Frovatriptan Succinate

摘要：近年来，一次性使用系统变得越来越重要。这尤其适用于它们在基于哺乳动物细胞培养的生物制药产品制造中的使用，例如用于治疗癌症和自身免疫疾病的抗体。如今，这类生物治疗药物的开发者和制造商可以从不同供应商那里选择大量的一次性使用系统产品组合。例如，有存储袋、过滤器、混合器、生物反应器、连接器、收获和转移系统、膜吸附器、冷冻和解冻系统的一次性版本，仅举几个例子。因此，在完全的一次性生产设施中生产临床样本（上游处理到灌装）已经成为现实。基于对一次性使用系统术语的定义和一次性技术发展里程碑的介绍，本章节讨论了当前市场上可用的一次性使用系统最重要的优势和现有限制。随后，基于选定的产品示例，介绍了一次性技术的发展现状。重点放在上游区域和一次性生物反应器上。最后，从一次性系统日益增加的实施中推断出从过程强化到完全连续生产的途径。 1.引言 一次性使用（SU）系统及其组成技术现在已成为许多生物制药生产过程不可或缺的一部分。它们被用于研究与开发、临床前和临床生产以及商业生产的每个不同阶段，用于生产小到中等体积的治疗性蛋白，如单克隆抗体（mAbs）、激素、疫苗、细胞和基因治疗药物或抗体药物偶联物（ADC）。这些系统中使用的宿主细胞可以是昆虫细胞或微生物，但主要是哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢{CHO}细胞）。“一次性使用系统”一词描述的是一种塑料制品或设备，其细胞、培养基或产品接触表面在使用一次后即被丢弃（例如，焚烧）。因此，“一次性使用”一词也常用于SU系统的消耗性部件，这些部件由聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、乙烯醋酸乙烯酯、聚醚砜、聚硅氧烷和氟塑料如聚四氟乙烯或聚偏氟乙烯等材料制成。SU系统中的消耗性部件通常是刚性形状或柔性袋，由多层薄膜组成，通常预组装并灭菌。伽马辐射（25-50 kGy）是首选的灭菌方式，但X射线处理正在兴起。SU系统并不是一个新现象；严格来说，它们已经存在了50年。第一个SU培养系统（空心纤维生物反应器和CellFactories）是在20世纪70年代开发的，并在早期使用贴壁生长的哺乳动物细胞的mAb和疫苗生产过程中使用。自20世纪90年代以来，塑料过滤胶囊、无菌注射器过滤器和SU储存袋（包括输送系统）已经商业化。SU技术发展的一个重要里程碑是在1998年推出了第一个波浪混合SU生物反应器，Wave™ Reactor（见“一次性生物反应器”部分）。Wave™ Reactor不仅为其他可扩展的SU生物反应器类型铺平了道路，还促进了生物制药生产过程中其他SU工艺设备的发展。在21世纪初，首次可以在非无菌环境中使用无菌连接器连接无菌流体路径，2006年，第一个搅拌式SU生物反应器（HyClone™ S.U.B.和Xcellerex™ XDR-Disposable Stirred Tank Bioreactor）被引入市场。这引发了对SU技术应用和发展的新兴趣浪潮，得到了各种组织（例如，生物工艺系统联盟，生物制药运营组{BPOG}，国际制药工程学会，化学工程和生物技术学会{DECHEMA}在美国和欧洲地区）的支持。SU系统的开发商和制造商，以及来自工业界和学术界的用户，开始解决现有SU系统的弱点（见“一次性使用系统的优缺点”部分），并进一步开发和设计使用SU系统的设施。在开发生物制药和生物仿制药的压力下，自2015年以来，人们越来越关注使用SU系统的工艺强化和连续工艺，从而复兴了灌注技术（见“强化和连续设施趋势”部分）。事实上，全球用于生物制药工艺的SU设施数量正在增加。在过去5年中，亚洲地区对SU技术特别感兴趣；细胞和基因治疗药物的开发商和制造商渴望利用SU技术的潜力（见“一次性使用系统的优缺点”部分）；Covid 19大流行推动了SU技术的繁荣，这种繁荣一直持续到今天。 2.一次性使用系统的优缺点 SU系统可以快速安装并投入使用，比可重复使用的同类产品更便宜，并且具有高度的模块化和灵活性。最近的研究表明，它们还支持强化和连续生物制药生产过程的实施（见“强化和连续设施趋势”部分）。由于不需要在现场对SU系统进行灭菌或清洁（无需灭菌设施，无需现场清洁，无需注射用水），设施的占地面积可以减少，微生物污染的风险，特别是交叉污染的风险会降低。通过实施SU系统，可以缩短新产品的开发时间，并增加每年产品批次的数量。各种研究表明，使用SU系统的环境影响也比可重复使用系统更低。然而，SU系统中消耗品的不断更新确实产生了大量的废物。因此，为了进一步提高SU系统的可持续性，许多制造商目前正在研究机械回收使用量最大的SU系统消耗品的可行性，如生物工艺袋。SU系统的劣势包括缺乏标准化，导致依赖某些供应商，有限的可扩展性，可能的泄漏，提取物和可提取物（E&L）的发生以及消耗品的高成本。大多数列出的劣势可以归因于所使用的塑料材料属性及其进一步加工/处理。有趣的是，拒绝在生物制药过程中使用SU系统的主要原因是E&L，它们可能以不可接受的浓度发生。 虽然提取物是在实验室的严苛工艺条件下形成的化学物质，可提取物是在实际工艺条件下形成的。然而，像双(2,4-二叔丁基苯基)磷酸酯或3,5-二硝基双酚A这样的可提取物是提取物的一个子集。已知的E&L的安全信息不断由提取物和可提取物安全信息交换联盟更新，并可在互联网上获取（www.elsiedata.org）。E&L的来源包括塑料加工（添加润滑剂、增塑剂、抗氧化剂、热和紫外线稳定剂）、辐照、储存和运输SU系统的消耗品。事实上，E&L可能来源于工艺系统（例如，生物工艺袋、过滤器），以及一级（例如，注射器、安瓿、小瓶）和二级（例如，包装纸、容器标签）包装组件，可能会对产品质量、数量和稳定性产生负面影响。在最坏的情况下，E&L可能在存在的浓度下具有毒性，危及患者安全。由于患者安全是生物制药产品制造中的首要考虑，与最终药品（DP）最接近的工艺步骤（见图1.1），接触时间最长的步骤被认为是在E&L概况方面风险最大的步骤。这意味着上游加工（USP）在关键E&L浓度方面的风险最低，而用于灌装和完成工艺的SU系统风险最大，下游加工（DSP）步骤则介于两者之间。USP包括从工作细胞库（WCB）培养细胞、接种物生产、细胞扩增、生物反应器中mAb表达和收获（细胞分离和澄清）。在大多数情况下，DSP包括捕获和抛光步骤，提供最终药物物质（DS）。然后是配方，最后是灌装和完成。经过质量控制（QC）后，最终DP被标记、包装和运输。本章未显示USP中的培养基准备和生产过程步骤，以及DSP中的缓冲液生产步骤，但将在本章进一步讨论。 图 1.1 典型生物制药生产过程（以单克隆抗体生产为例）的步骤和阶段。 有趣的是，研究表明，通过过滤步骤或预冲洗过滤系统，可以大幅降低USP和DSP中可提取物的浓度。因此，建议在生产过程的每个步骤尽早确定E&L风险概况，并与专门的毒理学家合作。过去9年发布的建议和标准，如BPOG、美国材料与试验协会和美国药典可用于此目的。值得一提的是，SU设备制造商生成的E&L数据并不免除DP制造商进行与其工艺相关的自己的研究。尽管如此，市场上当前一代SU系统的优势远远超过它们的弱点。然而，一个重要的前提是正确选择和使用SU系统。用户可以从各种不同的产品中选择，甚至可以使用SU系统设计平台工艺。著名的SU系统制造商如Cytiva（ReadyToProcess系列，FlexFactory™系列）、Merck（Mobius®系列）、Pall（Allegro™系列）、Sartorius（Flexact®系列）和Thermo Fisher Scientific（HyPerforma™系列）为USP、DSP、配方和灌装提供平台。基于这些平台的最先进的工艺具有明确定义的工艺序列，这有助于开发高效的工程工作流程，提高供应安全性，并提供工艺优化的潜力。 3.一次性系统：我们今天所处的位置 3.1.一次性上游处理 SU系统在生物制药生产过程的上游加工中无处不在。基于SU系统的完整上游生产线在mAb生产过程中已经成为现实，其中使用了以下SU设备：管道、无菌连接器、采样和转移系统、带有储存袋的生物工艺容器、搅拌器、一次性生物反应器（SUBs）、过滤系统，如深层过滤器、微滤、超滤和透析系统、离心机和分离器。此外，还使用了典型的实验室用具，如小瓶、摇瓶和移液管。然而，这些类型的用具以及管道、采样系统、转移系统和带有储存袋的生物工艺容器不是本章的主题。关于这些主题的详细信息可以在（第2章和第5章）中找到。在过去的16年里，根据Langer的分析，搅拌器和生物反应器是最常实施的SU系统。因此，它们和最常用的用于初级回收（细胞分离/澄清）的SU系统将在本节中更详细地描述。因为SUBs是USP的核心，它们将是本节的重点。 3.1.1.一次性搅拌器 SU搅拌器主要用于USP中的培养基生产。机械驱动系统用于此任务，并且商业上可获得的搅拌器容量高达个位数立方米。它们有一个圆柱形或立方体形的塑料袋，并且大多数是搅拌的，但偶尔也可以是振荡系统（例如，Cytiva ReadyToProcess™搅拌器，最大50升工作体积）或圆盘混合系统（Thermo Fisher Scientific ImPULSE™搅拌器，最大5000升工作体积）。在搅拌的SU搅拌器中，旋转的搅拌元件通常是磁力搅拌器。然而，也有带有密封件（顶部或底部安装）的搅拌SU搅拌器，如Pall的Allegro™ SU搅拌器（最大1000升工作体积，见图1.2）或Thermo Fisher Scientific的HyPerforma™ SU搅拌器。 图 1.2 磁力混合器系统。（图片由 Pall Corporation 提供） HyPerforma™ SU搅拌器有6种尺寸（50-2000升工作体积），并且有一个顶部安装的搅拌器。该系统提供了5:1的混合体积转换比，并且有加热和非加热版本。然而，Pall的Allegro™ SU搅拌器的工作体积可达1000升，并且配备了底部安装的搅拌器。 搅拌式SU搅拌器的容量可达7000升（ABEC的CSR® General Mixer）。目前，这些是市场上最大的SU搅拌器。Werner及其合作者以及de Boulard和Kienle提供了当前SU混合技术的更全面的概述。这两篇出版物讨论了其他机械驱动的SU搅拌器（例如，基于悬浮技术的搅拌系统或翻滚搅拌器）以及特别适合DSP（见“一次性下游处理”部分）和产品配方（见“一次性配方和灌装完成”部分）的水力驱动版本。毫不奇怪，大多数描述的SU搅拌器的工作原理也出现在SU生物反应器中，这些设备的制造商也提供SU混合技术。 3.1.2.一次性生物反应器 SUBs，从毫升规模到立方米规模，用于细胞生产（例如，接种物生产）和产品表达（例如，mAb）目的。根据它们的功率输入（见图1.3），它们可以分为四类：机械驱动、气动和液压驱动以及混合版本。机械驱动的SUBs是最大的群体，包括搅拌式、波浪混合式和轨道摇动的SU版本。机械功率输入是通过搅拌、摆动运动（波浪混合运动）或轨道摇动来实现的。气动系统中的直接曝气产生热量和质量传递，而液压系统中使用泵。 图 1.3 根据功率输入对常见单次使用生物反应器类型的分类。 3.1.3.搅拌式一次性生物反应器 几十年来，在微生物和哺乳动物细胞的可重复使用搅拌生物反应器的开发经验反映在搅拌SUBs的设计中。不同供应商现在提供高达6000升工作体积的SUBs（见表1.2）。这些系统由刚性容器（10毫升至40升工作体积）或柔性袋（4.5-6000升工作体积）组成，高度与直径比（H/D）为1.5:1-2.2:1。最大的8000升SUBs（6000升工作体积）由ABEC在2019年推出。刚性搅拌SUB系统通常是独立的，由聚碳酸酯制成的塑料容器，不需要支撑容器来成型。与基于袋子的系统不同，在使用刚性系统时，折叠应力通常不是问题，因为折叠应力可能导致层断裂，从而导致泄漏。使用培养袋时，重要的是袋子要正确安装并完全适合其固定装置，以实现最佳性能，特别是在热传递方面。在展开袋子和安装过程中可能引起的腔室、口袋和褶皱应该被防止。根据生物反应器的规模，容器的加热和冷却是通过加热块、块冷却器或双夹套来完成的。通常使用气体排放过滤器加热器而不是排气气体冷凝器，即使它们的性能较低。为了降低由于过滤器堵塞或泡沫导致的排气过滤器堵塞的风险，在较大的搅拌SUBs中，几个排气过滤器被并行连接。BioBLU® 0.3c生物反应器（Eppendorf）使用了不同的原理。无液体的Peltier元件控制排气空气中的温度和凝结。Ambr® 250系统（Sartorius）也采用了类似的原理，以减少由于蒸发导致的液体损失。BioBLU® 0.3c和Ambr® 250都是可堆叠的模块化系统，具有多达32个或更多的平行培养容器。生物反应器容器的工作体积为100-250毫升，适用于筛选实验和工艺开发。这两个系统都提供用于哺乳动物或微生物细胞的版本，使用不同类型的搅拌器（斜叶搅拌器与Rushton搅拌器）以满足生产生物体的不同要求。