Sulforadex

——需要原文，请点击上方关注——摘要 背景：酒精相关肝病（ALD）发病率持续上升且缺乏有效治疗手段，已成为重大公共卫生问题。片仔癀（PTH）是临床常用于病毒性肝炎、肝纤维化的中药复方，但其对 ALD 是否确有治疗作用尚不明确。 目的：验证片仔癀对 ALD 的作用，鉴定其活性成分，并探索作用机制。 方法：采用高效液相色谱‑四极杆飞行时间质谱（HPLC‑Q‑TOF‑MS）与气相色谱‑质谱（GC‑MS）进行化学成分分析、质量控制与活性成分辨识；以 50% 乙醇灌胃构建 ALD 小鼠模型，以乙醇或叔丁基过氧化氢诱导 HepG2 细胞氧化应激与铁死亡；通过生化指标检测、病理组织学分析评价药效；结合转录组、聚合酶链反应、蛋白免疫印迹、小干扰 RNA / 质粒转染等技术探索并验证作用机制。 结果：片仔癀可显著改善小鼠 ALD，对酒精代谢影响微弱，但能强效抑制氧化应激与铁死亡。机制上，片仔癀恢复 Keap1‑Nrf2 信号通路、抑制三价铁内流；牛黄、麝香为其活性原料，牛磺酸与牛蒡酸（片仔癀中含量分别为 1.3、2.3 mg/g）为活性成分，二者通过结合 SIRT1 不同氨基酸残基，经 SIRT1/Keap1/Nrf2 轴与 SIRT1 / 转铁蛋白受体通路抑制氧化应激与铁死亡。 结论：片仔癀中的牛磺酸与牛蒡酸，通过 SIRT1/Keap1/Nrf2 轴介导的氧化应激抑制、SIRT1 / 转铁蛋白受体介导的铁死亡抑制，实现对 ALD 的改善作用。关键词 酒精性肝病；片仔癀；氧化应激；铁死亡；牛蒡酸；牛磺酸1、引言 酒精相关肝病（ALD）是全球性重大健康负担，全球患病率约 3.5%，高危饮酒人群中达 26.0%。长期过量饮酒引发的慢性肝脏病变，会导致肝脏结构与功能受损，涵盖肝脂肪变性、酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等一系列病症。ALD 已成为欧美地区肝移植首要指征，约占全球全因死亡率的 6%。 ALD 患病率高且缺乏有效疗法，目前最有效的干预手段为戒酒，但患者依从性差；临床仅糖皮质激素可用，疗效有限。因此亟需研发新型有效治疗药物。 明确 ALD 复杂发病机制是研发治疗策略的前提，其病理过程涉及脂质蓄积、细胞器应激、肝细胞凋亡、免疫炎症、肝星状细胞介导纤维化等多因素级联反应，核心特征为氧化还原稳态失衡，即活性氧（ROS）生成与清除失衡。过量饮酒代谢诱发 ROS 蓄积，进一步引发脂质过氧化、线粒体功能障碍与铁死亡。氧化应激受 Kelch 样 ECH 相关蛋白 1（Keap1）‑核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）轴精密调控：生理状态下 Nrf2 与 Keap1 结合并被泛素化降解；氧化应激时，Keap1 构象改变使 Nrf2 解离并入核，激活抗氧化相关基因转录，维持细胞氧化还原稳态。Keap1‑Nrf2 通路受沉默信息调节因子 1（SIRT1，Ⅲ 类组蛋白去乙酰化酶）调控，SIRT1 可调节 Keap1‑Nrf2 轴增强抗氧化防御，延缓 ALD 等多种肝病进展。 氧化应激与铁死亡密切相关。铁死亡是铁依赖性的调控性细胞死亡，以广泛脂质过氧化物蓄积为特征，可被氧化应激启动并加重。铁死亡中 ROS 主要来源为过氧化氢与二价铁的芬顿反应，转铁蛋白受体介导的三价铁过量内流是芬顿反应的关键条件。大量研究表明，氧化应激与铁死亡参与 ALD 等多种肝病进程，因此靶向干预上述病理过程对改善疾病预后意义重大。 中药是肝病药物研发的重要来源，疗效确切、安全性良好，且具备多靶点调控优势，适用于复杂病理机制疾病的治疗，但作用机制与活性成分阐释难题限制其全球应用。片仔癀是知名中药复方，由三七（85%）、麝香（3%）、牛黄（5%）、蛇胆（7%）组成，被列入国家中药保护名录，对病毒性肝炎、肝纤维化等疾病疗效显著，但其对 ALD 的作用尚未明确。 