Dasabuvir Sodium Hydrate

内容介绍 本书归纳和综述了新药的化学合成路线。覆盖范围为近5年美国FDA批准上市的新分子实体药共109个。针对每一个药物，本书给出了药物简介，药物化学结构信息，产品上市信息，药品专利保护和市场独占权保护信息，化学全合成路线和参考文献等。这些合成路线大多是目前制药工业中正在使用的化学合成工艺，有较高的实用性和学术价值。对参与反应的起始原料、中间体、反应产物都给出了详细的化学结构。每一步化学合成反应都给出了重要的化学试剂、催化剂、所使用的溶剂、合成反应条件及文献出处等。本书的特点是：作者从浩如烟海的科技文献中，精心挑选出最新、最有实用价值的合成方法，汇编成化学合成路线图，内容简洁，深入浅出，逻辑性强，容易理解，以最少的篇幅表达最多的技术信息，可帮助读者很快找到他们需要的药物合成方法及最可靠的原始科学论文。  读者对象：  1.任何从事与化学合成、药物合成、精细化工相关专业的科研人员、企业管理人员。 2.有机化学专业、药学专业、生物制药专业等大专院校的高年级学生、研究生、教师及科研人员。 3.从事客户委托的药物原料与药物中间体合成的科研人员、企业管理人员。 编辑推荐 对于制药企业而言,一个好的药物全合成路线, 可以大大缩短生产周期,简化生产工艺,降低生产成本,节约能源,减少或消除对环境的化学污染与排放。本书为了顺应我国近年来生物制药及医药工业飞速发展的潮流编写的，详细介绍了近五年美国FDA批准上市的所有（109个）新分子实体药的化学全合成路线。这些全合成路线多数是国外制药厂目前正在使用的工艺，其经济效益及社会效益都是极为显著，因此本书既有较高的科学价值又有很大的实用性。 作者简介 陈清奇，旅美药学家和化学家，担任美国MedKoo生物医药科研公司总裁，同时兼任美国数家生物制药公司的技术顾问，中国国内数个大学的客座教授。研究领域为药物化学，纳米医学体外诊断技术。 书籍目录        Abiraterone Acetate（醋酸阿比特龙）001        Aclidinium Bromide（阿克利溴铵）006        Afatinib（阿法替尼）009        Alcaftadine（阿卡他定）014        Alogliptin（阿格列汀）017        Apixaban（阿哌沙班）022        Apremilast（阿普斯特）028        Avanafil（阿伐那非）033        Axitinib（阿西替尼）038        Azilsartan Kamedoxomil（阿齐沙坦酯钾盐）044        Bazedoxifene（巴多昔芬）048        Bedaquiline（贝达喹啉）053        Belinostat（贝利司他）060        Boceprevir（波西普韦）064        Bosutinib（博舒替尼）071        Cabozantinib（卡博替尼）075        Canagliflozin（卡格列净）078        Carfilzomib（卡非佐米）083        Ceftaroline Fosamil（头孢洛林酯）087        Ceftolozane（噻呋特啰嗪）094        Ceritinib（色瑞替尼）098        Clobazam（氯巴占）101        Cobicistat（可比司他）104        Crizotinib（克里唑蒂尼）112        Dabigatran Etexilate Mesylate（甲磺酸达比加群酯）118        Dabrafenib（达拉菲尼）123        Dapagliflozin（达格列净）127        Dasabuvir（达沙布韦）132        Deferiprone（去铁酮）136        Dienogest（地诺孕素）138        Dolutegravir（度鲁特韦）141        Droxidopa（屈昔多巴）145        Efinaconazole（艾氟康唑）149        Eliglustat（依利格鲁司特）152        Elvitegravir（埃替格韦）155        Empagliflozin（依帕列净）161        Enzalutamide（恩杂鲁胺）166        