚集体的含量。例如，某些聚集体在纯水中可能会解离，而在生理缓冲液中则会保持完整[30]。理想的方法是使用代表最终制剂的溶液组成作为制备样品的溶剂或稀释剂进行分析。通常使用尺寸排阻色谱法（SEC）来评估原料药或制剂中聚集体的产生。               3.3 偶联类寡核苷酸的降解产物    寡核苷酸与另一种化学分子的偶联，最常见的是聚乙二醇（PEG）与适配体（Aptamer）的偶联，例如用于年龄相关性黄斑变性疾病的抗血管生成PEG偶联适配体Macugen[31]，其他类型的偶联物包括小分子[32]、肽[33]和蛋白质[34]。偶联物以及化学连接子（Linker）的降解同样需要考虑。例如，使用二硫键将偶联物连接到寡核苷酸上，二硫键在酸性条件下容易还原和断裂[35, 36]。如果色谱方法的专属性不足以用于寡核苷酸-偶联物的杂质/降解产物分析，可能还需要分别评估寡核苷酸和偶联部分分子的稳定性和降解产物。           3.4 辅料相关降解物       单个辅料通常不需要象API那样进行完整的化学稳定性评估，某些特殊辅料，如越来越多地寡核苷酸治疗药物的开发中使用“生物活性”的辅料，这些辅料会在体内引发生物反应，也是寡核苷酸发挥药物活性的必要条件。它们的目的多是靶向特定的细胞或组织，或促进寡核苷酸在细胞质或细胞核的摄取[37]。FDA发布的《脂质体药物产品行业指南》Guidance for Industry: Liposome Drug Products对此类辅料可能需要的控制措施具有指导性[38]。除了辅料本身的降解外，还应考虑到辅料是否影响寡核苷酸的降解，Isis 的一项研究发现，在一种ASO局部用药研究中，PEG衍生化的表面活性剂会导致硫代磷酸酯骨架的脱硫[39]。   在寡核苷酸复杂制剂的研究中，辅料的纯度控制也是关键问题。包括各种磷脂、定制化阳离子脂质体、胆固醇和聚乙二醇化脂质体 [40–42]。这些辅料中反应性杂质会被带入最终药物产品，也可能会导致产生寡核苷酸降解产物，甚至可能超出了在对API进行强制降解研究时所了解的范围。在许多小分子药物研究中，PEG和聚山梨酯等辅料中的反应性杂质已被证实与多种新生成杂质有关[43, 44]。需要进行专门设计强制降解研究用于评估单一辅料与API之间的相互作用，以评估反应性杂质或辅料诱导降解的可能性。    4 降解产物的分析检测    对于寡核苷酸治疗药物的CMC研究，申办方有责任识别每种可能降解产物带来的风险，并针对这些风险建立适当的控制策略。例如，许多降解物也是代谢产物，这也为这些杂质的安全性界定以及设定适当的报告限、鉴定限和界定限提供相关依据[45, 46]。4.1 降解产物的报告和定量    .单链寡核苷酸原料药和制剂产品中杂质的定量检测通常通过采用反相离子对色谱法（IPRP-HPLC）和/或阴离子交换色谱法（AEX-HPLC）[47, 48]。IPRP-HPLC能与质谱检测兼容，通过分子量进行结构表征，定量共洗脱杂质[49]。UPLC的系统和色谱柱提升使得其在色谱分离能力相较传统HPLC有显著提高，例如，一个21-mer的寡核苷酸（约6.8 KDa），使用IPRP-UPLC方法，可以使几种异构体杂质（与目标化合物相差约20 Da）与目标化合物以及杂质之间达到基线分离[50]。    ICH-Q3A和Q3B分别阐述了小分子原料药与制剂中降解产物如何报告、鉴别和界定[51, 52]。尽管文件明确排除了对寡核苷酸产品的适用性，但是其中的概念和原则仍然适用。例如，在注册稳定性研究中，对于新出现的降解产物，需要设定适当的报告、鉴别和界定阈值。在大多数情况下，任何不是工艺杂质的降解产物在用于安全性和临床研究批次中可能都不存在。如果之前在其他批次中未对该降解产物进行界定研究，那么当作为新杂质出现时，就会触发必要的报告、鉴别和界定阈值制定。另外，寡核苷酸药物杂质和降解产物通常是以类别或组存在的（即n-1、n+1等），并且同一组内的所有降解产物可能作为一个单独的峰洗脱，也可能不是单独的峰。因此，为整个杂质/降解产物组而不是每个单独的峰设定阈值可能是合适的。    4.2 降解产物影响方法专属性    寡核苷酸杂质与主峰在色谱中经常难以分离，分析检测极具挑战性，分析方法的专属性是首要关注点，同时也需要利用质谱对杂质进行表征，以评估方法的专属性。在稳定性研究中需要检测和定量降解杂质也进一步增加了分析方法的复杂性。如前所述，在开发早期中进行强制降解研究不仅有助于了解降解途径和降解产物，对于开发稳定性指示方法也具有重要意义。使用强降条件下的样品能够全面验证方法的专属性。一种分析方法虽然在放行检测中具有足够的专属性，但可能无法完全检测到稳定性研究中所有可能的降解产物，应在开发早期就要在稳定性研究中采用另一种正交的杂质检测方法，通过这两种方法的组合来提供足够的专属性。    4.3 双链和偶联类寡核苷酸中单链降解产物分析     在寡核苷酸原料药和制剂稳定性研究中实现合适的杂质分离相较于放行时明显更具挑战性。双链寡核苷酸的放行，通常要在退火前对单链通过变性方法进行分析检测[53]，单链的色谱分析肯定比双链简单，不会同时出现两条链的共洗脱峰。如图2是变性IPRP-UPLC方法下正义链和反义链分别检测后的色谱叠加图，以及各条链的共洗脱杂质，洗脱杂质的叠加进一步解释为什么需要在退火前对每条链分别进行杂质分析。然而，根据siRNA的化学性质和色谱优化情况，有可能开发出能够完全分离正义链与其杂质、反义链与其杂质的变性IPRP-HPLC方法，如图3所示。通过比较图2和图3中杂质峰的分离情况，尤其是图7.3中来自稳定性样品的峰复杂性增加，可以看出实现最佳分离的重要性。无论是否存在共洗脱杂质，采用变性方法来分析双链寡核苷酸的单链杂质谱对于稳定性样品中的杂质/降解产物分析是必要的。