Ulixertinib

导读前两期，我们讲到了受体酪氨酸激酶 RTKs（学懂通路第一期、第二期）。RTKs既是承接胞外信号的细胞膜受体，也是将信号传递至细胞内的“中转站”。本期我们将打开细胞的大门，走进细胞，学习一种重要的细胞内信号传递通路，感受信号通路从胞外进入胞内，直到进入核内并调控基因的表达、诱导特定生理效应产生的神奇过程。01前言促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，是细胞增殖、分化、细胞凋亡以及正常条件和病理条件下应激反应的关键信号通路。MAPK 是一组进化保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和BMK1（也称：ERK5）， 分别代表四条经典的MAPK通路。MAPK信号通路是一个级联磷酸化的过程，核心成员包括：MAP kinase kinase kinase ( MAPKKK或MKKK)、MAP kinase kinase (MAPKK或MKK)和MAP Kinase（MAPK）。目前，已经分别有25、7、13种MAPKKK、MAPKK、MAPK被鉴定出。其中，以RAF为代表的MAPKKK，作用于以MEK为代表的MAPKK，使之磷酸化并活化，活化的MEK再作用于MAPK家族信号分子，使之磷化并活化，活化的MAPK进入细胞核内调节转录调控。图 1. MAPK的四条经典通路02RAS-Raf-MEK 1/2-ERK 1/2 通路1.1  信号传递过程目前，MAPK家族中研究最为广泛的是ERK1/ERK2激酶。该通路的具体过程是：胞外的生长因子如EGF，激活酪氨酸激酶受体（如EGFR），提供接头蛋白GRB2的结合位点，招募SOS蛋白到细胞膜上。SOS通过消耗GTP活化Ras形成Ras-GTP。图 2. Ras的下游蛋白如上图所示，Ras活化后可以与下游多个蛋白产生效应，包括：AF6、PI3K、PLCε、RAF等。其中，Ras-GTP通过将Raf蛋白招募到质膜上后，使其被其他多种激酶(PKA、PAK、SRC)磷酸化，激活其激酶功能。Raf蛋白家族包含BRAF、ARAF和CRAF（Raf1），BRAF在恶性肿瘤形成、发展过程中发挥重要作用。活化的Raf激酶再进一步与下游的MEK 1/2结合并使ERK1/2激活。激活的ERK1/2 能够继续磷酸化ELK1, ETS, FOS, JUN, MYC 和SP1等转录因子，诱导与细胞周期与细胞增殖有关的基因表达；此外，激活的ERK1/2 也可以磷酸化多种细胞内的激酶，例如：RAKs、MSKs、MNKs，这些激酶对细胞的增殖和粘附产生作用。1.2  信号通路与肿瘤下图是不同实体瘤中发现的与RTK/RAS/RAF 通路相关的突变，这条信号通路与多个癌种的发生密切相关，针对这条通路上的关键靶点，已成功上市多个药物。图 3. 实体瘤中与Ras-Raf-MEK通路有关的突变1.2.1 Ras与肿瘤Ras是一种GTP结合蛋白，主要包括：H-Ras/K-Ras/N-Ras，三者相互间具有85％的氨基酸同源序列，是癌症研究的重要靶标。其中， Kras是Ras家族中最常出现的亚型，占Ras基因突变总数的85%。研究发现，Kras在90 % 胰腺导管癌中均发现突变；此外，在黑色素瘤中，Ras突变近于28％左右，其中N-Ras为主要突变体（93％）。虽然Ras与肿瘤的发生发展密切相关，但是目前仍未有直接针对Ras的靶向药物上市。最主要一个原因在于Ras蛋白的无特征、近乎球形的结构，无明显结合位点，因此在很长一段时间都被当做“不可成药靶点”。但是近年来，针对共价抑制剂研究和靶向降解剂的出现使得靶向KRAS突变体成为可能。图 4.  针对该通路各个环节开发靶向药物1.2.2 BRAF与肿瘤 RAF基因家族包含BRAF、ARAF和CRAF，其中，BRAF在恶性肿瘤形成、发展过程中发挥重要作用。BRAF最常见突变形式为第15外显子的第1,799位核苷酸上T突变为A，导致其编码的缬氨酸变为谷氨酸，即BRAF V600E突变（占BRAF所有突变的80 %）。