Eribulin Mesylate（甲磺酸艾日布林）168        Eslicarbazepine Acetate（艾利西平醋酸酯）175        Estradiol Valerate（雌二醇戊酸酯）180        Ezogabine（依佐加滨）185        Finafloxacin（非那沙星）193        Fingolimod Hydrochloride（盐酸芬戈莫德）197        Florbetapir F 18（氟比他匹）205        Flutemetamol F 18（富特米他）211        Gabapentin Enacarbil（加巴喷丁恩那卡比）214        Gadobutrol（钆布醇）218        Gadoterate Meglumine（钆特酸葡甲胺）224        Ibrutinib（依鲁替尼）227        Icatibant（艾替班特）232        Idelalisib（艾代拉里斯）234        Indacaterol （茚达特罗）236        Ingenol Mebutate（巨大戟醇甲基丁烯酸酯）240        Ioflupane 123I（碘[123I]氟潘）242        Ivacaftor（依瓦卡特）247        Ledipasvir（雷迪帕韦）250        Linaclotide（利那洛肽）259        Linagliptin（利拉利汀）261        Lomitapide（洛美他派）267        Lorcaserin（氯卡色林）270        Lucinactant（芦西纳坦）274        Luliconazole（卢立康唑）276        Lurasidone（鲁拉西酮）279        Macitentan（马西替坦）283        Miltefosine（米替福新）286        Mipomersen Sodium（米泊美生钠）290        Mirabegron（米拉贝隆）292        Naloxegol（纳罗克格）296        Netupitant（奈妥吡坦）299        Nintedanib（尼达尼布）303        Olaparib（奥拉帕尼）307        Olodaterol（奥达特罗）311        Omacetaxine Mepesuccinate（高三尖杉酯碱）315        Ombitasvir（艾姆伯韦）319        Ospemifene（奥培米芬）323        Paritaprevir（帕瑞它韦）327        Pasireotide（帕瑞肽）331        Peramivir（帕拉米韦）333        Perampanel（吡仑帕奈）337        Pirfenidone（吡非尼酮）343        Pomalidomide（泊马度胺）345        Ponatinib（泊那替尼）351        Regorafenib（瑞戈非尼）355        Rilpivirine（利匹韦林）357        Riociguat（利奥西呱）366        Rivaroxaban（利伐沙班）370        Roflumilast（罗氟司特）378        Ruxolitinib（鲁索替尼）384        Simeprevir（司美匹韦）388        Sofosbuvir（索非布韦）396        Suvorexant（苏沃雷生）401        Tafluprost（他氟前列腺素）405        Tasimelteon（他司美琼）409        Tavaborole（它瓦波罗）413        Tedizolid Phosphate（磷酸特地唑胺）415        Telaprevir（替拉瑞韦）418        Teriflunomide（特立氟胺）426        Ticagrelor（替格瑞洛）430        Tofacitinib（托法替尼）438        Trametinib（曲美替尼）443        Umeclidinium（芜地溴铵）447        