Liraglutide (Hybio)

Continuous-Flow Solid-Phase Peptide Synthesis to Enable Rapid, Multigram Deliveries of Peptides https://doi.org/10.1021/acs.oprd.4c00165 本文来源于Merck的Kyle E. Ruhl团队,在June 14, 2024发表于Org. Process Res. Dev. 摘要 多肽可能通过将大分子和小分子的药理优势结合到每日一次的口服制剂中，从而彻底改变疾病治疗方式。几十年来，批次模式的固相多肽合成（SPPS）一直被用于多肽药物的发现与开发；然而，尽管技术有所进步，其诸多缺点仍然存在。本文描述了一种连续流动（CF）SPPS工作流程，用于优化和交付多克级的多肽片段，这些片段可轻松转化为大环或线性多肽原料药（API）。为了开发这一工作流程，我们基于最近公开的一种大环多肽PCSK9抑制剂，设计了一个包含10个氨基酸的多肽模型。与批次模式SPPS相比，CF-SPPS能够快速、数据丰富地优化多肽序列，同时大幅减少开发工作量、工艺执行时间和废物产生。为满足项目需求并交付多克级多肽，我们开发了一种液压控制的CF-SPPS原型，该原型利用小规模优化数据，实现向更大规模多肽交付的无缝过渡。 福利 | 连续流系列白皮书领取 扫码登记信息并留言“连续流白皮书系列”，即可获取由药石科技提供的下列技术资料（工作人员会通过登记的邮箱发送，请务必填写正确信息）： 《Techwhitepaper-flowchemsitry_diazotizationreaction》 《连续光催化技术的研究》 《连续流技术手册》 《药石科技2024年环境、社会及公司治理报告》 ...... 前言 多肽疗法在改善人类健康方面有着悠久的历史，胰岛素、利拉鲁肽和奥曲肽等注射药物是这一领域的里程碑式成就。与天然线性多肽相比，含有非经典氨基酸的大环多肽具有更强的蛋白酶抗性、更低的受体结合熵障，以及更优的口服药代动力学特性。默克公司(Merck & Co.)近期公开的MK-0616就是典型代表，这款大环多肽PCSK9抑制剂作为每日一次口服降脂药已进入临床试验。如figure1A所示，先导化合物1通过mRNA展示技术发现，后经自动化固相多肽合成(SPPS)优化得到第一代抑制剂2，最终通过引入非经典氨基酸和交联结构开发出MK-0616。 在药物发现阶段，SPPS是制备毫克至克级多肽的关键技术。当项目推进至临床前研究时，通常需要10克以上的原料药(API)用于药效学/药代动力学(PK/PD)研究、制剂开发和毒理评估。虽然自动化批次SPPS设备可用于初期库构建，但多数团队在放大生产时仍选择手动操作（如砂芯反应器），以便精确控制氨基酸当量、定制反应条件和实时监测偶联进程。以化合物2为例（figure1B），其结构-活性关系(SAR)研究路线直接用于早期放大：先在氯三苯甲基树脂3上逐步构建线性序列，经切割脱保护得到4，最终通过硫醇与双苄基溴5的烷基化环化获得6。 然而，这种模式存在显著局限：1）多项目并行时，长序列在不同树脂上的工艺优化和非经典氨基酸供应可能成为瓶颈；2）批次SPPS虽稳定可靠，但溶剂消耗大、周期长（1-2周），环境友好性差。近年兴起的连续流动固相多肽合成(CF-SPPS)提供了新思路。与传统批次反应器不同，CF-SPPS采用填充床反应器(PBR)固定树脂，优势包括：操作简便、溶剂用量少、易于集成过程分析技术(PAT)实现自动化控制。早期CF-SPPS使用刚性无机载体，但因载量低、机械稳定性差未能推广。现代聚合物树脂在有机溶剂中会显著溶胀，这种动态体积变化给固定体积PBR带来挑战，长期制约着CF-SPPS发展。 2019年，Seeberger团队与Vapourtec公司推出的可变床流动反应器(VBFR)突破了这一限制。该技术通过步进电机和双压力传感器实时调节床体积，配合在线UV-vis监测，既能追踪树脂溶胀状态，又可识别序列特异性聚集等问题。虽然VBFR能满足小规模（<2克）优化需求，但临床前研究需要10-20克级的交付能力。