这一突变使BRAF蛋白持续激活，活性提高约500倍，并且能够不依赖于上游RAS激酶单体，持续激活下游的ERK，最终导致细胞的无限增殖和分裂。目前针对BRAF单靶点/多靶点的药物主要有：达拉非尼、瑞戈非尼、维罗非尼、索拉非尼等。1.2.3 MEK与肿瘤MEK1/2作为易突变的蛋白Ras、Raf下游蛋白，因此也可以作为一个靶点。目前，该靶点获批的抑制剂主要用于黑色素瘤以及肺腺癌，如曲美替尼（trametinib）、司美替尼（selumetinib）等。1.2.4 ERK与肿瘤 ERK激酶是MEK激酶的唯一下游靶点，研究显示，靶向于ERK靶点的抑制剂能够有效阻断RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，同时能够有效逆转由上游BRAF、MEK突变而导致的耐药。目前ERK抑制剂处于临床试验的主要有：AZD0364、KO-947、Ulixertinib。值得注意的是，由上海海和药物与中国科学院上海药物研究所合作开发的小分子抑制剂HH2710也已于2019年9月获美国FDA的临床试验许可，拟用于治疗经检测确认存在MAPK信号通路基因异常的恶性肿瘤。03其他三种MAPK通路图 5. ERK 1/2 和其他三种MAPK通路除了大家熟知的的Ras-Raf-MEK-ERK通路，根据MAPK的种类不同（p38、JNK、ERK5），MAPK还有三条经典的通路。其中，p38和JNK通路涉及的生理效应主要与炎症和细胞凋亡等应激反应有关。2.1 JNK/SAPK级联反应 JNK（JUN N -terminal kinases, JNK）主要包括JNK1/2/3，也称作SAPKs（stress-activated protein kinases）。JNK/SAPK信号通路 可被应激刺激(如紫外线、热休克、高渗刺激及蛋白合成抑制剂等)、细胞因子(TNFα，IL-1)、生长因子(EGF)及某些G蛋白偶联的受体激活。应激反应信号经小分子G蛋白Ras超家族的成员之一Rho 亚家族（Rac、Rho、cdc42）传递到MAPKKK，进一步地依次活化MEK4/7和JNK。JNK磷酸化激活后可以作用下游多种转录因子（例如：JUN、ELK1、ETS2等）与激酶（主要是MNK），产生促进生长、分化、存活、凋亡等多种生理效应。图 6. JNK/SAPK级联反应2.2 p38级联反应P38激酶主要有四种：p38 α, β, γ 和δ，诱导该通路的主要诱因有：缺氧，紫外线辐射，渗透性休克，炎症等应激反应。P38 MAPK激酶主要由ERK3/6磷酸化激活，进一步地通过诱导转录因子及激酶促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。此外，该通路对细胞运动也有促进作用。2.3 BMK1 （ERK5）级联反应ERK5可以被上游的MEK5激活。与ERK1/2通路类似，该通路也与细胞增殖有关。参考文献：[1] Robert, Jacques. Textbook of Cell Signalling in Cancer [M]. Springer International Publishing, 2015.[2]  Wagener C , Stocking C , O. Müller. Cancer Signaling - From Molecular Biology to Targeted Therapy[M]. 2017.[3] Amanda H . Cancer cell signalling[M]. Wiley Blackwell, 2014.[4]  Comprehensive pancancer genomic analysis reveals (RTK)-RAS-RAF-MEK as a key dysregulated pathway in cancer: Its clinical implications. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2017.11.016.部分素材来源于互联网，只为知识传播，不做商业用途，侵删。预告第二期：PI3K通路；第三期：细胞因子通路；做号不易，感恩“分享”