除了使用哺乳动物（主要是CHO）和微生物（主要是大肠杆菌{E. coli}和毕赤酵母{P. pastoris}）细胞的应用外，这些系统还用于处理人类原代细胞（即间充质干细胞{MSCs}、诱导多能干细胞{iPSCs}和CAR-T细胞），因为它们的高度自动化、并行运行培养的能力以及低初始工作体积。另一个流行的搅拌SUB系统，用于筛选研究、培养基优化和克隆选择是Ambr® 15，它提供10至15毫升的工作体积和自动化液体处理。与其他刚性搅拌SUB系统不同，Ambr® 15呈立方体形状，除了用于pH和DO测量的光学传感器点、搅拌器和搅拌器轴之外，没有内部结构。Nienow等人已经证明，Ambr® 15优于通常在早期工艺开发或CHO克隆选择中使用的常规摇瓶。他们证明，在Ambr® 15中表达IgG4的CHO细胞系的性能比摇瓶更接近大规模生物反应器。Lonza的数据也显示了Ambr® 15和更大的SU生物反应器中不同mAbs的产品滴度的可比性（见表1.1）。最近，Ambr® 15也被证明用于原代细胞的工艺开发。然而，由于Ambr® 15系统的技术复杂性更高，与其经典的摇瓶或TubeSpin®生物反应器相比，需要更多的努力来保持其运行。 台式搅拌式SUBs，包括AppiFlex ST (Applikon)、BioBLU® 1c、3c、5c和10c (Eppendorf)、Mobius® CellReady 3 L (Merck Millipore)和UniVessel® SU (Sartorius)，与经典的可重复使用搅拌细胞培养生物反应器的设计非常接近。所有哺乳动物版本都配备了一个或两个顶部安装的船用或分段叶片搅拌器，能够实现50-200 W/m³的特定功率输入，这对于常见的基于哺乳动物的过程来说是足够高的。UniVessel® SU是第一个商业化的刚性搅拌SUB，由两级搅拌器搅拌。分段叶片搅拌器(SBI)的三个元件在形状上类似于BioBLU®的“象耳”搅拌器，但它们的叶片角度较低，为30°（而不是45°），这导致功率输入较低。UniVessel® SU在过去已经被广泛研究，以预测流体流动、特定功率输入(0.4–435 W/m³)、混合时间(3–100 s)、氧质量传递(10–50 h⁻¹)和流体动力学应力。科学文献中报道了无数的应用，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和人类原代细胞。另一个被良好描述的搅拌式SUB是Mobius® CellReady 3 L，它在2009年夏天推出。该系统配备了一个船用搅拌器（顶部驱动）、一个微孔分散器或开放式管道分散器和标准传感器。关于Mobius® CellReady 3 L的生化工程参数的详细信息，包括流体流动和流体动力学应力，可以在几篇研究文章和教科书中找到。不同的作者已经表明，在Mobius® CellReady 3 L和3 L玻璃搅拌生物反应器中可以实现类似的细胞密度和抗体滴度。此外，Cierpka等人、Grein等人和Lawson等人已经表明，Mobius® CellReady 3 L和50 L可以成功地用于处理干细胞。由于3D打印技术的进步和生物相容性打印材料（USP VI级材料）的可用性，Applikon推出了AppliFlex ST生物反应器，其顶板和内部部件（包括搅拌器）都是3D打印的。生物反应器的定制为用户提供了新的程度的灵活性，允许调整尖端管/给液管线的大小和位置，以及搅拌器的类型和几何形状。因此，生物反应器可以根据工艺/应用进行设计，而不是相反。然而，由于3D打印的技术限制，生物反应器的最大尺寸目前限于台式规模（~10 L）。Thermo Fisher Scientific (HyPerforma™ S.U.B)和Cytiva (Xcellerex™)的SU搅拌袋系统可用于高达2000 L的哺乳动物细胞培养，并为不锈钢制成的搅拌生物反应器提供了真正的替代品。这两种生物反应器系统都使用圆柱形袋子，其中预先安装了低剪切搅拌器和通常使用的曝气设备，如微孔分散器和开放式管道分散器。这些袋子生物反应器的相关搅拌器（d/D为1:3–1:2）和反应器几何形状（H/D为1:1–2:1）是从它们的钢制对应物复制而来的。两个系统都拥有一个偏心、角向、轴向流动的搅拌器。偏心位置的搅拌器消除了表面的流体涡旋，消除了挡板的需要。XDR生物反应器使用磁力耦合、底部驱动的船用搅拌器运行，S.U.B是顶部驱动的，并包含了一个密封件。XDR和S.U.B系统目前被用于许多使用哺乳动物（例如，CHO、杂交瘤、Vero、婴儿仓鼠肾{BHK}）和昆虫细胞的mAb和疫苗生产过程中。Lonza实现了类似的产品数量（中到高细胞密度和滴度在g/L范围内），此外，对SUBs的微生物版本的的兴趣导致了S.U.F 300和XDR 200 MO的设计。Sartorius的BIOSTAT® STR高达2000 L，尽可能接近现代可重复使用细胞培养生物反应器的经典配置。袋子可以配备一个环状分散器或微孔分散器和两个轴向流动的SBIs，或一个轴向流动的SBI和一个径向流动的圆盘搅拌器的组合。生物反应器中的均匀混合是通过中心搅拌系统实现的。Löffelholz等人进行的实验和数值研究表明，由于其几何相似性导致的可比流体动力学特性，BIOSTAT® STR生物反应器具有可扩展性。他们报告了BIOSTAT® STR 50 L、200 L和1000 L（2 × SBI）的特定功率输入在29–86 W/m³（utip ~ 1.8 m/s）和混合时间在10到200 s之间。Lonza在其位于瑞士Visp的IBEX一次性生产设施中使用BIOSTAT® STR生物反应器。图1.4显示了当使用Lonza的GS Xceed® CHO平台技术时，BIOSTAT® STR生物反应器中的过程可扩展性的一个例子。 图 1.4 不同规模（200 L 中试规模，1000 L 和 2000 L 生产规模）的 BIOSTAT® STR 生物反应器中归一化活细胞密度（VCD）的时间依赖性曲线。数据代表基于 GS Xceed® CHO 平台技术的 Lonza 补料批处理生产过程。 Pall Life Sciences在2018年推出了Allegro™ STR系统，这是一个与经典生物反应器设计不同的生物反应器。Allegro™ STR的培养容器由一个方形袋子组成，有五种不同的规模（Allegro™ 50、200、500、1000、2000 L）。与经典的圆柱形搅拌SUBs不同，Allegro™ STR的支撑容器在袋子的侧面集成了凹槽，充当挡板。底部安装的变桨搅拌器提供了<30 s的混合时间和高达40 h⁻¹的kLa值，搅拌器速度高达105 rpm。Schirmer等人使用IgG产生的CHO细胞系进行的培养研究表明，Allegro™ STR 200 L生物反应器提供了与类似规模的经典搅拌SUB相当的细胞密度（21.5 × 10⁶细胞/mL）和mAb滴度（1.9 g/L）。Thermo Fisher Scientific最近引入了一个基于长方体容器的类似生物反应器概念：HyPerforma™ DynaDrive™ S.U.B系列（50、500、3000、5000 L），它专门设计用于强化过程。由于长方体容器形状和由此产生的H/D比率（2.5:1–2.9:1），高转换比高达10:1和20:1是可能的。与其他具有刚性搅拌器轴的搅拌SUBs不同，DynaDrive™的搅拌器安装在柔性传动系统上。根据生物反应器的大小，使用两个到四个直径为110-490 mm的船用搅拌器，这些搅拌器战略性地扩展了一个柔性绳梯，并在梯子底部使用扫掠搅拌器。关于DynaDrive™系统的生化工程参数和由此产生的流体流动模式的详细信息可以在中找到。总之，DynaDrive™提供了高达80 W/m³的P/V，kLa值在40到>50 h⁻¹之间，混合时间<60 s。Cobia等人证明了DynaDrive™系统（50、500、5000 L）在14天的标准补料批处理中的可扩展性。他们在不同的生物反应器规模上报告了可比的VCDs（~20 × 10⁶细胞/mL）和产品滴度（~3 g/L）（图1.5）。 图 1.5 Thermo Fisher Scientific 的 HyPerforma™ DynaDrive™ 生物反应器。（照片由 Thermo Fisher Scientific 提供） 美国食品药品监督管理局（FDA）的过程分析技术（PAT）倡议要求监测各种过程参数以确保生物制药产品的质量。因此，SUBs必须配备适当的传感器技术。如今，大多数SUBs只配备了基本的仪器（即pH、DO和温度传感器，见表1.2）。这些系统要么直接配备了SU传感器，要么可以使用无菌连接配备传统传感器。一些SUBs还包括内置的电容传感器，允许非侵入性在线测量活细胞体积（VCV）。关于SU传感器及其测量原理的当前状态的更多信息可以在中找到。 当前的趋势集中在引入非侵入性光谱测量技术（例如，紫外/可见光、红外、荧光、拉曼光谱），其中最有趣的是拉曼光谱。包括葡萄糖、乳酸、醋酸、甲酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨在内的几种与生物学相关的分子都是拉曼活性的，如果能够基于适当的过程训练集构建良好的模型，这项技术有潜力测量活细胞密度、总细胞密度和产品浓度。 3.1.4.波浪混合式一次性生物反应器 所有波浪混合生物反应器都使用由多层薄膜制成的2D或3D袋子。袋子通常由聚乙烯制成，接触层通常由乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)制成。袋子内的混合是通过由摇摆平台的摆动运动产生的波诱导混合过程实现的。袋子内部的波特性取决于袋子的几何形状、摇摆角度、摇摆速率、袋子的平移、填充体积和流体特性（即，流体密度和粘度）。过去的各种研究表明，波诱导混合对剪切敏感的悬浮细胞特别有益。Werner等人使用计算流体动力学(CFD)模拟发现，与配备Rushton涡轮和桨叶搅拌器的搅拌细胞培养生物反应器相比，能量耗散和剪切模式更加均匀。由于波动运动，氧气通过袋子内头顶空间的无泡表面曝气进入流体，培养基表面不断更新。大多数可用的波浪混合生物反应器系统的氧气传递速率（由体积氧传递系数kLa描述）及其对培养结果的影响已经进行了研究。波浪混合系统在袋子设计（即，材料、几何形状）、控制机制、安装的传感器类型和平台运动方面有所不同，可以是1D、2D或3D。质量和能量传递的强度，因此细胞生长和产品表达可以直接通过波的产生和传播来控制。然而，要适当控制各种影响参数，需要很好地理解系统。因此，在部署系统之前，使用生化工程方法对系统进行技术表征是有用的。关于波浪混合生物反应器的技术表征的详细信息，包括使用的方法的指南（例如，DECHEMA，BPOG），可以在科学文献中找到。 1D摆动混合概念在生物制药行业中使用最为广泛。1D运动袋子内的流体流动可以通过修改的雷诺数(Remod)来表征，这是Eibl等人在2009年引入的。他们发现，在1D运动袋子中，当Remod > 1000时会发生湍流条件，Remod取决于工作体积、培养袋的长度、液位、摇摆速率、流体的运动粘度和一个经验的袋子依赖常数。与Remod概念相反，Oncül等人引入了无量纲的Womersley数与参数β相结合，以量化流动的非稳态特性。他们发现，在β > 700和Womersley数>8.5时，振荡波浪混合生物反应器中会发生湍流条件。报道的混合时间（4–800 s）和kLa值（5–50 h⁻¹）使1D运动的波浪混合生物反应器适合大多数细胞培养（例如，CHO和BHK细胞），特别是那些对氧气需求低和中等且具有牛顿流体流动特性的。对于1D运动袋子，已经证明增加摇摆角度和摇摆速率比增加曝气速率更有效地增加kLa。当培养好氧微生物时，已经报道了1D运动袋子的氧气传递条件的限制。Hitchcock展示了通过增加薄膜层的形成来增加好氧微生物培养的氧气质量传递，对于涉及高光学细胞密度的细菌人乳头瘤病毒疫苗生产。为此，Hitchcock使用了一个BIOSTAT® RM 50 L袋子，工作体积为5 L。相反，Dreher等人展示了通过使用基于氧气消耗模型的线性进料策略，可以在BIOSTAT® RM 10 L（带5 L工作体积，10°和42 rpm）中实现E. coli BL21的OD600为130。 2D和3D运动袋子系统（例如，CELL-tainer®或Allegro™ XRS，见表1.2）提供了高达73和450 h⁻¹的kLa值。适应的袋子运动增加了湍流和表面更新。因此，这些系统适合对氧气需求高或具有特殊混合要求的培养，例如非牛顿培养基。CELL-tainer®结合了垂直摇摆运动和水平平移，而Allegro™ XRS有一个3D袋子，使用同时的双轴摇摆运动，使流动具有翻滚特性。关于CELL-tainer®生物反应器运动的详细信息，包括生化工程和CFD模拟数据，可以在中找到。