Coltuximab ravtansine

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）代表了一类新型的癌症治疗药物。它们的设计包括一个针对肿瘤的特异性抗体、一个连接子和一个细胞毒性有效载荷。它们的设计目的是允许高度有效的细胞毒性药物特异性地靶向肿瘤细胞，同时避免对正常细胞的损害。已有报告称，ADC的任一组成部分都可能驱动常见的毒性。目前有50多个ADC正在进行积极的临床开发，另有约20个已被终止。在这篇综述中，分析了ADC的报告毒性，并详细探讨了它们的作用机制。讨论了减少毒性的方法，包括剂量策略和药物设计。对活跃和已终止药物报告的毒性很重要，以推动合理设计并提高未来ADC的治疗指数。 1.引言 抗体-药物偶联物（ADCs）是肿瘤治疗领域的新成员。目前，已有3种药物获得许可：吉妥单抗-奥佐加米辛（CMA-676, Mylotarg®），除了日本外，已在所有地区撤回；本妥昔单抗-维多汀（BV; SGN-35, Adcetris®）和阿多-曲妥珠单抗-埃姆坦辛（T-DM1, Kadcyla®）。然而，ADC 开发领域正在迅速扩展，约有55种活跃的临床化合物，约20种已终止临床试验，还有更多在临床前阶段显示出前景。ADC 的设计旨在利用抗体靶标的特异性与化疗药物的细胞毒性，因此应表现出高度特异性和低毒性。这一理想在实践中难以实现，因为ADC反复诱发限制这些化合物治疗窗口或阻碍进一步临床开发的毒性。有许多ADC在早期临床前阶段显示出前景并短暂进入临床试验，但未能取得进展或突然终止。这些终止的原因多种多样，包括财务和战略原因，但也有一些可能因不可预见或不可接受的毒性而失败。重要的是，这些失败化合物的结果需要公开，以便ADC研究和开发不再重复过去的错误。 在这篇综述中，确定了35种活跃和已终止化合物的报告毒性，并全面评估了ADC的每个组成部分对所展示毒性的作用。正如预期的那样，有效载荷通常驱动毒性效应；然而，靶标和连接子可能决定毒性的器官特异性，这将在详细讨论。了解每个组成部分在ADC中的作用将有助于通过提高疗效和降低毒性来开发具有改善治疗指数的ADC。设计ADC的新技术正在推动下一代进入临床。随着ADC设计领域的发展，评估过去ADC的毒性将变得越来越重要，以便设计未来的ADC。 2.ADC设计 ADC由三个明确定义的组成部分组成：抗体、连接子和有效载荷，这些已经在 Sievers 等人的综述中进行了全面回顾。一个理想的ADC要实现最大疗效和最小毒性，需要适当组合这三个组成部分。 2.1.抗体 在毒性的背景下，抗体需要准确地高效地结合到肿瘤细胞上的抗原，同时避免正常细胞。因此，非常重要的是抗体结合到一个合适的靶标抗原，该抗原优先或仅在肿瘤细胞上表达。抗体可能不适用的原因包括不适当或低亲和力结合、肿瘤细胞上抗原表达不足或结合后缺乏内化。然而，一些ADC可能不需要内化就能释放有毒有效载荷。正如CEACAM5被认为不内化，Immunomedics 抗CEACAM5的 labetuzumab govitecan (IMMU-130) 可能在抗体结合后释放有效载荷，无需内化。CEACAM5 也是 SAR408701 的靶标，该药正在进行1期研究。 不适当的结合可能是由于靶标抗原在正常细胞上的表达或对 Fc 受体（FcR）或凝集素受体，如甘露糖受体的非特异性结合。此外，具有特定生物学效应的抗体如果非特异性或不适当地结合到正常细胞上的靶标抗原，可能会引起毒性效应，而与有效载荷的传递无关。事实上，MEDI-547，一种针对 EphA2 的 ADC，与 MMAE 结合，在非常低的剂量下表现出毒性，这可能表明是抗体介导的生物学效应而不是细胞毒性有效载荷的传递。 2.2.连接子 连接子化学对于及时从抗体释放有效载荷非常重要。像抗体一样，有效的连接子将通过确保准确释放有效载荷来提高ADC的治疗指数。虽然连接子本身似乎不会引起毒性，但连接子的稳定性对随后由有效载荷施加的毒性有相当大的影响。更稳定的连接子将以目标特异性方式释放其有效载荷，引起更特定的毒性，而不太稳定的连接子更有可能经历非特异性裂解，导致更广泛的毒性概况。增加连接子的空间位阻（例如，SPDB-DM4 连接子有效载荷结构）可以提高 ADC 在循环中的稳定性，目标是减少非特异性毒性。可裂解连接子主要通过各种机制在内体或溶酶体室中从有效载荷裂解，包括酸性降解（腙）；通过组织蛋白酶 B 裂解的蛋白酶裂解（二肽）；巯基-二硫交换反应（二硫键，碳酸盐）。