Telisotuzumab vedotin

背景：抗体偶联药物（ADC）结合了单克隆抗体的特异性和药物的细胞毒性，是一类重要的靶向肿瘤治疗药物。尽管ADC在临床上取得了成功，但制剂相关的不稳定性，才是导致ADC研发受阻的主要原因，而非生物活性不足。本综述探讨了影响ADC稳定性的生化、物理化学和制剂因素，重点关注赋形剂选择、偶联位点异质性和连接子-有效载荷反应性。方法：本综述基于一系列经同行评审的关于ADC稳定性的机制、分析和生产工艺研究。我们的目标是重点阐述影响ADC药代动力学和治疗效果的制剂策略、降解途径和固态稳定化原理。结果：结果表明，包括缓冲液组成、赋形剂选择、离子强度和冻干在内的制剂变异性可直接影响有效载荷释放、连接子裂解、动力学和抗体构象。已证实，采用玻璃形成基质进行冻干以及添加表面活性剂等技术可增强抗水解、抗氧化和抗聚集稳定性。分析表征技术的进步，例如实时动力学建模和基于质谱的多属性技术，使得抗体偶联药物（ADC）制剂中降解和生物活性损失的定量分析更具可预测性。模型指导的优化和人工智能驱动的设计等新技术正在重新定义化学稳定性和制剂结果之间的联系。结论： ADC制剂如今已成为分子稳定性、临床可靠性和法规遵从性的关键组成部分，而非次要考虑因素。通过确保下一代设计的长期稳定性、更佳的药代动力学和更高的治疗指数，这些方法有望彻底改变ADC的开发。 简介 将细胞毒性分子的高效性与单克隆抗体（mAb）的靶向特异性相结合，以选择性地杀死肿瘤细胞同时保护健康组织，这一目标催生了抗体偶联药物（ADC）的治疗理论。最初的想法基于保罗·埃尔利希的“魔法子弹”理论，即需要一种载体分子将致命物质直接输送到靶细胞。然而，偶联化学的不足、连接子稳定性差以及药代动力学的不可预测性，在之后的几十年里一直限制着这一新概念的实现。 由于腙连接子不稳定且偶联特性不明确，20世纪80年代末90年代初的第一代抗体偶联药物（ADC），例如Gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg®），存在聚集、脱靶毒性和治疗窗狭窄等问题。直到引入更先进的偶联方法，例如马来酰亚胺-硫醇化学和可裂解的二肽连接子（例如缬氨酸-瓜氨酸），ADC才开始展现出显著的临床活性。随着2011年brentuximab vedotin（Adcetris®）和2013年trastuzumab emtansine（Kadcyla® ）的获批，ADC成为一种公认的治疗手段。这些偶联分子表明，如果优化连接子化学和制剂条件，将强效细胞毒性有效载荷可控地偶联到临床成功的抗体上，可以产生具有增强选择性、可量化疗效和可耐受毒性的药物递送系统。 自此之后，抗体偶联药物（ADC）领域以前所未有的速度发展，其日益增长的临床和产业意义体现在ADC研究和临床转化呈指数级增长。目前全球有超过200种候选药物正在进行积极的临床开发，其中20多种处于III期临床试验阶段（表1，参见原文），并且目前已有14种ADC获得FDA批准用于治疗多种疾病（表2，参见原文），包括血液系统恶性肿瘤、胃癌和乳腺癌。 靶向细胞毒性的概念已由早期上市的药物证实，例如brentuximab vedotin（Adcetris® ）和ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®），但这些药物也凸显了在效力、稳定性和安全性之间取得平衡的挑战。此后，随着每一代抗体偶联药物（ADC）逐步将设计控制融入有效载荷-连接子和抗体结构域，这三者之间的关系得到了改进。