近日，河南师范大学/抗病毒性传染病创新药物全国重点实验室常俊标&朱博&朱功名团队在国际顶级药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“Discovery of Novel Aromatic Urea-Imidazole Salt Derivatives for Cancer Therapy via Targeting ERK1/2”的研究论文。该研究聚焦于开发新型芳香脲咪唑盐衍生物，通过靶向ERK1/2蛋白，为癌症治疗提供了潜在的新策略。研究团队通过构建化合物库并结合表型筛选和蛋白质组学技术，发现了一种名为21y的化合物，其对MCF-7乳腺癌细胞表现出显著的抑制活性（IC50 = 0.67 μM）。进一步的机制研究表明，21y能够直接靶向ERK1/2，抑制其下游信号通路，并诱导细胞凋亡和自噬相关细胞死亡。在体外和体内实验中，21y均显示出强大的抗肿瘤和抗转移效果，且具有良好的药代动力学特性。这一成果不仅为ERK1/2靶向药物的研发提供了新的思路，也为乳腺癌治疗带来了新的候选。 图片来源：ACS 01 Background 研究背景 研究者指出表型筛选是许多重要药物类别的起源，但识别活性化合物的药理靶点是一个显著挑战。为了解决这一问题，蛋白质组学技术被认为是揭示药物靶点的关键手段。结合表型筛选和蛋白质组学可以加速药物发现并降低临床研究失败的风险。近年来，基于无标记的靶点识别方法受到广泛关注，因为它们能够在不需要化学标记的情况下揭示药物靶点。研究者强调，ERK1/2作为RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的关键组分，因其在多种肿瘤中的过度激活而成为潜在的抗肿瘤靶点。开发靶向ERK的药物被认为是解决药物耐药性问题的有前景的策略，因此，ERK抑制剂的研发成为肿瘤药物发现中的一个活跃领域。 图片来源：ACS 02 Drug Design 药物设计与评价 ①基于细胞的表型筛选来鉴定具有抗肿瘤活性的化合物 化合物库的构建与筛选：研究者们构建了一个包含芳香脲咪唑盐衍生物的化合物库（20a−k），并针对多种肿瘤细胞系（包括MCF-7、A549、HepG2、5637、HeLa、CFPAC-1和SW480）进行了细胞活性测试，主要以细胞生长抑制为筛选指标。 化合物20b的发现：在初步筛选中，化合物20b表现出对MCF-7乳腺癌细胞的良好抑制活性，其半抑制浓度（IC50）为1.55 μM，优于阳性对照药物5-FU（IC50 = 6.00 μM）和BVD-523（IC50 > 10 μM）。此外，20b对正常乳腺上皮细胞系MCF-10A的毒性较低（IC50 > 10 μM），显示出较好的肿瘤细胞选择性。 化合物库的扩展与优化：为了进一步提高活性，研究者们通过引入不同的芳基或烷基溴化物和异氰酸酯衍生物，扩展了化合物库（21a−ab和22a−h）。在这些衍生物中，化合物21y表现出对MCF-7细胞的更强抑制活性，其IC50值低至0.67 μM，同时对正常细胞系MCF-10A的毒性较低（IC50 > 10 μM），显示出更高的肿瘤细胞选择性和潜在的成药性。 ②蛋白质组学分析将ERK1/2识别为靶标 基于21y对MCF-7细胞的显著抗肿瘤活性，研究者们利用无标记的药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）和液相色谱-串联质谱（LC−MS/MS）蛋白质组学技术，鉴定出21y的直接靶点为ERK1/2。 ③ERK1/2的靶点验证 研究者通过多种实验方法验证了ERK1/2作为化合物21y的直接靶点。使用细胞热位移分析（CETSA）和差示扫描荧光法（DSF），研究发现21y能够显著提高ERK1/2蛋白的热稳定性，表明其与ERK1/2直接相互作用。