Casirivimab/Imdevimab

摘    要 蛋白质工程通过改造蛋白质（如单抗、纳米抗体），能开发出比传统小分子药物更特异、更安全的疗法，是现代药物发现的关键驱动力。蛋白质折叠与稳定性、免疫原性、复杂的监管审批流程是蛋白质工程的主要挑战。通过综述前沿技术（CRISPR、AI计算建模、噬菌体展示等），以提高设计效率与可预测性。 1 蛋白结构解析技术 蛋白质功能依赖于其一级、二级、三级和四级结构。X射线晶体学、冷冻电镜、核磁共振是解析蛋白质三维结构的基石。蛋白质间的相互作用（如氢键、结合能）对细胞过程至关重要。 图：蛋白质的结构. (A) 一条多肽链展示了蛋白质的一级结构，由通过肽键连接的氨基酸组成。这条多肽链的长度和序列决定了蛋白质的结构和功能。它由20种标准氨基酸（A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V）组成。(B) 从蛋白质数据库（PDB）中检索到的不同蛋白质的三维结构，突出了蛋白质的结构多样性：人源IgG抗体Fab'片段（PDB： 2VXV），一个纳米抗体-SARS-CoV-2复合物（PDB：7VOA），以及SARS-CoV-2受体结合域（RBD）蛋白（PDB：7VOA）。使用 PyMOLv0.99 绘制本图。 2  蛋白质工程中的先进计算工具 分子动力学模拟：在原子水平模拟蛋白质动态行为，研究稳定性与折叠，助力药物设计（如针对SARS-CoV-2刺突蛋白）。 分子对接：预测配体与蛋白质的结合模式与亲和力，用于虚拟筛选先导化合物。 人工智能：利用AI（如AlphaFold）从序列预测蛋白质结构，极大加速了蛋白质设计与理解。 3  生物制剂：新前沿 蛋白类疗法（抗体、细胞因子等）能选择性靶向疾病分子，疗效显著。稳定性、免疫原性、需要注射给药，是这一类疗法的一般挑战。这一类疗法的发展方向是通过工程化改造（如延长半衰期、降低免疫原性）和新型递送系统开发下一代生物制剂。 3.1. 抗体 结构与类型：包括全长单克隆抗体、单链抗体片段、Fc融合蛋白等。 应用领域：癌症：如曲妥珠单抗（靶向HER2）、免疫检查点抑制剂（帕博利珠单抗/纳武利尤单抗）、双特异性抗体（博纳吐单抗）、抗体偶联药物。传染病：如用于中和SARS-CoV-2的单抗组合（REGEN-COV）。 发展方向：优化药代动力学，增强疗效。 3.2. 纳米抗体 独特优势：源自骆驼科动物，尺寸小（~12 kDa），组织穿透力强，稳定性高。 应用领域：抗病毒：有效中和SARS-CoV-2、埃博拉、HIV、流感等病毒。癌症诊疗：用于靶向递送放射核素或作为分子成像探针；参与构建CAR-T细胞。自身免疫病：如首个获批的纳米抗体药物奥扎瑞珠单抗用于治疗类风湿关节炎。 图2：抗体结构. (A) 展示了人源抗体的结构，突出了其关键组成部分。从左到右依次是：(1) 全长Y形的Fab区域，负责抗原结合，随后是Fc区域（~150 kDa），(2) 仅重链（~90 kDa），(3) 纳米抗体（~12 kDa），(4) 双特异性纳米抗体（~24 kDa），并且可以将其工程化为多价纳米抗体，提供更多的中和治疗、诊断功能。(B) 各种抗体的三维结构，展示了不同的构象和不同的特异性，突显了抗体设计的复杂性和功能性。从左起分别是：全长人源抗PD-1治疗性IgG4抗体帕博利珠单抗的结构（PDB： 5DK3），与mTOR的FRB结构域复合的合成Fab结构（PDB： 9DBO），以及与SARS-CoV-2-RBD复合的VHH结构域的图示，展示了其独特的性质。许多研究表明，VHH结构域在作为独立单域以及在双特异性或多价形式中都表现出高效的病毒中和能力。 3.3. 细胞因子疗法 功能：免疫系统关键信号分子（如干扰素、白细胞介素），协调免疫应答。具有治疗癌症、自身免疫病和病毒感染的应用潜力。 挑战与优化：存在全身性副作用；通过蛋白质工程（如聚乙二醇化）改善其药代动力学和疗效。 4 蛋白质工程疗法的创新    噬菌体展示、定向诱变、CRISPR等技术实现了蛋白质变体的高通量筛选和快速原型构建。     X射线晶体学和冷冻电镜揭示疾病机制，为理性药物设计奠定基础。     计算建模与机器学习在合成前优化蛋白质设计，降低成本与时间。 5 方法论 5.1 分子克隆 核心是将目的基因插入载体并导入宿主细胞进行表达，是生产重组蛋白的基础。 5.2 蛋白表达系统与表达载体 5.2.1 表达系统选择 原核系统（如大肠杆菌）：快速、经济，适用于大规模生产，但缺乏复杂翻译后修饰（如糖基化），可能影响某些真核蛋白的功能。 真核系统：能进行复杂修饰，产物更接近天然。酵母/昆虫细胞：成本与复杂性折中。