Vandetanib（凡德他尼）450        Vemurafenib（威罗菲尼）456        Vilanterol（维兰特罗）460        Vilazodone Hydrochloride（盐酸维拉佐酮）463        Vismodegib（维莫德吉）468        Vorapaxar（沃拉帕沙）470        Vortioxetine（沃替西汀）473        附录1本书使用的期刊名称缩写表477        附录2专利文献代码481        附录3美国药品专利中的用途代码定义484        附录4美国药品市场独占权代码定义530        附录5美国FDA于2010—2014批准上市的药物名单563        英文索引607        中文索引611        CAS登记号索引613 下载方式 现在，这份资料分享给大家。小编在公众号设置了自动回复功能，在公众号后台回复关键词：新药全合成 ●书籍分享||有机氧化反应原理与应用 ●书籍分享||有机卤化反应原理及应用 ●推荐合成书籍【有机缩合反应原理与应用】 ●推荐合成书籍【有机环合反应原理与应用】 ●书籍分享||有机还原反应原理与应用 ●ChemDraw使用让你从化学菜鸟变成老鸟 ●干货分享||有机合成: 策略与控制 ●干货分享||有机合成工艺研发-副反应抑制法 ●基础有机化学(邢其毅)第3、4版教材+习题解析 ●ChemDrawV20最新版详细安装图文教程 ●干货分享||核磁共振二维谱 ●书籍分享||全合成中的经典:更多的目标、战略和方法 ●书籍分享||实用药物化学 ●书籍分享||基于模仿创新的小分子药物发明 ●书籍分享||制药工艺开发-目前的化学与工程挑战 ●书籍分享||手性合成:不对称反应及其应用(第5版) ●书籍分享||新药研发案例研究--明星药物如何从实验室走向市场 ●书籍分享||英汉·汉英化学化工词汇 ●书籍分享||有机化学结构与功能（第四版） ●书籍分享||过渡金属有机化学(原著第6版） ●重磅书籍分享||不对称催化基础 ●书籍分享||药物设计学-唐赟

摘要：人诺如病毒（HuNoVs）是引起急性胃肠炎的主要病原体，每年导致巨大的经济损失。由于缺乏合适的培养系统，HuNoVs的致病机制以及疫苗和药物的研发进展缓慢。尽管研究人员在上个世纪采用了多种方法在体外培养HuNoVs，但后代病毒的不可还原性、低病毒滴度和非传染性等问题不容忽视。2016年，研究人员利用人肠道类器官成功培养并连续传代了一些HuNoV基因型，初步展示了类器官在克服这一挑战中的潜力。本文回顾了过去20年在体外培养HuNoVs方面的努力，并讨论了使用人肠道类器官/类器官作为HuNoVs体外培养模型的优势和局限性。 1.引言 诺如病毒（NoVs）属于杯状病毒科诺如病毒属。病毒颗粒具有二十面体对称结构，T=3，直径约为25-40纳米，由90个VP1衣壳蛋白二聚体和少量VP2复合体组成，无包膜（图1A）。病毒基因组为正义单链RNA，长度约为7.7-8.3 kb，5'端与病毒编码的蛋白VPg结合，3'端聚腺苷酸化。根据遗传特征，NoVs可分为10个基因群和49个基因型，其中与人类感染相关的五种株（称为人诺如病毒，HuNoVs）为GI、GII、GIV、GVIII和GIX（图1B）。GII.4以其快速突变率而闻名，与全球50%的诺如病毒爆发相关，自1990年代以来，这一基因型株已引起六次大流行。2014年冬季，逃避人群免疫的GII.17株在亚洲出现，在中国和日本引起广泛爆发，并在某些地区取代了GII.4。近年来，非GII.4病毒如GII.2和GII.3也在几个国家引起大型爆发。 图1. 诺如病毒的形态特征、宿主范围和基因组特征：（A）透射电子显微镜下HuNoV GII.4 VLP的形态，显示直径约40纳米的正二十面体结构；（B）诺如病毒的宿主范围；（C）HuNoVs的基因组组织。HuNoVs的RNA基因组可以分为三个开放阅读框（ORFs），这些开放阅读框编码六个非结构蛋白的前体、主要结构蛋白VP1和次要结构蛋白V。 HuNoVs主要通过粪-口途径传播，具有高传播能力（最小感染剂量少于100个病毒颗粒），传播范围广（可通过人类、食物、水源等传播），存活时间长（可在物体表面存活2周，在环境中存活9周）。据估计，HuNoVs每年在全球引起近7亿病例和超过20万人死亡。HuNoVs感染所有年龄段的人群，感染者通常在12-24小时内出现恶心、水样非血性腹泻、腹痛、发热和不适；在这些病例中，HuNoVs在粪便（每克粪便10^5-10^11病毒拷贝）和呕吐物（每毫升呕吐物10^3-10^6病毒拷贝）中大量排出。