最近获批的药物，例如telisotuzumab vedotin（Emrelis® ）、Datopotamab deruxtecan（Datroway® ）、sacituzumab govitecan（Trodelvy®）和trastuzumab deruxtecan（Enhertu®），代表了数十年来生物化学优化的成果，这些药物具有更高的治疗指数和更广泛的临床应用前景。 抗体偶联药物的临床疗效至少受两种失效机制的影响：一是靶点生物学导致的失效，二是药物本身发生改变导致的失效。尽管这两种机制经常被放在一起讨论，但它们的成因各不相同，需要不同的研发策略。生物学失效反映了与靶点生物学和疾病背景相关的局限性，例如剂量限制性全身毒性、抗原表达异质性、耐药机制以及尽管靶点结合但临床获益不足。Rovalpituzumab tesirine 就是一个典型的生物学驱动型失效的后期案例；在随机3期TAHOE试验中，与标准疗法相比，rovalpituzumab tesirine治疗的总生存期更低。因此，该项目因耐受性和疗效问题而非药物质量问题而终止。同样，vadastuximab talirine 也因治疗相关死亡率过高而在3期CASCADE试验后终止。这种局限性是由全身毒性和暴露引起的，而非制剂本身的不稳定性。相反，聚集、连接子-有效载荷脱偶联以及DAR物种的重新分布等物理化学过程与制剂相关的不稳定性有关。这些过程会改变药代动力学并限制给药策略，但不会损害抗原特异性。Gemtuzumab ozogamicin （Mylotarg®）提供了一个有据可查的临床案例，由于溶液稳定性有限，需要严格的操作指南和冻干，这直接影响了临床应用。 随着抗体偶联药物（ADC）化学结构的日益复杂，越来越多的证据表明，ADC制剂的稳定性和理化性质对其临床疗效至关重要。制剂不仅影响药代动力学、生物分布和免疫原性，还有助于在操作和储存过程中维持结构完整性。ADC能否在生理和其他应激条件下保持活性，或因聚集、脱偶联或有效载荷氧化而无法到达靶点，取决于抗体、连接子、有效载荷和赋形剂之间的分子界面。 随着这一发展，抗体偶联药物（ADC）已被重新定义为一个动态系统，其治疗成功取决于制剂、化学、工艺工程和分子设计如何协同作用，以构建稳定且具有活性的结构。本研究聚焦于抗体偶联药物特有的制剂和稳定性问题，这些问题直接影响产品质量、药代动力学和临床转化。研究重点在于制剂相关的应力、稳定化技术以及影响药物研发和生命周期管理过程中重要质量属性演变的物理化学降解途径。目标读者包括制剂科学家、分析科学家和转化研究人员。本研究的重点在于支持从早期发现到规模化生产过程中合理决策的制剂相关机制和分析方法，而非对ADC靶点生物学或临床疗效的详尽讨论。本综述旨在弥合分子设计、药理学性能和转化应用之间的鸿沟。为此，本研究强调了制剂因素在将ADC概念转化为实用临床工具过程中长期以来被忽视的作用。 抗体偶联药物组成 ADC 由三个不同的元素组成：提供靶向特异性的单克隆抗体和提供杀肿瘤作用的细胞毒性有效载荷，所有这些都通过连接子连接，从而赋予重要的稳定性、可控释放和药代动力学（见图1 A）。 图1. 抗体偶联药物（ADC）的结构和作用机制：（A）展示了ADC的结构。该抗体包含两条轻链和两条重链，其内部包含可变区和恒定区。链间通过二硫键连接，并通过连接抗原结合片段（Fab）和可结晶片段（Fc）的铰链区连接。抗原结合位点位于Fab区，细胞毒性有效载荷通过连接子连接。（B）展示了ADC的作用机制。ADC在肿瘤细胞表面识别抗原后，经受体介导的内吞作用进入细胞内。