Westbrook等人成功地使用CELL-tainer®生物反应器系统培养E. coli BL21并生产重组谷胱甘肽S-转移酶-hCD83ext融合蛋白，取得了与搅拌生物反应器相当的结果。Junne等人通过保持主要的几何特征（角度和板宽之间的比例）展示了CELL-tainer®系统的线性可扩展性，并能够在各个不同的规模（12–120 L）上产生可比的流体特性和剪切应力。 无可争议的是，1D运动的波浪混合生物反应器比2D和3D运动系统得到了更深入的研究，并且在生物制药行业中得到了更广泛的应用。实际上，CFD模拟揭示了层流条件的存在和远低于搅拌细胞培养生物反应器报道的剪切应力水平。这一事实也鼓励了不同的用户使用1D运动袋子进行细胞治疗制造，例如扩展人类间充质干细胞和人类免疫细胞（例如CAR-T或NK细胞）。鉴于此，Sartorius和Cytiva推出了波浪混合生物反应器系统（BIOSTAT® RM TX和Xuri™ Cell Expansion System），这些系统具有特殊袋子设计，用于原代细胞处理。除了这些应用外，1D运动袋子也已证明在基于动物细胞的病毒生产基因治疗、疫苗和病毒样颗粒疫苗的生产过程中是有效的。 3.1.5.轨道摇动式一次性生物反应器 对于静止的、搅拌的、直接曝气的SU生物反应器，工程参数和放大标准通常可以没有任何重大问题地建立，但轨道摇动生物反应器的自由液面使得这一点更加困难。摇瓶（例如Erlenmeyer flasks）可用的不同流动模式工程值无法转移到轨道摇动管（例如TubeSpin®生物反应器15, 50, 450和600）和基于袋子的系统（例如OrbShake™生物反应器）。最被广泛研究的一次性轨道摇动生物反应器系统是OrbShake™生物反应器（Kühner AG），它由一个3D圆柱形SU袋子、一个支撑不锈钢容器和一个外围测量和控制单元组成。OrbShake™系统在台式（Vw 12 L）和生产（Vw 2500 L）规模上都有提供，中间还有两个额外的系统规模（SB50-X和SB200-X）。流体的混合是通过摇动平台的轨道运动实现的。流体动力学受到选定操作条件的高度影响，因为不同的反应器直径、轨道直径、流体高度、旋转摇动速度和流体运动粘度的不同组合创造了不同的流动/涡旋结构，最终控制剪切应力、湍流、曝气、对流、混合和悬浮过程。关于OrbShake™生物反应器的生化工程数据和流体流动动力学的详细信息可以在中找到。Dittler等人报告了SB10-X系统在建立无滴度感染细胞保存和放大（TIPS）过程的成功使用，使用Sf-9细胞和重组杆状病毒Autographa californica multicapsid核多角体病毒，该病毒产生分泌型碱性磷酸酶（rSEAP）。通过使用SB10-X系统和TIPS方法，他们在感染后4天实现了144-158 U/mL的rSEAP活性，与传统的两阶段过程相比节省了2-3天。最近，Coronel等人为SB10-X配备了切向流过滤（TFF）和交替切向流过滤（ATF）设备，以在灌注模式下运行系统（另见“强化和连续设施趋势”部分）并生产人类影响A病毒疫苗。作者证明了在轨道摇动生物反应器中可以实现高达50 × 10⁶细胞/mL的活细胞密度。Anderlei等人报告了SB200-X在100 L工作体积下的kLa值高达45 h⁻¹，并且根据摇动频率（50–70 rpm），混合时间在25到70秒之间。对于SB2500-X，报道了较低的kLa值，范围从~2到25 h⁻¹，取决于工作体积（500–2500 L）和摇动频率（35–55 rpm）。 3.1.6.用于初级回收/澄清的系统 大多数生物制药产品（特别是mAbs）分泌到细胞培养基中。因此，需要一个初级澄清步骤来分离细胞和大的污染物。为此，最常见的分离策略要么是基于过滤，要么是基于离心。在初级澄清之后，执行二次和/或三次澄清，以去除更细小的颗粒和生物负荷。这些步骤可以由一个或多个级别的深层过滤器组成，然后是一个无菌级膜过滤器。Merck Millipore（Millistak+® Pod系统）、3M™（Zeta Plus™）、Sartorius（Sartoclear® L-Drum技术）和Pall（Stax™技术）提供了适用于不同澄清范围的SU过滤器。过滤器由硅藻土、纤维素或全合成纤维（例如聚丙烯腈纤维）、无机过滤助剂组成，在某些情况下，还有带电基团。全合成过滤器（例如Millistak+® HC Pro）在工艺一致性方面提供了优势，并且在使用前需要的冲洗量显著减少。一些过滤器的过滤表面带正电荷，以通过电动力学吸附减少带负电的污染物。吸附性能允许过滤适应范围广泛的细胞培养液。例如，3M™ Emphaze™和Harvest RC是基于AEX的吸附性过滤器，可以大大减少HCCF中的rDNA。总的来说，SU深层过滤器由于其直接放大、模块化设计和完全封闭的过滤片/胶囊的可用性，便于轻松和安全地处理，提供了优势。 SU离心机是整个初级澄清和二次澄清步骤的SU过滤器的替代品，特别是当需要分离大量生物量时（例如，强化的补料批处理或灌注过程）。近年来，新的SU离心机（GEA kytero®, Alfa Laval CultureOne™）已经上市，补充了已经可用的离心机（CARR UniFuge和U2k, Sartorius Ksep®）。Sartorius的Ksep®系统使用具有流化床技术的逆流离心分离细胞和上清液[122]。分离过程包括加载、洗涤和卸缓冲液和细胞的重复周期。该系统有两种不同的尺寸，允许最大流量为114 L/h（Ksep® 400；处理体积10-200 L）和720 L/h（Ksep®6000 s；处理体积50–2000 L）。Saballus等人最近证明了Ksep®系统适用于澄清高细胞密度CHO过程（100 × 10⁶细胞/mL）。通过使用离心后过滤步骤，他们能够将浑浊度从8000降至<5 NTU，同时保持>90%的mAb回收率。其他SU离心机，如CultureOne™或kytero®（见图1.6），基于经典的盘片堆叠技术。在这些系统中，具有更高细胞密度的悬浮液集中在分离碗的外围，而纯化的上清液从中心上部移除。因此，实现了高浓度细胞和清澈上清液的连续排放。这两种SU离心机系统都有两个尺寸；CultureOne™ Primo和kytero® 500建议用于从高达500 L的生物反应器中收集细胞（处理能力高达200 L/h），因此用于中试规模。相比之下，CultureOne™ Maxi和kytero® 2000是为生产规模设计的，可以处理高达2000 L的细胞悬浮液体积（处理能力高达600 L/h）。kytero®系统完全无轴、机械轴承和密封件驱动。旋转的分离碗由磁力技术（breezeDrive®）悬浮。在CultureOne™系统中，过程室由机械密封件与环境隔离。Ott等人最近证明了kytero® 500 SU离心机适用于澄清CHO细胞培养悬浮液（补料批处理，VCDmax = 16.8 × 10⁶细胞/mL）。他们能够在不到2小时内完全分离出200 L SUB中的细胞悬浮液，实现98-99%的mAb回收率和10-15 NTU的浑浊度。 图 1.6 kytero® SU 离心机。（版权所有 GEA AG） 细胞分离的进一步选择包括利用SU声学室的声学分离技术，这些技术可以有效地减少高达2000 L生物反应器规模的浑浊度、颗粒和细胞。宏观尺度的声学分离器使用多维驻波从悬浮液中移除细胞和颗粒。为此，细胞悬浮液通过一个声场移动，在该声场中，物理力保持细胞并将它们聚集在声波的交叉点或节点处形成紧密堆积的群体。一旦达到临界细胞群大小，细胞群就会因重力而开始沉降。Pall的Cadence™ Acoustic Separator就是这样一个系统的示例。 3.2.一次性下游处理 最初主要用于USP的SU系统（见“一次性上游处理”部分），近年来在DSP中也越来越受欢迎。如今，可以使用SU系统执行复杂的步骤，如色谱、离心和TFF。然而，由于过去二十年细胞密度和产品滴度逐渐增加，过程强化已成为DSP中的一个重要方面（见“强化和连续设施趋势”部分）。在DSP中使用SU技术提供了更大的设计灵活性，并在过程变化变得必要时更快地适应。此外，合格和投产过程的准备时间更短，从而减少了变更控制文件的成本和工作量。因此，这对新生物制药产品的上市时间有重大影响。然而，DSP中的SU技术在可扩展性方面仍然有限，因此不支持超过4000 L的生产规模。因此，有一种趋势是向更大的一次性模块发展，这些模块支持更大的生产量或进一步的过程强化。 色谱是生物制药纯化中使用的关键技术。例如，通常进行三个色谱步骤来纯化mAb。第一步，称为捕获色谱，用于从澄清的细胞上清液中分离、浓缩和稳定产品。然后是两个抛光步骤，以进一步耗尽宿主细胞蛋白（HCP）、脱氧核糖核酸（DNA）和高分子重量物质（例如，聚集的产品）。使用一次性柱和SU色谱平台可以实现更快的周转时间，并通过消除清洁过程和验证来提高设施生产率。Cytiva（ÄKTA™ ready SU系统）和Pall（Allegro™ SU色谱系统）提供了SU色谱系统。两个系统都使用完全一次性的流路、预装的传统或SU柱和基于膜的色谱产品。这为多产品设施提供了相当大的灵活性，并从长远来看降低了处理成本。使用预装的一次性柱允许将劳动密集型和技术性很高的装填过程外包。这消除了装柱系统和装柱和清洁所需的缓冲液的需要。然而，预装柱的大小是有限的。Cytiva和Repligen提供了不同树脂和格式的GMP兼容柱。SU膜吸附剂（例如，Sartorius的Sartobind®，Pall的Mustang®）代表了基于柱的色谱的替代品，对于DSP过程强化特别感兴趣（见“强化和连续设施趋势”部分）。 病毒清除至少基于两个正交步骤，如国际人用药品注册技术要求协调会（ICH Q5A指南）所要求。通常，这是通过结合使用低pH病毒灭活步骤和过滤和色谱病毒清除步骤来实现的。为病毒灭活步骤提供了特别设计的SU混合系统。病毒过滤步骤通常使用具有15-20 nm膜截止的过滤胶囊（例如，Planova™，Viresolve®，Virosart®）在专用的SU处理平台上运行（例如，Agilitech、Sartorius、Cytiva、Merck Millipore的SU病毒过滤系统）。 3.3.一次性配方和灌装完成 配方步骤的目的是浓缩并交换产品溶液中的缓冲液，以实现适当的体积减少和缓冲条件。通常使用TFF来实现这一目的。使用TFF，溶液可以预浓缩至理想的浓度进行透析过滤。可以通过透析过滤完成缓冲液交换，并将产品浓缩至最终浓度以进行进一步处理。通常使用5-7的透析过滤体积以实现高达99.9%的缓冲液交换。如今，市场上有各种TFF系统（例如，Pall、Repligen、Merck Millipore、Parker）提供SU流路和带有高膜面积（高达10 m²）的SU卡带。一旦最终配方均匀，就应该对其进行无菌处理和灌装，不影响DP的稳定性或功能性，并尽量减少产品损失。为了满足所有这些要求，需要以下设备：解冻单元、合并或结合单元（例如，疫苗）、混合单元、自动化配方控制和计量单元、过滤单元和最终灌装机。如今，不同的制造商（例如，Meissner、Parker、Pall、Sartorius、Single-Use Support）提供了SU冷冻（例如，Cellsius® Pak, RoSSpFTU）和灌装系统（例如，SciLog® FD, Linkit® AX, Allegro™ SU灌装, RoSS.FILL）。SU灌装线设置的案例研究可以在以下参考文献中找到。 4.趋势加强和持续设施 Konstantinov 和 Cooney 定义了连续单元操作作为流程的一个子单元，在其中存在持续一段时间的连续流动输入和最小的内部保持体积。输出可以是连续的，或者被离散成小批量，然后以循环方式生产。基于这个定义，可以定义两种不同类型的连续过程：(1) 混合连续过程，其中批处理和连续单元操作被结合，以及 (2) 完全集成的单元操作或端到端过程。如今，混合连续过程已经是生物制药生产中的现实，其中可以区分出三种不同的类型：(1) 连续上游后跟批处理下游，(2) 连续上游和捕获与批处理下游，以及 (3) 批处理上游后跟连续下游。第一种类型并不新鲜，几十年来一直用于生产治疗性酶、血液因子和某些单克隆抗体。将这种方法发展到连续捕获步骤代表了重要的改进，解决了与下游过程相关的高成本问题，其中捕获步骤单独占成本的大约 25%。连续捕获方法意味着在澄清步骤之后不再需要大型保持罐，并且理论上可以将 Protein A 柱的尺寸减少两个数量级，这也导致缓冲液使用显著减少。在第三种方法中，细胞培养通常以传统的补料批处理模式进行，而一个或两个下游过程（例如，捕获，抛光）连续运行，这导致更小的连续色谱柱（=成本降低）。 无可争议的是，近年来大量使用单元操作（SU）系统的可用性推动了更加强和连续的单克隆抗体生产过程的发展。