尽管免疫能力正常的人通常在2-3天内从感染中恢复，但反复感染和新株的增加对健康不利。对于老年人和幼儿，HuNoVs感染可能有严重后果，如胃肠炎甚至死亡。对于免疫受损的人或实体器官移植（SOT）受者，可能会发生慢性HuNoVs感染，病毒脱落持续数周至数年。尽管HuNoVs在全球，特别是在发展中国家引起了严重的健康问题和社会经济负担，但由于对病毒致病机制了解不完全，目前尚无药物获批用于治疗HuNoVs。此外，已有四种针对几种HuNoVs的疫苗候选物在临床试验中进行了测试，但这些疫苗目前尚未获得许可。 胡诺病毒（HuNoV）的基因组（图1C）由三个开放阅读框（ORFs）和两端的非翻译区（UTRs）组成。ORF1大约有5kb大小，编码一个大约200千道尔顿（kDa）的前体多蛋白，该多蛋白可以被病毒编码的蛋白酶NS6水解成六个非结构蛋白（从N端到C端：p48、NTPase、p22、VPg、蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP））。ORF2和ORF3是从亚基因组RNA翻译而来。ORF2大约有1.8kb大小，编码主要的衣壳蛋白VP1。VP1的每个单体包含一个壳（S）域和一个突出（P）域。S域高度疏水，围绕病毒RNA形成二十面体壳，通过大约10个残基长度的柔性铰链与P域相连。P结构域可以细分为两个子域，P1和P2，P1子域由一个α螺旋和八个β-折叠组成，连接S结构域和P2子域。P2位于VP1的最外层，由六个从P1延伸出的反平行β-折叠组成。它是中和抗体的靶标，含有与碳水化合物和造血组织抗原相互作用的中和表位；此外，它在免疫选择压力下进化。同时，P2是决定病毒抗原性的区域，包含小鼠诺如病毒（MNV）的确定性受体结合位点和胡诺病毒（HuNoVs）的假定受体结合位点。ORF3大约有0.6kb大小，编码次要结构蛋白VP2，它位于病毒颗粒内部，通过与VP1衣壳结构域的相互作用与病毒颗粒的内表面结合；它也被认为参与衣壳聚集。 自从胡诺病毒被发现以来，科学家们一直在探索体外培养。尽管许多研究筛选了各种胡诺病毒敏感的细胞系，但尚未发现稳定的胡诺病毒体外复制系统。同时，株特异性和肠道生理学的差异导致了缺乏合适的模型来展示胡诺病毒如何感染动物。因此，很难解决胡诺病毒感染的机制、它们与宿主的相互作用、抗病毒药物的筛选和疫苗的开发。在本文中，我们回顾了胡诺病毒的四种主要体外培养系统（图2），并专注于肠类器官/类器官培养技术的有效性。 图2. 胡诺病毒（HuNoVs）的四种体外培养方法。其中，肠上皮细胞只能实现胡诺病毒样颗粒（VLPs）的附着和内化，而三维培养的肠上皮细胞尚未显示出能够培养胡诺病毒GI.1和GII.4的能力。2.胡诺病毒的体外培养2.1.胡诺病毒在肠上皮细胞系中的培养 肠上皮细胞是胡诺病毒从粘膜表面侵入内部时首先遇到的细胞类型。在阳性患者的近端小肠活检中观察到了绒毛缩短、粘膜炎症以及微绒毛缩短的肠上皮细胞空泡化等病理特征。此外，对一名患有急性胡诺病毒GII.4悉尼株腹泻的儿童肠移植患者的不同肠段活检组织进行了分析，发现人类诺如病毒靶向肠内分泌细胞（EECs），这些是具有感觉和内分泌功能的特化上皮细胞。这些迹象表明肠上皮细胞与胡诺病毒感染过程密切相关，因此研究人员最初尝试在肠上皮细胞中培养胡诺病毒。 利用含有诺罗病毒VP1 cDNA的杆状病毒重组体感染昆虫细胞可以产生类似病毒颗粒（VLPs），这些颗粒在形态和抗原性上与诺罗病毒相似；这些颗粒在实验动物接种后也被发现能够获得高水平的特异性血清抗体。White等人特别将放射性标记的重组诺罗病毒样颗粒（rNV VLPs）与13种不同的细胞系结合，并发现分化的人类结肠癌细胞（Caco-2）结合了最多的rNV VLPs，明显多于未分化的Caco-2细胞和其他细胞；此外，观察到rNV VLPs的内化。进一步的研究表明，分化的Caco-2细胞具有微绒毛结构，并表达H型1抗原，这与人群中HuNoV感染密切相关。Marionneau等人也观察到分化的Caco-2细胞表达H型1结构后rNV VLPs的结合和内化。同时，人类胃十二指肠结合部组织切片的接种实验显示rNV VLPs优先结合分泌型个体十二指肠和十二指肠上皮细胞的顶端表面以及十二指肠绒毛水平；这表明微绒毛的结构可能增加了病毒结合的面积，并促进了病毒的吸附和内化。 