因此，在初始稳定性时间点（即放行时）需要使用变性方法。    图2 正义链（绿）与反义链（蓝）IPRP-UPLC色谱叠加图Individual sense (green) and antisense strands (blue) of a 21mer siRNA, 0.25 mg/ml each. 方法条件（Method conditions）: Waters Acquity UPLC system, OST C18 2.1✖100 mm 1.7µm column, 20 mM triethylammonium (TEA) mobile phase with 0.25% methanol/min gradient, 0.25 ml/min flow rate, 60℃ column temperature    图3 21-mer siRNA初始点（绿），水溶液25℃ 2个月（蓝）变性IPRP色谱图，图中正义链与反义链及杂质完全分离Method conditions: Waters Acquity UPLC system, ethylene bridged hybrid (BEH) shield RP18 2.1✖150mm 1.7µm column, 10 mM TEA/10 mM propylamine mobile phase with 0.17% methanol/min gradient, 0.175 ml/min flow rate, 55℃ column temperature [50].  对于偶联类的寡核苷酸，如PEG-Aptamer，由于单个杂质的检测方法缺乏专属性，其纯度和杂质分析可能会变得更困难。主要是由于偶联物分子较大，并且在很多情况下具有异质性，杂质之间微小的化学差异导致在色谱图中的分离度较差。因此，对于偶联类寡核苷酸，在分析稳定性样品之前，将偶联部分离切割掉可能是一个选择，这样可以更容易地检测寡核苷酸相关的杂质。另一种方法可能是将未偶联的寡核苷酸与偶联寡核苷酸同步进行稳定性研究，以便更好地理解不同储存条件下寡核苷酸药物的降解产物特性。4.4 稳定性研究中非变性方法的应用    稳定性研究中使用非变性分析方法可以监测聚集体的形成/变化。在所有类型的寡核苷酸药物中，聚集体的形成都是一个风险。SEC是一种基于分子大小的分离技术，相较于其他分离技术，它具有良好的灵敏度，并且对被分析物的结构构象影响最小，是目前常用的检测和定量聚集体形成的手段。 除了分析聚集体外，非变性分析方法用于监测双链的含量和纯度变化。这类方法的一个挑战在于确认方法具有稳定性指示能力，能够准确定量双链组分含量/纯度的变化。双链寡核苷酸主要的有关物质和降解产物都以双链状态存在。由于SEC是一种基于分子体积大小的分离技术，它只能测定所有双链的总含量，而无法检测目标双链的含量和纯度变化，这也是SEC方法最显著的局限性。下图比较了冻干siRNA原料药在25°C/20%RH条件下放置6个月，用三种不同方法（非变性SEC、非变性SAX和变性IPRP-UPLC）获得的纯度结果[28]。非变性SAX方法经过优化提高了目标双链与其他双链变体/杂质之间的分离度。    图4为在初始点和6月后的非变性SAX色谱图，突出了目标双链与双链相关杂质之间的分离。图5显示了六个月期间内三种不同方法绘制的纯度趋势图。非变性SEC方法指示总双链的纯度，非变性SAX方法下是目标双链的纯度，而变性IPRP-UPLC方法下是正义链和反义链的纯度。可以看出，在六个月期间，非变性SAX和变性IPRP-UPLC方法都能够定量纯度的显著变化。非变性SAX方法是最敏感的稳定性指示方法，检测到的纯度值下降幅度超过20%。相比之下，SEC方法无法检测到纯度的任何变化，表明它不是作为测定siRNA含量/纯度的稳定性指示方法。与这些结论一致的是，Murugaiah研究中描述了使用UV定量SiRNA含量并校正SEC纯度和水分，他指出，由于SEC缺乏专属性，这种方法不是稳定性指示的方法。图 4  冻干siRNA原料药非变性SAX色谱图：初始点（绿）和25°C/20%RH储存 6月（蓝）方法条件：Agilent 1100 HPLC system, Dionex DNAPac PA200 2×250 mm colmn, 12.5 mM mobile phase A: tris base, 1 M NaCl (pH 8.0 with 1M HCl), B: water, gradient: 58% A at initial linear to 40.7% A at 80 min, 0.5 ml/min flow rate, 15°C column temperature, 5 μL injection, 0.25 mg/ml siRNA concentration.               图5 冻干siRNA原料药25°C/20%RH储存6月的纯度变化趋势图（非变性SEC，非变性SAX，变性IPRP-UPLC）          使用非变性方法的目的是要保证分析物的二级结构。SEC和SAX方法可以通过调整流动相，使用不同盐浓度稳定寡核苷酸的二级结构。但是可能无法准确定量稳定性过程中双链二级结构含量是否降低，因为流动相条件可能会使得在分离检测前“在柱”双链含量增加。因此，了解方法局限性以及分析目的至关重要。也可能需要借助其他技术，如Tm分析、微量热法、CD 或NMR），来确定稳定性过程中是否发生了二级结构的变化。                 参考文献：  Daren Levin Oligonucleotide Stability and Degradation P271