这一事实并不令人惊讶，因为现有的 SU 技术促进了加强单元操作的执行。然而，必须区分上游过程（USP）和下游过程（DSP）的加强。上游加强通常需要使用灌注技术，在这种技术中，细胞被保留在生物反应器中，而部分细胞培养基被连续交换。科学文献中报道的灌注过程中最高的细胞密度（VCD）高达 200 × 10^6 细胞/mL。为了以最小的培养基消耗实现如此高的 VCD，Ozturk 提出了使用细胞特异性灌注率（CSPR）来控制灌注过程。CSPR 描述了每天每细胞供应到生物反应器的细胞培养基量，是每细胞营养供应的良好指标。由于在灌注过程中细胞被保留在生物反应器中，因此生物反应器必须配备内部或外部灌注设备以保留细胞（见表 1.3）。选择合适的细胞保留设备是开发灌注过程的重要考虑因素，任何 SU 细胞保留设备都应满足以下特征：(1) 高鲁棒性，(2) 高细胞保留效率且不损伤细胞，(3) 高产品产量，(4) 可扩展性，(5) 低运行成本，以及 (6) 连续收获。细胞保留设备包括内部灌注膜过滤器、TFF 系统、ATF 系统、声波分离器和离心机。除了带有内部灌注膜过滤器的波混生物反应器系统外，所有其他系统均可用于生产规模。波混系统易于使用，因此通常应用于 N-1（即种子阶段）灌注过程。SU 灌注系统的可用性在过去几年中促进了高种子补料批处理生产和浓缩补料批处理过程的发展。除了前面提到的加强过程外，完全连续的灌注过程也非常有趣。这样的过程的目标是实现一个稳态，在这种状态下，生产力和产品质量可以在长时间内仅以最小的偏差维持，同时连续排出废细胞培养基和产品。与 N-1 灌注过程不同，必须定期进行细胞出血以保持必要的恒定 VCD 和高细胞活性。目前，这类过程的目标运行时间范围为 30 至 90 天；过程在稳定条件下运行的时间越长，生物反应器的空间-时间产量就越高。通过使用连续 USP 过程，已报道了 1 g/L/d 的特定生产力 。长时间的运行清楚地表明了对 SU 生物反应器及其内部和外部外围设备在抗性和无菌性方面的高要求。专门设计用于连续灌注过程和加强补料批处理操作的搅拌 SU 生物反应器的一个例子是 Thermo Fisher Scientific 的 HyPerforma™ DynaDrive™ 系列，已在“单次使用生物反应器”部分展示。因为加强 USP 可能导致更高浓度的固体和细胞污染物（例如，HCP，DNA）以及蛋白质聚集体，收获和随后的处理比传统补料批处理过程更加困难。然而，有两种主要的 DSP 加强方法：(1) 增加色谱柱的结合能力或更有效地使用它们，和/或 (2) 通过连续运行每个过程步骤来增加生产力。在单克隆抗体生产的捕获步骤中，通常使用 Protein A，自发现以来已经优化了几次（例如，增加结合能力，提高稳定性）。加强捕获步骤的替代方法是基于执行几个更便宜的色谱步骤而不是使用亲和色谱，或者专门使用阳离子交换色谱进行捕获步骤。其他纯化选项包括沉淀 、目标产品的结晶和两相萃取。捕获和抛光步骤也可以使用膜色谱而不是传统的填充床柱进行。膜色谱允许比填充床柱更高的流速（高达 50 倍）和更低的操作压力。各种制造商（例如，Natrix Separations，Pall，Sartorius）提供 SU 膜胶囊，也可以在结合-洗脱或流过模式下使用。根据 Lim 等人的研究，膜技术比传统填充床柱便宜得多，并且可以节省高达 65% 的成本。然而，膜色谱的缺点是其结合能力低于填充床柱。因此，膜技术目前不广泛用于 DSP 的捕获步骤。Casey 等人提出了在捕获步骤中添加五倍单次通过 TFF（=SPTFF）以减小捕获柱的尺寸。这种方法减少了高达 80% 的树脂和缓冲液使用量，从而显著降低了成本。加强 DSP 的另一种方法是在抛光步骤中使用混合模式色谱。不是依次执行几个色谱步骤，而是使用具有不同亲和力的几个组分作为色谱柱的固定相。 如上所述，过程加强的最终目标是创建一个端到端的过程。这包括使用多柱或逆流色谱的连续捕获步骤。在多柱技术中，几个柱子并行连接并循环操作。因此，只需较小的柱子尺寸。此外，这种方法消除了生产生物反应器后的保持步骤，并减少了使用的树脂和缓冲液量。目前，Merck Millipore（Mobius® Multi Column Capture System）和 Sartorius（Resolute® BIOSMB platform）提供了符合良好生产规范（GMP）的多柱色谱系统，具有完整的单次使用（SU）流路。这两个系统都可以用于捕获步骤的结合-洗脱模式，以及抛光的流过模式（例如，离子交换、疏水或混合模式色谱）。通过结合杂质而不是目标产品，实现了连续操作。一旦柱子完全被杂质加载，杂质突破发生，必须更换柱子。然而，这并不代表真正的连续操作模式，因此被称为伪连续。如前所述，在DSP期间需要执行病毒灭活和病毒过滤步骤。连续病毒灭活有两种方法：(1) 适应经典方法，使用两个交替操作的SU混合器（例如，Pall的Cadence™ Virus Inactivation system）和 (2) 实施一个 plug-flow 反应器，在反应器入口处向产品流中添加酸。在后一种情况下，产品在 plug-flow 反应器中的停留时间保持低pH值，然后在出口处通过添加碱进行中和。连续病毒过滤是使用多过滤器概念进行的，其中两个单独的过滤器并行连接。一旦一个过滤器达到其容量（例如，由于压力限制），系统自动切换到另一个过滤器，以便第一个过滤器可以无菌更换。单克隆抗体的配方通常需要几个TFF步骤，在这些步骤中，产品首先通过超滤浓缩，通过透析转移到适当的缓冲系统，并在第二步超滤中达到最终浓度。因此，这些过程通常不是连续步骤。SPTFF可以用于蛋白质浓缩和透析的连续处理。为此，可以通过增加膜面积和降低流速来增加过滤时间，以至于一个连续的过滤步骤就足够了。 5.总结和结论 SU系统已成为生物制药生产过程中不可或缺的一部分。大多数（约80%）用于研发以及临床前和临床样本生产。它们的特点是高度模块化、灵活性和安全性，以及节省成本的潜力。SU系统已变得重要，特别是对于合同制造组织生产治疗性蛋白如单克隆抗体及其生物仿制药，以及在Covid 19大流行中活跃的疫苗制造商。它们可以在整个生产过程中找到，从上游到填充和完成。尽管与大流行相关的SU系统耗材供应短缺，但预计SU系统的增长将继续。事实上，预计到2030年，全球SU过程市场将以每年16.6%的复合增长率增长。已经批准和正在开发中的细胞和基因治疗产品将有助于这一增长。当前的趋势是基于SU技术的加强和连续过程，其中实施了灌注，并在更短的时间内或更小的设施中实现了目标产品滴度和数量。SU系统制造商近年来开发的改进（例如，新的膜材料，系统更易于操作）和创新（例如，用于超高细胞密度过程的混合器和生物反应器，特殊灌注系统）为这一趋势做出了决定性贡献。然而，目前市场上许多现有系统并未完全适合此目的。需要更均匀的改进聚合物，允许更具创新性的设计；SU传感器需要提供更好的长期稳定性；需要在管道和连接器技术方面进行进一步创新；最终，SU产品需要更具成本效益。然而，后者也可能是SU系统新生产商的机会，可以促进这些系统在生物制药行业之外（例如，化妆品和食品工业）的日益实施。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：慢病毒载体（LVs）是将感兴趣的基因传递到哺乳动物细胞的强大工具，目前常用于细胞和基因治疗领域，用于治疗单基因疾病和如嵌合抗原T细胞（CAR-T）疗法等的过继疗法。本文全面回顾了LV生产中采用的各个生物加工操作。我们强调了包膜蛋白在载体设计中的作用以及它们对慢病毒载体生物加工的影响。对这些操作现状的概述提供了生物加工发现和改进的机会，重点强调了在开发和临床生产期间对LV进行最佳和可扩展处理的考虑因素。描述了LV产生的上游培养，并对不同的转染方法以及悬浮和贴壁生产细胞培养的各种生物反应器进行了比较。检查了LV的纯化，评估了小规模和大规模生产要求的不同下游工艺操作序列。对于可扩展操作，重点是层析纯化的发展，以及对切向流过滤应用的深入检查。还介绍了载体定量和特性分析的摘要。最后，讨论了LV生产的整个生物加工评估，以从不同工艺选项的潜在相互作用的更广泛理解中受益。本文旨在帮助从健壮和可扩展的过程中实现高质量、高浓度的慢病毒载体。 1.引言 慢病毒载体（LV）通常用于细胞和基因疗法中，用于将感兴趣的转基因转移到受体细胞中以获得治疗效益。作为载体，它们能够转导分裂和非分裂细胞，如神经元、造血干细胞和免疫系统细胞，特别是T细胞，传递高达11千碱基（kb）大小的转基因。LV是治疗单基因疾病和需要基因传递的过继细胞疗法试验的主要载体兴趣点，占英国体外先进治疗药品（ATMP）的57%。在美国、中国、欧盟和加拿大有100多项正在进行的临床试验正在使用慢病毒载体，用于体外细胞修饰或体内疗法。总体而言，由于其在临床试验中的普及和最近CAR-T疗法Kymriah和Yescarta的市场批准，预计到2026年LV生产市场将增长至8亿美元。随着对慢病毒载体疗法的持续兴趣，对高效的LV生物加工的需求也在增长。在扩大规模和生产过程中的问题可能会推迟慢病毒载体在临床和商业用途中的采用。当今遇到的一些生物加工挑战包括在上游生产中无法产生足够的滴度，以及在下游处理过程中普遍的低回收率，导致许多公司无法提供足够的能力以满足大规模需求。尽管目前存在开发适量载体的问题，但病毒载体及其生物加工的应用是一项有价值的企业。考虑到只需要改变转基因就可以转向另一个产品，通用生产过程的兴起是可能的。这可以是包装细胞系的形式，其中细胞恒定地表达载体组分和所选的包膜蛋白，等待合适的转移卡带进行稳定或瞬时表达。对于已建立的平台，生产者细胞系可能是有价值的，其中细胞恒定地表达与载体生成相关的所有组分。从理论上讲，这些细胞系具有有利的商业属性，因为它们不需要所需的质粒DNA和转染步骤。一旦设计了优化的上游和下游，开发一个平台以快速交换和验证转基因的可行性很高。加强和连续的处理，如在重组蛋白生产中看到的那样，可能有助于成本效益高的载体生产。 2.慢病毒载体的生物加工 慢病毒载体因其生理和物理化学特性而独特。LV通常基于HIV-1，并共享其许多特性，如80-120纳米直径的球形形状，衣壳核心和功能性酶，以及来自宿主细胞膜的包膜。LV颗粒的固有复杂性和敏感性在加工过程中带来了挑战，例如颗粒热稳定性（例如，在37°C下半衰期在7-8小时范围内），对冻融周期的敏感性，需要快速处理，盐，pH，剪切和缓冲液渗透压。在这里，由于未包装的载体或酶功能丧失或包膜蛋白损坏/缺失导致转导能力的丧失，是有缺陷的颗粒可以与功能性载体共纯化，这在减少过程能力方面是有问题的。此外，生产细胞类型及其在生产期间的活性已涉及载体稳定性，因此必须保持细胞健康以获得高产量。从野生型病毒发展慢病毒载体需要评估病毒基因组并选择病毒组分以确保安全和有效的基因转移。HIV基因组组织成转元素，编码功能性、结构性和辅助性蛋白，如Gag多肽、包膜蛋白和功能性酶，而非编码顺式元素如长末端重复序列（LTR）协助将病毒RNA基因组转录和包装成病毒颗粒，并指示逆转录和整合到受体细胞的区域。因此，慢病毒载体的最初发展已经看到了HIV-1的顺式和反式作用元素的分离到单独的质粒上，除了HIV-1包膜，它被伪型化为替代包膜蛋白，如小鼠白血病病毒（MLV）的全嗜性包膜蛋白或VSV-G在第三个质粒上。随后的几代人通过去除不必要的病毒序列，如辅助蛋白vif、vpr、vpu和nef，以提高滴度和安全性。在现代第三代包装系统中，tat被移除，一个组成型启动子取代了转移质粒5' LTR中的U3，以允许在没有Tat的情况下进行转录，以提高生物安全性。为了进一步保持安全性并维持载体滴度，rev在另一个质粒上提供。因此，当前的做法特点是3-4个质粒，其中包含感兴趣转基因的自我灭活转移质粒，由HIV-1 LTRs和rev反应元件所环绕。这与包含基本转元素Gag-P的包装质粒共同转染，第三个包含包膜蛋白的包膜质粒，以及第四个如果不在其他地方包含的话，用于HIV-1 rev。LV处理的要求因应用而异，但高滴度和纯度是最重要的。大多数载体生产中的杂质将是残留DNA、转染试剂、宿主细胞蛋白和培养基成分（见表1）。对于细胞疗法，最终产品是转导的细胞，因此载体的纯度配置文件比体内疗法的纯度配置文件不那么严格，因为产品质量保证/质量控制（QA/QC）要求在细胞阶段。对于体内疗法，要求将与载体本身有关。因此，对于体内疗法过程，关键质量属性将侧重于质量和浓度，而体外则侧重于质量和产量。 2.1.伪型包膜蛋白 慢病毒（LV）通常进行伪型化，即将载体的包膜蛋白替换为另一种病毒的包膜蛋白（见表2），实际上是用来自其他病毒的蛋白质包裹病毒颗粒，这些蛋白质为载体提供了不同的特性，影响其嗜性以及预期的细胞靶标，也可能影响生物加工过程中的成功。当转导细胞时，包膜蛋白必须与受体细胞表面的受体接触并结合。包膜蛋白的选择、其在载体表面的频率以及受体的可用性对于有效转导至关重要，同时限制了非靶目标的相互作用。