尽管使用rNV VLPs实现了进入Caco-2细胞的内化，但结合的rNV VLPs的内化水平较低（1.4%至6.8%）。同时，当Duizer等人尝试将HuNoVs接种到包括Caco-2在内的八种人类肠道上皮细胞系时，他发现它们中没有一个实现了基因拷贝的显著增加或新感染性病毒的产生。 2.2.在抗原呈递细胞中培养HuNoVs 抗原呈递细胞（APCs）是一群摄取和处理抗原并将它们呈递给T细胞的免疫细胞，包括巨噬细胞（MΦ）、树突状细胞（DCs）和B细胞。Wobus等人在2003年发现了第一种MNV菌株，随后发现MNV能通过口服感染STAT1−/−小鼠高效复制在DCs和MΦ中；因此，他们建立了第一个诺瓦克病毒的细胞培养系统，并首次证明诺瓦克病毒普遍无致病性。尽管小鼠不能被HuNoVs感染，但通过低剂量注射HuNoV VLPs可以刺激体内IgG和IgA介导的适应性反应；因此，推测HuNoVs在宿主感染后也产生细胞适应性免疫反应。Ponterio等人在重组杆状病毒表达系统中克隆并表达了HuNoV GII.4株的ORF2基因，制备了rNV VLPs，并测试了体外刺激的人外周血单核细胞（PBMCs）诱导的免疫反应，发现rNV VLPs能够诱导APCs的激活和成熟。此外，从免疫抑制移植患者分离的小肠切片证明了HuNoVs的可宿性；在DCs、MΦ、上皮内淋巴细胞、T细胞和肠上皮细胞中发现了病毒结构/非结构蛋白的表达。然而，当HuNoVs与来自易感个体的单核细胞亚群衍生的DCs和MΦ以及来自PBMCs的CD11c+ DCs一起体外培养时，发现一些来自PBMCs的DCs能够表达病毒VP1和VPg蛋白，但并非所有细胞中的病毒RNA拷贝数都增加；这表明这些细胞不满足HuNoVs体外高效复制的条件，并且之前检测到的抗原可能是被免疫细胞吞噬的感染肠上皮细胞。 尽管在血液衍生的DCs和MΦ中培养HuNoVs的尝试未成功，与此同时，研究人员发现野生型小鼠感染MNV-1增加了脾脏中特定B细胞标记物的数量和表达。因此，假设B细胞也可能对诺罗病毒敏感，并开始研究与HuNoVs培养的人类B细胞。2011年，Bok的对黑猩猩进行HuNoVs接种显示，血清抗体反应和粪便病毒持续时间与人类中发现的相似，十二指肠B细胞中发现了病毒衣壳蛋白；这表明B细胞可能对HuNoVs敏感。2014年，Jones等人成功地将HuNoVs GII.4悉尼株、MNV-1和MNV-3接种到伯基特淋巴瘤B细胞系（BJAB细胞系）中，并实现了病毒拷贝数的增加和结构/非结构蛋白的产生，通过传代实验进一步证明了新感染性病毒颗粒的产生。值得注意的是，团队强调了实验成功需要考虑的多个因素；接种物必须是未过滤的病毒阳性粪便上清液，因为肠道微生物的存在是HuNoV GII.4悉尼感染的重要辅助因子。随后的研究发现，肠道菌群成员克雷伯氏菌属（Enterobacter cloacae）表达人类组织血型抗原（HBGAs），被认为是人类HuNoVs的受体。此外，涉及的B细胞类型（可以在BJAB和Raji细胞中复制，但不能在Namalwa和HuNS1细胞系中复制）、它们的状态和密度也会影响感染效率，还有培养基中胎牛血清的来源。尽管这种体外培养系统最初取得了成功，但以下问题仍然存在。可以培养的HuNoV株较少（GII.4和GII.6）；病毒的复制效率低（0.1–0.5 Log10），远未达到体内病毒复制的水平；不同实验室复制的复制效率差异很大；随着病毒起始接种物的增加，病毒的复制效率降低。因此，这种培养系统只能适度增加HuNoV基因组拷贝数，不太可能产生体内观察到的病毒复制水平。 HuNoVs可以感染免疫缺陷患者，并在肠道上皮中高效复制，而组织切片中未检测到CD20+ B细胞。发现缺乏B细胞的患者病毒滴度比有B细胞的患者低约一个对数。在小鼠中的研究发现HuNoVs的VP2特别抑制B细胞对CD8+ T细胞的抗原呈递，这对于控制急性HuNoV感染至关重要。此外，感染HuNoVs的人类B细胞不会失去细胞活力，这与感染MNV后巨噬细胞和树突状细胞的溶解形成对比。总之，B细胞在HuNoV感染中扮演着重要角色，并有助于病毒负荷。可能的跨细胞运输发生在病毒通过肠道上皮进入先天或适应性免疫细胞时。同时，HuNoVs在体内的复制可能涉及多种细胞，并在特定环境中进行，这就是为什么很难使用单一的二维（2-D）细胞系来实现HuNoVs体外高效培养的原因。 2.3.在3D细胞团中培养HuNoVs 几十年来，HuNoVs的2D单层细胞培养系统以失败或效率低下告终，表明传统培养不能用于有效的感染和复制。