ADC的处理过程释放细胞内有效载荷，从而诱导靶细胞产生细胞毒性，最终触发细胞凋亡。当膜通透性有效载荷到达邻近的低表达或阴性抗原细胞时，会产生旁观者效应，从而增强异质性肿瘤的治疗效果。 抗原结合、内化、细胞内转运和有效载荷释放是抗体偶联药物（ADC）作用机制的生化和细胞过程，其分子设计是一个多步骤的过程（图1B）。给药后，完整的ADC在体内循环，而制剂赋形剂，例如糖类、聚山梨酯和氨基酸，则维持其构象稳定。肿瘤细胞表面表达的靶抗原，例如HER2、TROP-2、CD79b、CLDN18.2或CD123，会被存在的抗体选择性地结合。结合后，ADC-抗原复合物被内吞并经由内体-溶酶体系统运输，在此过程中，酶促pH或氧化还原信号导致连接肽断裂。释放的有效载荷随后通过微管破坏、DNA损伤或拓扑异构酶抑制等机制发挥细胞毒性作用，导致细胞凋亡或有丝分裂死亡。当有效载荷扩散穿过靶细胞膜到达邻近细胞时，也可能对邻近细胞产生旁观者效应。 表1（参见原文）列出了目前正在美国进行III期临床试验的抗体偶联药物（ADC）。其中，Trastuzumab deruxtecan（T-DXd）、sacituzumab govitecan、datopotamab deruxtecan（Dato-DXd）、mirvetuximab soravtansine、brentuximab vedotin和trastuzumab emtansine （T-DM1）是此前已获批准的ADC，目前正在评估其扩展适应症。相比之下， ifinatamab deruxtecan（I-DXd）、sacituzumab tirumotecan （MK-2870/SKB264）、 tusamitamab ravtansine和 patritumab deruxtecan（HER3-DXd）是尚未获得美国监管机构批准的新型ADC，目前正在进行临床评估。 单克隆抗体 抗体偶联药物 (ADC) 的抗体组分是一种单克隆免疫球蛋白，它作为靶向部分，能够特异性识别肿瘤相关抗原，并作为连接子与有效载荷连接的结构框架。抗体决定了抗原特异性、半衰期、生物分布和免疫原性，构成了 ADC 结构的基础。大多数临床 ADC 使用人源化或全人源 IgG1 抗体，因为它们具有优异的药代动力学特性和效应功能。理想的靶抗原应具有高肿瘤选择性、低正常组织表达和有效内化等特征，例如 HER2、TROP-2 或 CD30。 通过工程改造单克隆抗体以使其具有特定的偶联位点，是确保制剂重现性和药理学一致性的关键策略。Seki 等人证明，基于 AJICAP™ 的位点特异性偶联可制备出均一性更高的抗体偶联药物 (ADC)，并具有更高的稳定性和可预测的理化性质，这表明下游开发可行性与抗体结构之间存在密切关联。糖基化导向偶联是另一种在保持 Fc 功能的同时实现位点特异性有效载荷连接的策略。Xue 等人构建了 JSKN003，这是一种双特异性 HER2 靶向 ADC，它利用 N-糖基化工程化偶联保持了双触角糖基结构的完整性。与硫醇-马来酰亚胺结构相比，这种设计使结构更具亲水性，不易聚集，且更稳定。此外，它还实现了高度的结构均一性，并在曲妥珠单抗耐药表型中仍然有效。这些策略展示了抗体结构如何影响现代抗体偶联药物（ADC）设计中的耐药性调节、制剂稳定性和药理学可预测性。这些技术通过减少随机偶联方法导致的不稳定性及异质性，确保了稳定的药代动力学特性。 单克隆抗体降解机制及分析工具 表3（参见原文）列出了影响抗体偶联药物（ADC）单克隆抗体组分的主要不稳定途径。根据已报道的数据，热扰动和疏水表面暴露是构象和胶体不稳定的常见原因，而精氨酸盐、蔗糖和优化的组氨酸缓冲可以显著降低这些不稳定因素。