本研究旨在：（1）建立片仔癀质量控制指纹图谱；（2）评价片仔癀对小鼠 ALD 的治疗作用；（3）探索其作用机制；（4）鉴定片仔癀的关键活性原料与成分。研究结果将为片仔癀用于 ALD 治疗提供科学依据，并建立中药复方活性成分辨识的完整范式。2、材料与方法药品与试剂片仔癀复方及三七、蛇胆、牛黄、麝香均由漳州片仔癀药业股份有限公司提供，按《中国药典》严格质控。水飞蓟宾胶囊购自天津天士力圣特制药有限公司；甲磺酸去铁胺（DFOM）、铁抑素‑1（Fer‑1）、牛磺酸、牛蒡酸（BA）、萝卜硫素（SPN）、N‑乙酰半胱氨酸（NAC）购自 TargetMol 公司；叔丁基过氧化氢（tBHP）购自上海麦克林生化科技有限公司；药用乙醇购自 Sigma‑Aldrich 公司。 细胞计数试剂盒（CCK‑8）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；2',7'‑二氯二氢荧光素二乙酸酯检测试剂盒购自 MCE 公司；谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、乙醇检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；二价铁检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒购自南京纽松特维特曼生物科技有限公司。 TRIzol 试剂购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Green 与反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；无酶水购自上海碧云天生物技术有限公司；人源 SIRT1（His 标签）蛋白购自 MCE 公司；DMEM 培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX 与 Lipofectamine™ 3000 转染试剂购自赛默飞世尔科技有限公司。 质粒包括 pcDNA3.1 (+)、pcDNA3.1 (+)‑KEAP1–3HA、pcDNA3.1 (+)‑TFRC‑3HA、pcDNA3.1 (+)‑SIRT1（野生型）、pcDNA3.1 (+)‑SIRT1 D272A/R274A/S275A/S442A（突变体 1）、pcDNA3.1 (+)‑SIRT1 R274A/S441A（突变体 2），购自南京金载生物科技有限公司；小干扰 RNA（si‑SIRT1、si‑NC）购自南京益科生物科技有限公司；RIPA 裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂购自上海碧云天生物技术有限公司。片仔癀不同药物溶液制备亲水性成分工作液：片仔癀粉末 1.0 mg 悬浮于 1.0 ml 培养基，涡旋 2 min，4℃、12000×g 离心 10 min，取上清即为亲水性成分工作液。亲脂性 / 两亲性成分工作液：片仔癀粉末 1.0 mg 悬浮于 1.0 ml 培养基，涡旋 2 min，4℃、12000×g 离心 10 min，弃上清，沉淀用 50 μl 二甲基亚砜（DMSO）溶解，再用 1.0 ml DMEM 稀释，即为亲脂性 / 两亲性成分工作液。总成分工作液：按上述方法制备亲水性成分上清，沉淀用 DMSO 溶解后与上清混合，即为总成分工作液。所有工作液用 DMEM 稀释 20 倍后用于细胞孵育。 不同储备浓度片仔癀亲脂性 / 两亲性成分工作液制备 分别取 0.2、0.5、1.0 mg 片仔癀粉末，按上述方法制备亲脂性 / 两亲性成分工作液，稀释 20 倍后使用。 