在感染病毒的活体动物中，细胞在三维（3D）环境中协同工作，这种空间环境可能对病毒感染至关重要，甚至对其他传染病原也是如此。此外，传统的2D单层缺乏体内组织的极性和某些结构特征，例如紧密连接、粘液、微绒毛和粘液，这些已被证明在病毒感染、复制和递送过程中发挥重要作用；这使得准确和全面地模拟病毒-宿主相互作用变得具有挑战性。 1998年，美国国家航空航天局（NASA）报告了旋转壁式生物反应器（RWV）的使用，该反应器模拟微重力、低流体剪切环境，允许在其中培养的细胞形成极化和3D团块形式；这使得有效地再现天然组织的构造并模拟人类微环境。自其引入以来，研究人员已使用该反应器培养来自众多器官（淋巴、肺、肾、胃、肠、阴道等）的细胞团，并深入研究了涉及的病毒的发病机制。特别是，当两种3D猴肾上皮细胞（VERO）和3D牛肾上皮细胞（MDBK）的团块被两种RNA病毒（水泡性口炎病毒和牛副流感病毒）和两种DNA病毒（疱疹病毒1型和牛腺病毒）感染时，发现细胞团比单层细胞更能抵抗病毒；此外，一旦团块成功感染，就会产生更具传染性的病毒。这在其他细胞团中得到了进一步证实，证明了使用3D团块模拟真实体内环境的优越性。 为了创建一个更接近生物体的感染环境，Straub等人应用了旋转壁式生物反应器（RWV）技术，并成功地在3D聚集的人胚小肠上皮细胞（INT 407）中培养了两种株系（GI.1和GII.4）的人类诺罗病毒（HuNoVs），并进行了多次传代。感染HuNoVs一天后，细胞团表现出空泡化和微绒毛缩短，从Cytodex珠上脱落；它们还显示出细胞病理效应（CPEs），细胞形态变得细长或扭曲。病毒颗粒主要在组织团中积累。随后，该团队在3D聚集的Caco-2中培养了两种HuNoVs株系，GI.1和GII.4，这些在感染的聚集体中显示出2-3 Log10的病毒RNA拷贝数，并通过免疫电子显微镜定位感染细胞。然而，其他实验室在使用相同的方法培养INT 407或Caco-2细胞的3D聚集体后，没有观察到病毒复制的迹象；但观察到了细胞分化和顶端绒毛的形成。Herbst等人使用共聚焦显微镜没有观察到病毒VP1和VPg，免疫荧光也没有在INT 407细胞中检测到HBGAs。这表明之前观察到的CPEs很可能是由样本被细胞毒素分子污染引起的，如脂多糖（LPS）和细菌内毒素，而不是病毒感染。 2.4.在HIE/HIO中培养HuNoVs 肠类器官和类器官是指通过在体外模拟3D环境中的培养基中添加各种对干细胞维持至关重要的因素（R-spondin 1、Noggin、表皮生长因子（EGF）、激活剂、抑制剂等），使成年干细胞（ASCs）、胚胎干细胞（ESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）生长和分化成具有组织学和遗传特征的器官。这项技术由Hans Clevers团队在2009年开创，当时小鼠Lgr51+肠干细胞成功地在体外非上皮生态位中培养成具有多种分化细胞类型（干细胞、Paneth细胞、肠细胞、杯状细胞和小肠内分泌细胞）的绒毛状肠上皮结构域，这些结构域能够长时间生长。从那时起，这项技术迅速发展，创造了肠、大脑、胃、肺、卵巢等许多类型的类器官。由于类器官能够模拟和反映不同环境中人体器官的状态，它们被用于许多领域，如致病微生物感染、药物开发和筛选、再生医学和精准医学。 人类肠道肠类器官（HIEs）由间充质和上皮层组成，包含肠道上皮的主要细胞类型，具有类似隐窝的增殖区。结合上皮单层细胞系的高通量和实验动物肠道的复杂性，HIEs已广泛用于人类肠道相关疾病的研究，并为各种病毒的体外培养提供了新的方向。 2012年，Mary K. Estes团队通过ESCs的定向分化获得了诱导性人类肠道类器官（HIOs），并成功地接种轮状病毒以产生感染性后代病毒。这是首次使用类器官进行微生物培养的报告。实验还揭示了轮状病毒能够感染间充质细胞群体，展示了类器官作为病毒培养系统的应用性和独特优势。四年后，该团队培养了空肠来源的单层HIEs，该系统有效地支持了不同亚型的HuNoVs的复制（96小时后，HuNoV基因组RNA增加了1.5-2.5 log10，35-45%的细胞被感染，透射电子显微镜下典型的病毒颗粒结构）和传代（连续四次传代显示病毒后代的产生）。研究人员发现，胆酸等添加剂使得GII.3和GII.17两种亚型能够复制，并促进了GII.4亚型的复制；同时，热或辐射处理有效地灭活了HuNoVs。这项研究代表了HuNoVs体外培养的重大突破，极大地推进了对HuNoVs的基础研究。