化学变化在ADC异质性中仍然发挥着重要作用，pH值和温度对脱酰胺和Asp异构化有显著影响，这些反应在互补决定区（CDR）和铰链区尤为常见。抗氧化剂和耐光初级包装可以减缓色氨酸和蛋氨酸残基的氧化。由于Met252和Met428是这些残基之一，因此ADC的稳定性取决于它们。抗体偶联会改变分子的疏水性、三级结构和分子电荷分布。如果这些变化控制不当，可能会加速聚集或降解。为了评估偶联后的稳定性并确保质量属性的均一性，采用成像毛细管等电聚焦（icIEF）和高分辨率质谱（MS）等先进分析技术进行电荷异构体分析变得至关重要。 构象不稳定性最好通过直接报告展开转变的工具来支持，例如差示扫描量热法 (DSC) 或升温荧光法 (DSF)，因为这些检测方法可以量化热稳定性的变化，而这种变化通常先于储存或工艺应力下的聚集发生。当主要机制是由蛋白质-蛋白质相互作用或低溶解度驱动的胶体不稳定性时，动态光散射(DLS) 衍生的相互作用指标和粘度测量可以提供与缓解策略（离子强度调节、精氨酸盐酸盐或表面活性剂）的直接机制联系，因为这些方法量化的是相互作用倾向，而不仅仅是聚集体形成的终点。 聚集现象需要进行粒径分辨分析，而尺寸排阻色谱 (SEC) 仍然是核心的稳定性指示方法，因为它能够定量地将单体与可溶性高分子量物质和片段分离。由于界面驱动的损伤会产生 SEC 无法完全捕获的颗粒群，因此需要采用亚可见颗粒方法（例如，流动成像显微镜和光遮蔽法）来验证表面活性剂、减少搅拌或优化操作条件是否能够以符合所提出的机制的方式抑制颗粒的形成。界面等电聚焦电泳 (icIEF) 和离子交换色谱 (IEX) 能够最直接地捕捉制剂应力下的电荷异质性和漂移，因为这些方法可以分辨通常由脱酰胺、异构化、氧化或 C 端赖氨酸加工引起的电荷异构体分布的变化。 对于脱酰胺、Asp异构化和氧化等化学修饰，肽图谱LC-MS能够提供最清晰的关联，因为它可以定位并定量位点特异性变化，这在缓解策略依赖于缩小pH窗口、减少光照或改变顶空氧气时至关重要。多属性LC-MS方法扩展了这一能力，能够在单个工作流程中对多个位点特异性属性进行靶向定量，同时还支持在稳定性研究中检测新峰。实际上，当SEC与正交的基于尺寸的方法（例如CE-SDS）联用时，碎片化和铰链区裂解的证据最为充分，因为方法的结合降低了将色谱伪影过度解释为真实碎片化的可能性。最后，疏水性驱动的相互作用和 DAR 诱导的不稳定性最好与能够解析药物负载和疏水性分布的检测方法联系起来，HIC 和 RP-LC 通常用于跟踪药物负载物种的变化，这些变化与浓度缩放或压力期间的聚集风险一致。 这些改进表明，偶联化学和抗体设计是影响抗体偶联药物（ADC）制剂质量的同一过程的两个组成部分，而非独立过程。总而言之，这些机制凸显了抗体的结构完整性对于维持ADC稳定性至关重要。 连接子 连接子是连接抗体和有效载荷的分子铰链（图2）。它控制着药物的释放速度和稳定性。为了发挥细胞毒性，连接子必须能够在靶细胞内迅速裂解，同时在全身循环中保持完整。组织蛋白酶B可以酶促裂解传统的连接子，例如缬氨酸-瓜氨酸和缬氨酸-丙氨酸，这些连接子目前被视为基于单甲基澳瑞他汀E (MMAE) 的抗体偶联药物(ADC)的标准连接子。另一方面，不可裂解的连接子依赖于抗体的完全溶酶体降解，从而释放出具有改变药理学特性的稳定药物-氨基酸偶联物。 图 2. 目前 FDA 批准的抗体-药物偶联物中使用的连接子化学分类：（A）可裂解连接子和（B）不可裂解连接子。