在LV生物加工中，包膜蛋白必须在生产细胞中适当表达并整合到载体中。由于这些蛋白质属于载体表面，它们直接与大量介质相互作用，因此受到加工过程中应用的物理化学条件的影响，如剪切力、盐浓度和pH值。因此，包膜蛋白的选择对于载体设计很重要，不仅影响载体的功能和预期靶标，还影响载体在加工过程中的初始表达、对生产细胞的影响以及在下游加工过程中的单元操作的影响。许多病毒包膜蛋白可以伪型到LV颗粒上。然而，最常用的伪型包膜蛋白，并且被广泛认为是黄金标准，是来自印第安纳囊泡性口炎病毒的VSV-G糖蛋白。这种蛋白质通常被使用，部分原因是其广泛的嗜性，与大多数细胞类型中普遍存在的低密度脂蛋白受体（LDL-R）相互作用。然而，从载体设计的角度来看，VSV-G的缺点是表现出细胞毒性，导致在高表达时LV生产细胞系中的细胞不稳定，并限制了其在瞬时转染方式中的应用。尽管已经展示了VSV-G的稳定表达，但可能是由于载体超感染或表达减少导致结果不佳。尽管如中所述，VSV-G的诱导性启动子可能避免由组成型表达引起的细胞毒性，但这在加工过程中可能会由于诱导剂的添加或去除而出现问题（见第3.2节）。VSV-G LV通常应用于体外疗法，因为它们会被人血清中的补体灭活。在体内，对VSV-G的额外免疫反应是显而易见的，这可以通过适应性免疫反应抑制随后的LV给药。此外，尽管LDL-R普遍存在，但临床上有价值的静止淋巴细胞对CAR-T疗法的受体表达特别低，因此转导效率低下，除非事先激活。然而，由于VSV-G提供的高功能性滴度，其应用广泛，是常用的包膜蛋白。 包膜蛋白受到需要在下游加工中考虑的物理化学条件的影响。带有VSV-G包膜的LV已观察到在pH偏离pH 7时灭活，并且在用1M NaCl处理时，1小时内失去50%的功能滴度。对载体加工的影响在超速离心中尤为明显，其中带有包膜蛋白VSV-G的LV在超速离心中的表现优于带有流感包膜蛋白的LV或HIV-1包膜蛋白超过VSV-G，并且似乎对剪切有抵抗力。在加工过程中需要考虑包膜蛋白的稳健性，并解释载体包膜稳定性的差异。 已经研究并应用了其他包膜蛋白进行LV伪型化。来自与VSV相同的囊泡病毒科的糖蛋白Cocal-G与VSV-G共享71.5%的氨基酸序列，因此具有类似的特性。通过Cocal-G包膜的LV的转导已被可溶性LDL-R抑制，类似于VSV-G，因此可能通过相同的LDL-R或类似受体感染。与VSV-G不同，Cocal-G不会被人血清灭活，并且可以恒定表达，允许在载体生产细胞系中稳定表达的潜力，尽管这会导致超感染和细胞不稳定。已经检查了其他囊泡病毒科糖蛋白用于稳定生产细胞系的生成，如来自PIRY、Chandipura和VSV-New Jersey的那些，它们显示出105到106 TU/mL的滴度，在浓缩和冻融过程中稳健。此外，已经应用了病毒包膜蛋白RD114进行载体生产。来自猫内源性逆转录病毒的RD114包膜显示出较少的细胞毒性，不会被补体灭活，并允许在稳定生产细胞系中使用。这些包膜蛋白能够转导CD34+细胞，并在超速离心中显示出稳健性，50-70%的产量与100-200倍的浓缩。RD114已经进一步修改，通过在HIV基质/衣壳蛋白裂解位点的R肽裂解位点插入HIV基质/衣壳裂解序列，从而产生了RDPro包膜蛋白，与RD114相比，在瞬时生产中显示出更高数量级的滴度。这些RD114衍生的包膜蛋白进一步防止了超感染的作用，即产生的载体被阻止转导它起源的细胞系，并已在CAR-T疗法的淋巴细胞转导和CD34+前体细胞中找到应用。其他包膜，如仙台，需要胰蛋白酶处理来通过蛋白裂解激活包膜，尽管需要考虑在加工过程中补充额外的单元操作。此外，激活的仙台包膜在超速离心中表现较差，与未裂解包膜的50%恢复率相比，恢复率降至20%。 随着病毒载体的伪型化，理论上，任何在细胞表面表达的病毒组分都可以使用。然而，这些方法依赖于病毒蛋白，这可能会引起安全方面的担忧，并在筛选上增加开发成本。已经应用的一种方法是“即插即用”包膜蛋白，通过二硫键将细胞靶向蛋白共价键合到它们的表面，或者通过生物素化的靶向配体。这样的工作可能会改善载体的可能靶向机制，尽管这可能需要在加工过程中增加额外的单元操作以完全结合靶向组分。 3.慢病毒载体的上游生物加工 上游加工的重点是在批量生产LV的同时，允许有效的下游纯化。有几个重要因素需要管理，这些因素取决于生产模式，无论是通过质粒对细胞进行瞬时转染，还是使用稳定或可诱导的生产细胞系。一个基本因素是细胞的可扩展性扩展、它们的活性以及达到最佳LV生成的合适细胞密度。因此，细胞系的类型，无论是贴壁还是悬浮，用于扩展的生物反应器、具有适当补充的细胞培养基类型以及适用的瞬时转染方法，都是需要考虑的重要因素。 3.1.LV生产的细胞系 需要一个合适的细胞系来以高滴度生产LV颗粒。通常，选择的细胞系是人胚肾细胞293（HEK-293），特别是衍生的293T系。HEK-293T具有SV40 T抗原，这与抑制p53和阻止细胞内先天免疫反应的激活有关，已被证明可以提高LV的滴度。这种后继细胞系比其前身显示出几个优点，特别是更短的倍增时间、更高的转染效率和更高的载体滴度以及适应悬浮培养。培养密集的细胞群体对于高载体滴度非常有益，因为从理论上讲，每个细胞都是LV的产生单元。然而，这需要在整体流程上进行一定程度的优化，因为高细胞密度与较低的细胞活性相关，这将在加工过程中需要去除更多的污染物。这个缺点可能会抵消更多细胞数量带来的滴度优势。 3.2.瞬时、稳定和诱导生产 LV生产的主导模式是瞬时转染细胞，使用各种质粒表达和包装LV。最初开发这种方法是为了最小化复制能力载体的风险，这种方法已经经历了代际发展，以提高产量和安全性。质粒与化学转染剂共转染，通常给出的滴度在非纯化的范围内为10^6到10^7 TU/mL，尽管更大的转基因会给出较低的滴度。尽管如此，用残留的质粒DNA和转染试剂污染饲料是一个问题，需要去除这些。由于转染剂的细胞毒性问题，通常需要在转染后进行培养基交换，这需要额外的设备用于泵和罐混合质粒DNA、转染试剂和培养基，此外还增加了整体培养基消耗。此外，许多因素可以影响转染效率，包括质粒浓度、试剂：DNA比例、细胞密度、孵化时间、混合方案、温度和pH，其中一些在扩大规模时具有挑战性。因此，载体滴度的批次间变异性明显。临床级质粒和转染试剂的成本为生产运行增加了大量费用，通常至少使用每百万细胞1µg质粒DNA。有多种转染试剂可用于LV生产，选择哪一种将极大地影响生产运行的处理步骤和货物成本。磷酸钙（CaPi）是一种经济的转染试剂，通常在实验室或小规模使用，涉及在混合氯化钙和DNA与HEPES缓冲盐水时形成细小的磷酸钙和DNA沉淀物。沉淀物沉降并被细胞内吞。然而，这种方法由于混合两个缓冲液以产生一致的沉淀物而难以扩大规模；需要优化的变量，如组分浓度、温度和聚集时间。由于pH的微小变化，该过程进一步复杂化，这会对转染效率产生负面影响。此外，CaPi转染可能会在没有血清或白蛋白保护作用的细胞培养中引起细胞毒性。阳离子脂质体，如脂质体，也已被使用。它们形成包裹DNA的脂质体，通过与DNA的负电荷复合。脂质体与细胞膜融合，释放其内容物进行表达。尽管能够转染许多细胞类型，但脂质体具有细胞毒性，可以降低活性，因此在应用后需要进行培养基交换，因此通常只在开发规模使用。聚乙烯亚胺（PEI）更适合可扩展的转染，通过形成细胞内吞的与DNA的多聚体，提供了一个高效且成本效益的选择。多聚体的形成和降解是时间的函数，因此有一个最佳的使用窗口。尽管如此，PEI被认为比CaPi更简单，不需要严格控制以获得最佳的转染效果，同时使用的质粒DNA也更少。重组杆状病毒也被用作转染试剂来转移病毒组分，尽管这可能会导致在下游加工（DSP）中分离杆状病毒和慢病毒载体的更大成本。无论采用何种方法，载体生产通常在转染后48小时内达到峰值，从72小时开始下降，为收获提供了有限的时间窗口。理想情况下，载体群体的质量应该是相似的，尽管由于每个细胞规模上的转染效率不同及其对活性的影响，载体群体通常是异质的。瞬时转染的替代方案可以在稳定生产或包装细胞系中找到（见表3）。在这些细胞系中，病毒组分在细胞内恒定表达，不需要额外的质粒和转染试剂，除了包装外，只需要转移质粒。这简化了上游培养，并避免了来自残留质粒的额外成本和污染物负荷。此外，稳定细胞系生产者可能会产生更高质量的颗粒，由于生产的克隆来源，允许产生近乎同源的颗粒。此外，这种收获往往更清洁，可能由于存在的基于包膜的囊泡较少，以及缺乏质粒和转染试剂负荷。这样的稳定细胞系有潜力提供成本效益、可扩展和可复制的载体运行，每批之间的变异性较小，因为每个细胞将保持一致的生产能力。 高性能的稳定生产者通过基因组标记、筛选活性位点并用慢病毒组分替换而创建。例如WinPac和LentiPro26这样的细胞系已经被开发出来，它们提供了每天每毫升10^6 TU的滴度范围，前者利用逆转录病毒标记和重组酶介导的盒交换来高表达Gag-Pol，后者应用了活性较低的突变病毒蛋白酶来维持细胞活性并提高滴度。这些稳定的生产细胞系可能很难开发，需要分离和评估单个克隆的组分表达，这些需要在筛选抗生素中培养以维持滴度。 为了简化这一过程，已经开发了努力，例如使用细菌人工染色体，它将所有载体组分结合在一个单一的构建上，或者开发高通量筛选方法，例如将编码部分GFP片段的单个分离生产细胞与表达互补GFP片段的细胞共同培养，并监测GFP的重组以识别高产者。然而，关键地，稳定生产细胞提供的滴度低于瞬时引导方法，因此它们的采用是个问题。这特别是由于病毒蛋白表达可能对细胞产生的细胞毒性效应，例如蛋白酶，它与裂解促凋亡蛋白有关，以及包膜蛋白选择的限制。例如，VSV-G，一种高效的包膜蛋白，很难恒定表达。潜在的细胞毒性转基因也对长期在稳定生产者中表达是个问题。这个问题已经通过一种细菌色氨酸RNA结合衰减蛋白得到了解决，它通过结合在核糖体启动位点的上游来阻断转基因表达，限制了它在生产细胞系中的表达。 通常，生产或包装细胞的最大挑战是在维持高滴度的同时管理细胞毒性或细胞静止效应。虽然这可以通过可诱导系统来减轻，并且已经用LV实现了，但这些方法目前并不完全实用。Tet-on诱导将需要添加四环素，这必须在稍后去除，而tet-off诱导可能需要延长培养时间以达到表达高峰，并且还需要完全更换培养基，这可能是不经济的。在所有可诱导的情况下，也存在“泄漏”表达的风险，即LV的非控制生产是可能的。 尽管如此，随着进一步的开发，稳定生产者的应用将在LV生产中大有裨益。这些改进可以以高通量自动化克隆分离和评估的形式，以及改进的盒设计、包膜选择和细胞系开发。优化LV生产的可能策略是上调抗凋亡基因，下调细胞内感知，并优化蛋白质和脂质生成途径，以有效生产载体。 3.3.用于生产慢病毒载体的上游培养 为了生产高滴度的LV，需要大量的细胞。有各种解决方案来扩展生产细胞的数量（见表4），追求不同规模的贴壁或悬浮细胞。在开发过程中，需要小批量大小的灵活性，通常由贴壁培养主导，主要是因为HEK-293T天生是贴壁的，提供的高细胞密度和易于接触。这通常由培养瓶、培养皿和瓶子来满足。随着规模扩大，需要更大和更一致的批量大小，生产转移到搅拌罐、摇摆波和固定床生物反应器中，多层培养瓶跨越中间规模。就有效的货物成本生产而言，最近的一项研究表明，一次性搅拌罐在悬浮培养可用时最具成本效益，否则固定床比贴壁培养瓶提供更大的节省。许多上游培养容器也已经过渡到一次性使用。这些不仅有助于减少变更时间，还有助于通过减少设备的清洁和灭菌阶段来帮助验证。 3.3.1.贴壁培养 在开发阶段，贴壁培养是理想的，但在规模上受到限制。这里，要么用多个培养瓶进行扩展，要么垂直扩展到多层培养瓶。这些培养瓶提供了一系列的表面积供细胞附着和生长，1-40层CellSTACKS（Corning，636-25,440平方厘米）和1-40层细胞工厂（Nunc，632-25,280平方厘米）通常被使用。此外，HYPERflasks（1720平方厘米）和HYPERStacks（6000-18,000平方厘米）（两者都是Corning）提供了气体透过的塑料用于O2和CO2的大规模转移，因此不需要像生产载体那样大的头空间。这些系统的扩展或扩展在高表面积时变得越来越笨重和难以处理，需要更大的培养箱空间和运输考虑，通常需要额外的设备来协助。随着扩展，手动处理增加，开放操作的污染风险增加，特别是当批次经常汇集进行下游处理时。此外，转染阶段倍增，增加了变量载体生产的机会，并增加了技术人员的工作复杂性。培养瓶和滚瓶中的贴壁培养不允许培养管理，本质上是批量模式，没有内联能力来监测和控制溶解氧、pH值、废物产品和营养补充。 对于贴壁细胞的另一种培养方法是微载体，已经应用于HEK-293和HEK-293T的逆转录病毒载体和LV。这些微载体可以是多孔的或固体的，允许细胞在内部或表面生长。然而，微载体已经与结块和细胞脱落有关。此外，微载体内部可能会发生微环境，其中外表面细胞限制了营养物质和氧气的大规模转移，同时限制了有毒代谢产物、CO2和病毒颗粒的释放，导致LV滴度低。 