实验结果已由不同国家的多个实验室成功验证，支持了多种基因型的HuNoVs的复制（GI.1、GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.12、GII.14和GII.17）。HuNoVs在HIEs中的复制在生物学上是相关的，因为GII.4株的复制仅限于来自分泌型个体的培养，而GII.3株的复制则来自分泌型和非分泌型个体；这与流行病学研究的结果一致。此外，未分化的HIE培养主要包含干细胞，但HuNoVs不在这这些细胞中复制，与感染的人类或动物隐窝中的干细胞中未检测到HuNoVs一致。与原组织培养不同，HIEs可以使用连续传代维持，并保存以备后用。2012年分离获得的人类空肠肠类器官在7年后仍可用于实验，表明HIE培养极其稳定。更重要的是，HuNoVs在HIEs中的复制反映了宿主易感性的流行病学差异，这取决于与供体分泌状态相关的HBGAs表达的遗传变异。然而，这种培养方法的缺点包括构建肠类器官耗时、维持培养的高成本、需要接种的HuNoVs数量多（最少1×10^5基因组等价物），以及产生的HuNoVs滴度低。此外，许多实验室不易获得活体人类组织，并且涉及伦理问题，因此需要优化这种培养系统。 2019年，Sato等人使用人类iPSCs构建了单层、极化的原肠上皮类器官，并成功地接种了HuNoVs（GII.3、GII.4、GII.6和GII.17）和VLPs。他们发现HIO中HuNoV GII.3和GII.17的复制不依赖于胆汁，这表明类器官和肠类器官（iPSCs或ASCs）之间的生物学差异可能导致对外部刺激的不同反应，其机制值得进一步研究。Mirabelli等人使用胎儿空肠组织构建了2D和3D HIEs，并用HuNoV GII.4接种，发现两种培养系统的病毒产量分别为1 log10和2.5 log10。与需要微量接种病毒的2D系统相比，3D HIEs可以自发地发生极性反转并直接感染病毒（不需要微注射）。此外，在接种病毒之前对3D HIEs预施用不同的药物可以显著促进（ruxolitinib，JAK1/2抑制剂）或抑制（聚合酶抑制剂2′-C-甲基胞苷）病毒的复制，表明3D HIEs是测试抗HuNoV药物的有前景的平台。 图3显示了不同发育阶段的胎儿牛肠类器官和肠类器官的自然形态。类器官和肠类器官的形态特征是动态的，它们都有独特的形态。表1比较了HIEs和HIOs的来源、特点和当前培养的HuNoV基因型。尽管HIOs比HIEs更容易获得，HIEs只能通过活检组织获得，但它们包含的间充质元素和胎儿表型可能对其使用有影响；此外，与HIEs不同，HIOs不能无限代保存。总之，HIOs和HIEs极大地促进了我们对HuNoV感染机制的理解。同时，使用HIEs研究了几种常见抗病毒小分子化合物对HuNoV的抗病毒效果（例如，Dasabuvir对GII.3的EC50为7.55-9.85 µM，对GII.4为11.71-12.41 µM，Nitazoxanide对GI.1、GII.3、GII.4和GII.17的EC50分别为27.4 µM、14.4 µM、12.9-53.9 µM和33.4 µM）。然而，迄今为止，这些HuNoV培养系统在连续感染传代（支持病毒复制至第四传代）中难以实现高病毒产量（病毒滴度增加30-1000倍），并且感染HuNoVs的HIE/HIOs没有显示出显著的CPEs。 图3. 不同发育阶段类器官和肠类器官的形态。发育中型类器官的形态。第3天（a）类器官呈现指状突起，第6天（b）类器官更短，类似绒毛，第9天（c）类器官呈圆形，有紧密排列的隐窝细胞，第20天（d）类器官呈球形；24小时（e）肠类器官具有清晰且紧凑的隐窝细胞，48小时（f）肠类器官呈现具有腔隙的圆形，72小时（g）肠类器官中细胞逐渐分散，144小时（h）出现大量排斥细胞和非典型隐窝细胞。 2.5.肠类器官/类器官培养系统的优越性和前景 表2展示了几种已报道用于培养人诺如病毒（HuNoVs）的体外培养系统的细节。其中，HIO/HIE培养在可重复性和效率方面显示出优势。在类器官技术发展之前，对致病微生物的研究主要基于两种培养系统：特定细胞系和动物模型。尽管细胞培养简单且成本低廉，但2D细胞层并未真实反映致病微生物侵入生物体的3D空间环境，缺乏组织或器官中各种细胞类型的相互作用和抗病毒反应。此外，细胞系通常来源于肿瘤组织或经历了特定突变，因此能够无限增殖，并不能准确代表健康组织。