mAb，单克隆抗体；MC，马来酰亚胺己酰基；GGFG，甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸；PEG，聚乙二醇；Val，缬氨酸；Ala，丙氨酸；PABC，对氨基苄氧羰基；Cit，瓜氨酸；sulfo-SPDB，磺化 N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯；SPDB，N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯；CL2A，碳酸酯连接子 2A；MCC，马来酰亚胺甲基环己烷羧酸酯。 对连接子的化学修饰有助于改善药代动力学并降低脱靶毒性。Watanabe及其同事构建了具有亲水基序的外切可裂解连接子，使抗体偶联药物（ADC）在血浆中更稳定，且不易聚集。比较外切连接子和基于依沙替康的ADC中的连接子发现，亲水性可降低非特异性摄取并提高药物抗体比（DAR）的均匀性。类似地，Su和Zhang也展示了空间位阻和连接子中二硫键的位置如何改变有效载荷释放的动力学和稳定性。 能够响应刺激或诊断的多功能系统为连接子设计开辟了新的途径。为了开发诊疗一体化抗体偶联药物（ADC），Xiao及其同事将荧光探针整合到肽连接子中，实现了细胞毒性和体内成像的同步进行。诸如Linker-GPT之类的计算方法利用人工智能来构建在亲水性、反应性和合成可行性方面表现最佳的新型连接子结构，进一步拓展了这一领域的研究。这些进展表明，数据驱动的制剂设计（其中连接子化学性质根据分子功能和可生产性进行定制）已使药物开发摆脱了经验选择。 某些化学和生物过程决定了连接子-有效载荷的反应活性，而制剂条件则显著影响其动力学。在储存或循环过程中，这些动力学决定了有效载荷是通过非靶向途径过早释放，还是主要在靶向介导的内化后释放。因此，连接子-有效载荷连接处的水解、交换、还原和氧化降解活性的制剂依赖性控制以及连接子的固有设计都会影响非靶向有效载荷的释放。 对于可裂解连接子（图 2A），制剂条件直接影响导致有效载荷释放的化学过程速率。酸不稳定连接子（例如gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®) 中的腙连接子）的裂解是通过质子催化水解发生的。水分活度、缓冲液组成和缓冲容量是决定水解是在储存早期还是在酸性细胞内区室中发生的关键因素，因为反应速率随 pH 值降低而增加。因此，pH 值控制不佳或水分含量过高会促进水解，导致有效载荷过早释放。 蛋白酶可切割肽连接子的切割动力学，例如用于brentuximab vedotin（Adcetris®）和polatuzumab vedotin （Polivy®）的缬氨酸-柠檬酸连接子，取决于肽键的可及性和分子流动性。尽管这些连接子旨在溶酶体中快速酶促切割，但提高分子柔性的制剂条件，例如更高的水分含量、液体制剂或更高的温度，会降低肽键水解的动力学障碍。在这些情况下，由于储存或循环过程中可能发生意外切割，脱靶效应的风险可能会增加。 有效载荷从可还原的二硫键连接体中释放是通过具有氧化还原敏感动力学的硫醇-二硫键交换过程实现的。由于氧化还原条件控制不当，痕量硫醇、赋形剂污染物和缓冲液成分均会改变交换速率，从而导致靶细胞外发生还原反应。无论抗原是否结合，加速还原均可实现全身暴露和早期有效载荷释放。 不可裂解的连接子（图 2B），例如 trastuzumab emtansine（Kadcyla®）中的硫醚连接子，并不依赖于程序性裂解来释放有效载荷。相反，脱靶释放是由制剂驱动的较慢的化学分解过程造成的。