为了扩展目的，来自贴壁细胞的LV生产通常转移到固定床生物反应器中。作为基于培养瓶或瓶子培养的替代方案，细胞在由高度多孔微纤维载体组成的3D基质上扩展，提供了经济体积下的大量表面积。这种反应器已经应用于逆转录病毒和腺病毒载体。商业化的固定床生物反应器的例子是Pall的iCELLis或Univercells的Scale-X生物反应器，分别提供0.53-500和2.4-600平方米的表面积。这样的生物反应器允许对生产载体的培养参数进行内联监测和控制。内联监测提供了对生物加工环境的更深入了解，并提高了离线的应用程序在硅模型的未来优化中。 此外，Scale-X流程可以作为Univercells的Nevaline的一部分进行加强，提供切向流过滤（TFF）的内联浓缩和模块化下游处理选项，如澄清和色谱。iCELLis已用于在固定灌注速率或针对特定葡萄糖目标的灌注系统中生产瞬时LV，最终在灌注模式下（总体积5.5升）的4平方米填充床上实现超过10^10 TU的滴度。尽管这项工作表明仍需要优化，因为固定床反应器受到细胞分布不良的影响，可能不会最佳地扩展，也不会在更大的压缩下允许有效的转染，最终每平方厘米的生产力低于贴壁培养瓶。在细胞分布更均匀的Scale-X生物反应器中也产生了类似的滴度。iCellis Nano中LV的LV与在cGMP条件下使用10层细胞工厂生产的LV的并排比较也证明了类似的转导效率。尽管如此，这项研究中的iCellis Nano的单一运行相当于30个三重培养瓶，展示了上游规模选项的影响。 3.3.2 悬浮培养 悬浮培养通常应用于各种重组蛋白的生产，因为它们易于规模化、对培养参数的控制以及工业上的广泛熟悉。对于LV生产，HEK-293T培养可以适应悬浮培养，并用于传统的搅拌罐生物反应器和摇袋。悬浮培养为规模化提供了解决方案，最小化了手工处理，允许灌注培养、自动化、内联监测和控制，以及转染试剂的简化应用。然而，必须使细胞适应悬浮培养才能在这些生物反应器中使用。这可能很难完成，而不损失生产力，滴度在10^6 TU/mL范围内及以下。直到最近才有滴度通过在悬浮介质中逐渐适应达到10^8 TU/mL。通常，细胞密度远低于贴壁培养，因此在这些方法中载体自然会被稀释。此外，还需要额外考虑初始澄清，以去除悬浮的细胞。 搅拌罐生物反应器为LV生产提供了最简单的规模化方法。这些单元可以结合开发规模的生产，如在Ambr生物反应器中用于HEK-293T生长优化，到10L Biostat的更大规模，后者的生物反应器据报道可以扩展到10,000 L。此外，Pall Allegro报告了1.1×10^10 TU/L的滴度。搅拌罐生物反应器的规模化遵循典型的规模化参数，如跟随kLa体积传质系数、功率体积（P/V）比率和叶尖速度。由于哺乳动物细胞通常比细菌细胞需要更少的kLa，因此规模化参数倾向于P/V和叶尖速度，以防止对生产者细胞造成剪切损伤。尽管在规模化方面，瞬时转染生产策略的限制是明显的，其中可能需要更换培养基，这在悬浮细胞中更加困难。 摇动生物反应器为生产者细胞的扩展提供了一种方法，使用一次性充气的可处置袋，在平台上轻轻摇动细胞和培养基以促进混合，规模为10-200 L。该方法提供了高气体传质，同时由于缺乏搅拌器，为细胞提供了低剪切环境。这种生物反应器已被用于在临床规模上从稳定生产细胞系生产载体，尽管这次运行在这个例子中使用了Fibra-Cel盘作为生长基质，尽管悬浮细胞在专利文件中有所记录。 3.3.3 灌注培养 灌注培养的选择可以去除细胞废物，因为它们在发展过程中产生，并维持生产细胞的营养水平。载体在培养容器内的停留时间也减少了，这意味着由于时间敏感的损失，存在的非功能性载体较少，从而提高了产量。这种灌注方法在批量运行中允许高达15倍的改进，每升高达10^11累积TU，在固定床反应器中取得了更好的成功。此外，由于载体对温度敏感，灌注可以将载体带到一个较凉爽的环境中，远离对细胞不稳定的较温暖的培养温度。尽管灌注培养需要根据设定的灌注速率消耗大量的培养基，这可能会增加成本，但一些单克隆抗体（mAb）过程表明与补料批次方法相比，有潜在的成本节省。灌注培养理论上可以集成到任何下游流程中，如色谱，用于连续纯化和加强流程。 3.3.4 细胞培养基和补充剂 培养基的选择直接关系到生产者细胞的扩展和活性，以及下游加工的成功，因为培养基负责载体的稳定性，并形成了要处理的初始载体含料。 有一种趋势是去除LV生产的血清。许多LV生产策略使用血清来协助最佳细胞生长和载体本身的稳定性，这似乎从高蛋白溶液中受益，很可能是由于与白蛋白和脂质相关的稳定。补充白蛋白显示了在DSP加工中载体的稳定。然而，大多数使用的血清都是牛源性的，因此牛相关疾病传播和全球短缺的威胁是令人担忧的。虽然重组人白蛋白可能作为替代品，但这将增加生产成本。此外，高蛋白质负荷给下游流程增加了压力，必须去除大部分血清污染物。这样的压力导致了无血清培养基在细胞培养中的使用，并且现在在LV生产中已经很好地建立，产生的滴度与含血清培养基相当；HyCell TransFX、FreeStyle 293和SFM4TransFx-293只是一些商业上可用的培养基的例子。这种无血清表达载体通常涉及在培养中顺序减少血清，直到细胞适应低或零血清浓度。否则，一个常见的上游策略是在含血清的培养基中扩展细胞，然后在载体收获前换成无血清的替代品。 细胞培养的补充与LV滴度的提高有关。添加丁酸钠与提高重组蛋白生产有关，通过抑制组蛋白去乙酰化酶，导致转录因子功能改善，从而增加来自病毒LTRs的RNA副本并提高LV滴度。额外补充胆固醇和脂质与提高滴度有关，很可能是由于稳定了病毒出芽的细胞表面脂质筏。然而，一项使用仙台F/HN包膜蛋白和不同培养基类型的研究发现，额外的补充并没有显著提高产量，但仍然建议较小的累积效应可能是有益的。由于细胞培养基中咖啡因的存在，在转染后产量有所提高，尽管这样的结果尚未复制。此外，有报道称，在收获前将pH降至6可将滴度增加三倍。在这个实验中，使用了VSV-G包膜蛋白，而在pH 6下其感染力可能降低，因此可能减少了超感染的影响。研究还表明，高细胞培养基渗透压与提高逆转录病毒稳定性有关，因为病毒膜中胆固醇与磷脂比率降低，导致稳定性提高。 4.慢病毒载体的下游处理  慢病毒载体（LV）的下游生物加工关注于最大化载体的回收并最小化可能对产品功效或安全性产生负面影响的成分，同时保持经济可行性。虽然最终产品概况取决于载体是体内还是体外应用，以及最终的转导单位数量取决于验证的治疗剂量，但总的来说，生物加工操作必须减少杂质的数量，同时保持病毒效力以确保最终用户的安全。这些杂质可能包括残留DNA（来自宿主细胞和质粒）、宿主细胞蛋白、血清、蛋白多糖以及与过程相关的杂质，如核酸酶和可浸出物。 LVs的完整下游处理由许多单独的单元操作组成，旨在实现载体材料的纯化、浓缩和稳定性。简而言之，一个典型的过程包括连续的纯化步骤，包括去除细胞及其碎片，然后是载体的富集以及去除宿主细胞或血清蛋白、核酸和脂质。载体产品可能在交换到适合稳定性的配方缓冲液之前进一步浓缩，然后最终在储存或应用之前进行无菌过滤（请见第6节对整个生物加工评估）。 4.1. 载体过滤：初始澄清 澄清和无菌过滤过程旨在去除细胞和细胞碎片等大颗粒杂质。澄清通常在过程的早期进行，因此在处理高负载的细胞和细胞碎片以及稀释的LV浓度时，而无菌过滤发生在生物加工的后期阶段，处理较低浓度的细胞或细胞碎片和较高浓度的LV颗粒。用于澄清的初始下游阶段通常是微滤和/或离心。细胞和大部分颗粒可以通过低速离心沉淀并去除。或者，可以使用声波过滤器在收获期间使用声波捕获悬浮细胞并返回到生物反应器。两者都随后通过膜或深度过滤器进行微滤。初始的离心作用是作为预过滤步骤，以防止过滤器过早堵塞。在大规模生产运行中，需要考虑离心机的容量，因为容量考虑。连续离心机的应用，如在单克隆抗体和重组蛋白加工中普遍的盘式堆叠离心机，在LV生产中尚未看到，因为低容量处理（升到几百升）和这些过程的典型批次模式需要与离心机的高资本成本与过滤选项相平衡。 过滤技术在初始澄清中占主导地位，一次性系统提供了简化的清洁和验证。使用级联过滤器，即用逐渐精细的过滤器过滤料液，可以防止最终过滤器过早堵塞，这可能导致由于载体排除和通量减少而导致滴度损失和处理时间延长。过滤器的选择影响澄清步骤的效率。对于膜过滤器，料液通过具有特定孔径的平坦或褶皱的惰性聚合物片，根据膜的绝对保留等级进行穿孔。深度过滤器是一类具有海绵状质地的过滤器，其中颗粒在通常由聚合物、粘合剂和过滤助剂（如硅藻土）组成的整个过滤器床上被保留。对于一些深度过滤器，介质带有电荷，用于电静力保留宿主细胞蛋白和DNA，硅藻土显示出改善的料液容量，尽管在高浓度下它可以降低LV滴度。在一些小规模研究中，使用包括基于纤维素和合成介质（如聚丙烯酸纤维与硅过滤器助剂）的多个深度过滤器介质，已经显示出90%的浑浊度降低，同时保持高恢复非包膜载体，如基于猴腺病毒的载体。在LV应用中，没有过滤器助剂如硅藻土的深度过滤器恢复了>95%的滴度，同时在50 L规模上减少了>85%的HCP。通常，大多数保留等级在微滤范围内从10到0.2 µm以级联方式应用，要么只应用膜，要么应用深度过滤器和膜的序列进行更细的过滤。在直径80-120 nm的LV可以通过小保留等级的过滤器，尽管典型的终点0.22 µm确实看到滴度损失。表5中列出了一些用于澄清的可用过滤器的例子。 载体的性能取决于过滤器的保留等级、料液的质量和该规模预期的负载挑战。在高度污染的过滤器中，高跨膜压力可能导致杂质潜在地转移到滤液中，可能是由于过滤器表面细胞或片段的破裂。澄清受到上游生产的影响，悬浮培养需要去除整个细胞，而贴壁培养可能由细胞片段组成。此外，用于LV生产的瞬时转染产生与稳定生产细胞系不同的宿主细胞蛋白谱，并且可以根据使用的包膜蛋白而不同。在所有情况下，由于吸附到过滤器或被过滤器排除的组分，以及过滤系统保持体积中的损失，预计会有一定程度的LV损失。对于许多澄清过程，冲洗过滤器与缓冲液后处理是理想的，以摆脱任何吸附的载体，以改善恢复并清除死体积。 虽然通常应用于浓缩和透析（见第4.6节），切向流膜微滤也可以应用于澄清。由于切向料液流动，膜表面积累的任何蛋糕层都被去除，维持通量，与传统的死端过滤模式相反。最近，一种新的过滤器介质，Repligen的2-5 µm深度过滤器在切向流过滤中使用，以在收获时分离悬浮细胞和LV，报告的LV产量为90%。这种方法可以将悬浮细胞与LV收获物分离，允许回收生产细胞以进行持续培养和顺序收获的机会。 4.2 载体过滤：无菌过滤 无菌过滤通常是下游过程的最后一步，在这一步骤中，经过纯化、浓缩和配方的病毒载体通过一个精细的过滤器，以去除任何偶然的微生物，如细菌或真菌，同时保持LV滴度。在使用0.22 µm注射器膜过滤器进行无菌过滤期间，报告了30-50%的滴度损失。这部分是由于配方不足或纯化不良导致过度聚集和载体损失。由于载体回收率低和偶然微生物存在的风险，无菌过滤可以早期在封闭系统中进行，或者完全可以取消，尽管这将受到监管机构的密切审查。 4.3 非色谱纯化 LV的纯化寻求利用载体和其他介质组分之间的差异，即大小、密度、电荷或对固定相的特异性。这可以通过多种方法实现，常见的单元操作是超速离心和色谱（见第4.5节）。超速离心是一种纯化和浓缩载体的单元操作，通常在载体生产的研究和开发阶段应用。这种技术也广泛用于通过在大g力下沉淀病毒颗粒来纯化逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。由于载体的体积比溶液中的游离蛋白大，载体最初被沉淀，蛋白质留在上清液中。或者，使用梯度（通常使用蔗糖、菲可尔或碘克沙醇分层逐渐更密集的层），载体可能出现在特定的带或沉淀物中，而介质污染物在前面的层中，尽管与载体密度相似的囊泡或杂质可能会与载体共同沉淀，除了抑制蛋白多糖。然而，通过蔗糖梯度生产的载体在小鼠中显示出较少的免疫原性效应，可能是由于血清污染较少。载体颗粒可以重新悬浮，并重新旋转以获得更大的纯化，多达四轮提供相对清洁的材料。此外，一些包膜蛋白可能在操作期间受到剪切力的负面影响，VSV-G特别耐剪切。此外，颗粒本身可能受到梯度渗透压的损害。此外，任何梯度成分可能需要在顺序过程中去除。高速离心机（10,000×g）也可以用于纯化，尽管这可能需要延长旋转时间，有报道称使用蔗糖旋转时间长达4小时。然而，用于载体纯化的离心可能耗时、规模受限（与超速离心机的容量相关，除非追求规模扩展）和劳动密集型。因此，它的应用通常限于研究、开发或早期临床试验阶段。 LV可以通过向含有载体的介质中添加辅料来沉淀，这可以用于浓缩目的。已经使用了聚乙二醇（PEG）、聚-L-赖氨酸、软骨素C硫酸盐和鱼精蛋白硫酸盐的混合物和磷酸钙等沉淀剂。在大多数情况下，载体与材料一起孵化，然后通过离心沉淀，重新悬浮和解聚沉淀物，然后进行进一步的处理，如TFF或透析。作用模式是由于溶剂可用性降低导致溶解度降低，从而引起载体沉淀或由于电荷导致聚集。