为此，我们开发了液压控制的大规模CF-SPPS原型，目标实现：1）合成周期从2周缩短至1天；2）氨基酸当量≤2；3）减少50%溶剂消耗；4）建立可放大的工艺参数。 结果与讨论 为了建立优化工作流程并确定放大生产的关键参数，从而指导多克级多肽合成的连续流动固相多肽合成（CF-SPPS）原型设计，我们选择了figure2A所示的简化版10AAs多肽序列7作为模型系统。该序列基于第一代PCSK9抑制剂2的结构，但剔除了非经典氨基酸以规避其供应限制。 小规模优化与偶联试剂筛选 我们采用Vapourtec公司的10毫米直径可变床流动反应器（VBFR）对小规模合成完全保护的前体肽9进行优化。图2C展示了标准SPPS循环及VBFR平台配置（figure2B）。流程中，泵A和泵B通过样品环i和ii将氨基酸与偶联试剂的DMF溶液输送至T型混合器。混合物流经温度控制反应器（iii）在80°C下生成活性酯，随后冷却至40°C后进入填充柱（iv），与树脂上的肽链N端完成单次偶联。每轮偶联后，泵C输送20% 4-甲基哌啶/DMF进行Fmoc脱保护，最终通过DMF洗涤完成循环（figure2C）。整个过程通过R系列软件全自动化运行，并利用在线UV-vis监测流出物。 在初始优化中，我们对比了多种偶联试剂（table1）。以Fmoc-Cys(Trt)负载树脂8（0.6 mmol/g）为起始物，结果显示磷试剂PyAOP和PyBOP（entry1-2）能提供高HPLC纯度（88%和83%）与中等收率（65%和73%）。而脲类试剂（HATU、HBTU和COMU，entry 3-5）因氨基酸活化不完全导致收率（40%-49%）和纯度（65%-76%）较低，可能与其残留引发的胍基化副反应有关。DIC/Oxyma（entry 6）虽收率（52%）与脲试剂相当，但纯度（83%）更高，且成本与安全性更优，故被选为后续优化的基础。 线性流速与温度的影响 通过DIC/Oxyma体系，我们考察了线性流速（基于空柱计算）对合成的影响（table2）。流速76 cm/h和96 cm/h时，肽9的收率（71%-73%）和纯度（87%）均表现良好（entry4-5）；但增至115 cm/h时（entry 6），收率骤降至17%，推测因高速流动导致活化不完全及Oxyma过量引发副反应。 通过在线UV-vis监测脱保护生成的二苯并富烯峰面积（figure3），证实76 cm/h时脱保护效率最高，96 cm/h次之，而115 cm/h显著下降，表明线性流速是控制偶联效率的关键参数。 此外，树脂对温度敏感，需严格控制床温。未绝缘的传输线使反应物流入柱时温度达65°C，导致收率降低；改为空气冷却至40°C后（table2，entry7），收率提升近10%。活化时间优化表明，2-3分钟足以完成活性酯形成（entry 8-10）。降低氨基酸当量至1.6当量（entry 11）仍会减少收率，提示2当量为最低有效用量。 放大原型设计与性能验证 基于上述参数，我们开发了35毫米柱径的CF-SPPS原型（figure4），采用液压系统恒定压缩树脂床，并通过线性电位计实时监测床高变化。 以76 cm/h线性流速进行7.0 mmol规模合成时，床高膨胀超一倍（figure5），压差波动0-6 bar，但未影响化学性能。整个合成仅需3.5小时，获得19.3克肽9（收率70%，纯度90.2%），且工艺数据与小规模实验一致，验证了放大的可靠性。 流动切割与绿色工艺潜力 我们进一步实现了树脂上肽的流动切割（figure6），通过UV监测实时判断终点，避免了批次操作的不确定性。 与传统SPPS相比，CF-SPPS将合成周期从1-2周缩短至1天，溶剂消耗减少50%以上，且过程质量强度（PMI）显著降低，凸显其在可持续生产中的优势。 结论 我们开发的CF-SPPS原型能在单次运行中高效制备20克级多肽，且纯度与收率俱佳。该技术通过小规模VBFR优化参数，实现了线性流速、温度与活化时间的精准控制，为千克级生产奠定了基础。未来研究将聚焦于进一步缩短合成时间、探索绿色溶剂替代（如乙腈/水体系），并推动该技术向临床供应规模扩展。 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！