不同离心速度片仔癀亲脂性 / 两亲性成分工作液制备 取 1.0 mg 片仔癀粉末，分别以 3000、6000、12000×g 离心 10 min，按上述方法制备亲脂性 / 两亲性成分工作液，稀释 20 倍后使用。 四种原料不同药物溶液制备 分别取三七（0.85 mg）、牛黄（0.05 mg）、蛇胆（0.07 mg）、麝香（0.03 mg）粉末，按片仔癀溶液制备方法，分别得到亲水性、亲脂性 / 两亲性、总成分工作液，稀释 20 倍后使用。 牛黄与麝香混合液不同药物溶液制备 取牛黄（0.05 mg）、麝香（0.03 mg）粉末，按上述方法制备亲水性、亲脂性 / 两亲性、总成分工作液，稀释 20 倍后使用。片仔癀复方色谱与质谱分析样品制备 药物工作液：0.5 ml 药物工作液与 0.5 ml 甲醇混合，涡旋 5 min，4℃、18000×g 离心 5 min；取 0.9 ml 上清氮气吹干，用 0.1 ml 50% 甲醇复溶，涡旋 5 min、离心后取 80 μl 上清用于 HPLC‑Q‑TOF‑MS 分析；另取样品氮气吹干后用 100 μl 纯甲醇复溶，离心后用于 GC‑MS 分析。 细胞样品：干预后 6 孔板细胞经超纯水反复冻融裂解，取 0.5 ml 裂解液按上述方法提取处理，用于 HPLC‑Q‑TOF‑MS 分析。 HPLC‑Q‑TOF‑MS 分析 采用岛津 LC‑30A 高效液相色谱系统、AB Sciex Triple TOF™ 5600 质谱系统，电喷雾电离源，Analyst TF 1.6 工作站。色谱柱为 Waters Xselect® HSS T3（3.5 μm，4.6×150 mm），柱温 40℃；流动相 A 为含 0.05% 甲酸的超纯水，流动相 B 为乙腈，梯度洗脱；流速 0.5 ml/min，进样量 10 μl，分析时间 34 min。质谱采用正负离子模式，参数按标准条件设置，用 MultiQuant 3.0.3 软件定量。 GC‑MS 分析 采用岛津 GCMS‑QP2010 Ultra 质谱仪、AOC‑20i 自动进样器，GCMS solution 4.11 SU2 工作站。色谱柱为 Rtx‑5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），分流模式（分流比 10:1），进样口温度 210℃，进样量 0.8 μl；载气为氦气，流速 1.21 ml/min；柱温初始 90℃保持 3 min，以 40℃/min 升至 250℃保持 3 min。质谱离子源温度 220℃，电子能量 70 eV，选择离子监测模式检测 m/z 209，运行时间 31 min，溶剂切割时间 3.5 min。 动物实验与处理 所有动物实验遵循《赫尔辛基宣言》伦理准则，经中国药科大学动物伦理委员会批准（批准号：2024‑11‑013）。8 周龄 SPF 级 C57BL/6J 雄性小鼠，饲养于温度（22±1）℃、湿度（50±10）%、12 h 明暗循环环境，自由摄食饮水。 ALD 小鼠模型构建：小鼠每日灌胃 50%（v/v）乙醇溶液，连续 10 d；末次给药 7 h 后麻醉脱颈处死，采集血清与肝脏组织样本。 片仔癀药效实验：小鼠随机分为 5 组（n=6）：对照组、模型组、片仔癀低剂量组（0.2 g/kg）、片仔癀高剂量组（0.4 g/kg）、水飞蓟宾组（阳性对照，0.15 g/kg）；每日灌胃给药 1 次，连续 10 d，对照组与模型组给予等体积溶媒。 活性原料筛选实验：小鼠随机分为 7 组（n=6）：对照组、模型组、片仔癀组（0.4 g/kg）、三七组（0.34 g/kg）、蛇胆组（0.028 g/kg）、牛黄组（0.02 g/kg）、麝香组（0.012 g/kg）；给药方式同前。 牛磺酸与牛蒡酸药效实验：小鼠随机分为 6 组（n=6）：对照组、模型组、牛磺酸组（0.2 g/kg）、牛蒡酸组（0.1 g/kg）、牛磺酸 + 牛蒡酸组（0.2、0.1 g/kg）、水飞蓟宾组（0.15 g/kg）；给药方式同前。 