然而，使用沉淀剂可能需要额外的处理来去除它们，以及延长时间来完全沉淀载体颗粒，并与多达16小时的孵化常见的沉淀物一起沉淀。此外，重新悬浮和解聚沉淀物可能是有问题的，当使用磷酸钙时需要EDTA处理。尽管如此，在这个单元操作中报告了50%到100%的功能恢复。 4.4 核酸减少 核酸杂质来自转染的质粒DNA或生产细胞系的宿主细胞DNA。在处理过程中需要减少核酸，以提高纯度并防止对受体细胞或患者的任何有害影响，残留DNA的限制被设定为长度<200 bp，每剂<10 ng。这可以通过在过程中的某个时候添加核酸酶，如苯酰核酸酶来完成。通常，核酸酶直接添加到生物反应器中的LV培养物中，在收获前或收获后不久，或在澄清后。然而，由于这些阶段的体积较大，需要更多的酶单位才能有效，这会产生成本。另一种选择是生产者或辅助细胞分泌核酸酶，如Oxford Biomedica开发的SecNuc，其中与载体组分共转染编码核酸酶的质粒，或生产细胞与表达核酸酶的细胞共培养。否则，核酸酶可以在浓缩步骤后添加，以降低酶的需求。无论何时添加酶，它们必须在下游进一步去除，并且必须考虑高核酸负担的影响，如在色谱中的共洗脱和/或降低的结合能力，以及核酸复合物的形成。此外，必须考虑载体所在的缓冲液的组成，以实现最佳消化，因为一些核酸酶需要镁离子、升高的温度和特定的pH范围才能有效，以及所需的孵化时间，这可能会导致载体灭活。核酸也可以通过仔细选择离子交换或混合模式流穿色谱（见第4.5节），或使用稳定生产细胞（第3.2节）和全介质替代在上游（第3.3节）的TFF来减少。 4.5 色谱纯化 色谱是一种单元操作，通过其与固定相和流动相的相互作用来分离混合物的组分。它是一种可扩展的解决方案，用于纯化和浓缩颗粒，并且与离心相比相对较快，并且易于自动化，以实现一致和可靠的结果。它在纯化许多生物来源的材料方面有广泛的应用，如单克隆抗体、重组蛋白、工业酶和核酸。通常，用于解决饲料的相互作用是尺寸排除色谱（SEC）中的组分大小，离子交换（IEX）中的电荷，以及疏水性和对固定相或流动相的亲和力。这可以以捕获和洗脱模式运行，或以流穿模式进行抛光和改进。对于LV的纯化，可以应用多种类型的色谱，观察到不同的恢复率（见表6）。 色谱的固定相开发主要集中在小分子的纯化上。这导致了多孔珠基固定相的广泛应用，以最大化表面积，实现高动态结合能力。由于组分的尺寸较小，质量传递以扩散为主。这对于病毒颗粒来说是有问题的；由于它们的尺寸，珠孔太小，因此它们的内部表面积无法接触，从而降低了结合能力和载体捕获的性能。此外，由于基于扩散的质量传递，固定相的流速往往较慢，降低了产量，这可能导致由于过程时间增加而导致滴度损失更大。鉴于这些限制，已经开发了依赖于对较大颗粒的对流质量传递的新固定相（见图1）。这样的相允许更大的流速和产量，同时保持可用的表面积以结合能力。最简单的是大孔固定相，如单体，其中许多通道形成一个海绵状结构供料液流过。单体的特点是它们的大表面积与体积比，并且已经成功地纯化了多种类型的病毒，包括具有不同包膜的LV。或者，膜固定相也提供对流质量传递。这些遵循典型的平坦或编织片，可能堆叠在一起以增加容量，具有供料液流过的孔，并允许捕获载体。最近开发的是纳米纤维旋转固定相，它提供阴离子交换色谱（AEX），并实现了约90%的LV恢复，由Puridify开发，现在由Cytiva（前身为GE Healthcare Life Sciences）拥有。这些相由薄的电纺线定义，移动相可以流过，保留在纤维本身上。这种纳米纤维在LV和腺病毒的结合和洗脱中已经显示出实用性，尽管商业容量目前集中在mAb市场上。一些混合模式色谱应用也已经开发出来。虽然AEX已被证明是纯化载体的有用工具，但最终洗脱中仍存在一些杂质，特别是DNA和蛋白多糖。因此，已经开发了一些混合模式固定相，如CaptoCore。这些结合了尺寸排除和AEX色谱，在负模式容量下纯化载体。在这种方法中，载体被排除在带有AEX配体的内部核心之外。因此，载体流过柱子，而带负电的DNA或其他较小的蛋白质被捕获和去除。这可以作为载体和病毒的抛光步骤或污染物减少步骤。 图1. 用于慢病毒载体纯化的色谱树脂的说明性示例，从左到右展示了对流质量传递的增加。 4.5.1 阴离子交换色谱 LV在中性pH下表面具有净负电荷，由于外部包膜的组成和它们的整体等电点，因此使用季铵盐（QA）或二乙氨基乙基（DEAE）配体的AEX色谱是捕获和洗脱它们的可行选择。对于逆转录或慢病毒载体，洗脱往往是分步进行的，首先通过顺序增加盐浓度洗脱松散结合的组分以提高纯度，然后最终高盐缓冲液洗脱载体。McNally使用0.3 M NaCl的初始洗脱，然后上升到1.3 M进行载体洗脱，整个过程中保持pH为8的Mustang Q AEX。对于像DEAE这样的弱配体，这个配置文件可以类似于pH 8和NaCl浓度为0.1和0.65 M。分步洗脱对载体特别有效，因为它们的大小大和表面成分可变，允许在固定相上的多个位点进行相互作用，并且因此与单个料液组分相比保留得更多。然而，这确实需要更大的盐浓度或pH变化来洗脱，这需要立即稀释以保持稳定性，由于渗透效应或包膜降解。因此，色谱的浓缩方面被减弱，必须考虑增加的缓冲液消耗用于稀释。此外，LV的瞬时生产可能导致载体的异质种群，导致不同的洗脱种群，这可能归因于外部包膜的不同组成。无包膜蛋白载体显示比包膜阳性载体更低的等电点，具有不同的zeta电位，这可能会影响色谱纯化的效率，可能是由于与色谱固定相配体的多种相互作用。此外，已经证明，用NaCl预处理载体装载材料可以令人满意地抑制大量蛋白质与AEX材料结合，提高纯度。 4.5.2 亲和色谱 亲和色谱通过其对固定相配体的特异性来解决混合物的组分。这是一种可行的技术，可以允许在不使用高盐浓度洗脱的情况下实现载体的高纯度和浓缩，例如在离子交换中，从而在下游处理过程中保持载体滴度。由于捕获基于亲和力，理想情况下只有载体被保留和洗脱，残留的DNA和蛋白质在柱内保持未结合状态。以前，LV包膜上表达过组氨酸标签以帮助其纯化，但产量很低，为46.7%，大多数可能仍然附着在柱子上。同样，可以在载体表面表达生物素，允许其通过固定化的链霉亲和素捕获，并在添加生物素后洗脱，允许载体浓度提高4500倍以上。这已经通过在CD8α茎上添加生物素模拟物进一步开发，尽管在小规模上产量高（60%），但在扩大规模时下降到20%。此外，已经应用了一种类似的方法，将低亲和力神经生长因子受体（LNGFR）被动地结合到载体表面，因此可以通过固定在磁珠上的抗LNGFR抗体捕获，回收率超过85%，尽管没有从抗体珠上释放，并且只有通过将细胞与载体结合珠混合才能实现转导恢复。在载体包膜的外表面应用亲和标签也可能会引起一些监管方面的担忧，如果来自非哺乳动物来源，尽管这可能对于体外疗法来说可以最小化，因为在载体阶段的要求不那么严格。此外，观察到逆转录病毒载体与可溶性肝素混合时受到抑制，从而导致肝素亲和色谱在LV纯化中的应用，肝素和相关的肝素硫酸盐捕获LV，产量高达53-61%的载体。 4.5.3 尺寸排除色谱 尺寸排除色谱（SEC）是一种基于尺寸通过填充多孔珠的流动材料来解决饲料组分的方法。由于它们与较小颗粒相比的较大尺寸，LV可以被高度纯化，感染性恢复超过70%，纯度超过90%，尽管高分子量污染物和DNA可能仍然存在。此外，SEC的应用是将载体缓冲液交换到配方缓冲液中，或者在离子交换后去除盐分。然而，由于线性流速降低，该步骤的整体产量较低。此外，SEC在进料体积较低时最有效，大约是床层柱的15%，以保持有效的分离，因此需要事先浓缩。由于感兴趣的产品在洗脱过程中被稀释，可能需要额外的浓缩轮次。最终，SEC可以作为抛光步骤，在先前阶段大部分污染物被去除后使用。 4.5.4 立体排阻色谱 与聚乙二醇的结合导致了立体排阻色谱的使用。该方法基于粒径大小选择性，可以作为病毒的一种快速替代SEC的方法。这种方法遵循与PEG沉淀类似的机制，不同之处在于存在一个亲水的固定相，供大颗粒凝聚。在洗涤柱子时，洗脱缓冲液中PEG浓度的降低会基于尺寸选择释放结合的载体。虽然该方法已应用于流感病毒，但LV的恢复率报告为60%。 4.6 切向流过滤的浓缩和缓冲液交换 切向流过滤（TFF）是一种单元操作，通常以超滤/透析（UF/DF）模式运行，允许在LV处理过程中体积减少和缓冲液交换，同时去除低分子量杂质，同时保留载体颗粒。它以不同的格式（表7）使用不同的参数（表8）。在这里，切向超滤允许体积减少以将载体浓缩至适当的滴度，并简化下游处理，减少体积进料。缓冲液交换（透析）通常跟在浓缩步骤之后，以优化更换缓冲液的消耗效率。载体可以交换到的缓冲液的选择对于维持载体的稳定性至关重要，无论是在冷冻-解冻过程中（见第4.7节），还是在交换到最佳的色谱结合缓冲液中，或者有效地转导受体细胞。除了TFF之外，这可以通过多轮离心和在所选缓冲液中重新悬浮或SEC方法来实现。然而，TFF提供了更大的自主性和减少的手工处理，同时保持高载体浓度。一些TFF系统使用中空纤维单元，而其他系统使用卡带，由不同的膜组成，如基于纤维素的（例如，混合纤维素酯）和聚醚砜（PES）。两种格式都是可扩展的，适用于载体浓缩和缓冲液交换的解决方案。两者都提供高表面积与体积比，尽管平板卡带可以比中空纤维提供更高的通量，尽管由于它们的迂回流路和湍流促进的屏幕，对载体颗粒的剪切率更高。使用TFF的膜允许盐、缓冲液和小分子物种根据它们的保留等级（通常以kDa表示）跨膜传递。TFF中澄清的效率与料液和每个单独组分的保留系数有关。一些研究小组已经将TFF作为色谱的替代品，作为澄清和纯化步骤，达到高达97%的恢复率，或者与超速离心结合使用，允许高达1800倍的浓缩。因此，TFF可以应用于多个实例，例如在色谱之后去除洗脱缓冲液中过量的盐，将缓冲液交换到配方缓冲液中，到色谱捕获的优化结合缓冲液中，或者在SEC之前的浓缩。此外，如果载体的生产要强化，可以使用串联过滤，使用中空纤维膜在连续减小表面积的中空纤维中浓缩产品，或者应用单次通过切向流过滤，其中没有循环回路，料液沿着长的迂回膜路径流动。尽管，截至撰写本文时，尚未发表LV的应用，单次通过TFF已在mAbs和重组蛋白生产中得到采用。随着过程的成熟，这些单元操作的实施是可能的，特别是与基于灌注的生物反应器和稳定生产细胞系相结合，允许最佳的连续生产。尽管如此，TFF的参数需要根据料液进行优化，因为流速和膜类型可能导致剪切损伤和载体损失。此外，跨膜压力、料液流速和料液组成对通量的影响由于污染可能导致处理时间延长，并需要更大的膜，这涉及到更大的保持体积。载体也可能吸附或被困在膜的表面，特别是如果孔径与载体大小相近，尽管更大的孔径提供更好的杂质去除和通量性能。因此，通常使用100-750 kDa范围内的膜，其中更大的孔径有利于通量，以牺牲载体吸附为代价，而较低的截止速度减慢通量以保持载体。运行后冲洗可以帮助释放吸附的载体，优化取决于该阶段的料液。此外，向料液中添加添加剂，如蔗糖或类似的粘度增强剂，可能保护载体免受剪切。 4.7 配方 LV的缓冲液配方对于在整个处理过程中以及最终应用中维持载体的转导能力是必要的。最终的配方将根据其应用而变化。例如，体内疗法可能需要更严格的配方，如使用注射用水以确保安全，与体外应用或在处理过程中临时冷冻的载体相比。对于许多体外疗法，通常将载体配方到细胞培养的细胞培养基中；这简化了过程，不需要考虑LV配方对细胞生长的影响。然而，这并不意味着LV的最佳配方，因为培养基组分可能无法充分稳定载体，或者可能允许载体聚集或吸附到容器上。这在冷冻过程中特别成问题，如果载体需要长途运输或存放一段时间，尽管细胞培养基中的蛋白质和糖的存在在这里可能有益。通常，缓冲液辅料作为载体配方的防腐剂。这些可以包括重组蛋白，如人血清白蛋白，因为一些蛋白质已被证明可以稳定载体，以及如蔗糖或海藻糖等糖，它们可以作为冷冻保护剂和渗透压调节剂。应该使用缓冲液种类来在各种温度下维持稳定的pH值（理想情况下是生理的），因此基于它们有效的缓冲范围和对温度的pH漂移抵抗力，已经使用了像HEPES和组氨酸这样的种类，与常见的缓冲液如TRIS不同，TRIS会看到pH漂移。尽管如此，已经在TRIS或磷酸盐缓冲液（PBS）中使用蔗糖或海藻糖进行冻干的LV长期储存中取得了成功。后者证明了载体在37°C下冻干至少四周的稳定性。一些NaCl可能有助于稳定性，添加氯化镁也可以防止聚集。另一个考虑因素是缓冲液对处理单元操作的影响，例如，常见缓冲系统中的负磷酸根离子与AEX色谱树脂中的带正电荷的配体发生相互作用。Kumru等人研究了多种辅料对LV物理稳定性的影响，通过观察粒径、形态和zeta电位，他们指出，当在37°C的玻璃中过夜孵化时，氨基酸脯氨酸和赖氨酸以及糖的甘露糖和乳糖可以最小化载体损失。导致吸附损失到玻璃上的辅料是盐（例如，氯化钙）、还原剂、螯合剂和阳离子肽。这些在冷冻-解冻周期中也被发现对LV有负面影响，而糖、多元醇和环糊精以及某些氨基酸如亮氨酸则有所帮助。然而，在这个实验中，只检查了物理稳定性，没有检查转导能力。 5.