此外，微尺度热泳（MST）分析显示21y与ERK1和ERK2的结合亲和力分别为156 nM和116 nM，且在ADP-Glo激酶活性测定中，21y对ERK1和ERK2的抑制活性IC50值分别为91.71 nM和97.87 nM，进一步确认了其强抑制作用。分子对接实验表明，21y能够占据ERK1和ERK2的ATP结合口袋，与已知的ERK抑制剂BVD-523类似。Western blotting实验显示，21y能够显著增加ERK1/2的磷酸化水平，同时抑制其下游底物c-Myc和p90RSK的磷酸化，诱导MCF-7细胞的凋亡和自噬。通过siRNA敲低ERK1和ERK2的表达后，21y对细胞增殖的抑制效果显著减弱，进一步证实了ERK1/2在21y抗肿瘤作用中的关键角色。这些结果为21y作为潜在的ERK1/2抑制剂用于癌症治疗提供了坚实的理论依据。 图片来源：ACS 03 In vitro In Vivo 体内外评价 ①21y激酶的选择性分析 研究者通过Eurofins Kinase Profiling Service对21y进行了激酶谱分析，测试了其在10 μM浓度下对216种激酶的抑制活性。实验结果显示，ERK1/2是21y的最强抑制靶点，其对ERK1和ERK2的抑制活性IC50值分别为91.71 nM和97.87 nM，表明21y对ERK1/2具有较高的选择性。此外，21y对其他激酶的抑制活性较弱，显示了其相对较好的激酶选择性。 图片来源：ACS ②构效关系研究 研究者对化合物21y的结构特征与其抗肿瘤活性之间的关系进行了系统分析，以揭示影响其活性的关键结构因素。研究表明，在芳香脲咪唑盐衍生物库中，R1位置的L-苯丙氨酸取代基（IC50 = 205.75−376.10 nM）和R2位置的苯并咪唑取代基（IC50 = 205.75−285.20 nM）对ERK2的抑制活性具有显著影响。特别是，化合物20b在R1位置为L-苯丙氨酸、R2位置为苯并咪唑时，表现出良好的ERK2抑制活性（IC50 = 205.75 nM）和抗增殖活性（MCF-7 IC50 = 1.55 μM）。进一步的研究发现，21y的结构优化，尤其是引入3,5-双三氟甲基取代基，显著增强了其对ERK2的抑制活性（IC50 = 97.87 nM）和对MCF-7细胞的抗肿瘤活性（IC50 = 0.67 μM）。此外，研究还发现芳香环的取代基位置对活性有显著影响，某些取代基如F、Cl、Br和CF3在中位位置的引入能够提高ERK2的抑制活性，而在其他位置的引入则可能降低活性。通过这些构效关系的研究，研究者为21y的进一步优化和开发提供了重要的理论基础。 图片来源：ACS ③21Y抑制MCF-7细胞增殖，迁移和侵袭 研究者通过一系列体外实验评估了化合物21y对MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。实验结果表明，21y能够显著抑制MCF-7细胞的增殖，表现为EdU掺入实验和克隆形成实验中细胞增殖能力的剂量依赖性下降。此外，21y在划痕实验中显著减缓了细胞的迁移速度，并在Transwell实验中抑制了细胞的侵袭能力。进一步的Western blot实验显示，21y能够上调E-钙黏蛋白的表达，同时下调N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，表明其可能通过逆转上皮-间质转化（EMT）过程来抑制细胞迁移和侵袭。这些结果表明，21y通过靶向ERK1/2，不仅抑制了MCF-7细胞的增殖，还通过影响EMT相关蛋白的表达，显著抑制了细胞的迁移和侵袭能力，进一步证实了其作为潜在抗肿瘤药物的开发价值。 图片来源：ACS ④21y诱导MCF-7细胞中的细胞凋亡和诱导的自噬起始和MCF-7细胞的自噬通量 综合探讨了化合物21y在MCF-7乳腺癌细胞中诱导细胞凋亡和自噬的作用及其潜在机制。实验结果表明，21y能够显著诱导细胞凋亡，表现为细胞凋亡率的增加、Caspase 3和PARP1的裂解以及Bax/Bcl-2比值的升高，同时线粒体膜电位的降低进一步证实了凋亡的启动。