尽管动物模型可以反映致病微生物在生物体内的实际感染情况，但这一系统需要投入大量的时间和资源；对于绿猴和狒狒等特殊实验动物尤其如此，这些动物在大多数实验室中难以大量评估。当用于研究感染人类的微生物时，这些动物的内部环境与真实人体之间仍存在不可忽视的差异，限制了某些致病微生物的体外培养和发病机制的研究。 类器官模型介于细胞系和动物模型之间，可以通过ASCs、多能干细胞（PSCs）或iPSCs在体外大规模培养，以获得具有生态位的多类型细胞群，这些细胞群保持一定的特性和功能；它还能够重现部分生理功能，并促进稳定的自我更新。与单一细胞系相比，类器官的结构特性可以促进细胞类型之间的相互作用和细胞-基质连接，从而创造出不同区域的营养供应和氧浓度梯度。许多研究发现，多种病毒（如埃可病毒71型、星状病毒）诱导的HIE抗病毒途径或特定的干扰素（IFN）刺激基因（ISGs），在传统的单细胞系中并未发现，这表明实验室中长期使用的细胞系可能无法完全重现病毒感染所涉及的生理过程。与动物模型相比，人类衍生的类器官可以更真实地反映感染后的内部环境和生理过程，并可以缩短培养周期，实现动态追踪。因此，多种类器官模型已被用于研究病毒性传染病，包括乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒和寨卡病毒；这些模型还与单细胞RNA测序（scRNA-seq）、CRISPR/Cas9、蛋白质组学、转录组学和芯片技术相结合，以分析病毒致病机制、宿主受体和用于抗病毒化合物筛选。同时，由于类器官技术发展时间相对较短，仍有许多未解决的问题需要进一步探索和解决。首先，目前用于制备类器官的方法依赖于各种生长因子，但这些生长因子不足以复制真实器官发育过程中身体的精细和复杂的微环境。培养过程中产生的氧浓度有限和代谢废物数量增加可能导致类器官局部坏死；成熟的类器官直径通常为100-500微米，它们缺乏概括复杂人类疾病模型所需的血管结构和免疫组分。近年来，Bouffi等人建立了一个使用人源化免疫系统小鼠中功能性人类免疫组织的类器官模型，为免疫类器官的研究提供了新的方法。其次，为了增加HIE模型的复杂性并更接近体内条件，HIE细胞可以与间充质或血管细胞和肠道微生物组分共培养。其次，用作培养基的Matrigel蛋白混合物由BD Biosciences生产；这种培养基昂贵，主要成分包括由鼠肉瘤细胞分泌的胶原固定蛋白混合物。因此，值得分析这种外源性成分是否对类器官模仿真实器官和是否可以用作可靠的临床评估治疗手段。第三，尽管主要使用的生长因子是Wnt3a、R-Spondin和Noggin，但不同制造商生产的用于培养HIE的培养基的成分和比例是保密的；这对于HIE分化和HuNoV培养很重要。Ettayebi等人比较了先前描述的初代增殖培养基（BCMp）和分化培养基（BCMd）与Stem Cell Technologies生产的商业化人类类器官生长培养基IntestiCult™的使用。他们发现，在IntestiCult™中的HuNoVs株的复制率显著更高。第四，由于类器官培养过程中自动化水平低，人为诱导的系统误差的可能性高，调节不同类型类器官成熟形态和大小的行业标准尚未出现。这间接导致了类器官实验难以重复和一致。根据在美国进行的一项研究，测试单个HuNoV样本在HIE培养中的试剂成本约为36美元，从开始到量化的过程至少需要三周。然而，对类器官的探索仍在进行中，越来越复杂的培养系统将使类器官在有效体外模型中发挥更突出的作用，以模拟真实器官发育和感染。 3.结论 人诺如病毒（HuNoVs）每年都会施加经济负担并引起健康问题，因此改进现有的体外培养模型是更好地理解、预防和治疗病毒感染的必要条件。虽然B细胞和HIE/HIO培养系统有助于疫苗和药物的开发，但有限的病毒复制仍然限制了对HuNoVs的进一步研究。建立HuNoVs体外培养的最有效方法之一是识别HuNoVs的细胞受体，然后建立过表达受体的细胞系。然而，不幸的是，已经证明MNV的主要生理受体CD300lf不是HuNoVs的受体。关于使用HIE/HIO培养HuNoVs，可以通过诱导STAT1的敲低、特定抑制剂或特定病毒蛋白的过表达等方法优化培养系统来提高效率。这将抑制JAK-STAT途径，这是宿主先天免疫的主要参与者之一。同时，HuNoVs的研究，以及与其他学科如免疫学和RNAseq等新兴技术相结合，将增强我们对它们的理解，为未来预防和治疗HuNoVs提供机会。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。