组织学分析 肝脏组织用 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，行苏木精‑伊红（H&E）染色；肝脏组织用 OCT 包埋、冰冻切片，行油红 O 染色，异丙醇分化、苏木精复染。 血清生化分析 按试剂盒说明书检测血清 ALT、AST、TC、TG、GSH、SOD、MDA、二价铁、乙醇浓度。 细胞培养与转染 HepG2 细胞购自美国典型培养物保藏中心，用含 10% 胎牛血清、1% 青霉素‑链霉素的 DMEM 培养基，于 37℃、5% CO₂培养箱培养。按说明书用 Lipofectamine™ RNAiMAX 或 Lipofectamine™ 3000 试剂转染 siRNA 或质粒。 细胞活力检测 按 CCK‑8 试剂盒说明书检测细胞活力。 细胞内 ROS 水平分析 细胞用含 10 μM 2',7'‑二氯二氢荧光素二乙酸酯的培养基孵育 30 min，PBS 洗涤后离心，用 Synergy H1 多功能酶标仪检测 488/525 nm 荧光强度，数据经细胞活力校正。 网络药理学分析 通过 TargetNet、ETCM、SwissTargetPrediction 数据库预测牛蒡酸、牛磺酸潜在靶点；GeneCards 数据库检索 ALD 相关靶点；经 UniProt 数据库标准化后，取交集得到牛蒡酸 / 牛磺酸治疗 ALD 的潜在靶点；用 STRING 数据库构建蛋白互作网络，进行功能富集分析，经 PubMed 文献检索筛选氧化应激 / 铁死亡相关靶点。 分子对接 收集雌激素受体 α（1XPC）、瞬时受体电位香草酸 1（8GFA）、KEAP1（7K2L）、SIRT1（4KXQ）、COUP 转录因子 2（AF‑P10588‑F1‑model_v6）结构，用 Autodock Vina 1.1.2 进行分子对接，对接盒设为 20 Å×20 Å×20 Å，重复 20 次，取最优对接构象分析。 生物膜干涉（BLI）实验 用 Octet R8e 系统检测牛磺酸、牛蒡酸与人源 SIRT1 重组蛋白的直接结合，NTA 传感器捕获 SIRT1‑His 蛋白，分析与小分子的结合动力学。 RNA 提取 按常规方法用 TRIzol 试剂提取肝脏组织或细胞总 RNA，氯仿抽提、异丙醇沉淀、75% 乙醇洗涤，无酶水复溶。 转录组分析 RNA 样本经 poly (A) 尾筛选获取 mRNA，反转录构建 cDNA 文库，BGI T7 平台测序；用 SOAPnuke v2.2.1 过滤原始数据，HISAT2 v2.2.1 比对参考基因组，用 Dr. Tom 多组学数据挖掘系统进行生物信息学分析。 聚合酶链反应（PCR） 按说明书用 HiScript III RT SuperMix 进行反转录，ChamQ SYBR qPCR MasterMix 进行荧光定量 PCR，用 2⁻^ΔΔ^Ct 法计算基因相对表达量。 蛋白免疫印迹（Western blot） 细胞用含蛋白酶、磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液裂解，SDS‑PAGE 电泳分离蛋白，转印至聚偏二氟乙烯膜，5% 脱脂牛奶封闭；一抗（抗 Nrf2、抗 Keap1、抗 β‑actin）4℃孵育过夜，二抗室温孵育 1 h；超敏 ECL 底物显色，化学发光成像系统成像，ImageJ 软件定量条带灰度值。 统计学分析 用 GraphPad Prism 9.0 软件分析数据，结果以均值 ± 标准误（SEM）表示；多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）+Tukey 事后检验，两组比较采用 t 检验；P<0.05 为差异具有统计学意义。 