载体特性和质量控制  对于人体试验的应用，LV批次在放行前应进行广泛的表征和QC测试。为了保持安全性，产品必须保持在预先确定的规格范围内，这些规格由适当验证的、精确且可重复的检测协议支持。一个典型的LV批次将需要纯度、身份、安全性和效力的规格，并且这些必须在批次之间保持合理的一致性，如监管机构所要求的，随着潜在治疗从动物研究到商业发布的过程，严格性不断发展。所需的检测可以是大多数重组过程所典型的和预期的，但也可以扩展到载体和转基因特定的检测。例如，残留DNA可以通过Picogreen或定量聚合酶链反应（qPCR）进行检测，而宿主细胞蛋白可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、SDS-PAGE或任何形式的总蛋白定量，如Bradford、Lowry或双缩脲酸比色法，以及标准的支原体和内毒素检测进行分析。过程中的添加剂，如核酸酶，可以通过ELISA进行滴定，也可以通过qPCR检测HEK-293T细胞中的SV40 T抗原（抗原的qPCR可以作为宿主细胞DNA杂质的信号）。由于载体颗粒本身的性质，包含核酸、脂质和蛋白质，以及区分功能性滴度和总颗粒数，载体特定的检测更为复杂。验证定量方法是LV开发过程和商业供应QA/QC的关键。由于各种工业或学术团体中可用的转基因、包膜蛋白和受体细胞的多样性，以及不同团体之间的滴度差异很大，这取决于操作者，因此达成方法学的共识是有问题的。尽管如此，在表征生产运行的有效性时，载体定量是必不可少的，并且作为监管批准的关键质量属性的要求。LV的定量可以广泛地分为定量载体的各个部分，这些部分在一定程度上有交叉，这些分组可以列为功能性、载体RNA定量、载体蛋白、载体酶活性和物理计数颗粒。对于功能性，选择的定量方法是转导已知数量的细胞并检查转基因表达。这种方法通常需要在各种稀释度下对感兴趣的载体进行滴定，并将载体溶液与已知数量的细胞混合。可以添加聚布雷恩以增强转导，通过最小化包膜蛋白和受体之间的静电排斥。在允许细胞扩张并稀释出任何短暂的转基因表达一段时间后，通常通过染色抗体或亲和染料检查细胞表达，除非使用标记基因（通常是GFP），并用流式细胞术进行分析。通过知道转导细胞的百分比、添加的载体溶液体积和细胞数量，可以确定转导单位。然而，这并不考虑可能在高感染度下出现的多重整合，因此必须进行滴定。此外，由于短暂转基因表达导致滴度过高的风险是显而易见的，因此建议在转导和细胞读取之间有适当的时间长度，以稀释出非整合的转基因，更好地反映长期细胞培养治疗。此外，总体积、细胞密度、细胞受体的可用性和搅动可能会影响结果，因此不同团体之间的滴度很难直接比较。理想情况下，转导的细胞应该是与目标受体细胞相同的类型，尽管通常使用HEK-293T。此外，在FACS分析期间的门控策略、染色的转基因数量和染色的质量需要考虑。此外，转导抑制物的存在，如非功能性载体、游离漂浮的包膜蛋白和蛋白多糖，可能会导致滴度被低报，以及载体从未接触到细胞或可用受体的机会。 可以通过整合测定非染色方案的功能滴度，其中提取转导细胞基因组DNA（gDNA），并通过qPCR定量前病毒，并与管家基因进行比较。这个测定可以是感兴趣的转基因特有的，尽管如果载体转基因和标准之间的序列共享，世界卫生组织（WHO）已经制定了一个标准，用于跨团体比较。qPCR可以定量多个整合，尽管这不是转基因功能性的指标。此外，质量取决于gDNA的分离和缺乏来自质粒、宿主细胞和短暂形式的DNA污染，因此需要扩增时间或/和核酸酶以最小化假阳性。考虑到测定仍基于转导效率，实际应用是在转导的细胞中，转基因难以染色或用于转导细胞gDNA的遗留采样。 核酸定量涉及载体RNA的定量。这种方法需要破坏载体，分离载体RNA，其逆转录为互补DNA，然后进行定量。值得注意的是，这种方法不定量载体功能，因此其应用在一定程度上是有限的。存在质粒DNA夸大结果的风险，这需要通过非逆转录对照或DNase处理进行校正。此外，非功能性但包装的载体可能会导致过度报告。它依赖于RNA提取的效率及其稳定性，尽管这可以通过添加RNA标准来控制。然而，其有效性对于过程开发目的可能是有问题的，因为样品中qPCR或逆转录酶的不同抑制剂可能会影响结果，例如色谱洗脱中的高盐。qPCR可以进一步扩展为数字滴液qPCR（ddqPCR），其中通过水-油乳液滴在高稀释下分离单个qPCR反应。通过计算阳性滴液的数量，可以按照泊松分布计算模板浓度，而无需标准曲线。这种技术已经与LV一起使用，即使模板非常稀少也可以提供结果，并可用于计算受体细胞中的载体副本数。 p24 ELISA测定是一种定量样品中p24 HIV衣壳蛋白质量的方法，可以作为常规商业试剂盒购买。基于抗体的测定可以在一天内提供蛋白质的定量，而功能性感染性需要2-3天。在测定中，载体通过洗涤剂破坏，然后在板上孵化，蛋白质通过电荷结合到塑料上或p24被预先固定的抗体捕获。另外孵化一次抗体并洗去，然后添加酶联二抗体。洗去后，结合的酶允许通过吸光度或荧光测量底物的变化，这直接对应于p24的数量。这种方法已被广泛采用，结果通常报告为p24质量与转导单位（P:I比率）的比率。这将颗粒质量与功能联系起来，因此作为载体质量的衡量，甚至允许团体通过估计每pg p24的1x10^4个LV颗粒来假设LV数量。然而，p24试剂盒依赖于它们抗体的特异性，在某些情况下会过度报告，因为包括未处理的p24形式，如GAG、载体片段和灭活或未成熟的病毒。 测量载体酶活性可以提供病毒蛋白的替代定量测定。在基于qPCR的产品增强逆转录测定（PERT）中，载体进行滴定并用洗涤剂裂解，然后与标准RNA模板混合。设置热循环器，进行逆转录的初始孵化时间，然后温度升高导致酶失活。然后运行qPCR以定量RNA模板转换为DNA的数量，与已知的HIV-1重组逆转录酶对照进行比较。由于它依赖于逆转录酶的活性，测定将对逆转录酶的抑制剂敏感，可能需要通过通常在qPCR主混合物中提供的惰性蛋白进行稳定。这可能在处理样品中看起来有问题，这些样品可能具有不同范围的稳定剂或抑制剂。然而，该方法是快速的，提供结果在2小时内，因此可以提供高吞吐量定量，一天内多个样品。与p24测定相比，该测定也可以更具成本效益，因为缺乏特定的抗体和使用常见的qPCR混合物。 另一种技术是物理颗粒计数。动态光散射（DLS）是一种方法，通过量化光束被颗粒中断时散射的光量，并使用样品的已知粘度，通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算颗粒的水动力直径。结果可以在30分钟内获得，并估计平均粒径、多分散性和粒径分布的计算。尽管这也只确定物理颗粒数量而不是功能性，但DLS数据的质量随着多分散性的增加而逐渐不可靠，增加的颗粒数量导致散射错误，这会影响感兴趣的颗粒。这对于可能具有相当高多分散性的工艺混合物来说是有问题的，此外还有必须为DLS准确性表征的不同粘度。除非提供干净的样品，否则该方法主要用于混合物中的平均粒径和确定样品是否聚集。 尽管DLS技术已经通过多角度动态光散射得到改进，这增加了光散射的检测角度数量，并在高多分散性下提供了更稳健的结果，但颗粒浓度的准确性可能在名义值的50%以内变化。 基于与DLS相似原理的替代方法可以在纳米颗粒跟踪分析方法中找到。在这里，通过显微镜录制视频片段，并通过跟踪算法量化小颗粒的布朗运动。尽管无法区分LV与其他类似大小的颗粒，但一些新型号允许染色和跟踪特定荧光的颗粒，因此允许量化特定物种。同样，可调电阻脉冲传感检测通过小孔的颗粒大小和数量，并已与LV一起使用。 其他基于物理颗粒的定量可以通过在电子显微镜中计数颗粒来完成，使用负染色，现代系统，例如Vironova的台式MiniTem，提供自动化的电子显微镜和分析。此外，标记的LV的荧光可以与共焦显微镜中的荧光珠进行比较。这两种方法完成都非常耗时，并且不适用于大量样品。最近增加的一种方法，利用高性能液相色谱（HPLC）与AEX树脂，可以洗脱载体带，基于它们的荧光，估计每毫升范围内10^8到10^10个载体颗粒的数量。 这种方法已用于区分DNA和载体，并且与ELISA和ddPCR相当，允许在6.5分钟内应用来自过程不同方面的各种样品。尽管这种方法只量化载体颗粒，并不显示功能单位，但这种快速和高通量分析考虑对于过程开发具有很大的价值。 6.LV生产的整个生物过程评估  图2展示了生产慢病毒载体的不同过程选项。有些过程选项仅适用于小规模或需要少量剂量的应用程序（超速离心、SEC和篮式离心），而大多数是可扩展的（例如，过滤选项、色谱等）。操作的最终顺序取决于LV产品的规模、用于LV生成的技术、LV滴度以及所需的产品和杂质概况。在这方面，需要应用某些操作的实际点（例如，浓缩、透析、DNA消化等）将取决于这些因素。例如，应用苯酰核酸酶或类似产品进行DNA消化可能在LV生成步骤的任何地方进行，作为澄清步骤的一部分，或在色谱之前或之后。 图2. 慢病毒载体生产的生物过程选项。(1) 一些研究表明，在之前使用不同孔径大小的膜过滤或包含低速离心的序列。过滤过程的序列将根据规模、细胞密度以及产品和杂质概况来决定是否采用。(2) 这些是在临床前和临床研究中使用的操作策略的例子。(3) Benzonase 可以在下游过程中的多个步骤中添加。 在他们的综述论文中，McCarron等人提供了扩大慢病毒载体生产的挑战概述。这些在表9中简要总结。在LV生产中，生物过程理解在解决低恢复率和载体功能性丧失方面最相关。这始于对最终产品应用的理解，这定义了操作的最终规模，以及产品和过程规格。此外，确定影响过程选项性能的相关参数将对这些选项及其操作的最佳选择很重要。筛选研究可以提供关键的生物过程信息，例如TFF操作中的跨膜压力水平或横流速率，AEX色谱中的柱流速率，或TFF操作中正确的分子量截止（MWCO）或膜材料。确定在未配方LV产品的过程开发中使用冷冻-解冻材料的影响也很重要（例如），而不是使用新鲜材料，因为这一步可能对过程性能有巨大的影响，而不是作为生物过程操作本身的结果。 定义LV生产生物过程序列中的步骤需要进行整体生物过程分析，因为不同操作之间存在相互作用。例如，浓缩和缓冲液交换（TFF）后跟阴离子交换（AEX）色谱产生了一种LV产品，当用于转导时，与仅使用TFF步骤相比，尽管总体产量较低，但对细胞没有毒性。另一个例子是，TFF操作，无论是单独使用还是与超速离心结合使用，都产生了一个功能滴度更高的LV产品，当这个步骤被移除时，这种产品是看不到的。最后，DNA消化在过程序列中的位置或TFF步骤的位置可以用来改善随后的AEX色谱。 对病毒载体细胞和基因疗法的日益关注推动了生物加工的界限。对于更大规模的LV生产，需要研究过程剪切的作用，因为大规模生产意味着使用更大的泵或以更高的流速运行泵，因此，可能产生更高的剪切率。此外，更高的生产力要求也意味着增加通量要求以缩短TFF操作时间。这对LV生产有几种影响：较短的时间可能对LV稳定性有利，而增加的通量可能意味着需要以更高的横流速率或更高的跨膜压力运行；这两者都可能导致暴露于高过程剪切。病毒载体通常被认为是脆弱的，因此对剪切敏感。例如，Valkama等人提到，增加的循环流速，绕过柱子，导致感染性LV损失20%。然而，我们实验室的早期分析发现，一些伪型LV即使在暴露于非常高的过程剪切后也能有很高的恢复率，使用超规模缩小（USD）（未发表数据）。这表明过程剪切可能对不同的慢病毒载体有不同的影响，生物过程操作的设计（例如，TFF）应该考虑到这些，以提高生产力并满足大规模制造的要求。我们之前展示了使用超规模缩小设备预测大规模TFF操作生产单克隆抗体。这种大规模设备与用于LV TFF加工的设备类型相似。超规模缩小方法也已用于评估其他单元操作。USD由于进行分析所需的材料量少，因此能够进行整体生物过程评估。最后，作为LV生产的整体生物过程分析的一部分，结合过程经济分析将是有益的，因为它可以证明生物过程选择的经济可行性。 7.结论  我们回顾了慢病毒载体生物加工的基本单元操作、整体生物过程选择和当前发展的其他方面。由于细胞和基因治疗的治疗益处被认识到并转化为临床应用，对LV的需求在可预见的未来将保持高涨，新应用正在被探索（例如，作为病毒疫苗载体）。尽管目前全球LV的制造能力很低，LV生物加工需要优化，但显然正在努力提高产量和恢复率。这些发展将导致更广泛地实施基因转移剂以改善治疗结果。对慢病毒载体的生物过程要求的基本理解是确保LV产品从临床开发转化为患者使用的关键。TFF和AEX色谱是可扩展LV生物加工的首选单元操作的领跑者，微滤也是如此。根据我们对这些操作的了解，溶液环境（即，缓冲液、添加剂、辅料等）以及固相材料（例如，膜、树脂或纤维）将在不同伪型LV的处理过程中有重要贡献。确定关键操作参数和过程条件将是过程开发中必不可少的活动，以及整体生物过程评估。这应该能够获得高LV浓度和产量，同时在LV产品中最小化杂质。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。