主要机制是氧化应激，当表面活性剂降解过程中产生的过氧化物改变连接子-有效载荷连接处或邻近的氨基酸残基时，就会发生氧化应激。尽管比酶促或水解裂解慢，但这些在储存期内累积的动力学过程可能会改变药物与抗体的比例分布，并增加循环中游离有效载荷的量，最终可能导致脱靶暴露。 图 2所示的连接子类别均遵循一个基本原理：非靶向有效载荷的释放取决于制剂相关的反应动力学，而该动力学又基于多种化学机制。因此，控制 pH 值、水分含量、缓冲液组成、氧化还原环境和赋形剂稳定性对于确保有效载荷的释放与所需的生物触发机制而非意外的化学途径相关联至关重要。 连接子降解机制和分析工具 表4（参见原文）列出了可裂解和不可裂解连接子特有的不稳定性机制。马来酰亚胺脱偶联是目前研究最为透彻的过程之一，直接证据表明，水解的马来酰亚胺或工程化的偶联位点可显著降低与血清白蛋白的硫醇交换。谷胱甘肽或蛋白酶的过早裂解是另一个主要的临床问题。通过改变连接子的疏水性、空间位阻或自裂解间隔基，可以在保持细胞毒性释放效率的同时显著提高稳定性。强制稳定性研究表明，减少氧气暴露或添加抗氧化赋形剂可以防止连接子组分的氧化降解。连接子组分可以控制抗体偶联药物的整体物理化学行为，包括其溶解度和相互粘附的倾向。 连接子的缺陷通常表现为物种重新分布，而非简单的效力损失，因此分析方法必须侧重于直接测量偶联状态和偶联物种完整性变化的检测方法。对于马来酰亚胺水解和逆迈克尔交换，最直接的证据是偶联物种分布的保持和交换相关转移反应的抑制，因此，通常使用正交液相色谱-质谱联用（LC-MS）和药物载量分布分析来评估以稳定性为导向的马来酰亚胺设计，这些方法可以检测偶联状态的微小但系统性的变化。由于这些机制通常表现为DAR漂移和疏水性分布改变，疏水相互作用色谱（HIC）和反相液相色谱（RP-LC）提供了实用的稳定性指示读数，将“交换抑制”与可测量的保留时间和峰型联系起来，从而与稳定的药物载量相一致。 对蛋白酶敏感或酸不稳定的连接子过早裂解需要采用能够同时检测偶联物数量变化和释放的有效载荷出现的分析方法，因为裂解可能发生在单体未立即被SEC分解的情况下。因此，最符合机制的证据包括对相关基质中未结合的有效载荷和分解代谢物进行LC-MS/MS分析，并结合完整或亚基LC-MS分析，以确认连接子相关的质量变化是否与有效载荷的释放同步发生。连接子部分的氧化同样最好通过化学鉴定方法来支持，因为氧化可能在后期才会显著改变尺寸分布，而肽图谱LC-MS或MAM类工作流程可以直接读取氧化特征，从而可以在稳定性研究中对其进行定位和趋势分析。 当连接子-有效载荷区域增加疏水性并促进自缔合时，需要使用尺寸排阻色谱法（SEC）来定量可溶性聚集体，但胶体分析通过显示亲水性间隔基或聚乙二醇化是否在聚集体出现之前减少吸引相互作用，从而加强了机制联系。在空间位阻和连接子长度影响工艺结果的情况下，与制剂相关的分析联系通常是间接的，应侧重于设计改变是否降低了偶联物群体的异质性，并在压力下产生更稳定的物种分布，这可以通过药物载量分离色谱和基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的表征来确认，而不是依赖单一终点分析。 原文：L.Torres-Dias, E.Moore, S.Shukla, et al., Formulation Matters: The Overlooked Engine of Stability and Success in Antibody–Drug Conjugates. Pharmaceuticals, 2026.