3、结果 片仔癀化学成分表征 采用 HPLC‑Q‑TOF‑MS 与 GC‑MS 对片仔癀进行严格质控，共鉴定出 46 种化合物，选定三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）、麝香酮为质控标志物并定量；同时测定牛磺酸、牛蒡酸含量，方法学验证符合国际协调理事会标准。 三七来源的三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1 含量分别为 3.1、2.6、2.9 mg/g；牛黄、蛇胆来源的胆酸、脱氧胆酸含量分别为 1.6、2.3 mg/g；麝香来源的麝香酮含量为 3.3 mg/g；牛黄来源的牛磺酸、牛黄与麝香来源的牛蒡酸含量分别为 1.3、2.3 mg/g。上述结果为片仔癀质控与活性成分辨识提供依据。 片仔癀改善 ALD 氧化应激 片仔癀临床用于病毒性肝炎剂量为 1.8 g/d，小鼠等效剂量 0.36 g/kg；安全性实验显示，0.2、0.4、2 g/kg 剂量连续灌胃 15 d，小鼠血清生化、血液学、主要脏器重量与组织学均无异常，安全性良好。 构建乙醇诱导 ALD 小鼠模型，水飞蓟宾为阳性对照。模型组小鼠血清 ALT、AST 显著升高，片仔癀高剂量、水飞蓟宾可显著降低上述指标，低剂量效果较弱；肝组织 H&E 染色显示，模型组肝索紊乱、肝细胞气球样变、炎症浸润明显，片仔癀与水飞蓟宾可显著改善肝组织形态、减轻炎症；油红 O 染色显示，片仔癀与水飞蓟宾可减少肝脂质蓄积，降低肝 TC、TG 含量，呈剂量依赖性。 片仔癀对血清乙醇浓度、酒精代谢酶（ADH、ALDH、CYP2E1）基因表达无明显影响，细胞实验验证其不直接调控乙醇代谢；但可剂量依赖性降低乙醇 / 叔丁基过氧化氢诱导的 HepG2 细胞 ROS、MDA 水平，升高 GSH、SOD 活性，证实其可独立于酒精代谢通路，强效改善氧化损伤。 片仔癀通过调控 Keap1‑Nrf2 信号与二价铁稳态改善氧化应激与铁死亡 MDA 是脂质过氧化终产物，也是氧化损伤与铁死亡标志物，片仔癀可显著降低 MDA 水平，提示其可能改善铁死亡相关氧化应激。转录组分析筛选出 164 个氧化应激模型‑对照组、片仔癀处理‑模型组的共调控差异基因（DEGs）；基因本体（GO）富集显示，差异基因主要参与金属离子应答与稳态、氧化应激应答、生长调控等，血红素氧合酶 1（HMOX1，Keap1‑Nrf2 通路下游基因）富集于氧化应激应答类别；京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集显示，差异基因与肿瘤坏死因子、白介素 17、叉头框 O、胰高血糖素信号、胰岛素抵抗、铁死亡、矿物质吸收等通路相关，HMOX1 亦富集于铁死亡通路，提示片仔癀通过铁死亡与氧化应激信号发挥抗氧化作用。 片仔癀可剂量依赖性降低 HepG2 细胞 KEAP1 mRNA 与蛋白表达，升高 NRF2、HMOX1 mRNA 及 Nrf2 蛋白表达，ALD 小鼠体内实验验证一致结果。铁死亡相关检测显示，片仔癀可特异性剂量依赖性降低乙醇 / 叔丁基过氧化氢诱导的 HepG2 细胞 TFRC mRNA 表达，对 GPX4、ACSL4、SLC7A11、FSP1、NOX1 无明显影响；同时剂量依赖性降低细胞内二价铁水平。上述结果表明，片仔癀通过调控 Keap1‑Nrf2 通路、抑制铁内流发挥抗氧化作用。 牛黄与麝香是片仔癀抑制氧化应激与铁死亡的活性原料 片仔癀含三七、麝香、牛黄、蛇胆四种原料，分别检测各原料作用：四味混合组作用与片仔癀相当，牛黄、麝香可显著恢复 ROS、MDA、二价铁水平及 SOD、GSH 活性，三七、蛇胆无明显作用；牛黄与麝香联用可协同改善上述指标。 ALD 小鼠体内实验验证，牛黄、麝香可显著降低血清 ALT、AST，改善肝组织病理与脂质蓄积，降低肝 TC、TG，升高肝 SOD 活性、降低 MDA 水平，证实牛黄、麝香是片仔癀的活性原料。 