此外，21y还激活了完整的自噬过程，表现为LC3B-II、ATG5和Beclin1蛋白表达的增加以及P62蛋白水平的下降，免疫荧光和透射电子显微镜观察到的自噬体和自噬溶酶体的形成也支持了这一点。值得注意的是，自噬抑制剂（如3-MA和CQ）能够增强21y诱导的细胞凋亡，表明自噬在细胞死亡过程中可能具有保护作用。这些发现揭示了21y通过靶向ERK1/2在MCF-7细胞中诱导细胞凋亡和自噬的双重机制，并为开发基于21y的抗肿瘤策略提供了重要的理论依据。 ⑤药代动力学特征与体内抗肿瘤活性 研究者对化合物21y在Sprague-Dawley（SD）大鼠体内的药代动力学特性进行了研究，结果显示，21y在口服给药后表现出良好的药代动力学特性，其消除半衰期（T1/2）为2.51 ± 0.04 h，Cmax为769.67 ± 15.30 ng/mL。而在静脉注射给药后，T1/2为3.15 ± 0.14 h，Cmax为534.00 ± 8.00 ng/mL。基于这些数据计算得出，21y的生物利用度为37.09%。这一结果表明，21y具有适度的口服生物利用度，为后续的体内疗效研究提供了重要的药代动力学支持。 研究者通过4T1乳腺癌异种移植小鼠模型评估了化合物21y的体内抗肿瘤活性及其机制。结果显示，21y在不同剂量（25 mg/kg和50 mg/kg）下均能显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为40.72%和54.86%，显著高于BVD-523（26.89%）。此外，21y处理的小鼠肿瘤组织中ERK1/2磷酸化水平在给药后8小时达到峰值，随后逐渐下降，表明21y通过抑制ERK1/2信号通路发挥抗肿瘤作用。免疫组化分析进一步证实，21y显著降低了肿瘤组织中Ki67和PCNA的表达，同时上调了自噬标志物LC3B的水平，表明21y通过抑制细胞增殖和激活自噬来抑制肿瘤生长。此外，21y处理的小鼠未出现明显的体重下降或器官损伤，表明其具有较低的毒性。这些结果表明，21y通过靶向ERK1/2信号通路在体内表现出显著的抗肿瘤活性，并且具有良好的耐受性，为21y作为潜在的抗肿瘤药物的进一步开发提供了有力的证据。 ⑥21y对乳腺癌肺转移的抑制效果 通过尾静脉注射4T1-luc细胞建立肺转移模型，研究者发现21y在25 mg/kg和50 mg/kg剂量下均能显著减少肺部转移灶的数量和重量。具体而言，与对照组和BVD-523处理组相比，21y处理的小鼠在生物发光成像中显示出更低的信号强度，且在实验结束时肺部转移灶数量显著减少。此外，H&E染色显示21y处理的小鼠肺组织病理变化减轻，表现为肺泡结构更完整、细胞结构更清晰。这些结果表明，21y不仅在抑制肿瘤生长方面表现出色，还具有显著的抗肺转移潜力，为乳腺癌治疗提供了新的策略。 总结 研究者总结了化合物21y作为新型ERK1/2抑制剂在乳腺癌治疗中的潜力。研究团队开发了一系列芳香脲咪唑盐衍生物，并从中筛选出21y，该化合物对MCF-7乳腺癌细胞表现出显著的抑制活性（IC50 = 0.67 μM）。通过DARTS和LC−MS/MS蛋白质组学技术，研究者证实21y直接靶向ERK1/2，其对ERK1和ERK2的抑制活性IC50值分别为91.71 nM和97.87 nM。体外实验显示，21y通过抑制ERK1/2下游信号通路，诱导细胞凋亡和自噬相关细胞死亡。体内实验进一步证实，21y在4T1乳腺癌异种移植小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤生长和抗肺转移效果，且具有良好的药代动力学特性和较低的毒性。此外，21y在BRAF V600E突变的A375黑色素瘤细胞中也显示出强效的抗增殖活性，提示其可能对黑色素瘤治疗也具有潜在价值。综上所述，21y作为一种新型ERK1/2抑制剂，在乳腺癌治疗中展现出良好的应用前景，值得进一步开发为临床药物。 参考来源： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c01434 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