哺乳动物细胞（如CHO）：是生产治疗性蛋白的“金标准”，修饰最准确，但成本高、周期长。 5.2.2 载体：类型与功能载体是将基因导入细胞的通用工具，其关键特性（选择性标记、标签、蛋白酶切割位点）用于筛选、纯化和获得最终产品。 选择表达系统取决于对蛋白修饰和成本的需求；选择载体类型则取决于目标是表达蛋白、克隆基因还是进行基因治疗。 表1：蛋白质融合常用连接子示例 5.3 治疗性蛋白纯化：多步骤过程，包括细胞裂解、初步分离（如盐析）和核心的色谱纯化技术（如亲和、离子交换、尺寸排阻色谱）。 图3：重组蛋白的克隆、表达和纯化. (A) 工作流程始于分子克隆，其中通过PCR从抗体文库中扩增出用于蛋白治疗的目的基因。使用相同的限制性内切酶切割载体和基因，或使用 Gibson Assembly 方法进行组装 (1)。通过将混合物在42°C热激30-60秒，然后在含有特定抗生素的LB培养基中37°C孵育数小时以培养转化细胞，随后在LB琼脂平板上铺板培养24小时进行转化。此步骤便于进行菌落PCR和测序以验证成功克隆 (2)。(B) 使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在低温（16-20°C）下诱导蛋白表达，以促进重组蛋白的正确折叠 (3)。纯化过程从细菌细胞裂解开始，随后进行离心和过滤以去除细胞碎片。所得的细胞裂解液然后通过整合色谱柱（如Ni-NTA）进行蛋白纯化。通过在4°C过夜透析，使用特定的蛋白酶（如TEV蛋白酶）从蛋白上移除标签。通过尺寸排阻色谱（SEC）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实现进一步纯化。在纯化过程的各个阶段进行分析 (4)。此重组蛋白克隆、表达和纯化的方案改编自。本图使用 BioRender (https://app.biorender.com，访问于 2025年8月12日) 制作。 5.4 重组蛋白表征：需使用多种技术验证蛋白的结构、功能和相互作用。技术选择取决于研究目标，包括SDS-PAGE（纯度/大小）、质谱（鉴定/修饰）、SPR/ITC（结合动力学/热力学）、CD（二级结构）、X射线/冷冻电镜（高分辨结构）等。 表2：重组蛋白表征技术：优势、局限性与应用 6 临床案例：成功范例 抗感染：巴尼韦单抗、卡西瑞单抗/伊德韦单抗组合用于治疗COVID-19。 抗癌：曲妥珠单抗（乳腺癌）、帕博利珠单抗（多种癌症）、CAR-T细胞疗法（如Kymriah, Yescarta治疗血液癌）。 细胞因子疗法：干扰素-α（肝炎）、白细胞介素-2（肾癌、黑色素瘤）。 纳米抗体：奥扎瑞珠单抗（类风湿关节炎）、卡普拉珠单抗（血栓性血小板减少性紫癜）。 7 挑战与前景 核心挑战： （1）蛋白折叠与稳定性：预测生理环境下行为仍困难。 （2）免疫原性：可能引发免疫反应，影响疗效与安全。 （3）监管与成本：审批流程复杂漫长，研发成本高昂。 （4）递送难题：尤其是大分子靶向递送至细胞内。 未来前景： （1）AI与计算设计：提高蛋白质行为预测的准确性。 （2）个性化医疗：根据个体基因谱定制疗法。 （3）下一代生物制剂：开发更稳定、低免疫原性的新型蛋白。 （4）联合疗法：与其他疗法联用以增强疗效、克服耐药。 8 结论 1、蛋白质工程已彻底改变药物发现，提供靶向性更强、更安全的治疗方案。 2、克服折叠、稳定性和免疫原性挑战，并利用分子克隆、CRISPR和AI等先进技术至关重要。 3、产学研合作与持续研发投入是推动该领域发展、实现个性化医疗和改善全球患者预后的关键。未来充满希望。 原 文 出 处 Mohammed, A.; Ibrahim, N.A.; Basher, N.S. Protein Engineering and Drug Discovery: Importance, Methodologies, Challenges, and Prospects. Biomolecules 2025, 15, 1628. https://doi.org/10.3390/biom15111628                                                                                                                                                                                                       IF: 4.8 Q1 B2 指导教师：王战辉 教授