片仔癀亲脂性与两亲性组分发挥抗氧化与抗铁死亡作用 将片仔癀分为亲水性、亲脂性 / 两亲性、总成分组分，检测显示总成分、亲脂性组分可显著降低乙醇 / 叔丁基过氧化氢诱导的细胞 ROS、MDA、二价铁水平，升高 SOD、GSH 活性，亲水性组分无明显作用，提示亲脂性组分是抗氧化、抗铁死亡的主要有效组分。 优化分离条件：1 mg/ml 储备浓度、12000×g 离心速度下，亲脂性组分活性最优，证实离心参数对活性组分分离至关重要。 片仔癀中牛磺酸与牛蒡酸抵御氧化应激与铁死亡 牛黄、麝香的亲脂性 / 两亲性组分可显著恢复氧化应激、铁死亡标志物水平，亲水性组分无作用；三七、蛇胆的亲脂性 / 两亲性组分亦无作用。对牛黄、麝香亲脂性 / 两亲性组分进行 HPLC‑Q‑TOF‑MS 分析，细胞摄取组分中鉴定出 8 种化合物：猪脱氧胆酸（HDCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）、柠檬酸、牛蒡酸、5‑环十六烯‑1‑酮、牛磺酸；细胞实验证实仅牛磺酸、牛蒡酸可剂量依赖性抑制 ROS 水平，为片仔癀的活性成分。 牛磺酸与牛蒡酸协同抑制氧化应激与铁死亡 片仔癀中牛磺酸、牛蒡酸含量分别为 1.3、2.3 mg/g，50 μg/ml 片仔癀中二者浓度约 0.5 μM，该浓度即可显著改善氧化应激、铁死亡指标。设置牛磺酸（0.5、5、50 μM）、牛蒡酸（0.5、5、50 μM）浓度梯度，细胞实验显示二者均可剂量依赖性降低乙醇 / 叔丁基过氧化氢诱导的 ROS、MDA、二价铁水平，升高 SOD、GSH 活性；二者联用效果优于单用。 ALD 小鼠体内实验显示，牛磺酸、牛蒡酸单用或联用均可降低血清 ALT、AST，改善肝组织病理与脂质蓄积，降低肝 TC、TG，升高肝 SOD 活性、降低 MDA 水平，联用效果最优，证实牛磺酸、牛蒡酸是片仔癀抵御氧化应激与铁死亡的核心成分。 牛磺酸与牛蒡酸调控 Keap1‑Nrf2 信号 氧化应激核心调控通路为 Keap1‑Nrf2 轴，蛋白免疫印迹显示，牛磺酸、牛蒡酸可降低乙醇 / 叔丁基过氧化氢诱导的 HepG2 细胞 Keap1 蛋白表达，升高 Nrf2 蛋白表达与 HMOX1 mRNA 水平；ALD 小鼠体内实验验证一致结果。Keap1 过表达质粒转染后，牛磺酸、牛蒡酸无法恢复 ROS、SOD 水平，证实二者通过 Keap1‑Nrf2 信号抑制氧化应激。 牛磺酸与牛蒡酸调控三价铁稳态 铁死亡依赖芬顿反应与铁内流，牛磺酸、牛蒡酸可显著降低乙醇 / 叔丁基过氧化氢诱导的 HepG2 细胞 TFRC mRNA 表达，减少二价铁蓄积；TFRC 过表达质粒转染或铁螯合剂 DFOM 处理后，二者无法恢复 GSH、MDA、二价铁及 ROS、SOD 水平，证实二者通过 TFRC 介导的铁内流抑制铁死亡。 牛磺酸与牛蒡酸直接结合 SIRT1 抑制氧化应激与铁死亡 网络药理学筛选出牛磺酸‑ALD、牛蒡酸‑ALD 共同靶点，分子对接与 BLI 实验证实，SIRT1 是二者共同高亲和力靶点：牛磺酸结合 SIRT1 的 D272、R274、S275、S442 位点，牛蒡酸结合 SIRT1 的 R274、S441 位点。 SIRT1 沉默（si‑SIRT1）后，牛磺酸、牛蒡酸无法改善氧化应激、铁死亡指标；构建 SIRT1 野生型、突变体 1（牛磺酸结合位点突变）、突变体 2（牛蒡酸结合位点突变）质粒，回补实验显示，野生型 SIRT1 可恢复二者作用，突变体则无作用，证实牛磺酸、牛蒡酸通过直接结合 SIRT1 抑制氧化应激与铁死亡。 4、讨论 ALD 发病率攀升且缺乏有效疗法，本研究证实片仔癀可通过改善氧化应激与铁死亡显著缓解 ALD；明确牛黄、麝香为活性原料，亲脂性 / 两亲性组分为活性组分，牛磺酸、牛蒡酸为核心活性成分；机制上，二者通过 SIRT1/Keap1/Nrf2 轴抑制氧化应激，通过 SIRT1 / 转铁蛋白受体通路抑制铁内流与铁死亡。研究为中药复方活性成分与靶点辨识提供范式，也为 ALD 治疗提供候选药物与先导化合物。 片仔癀临床常用于病毒性肝炎、肝纤维化，近年被证实可抑制结直肠癌，但其对 ALD 的作用与机制尚未明确。本研究首次证实片仔癀对 ALD 具有明确治疗效果，为临床应用提供依据。 酒精代谢是 ALD 核心诱因，但片仔癀不影响酒精代谢与代谢酶表达，而是通过调控氧化还原稳态发挥作用：酒精诱导 ROS 蓄积激活 Keap1‑Nrf2 通路，片仔癀可恢复 ROS、SOD、MDA、GSH 水平，调控 Keap1‑Nrf2 通路；同时酒精诱导肝铁过载，触发铁死亡，片仔癀可抑制 TFRC 表达、减少二价铁蓄积，靶向铁内流通路抑制铁死亡。 中药复方成分复杂，本研究通过 “原料筛选‑组分分离‑细胞摄取‑活性验证” 的策略，精准锁定牛磺酸、牛蒡酸为活性成分。牛磺酸是牛黄中丰富的非必需氨基酸，具备抗氧化、抗炎、抗凋亡作用；牛蒡酸是反式共轭亚油酸，存在于反刍动物肉脂中，二者均通过 Keap1‑Nrf2 通路发挥抗氧化作用，联用效果增强。 SIRT1 是氧化还原稳态关键调控因子，可调控 Keap1‑Nrf2 轴与铁代谢，本研究证实牛磺酸、牛蒡酸通过结合 SIRT1 不同位点，发挥抗氧化、抗铁死亡作用，为靶点调控提供新依据。 5、结论 片仔癀通过抑制氧化应激与铁死亡改善 ALD；其中牛磺酸与牛蒡酸通过直接结合 SIRT1 不同氨基酸残基，分别抑制 Keap1‑Nrf2 轴介导的氧化应激、TFRC 介导的铁内流，发挥核心治疗作用。本研究为片仔癀临床治疗 ALD 提供坚实证据，鉴定出牛磺酸、牛蒡酸为 ALD 治疗先导化合物，并建立中药复方复杂体系活性成分与直接分子靶点的系统辨识范式。 需要原文PDF，请关注并私信。 💛 感谢阅读，关注我们，一起前行。 关注下方二维码👇，关注后续精彩内容~~~ 往期精彩推荐  Phytomedicine：中药药效物质基础及作用机制研究-基于多模型与植物化学分析揭示天南星最优成分抗阿尔茨海默病作用机制 CEJ（IF=13.2） | 中药苦参碱 - 没食子酸自组装纳米颗粒，实现多靶点心肌保护 ，改写心梗治疗格局 Carbohydr Polym (IF=12.5)|中药自组装-果胶凝胶搭载栀子苷，双靶点攻克胆汁淤积性肝病 Food Hydrocolloids (IF=12.4)| 香菇多糖搭伙淫羊藿次苷，实现抗炎活性与稳定性双突破 J Adv Res（IF=13.0）|药食同源中药成分木犀草素-玉竹-智能纳米组装平台，赋能癌症化学免疫治疗 MTB（IF=10.2）| 泻心汤里的天然 “纳米小药”！精准掐断结肠炎的炎症开关 Phytomedicine（IF=8.3）：中药自组装研究-附子与甘草药对自组装的治疗心衰的药效物质基础表征新思路 Adv Funct Mater（IF=19.0）｜分子自组装新策略：天然中药活性成分苦杏仁苷与甘草酸自组装水凝胶，为创伤性脑损伤术后治疗提供可选策略 Redox Biol（IF=11.9）| 抗癌不损心：破解阿霉素心脏毒性困局，为肿瘤化疗筑起心脏防线 Bioact Mater（IF=20.3）| 传统中药活性成分与智能纳米递送系统强强联合，让心肌梗死治疗更精准、更持久！ APSB（IF 14.6）| 中国药科大学—顶刊突破！中国团队发现肝癌耐药新靶点，金雀花碱衍生物 DC218 精准破局 APSB（IF 14.6）|中医智慧遇上纳米科技！南中医团队用黄芪外泌体，攻克三阴性乳腺癌化疗难题 Phytomedicine（IF 8.3）|灵芝再立新功！灵芝酸 D 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