相反，不可裂解连接子（MC 和 SMCC）需要完全的溶酶体蛋白水解抗体，生成带有带电赖氨酸或半胱氨酸的有毒有效载荷（表1）。 2.3.有效载荷 ADC中使用的有效载荷是高度有效的细胞毒素，对生存所需的关键细胞过程产生影响（表1）。大多数当前临床测试中的化合物使用 either maytansine derivatives (DM1/DM4) or auristatins (MMAE/MMAF)，它们都是微管抑制剂。这些通常通过在 G2/M 期引起细胞周期停滞，诱导正在有丝分裂的细胞凋亡。最近的工作表明，微管抑制剂也可能扰乱间期的非分裂细胞。这些发现为微管抑制剂如何对缓慢复制或非分裂的肿瘤细胞具有细胞毒性提供了解释。 ADC中使用的其他类别的细胞毒素包括 enediynes (calicheamicin), duocarmycin derivatives, pyrrolobenzo diazepines (PBDs) 和 indolinobenzodiazepines，所有这些针对 DNA 的小沟，以及 quinoline alkaloids (SN-38)，它抑制拓扑异构酶 I。 ADC中使用的大多数有效载荷非常有效，通常在皮摩尔范围内具有细胞毒性，这是必要的，因为只有非常少的量（<1%）的注射剂量的抗体定位到肿瘤。然而，正是这种效力驱动了 ADC 的毒性，导致大多数毒性被有效载荷的类别所表征。 2.4.考虑其他组成部分 ADCs 的结合过程导致具有多个药物-抗体比率的异质性构建物群体。事实上，第一个获得 FDA 批准的 ADC，吉妥单抗-奥佐加米辛，平均 DAR 为 2-3，但几乎一半的抗体没有药物附加。每个抗体结合的细胞毒素分子数量的变化可能对 ADC 的处置产生显著影响，对毒性有影响。 结合位点是目前正在进行的密集审查领域，随着对这种方式作为控制特定药代动力学（PK）概况的增加，人们越来越重视。将 ADC 工程化以在已知位点上包含每个抗体的特定数量的有效载荷分子，将产生一个同质的 ADC 群体，这可能导致更好的治疗窗口（增加疗效 vs. 降低毒性）。目前正在研究的 ADC 特异性结合技术包括使用工程化半胱氨酸、非天然氨基酸和添加硒代半胱氨酸、谷氨酰胺或醛标签。添加一个工程化半胱氨酸位点以产生工程化硫（THIOMAB）抗体结合物结果是每个抗体大约有 2 个药物的 ADC。有几种使用这种技术的 ADC 正在进行临床前测试。 唯一在临床中披露使用特异性结合技术的 ADC 是 SGN-CD33A 和 SGN-CD70A，它们使用工程化半胱氨酸将每个抗体特异性结合 2 个 PBD 二聚体。 随着 ADC 的发展，越来越明显的是，没有一个 ADC 的组成部分将驱动疗效或确实毒性。相反，每个都有一定的作用，肿瘤和靶标抗原的生物学也可能影响 ADC 的活性。提高 ADC 的治疗指数需要优化每个组成部分与其他部分的结合，以产生针对特定疾病适应症的最佳 ADC。 3.毒性机制 ADCs 的毒性可能由药物的任何组成部分介导。靶标抗原在正常细胞上的低水平表达可能导致特定的毒性，而连接子的早期裂解释放游离药物可能产生更广泛的毒性。ADC 可能通过 Fc 和甘露糖受体结合诱导毒性的其他方式。大多数 ADC 毒性被认为源自有效载荷。正常的快速分裂细胞因微管抑制剂而面临毒性风险，因为它们对快速增殖的细胞产生细胞毒性作用。通常受标准化疗和 ADCs 影响的正常细胞包括消化道内衬细胞，导致胃肠道症状；毛囊中的细胞，导致脱发；以及骨髓细胞，导致骨髓抑制。不同有效载荷发现了一些关键毒性（表2）。特别是，MMAE 诱导周围神经病变和中性粒细胞减少症；MMAF 与血小板减少症和眼部毒性相关；DM1 根据连接子和随后的代谢产物，导致胃肠道效应以及血小板减少症和中性粒细胞减少症；DM4 偶联的 ADCs 最常见的不良事件是眼部毒性；卡利霉素导致血小板减少症和肝功能障碍；来自 SN-38 偶联药物的早期迹象表明中性粒细胞减少症是一种常见的毒性。 ADCs 如何以及为什么会对不同细胞类型产生这些毒性，在试图最小化未来药物开发的毒性时具有相当大的兴趣，一些已知因素在下面进行了讨论。 3.1.血小板减少症 血小板减少症可能是由于血小板的增强破坏或减少产生引起的。它表现为增加的瘀伤和出血（牙龈和鼻出血），在严重情况下可能导致粘膜出血。ADCs 诱导的血小板减少症被认为是由于抑制巨核细胞分化和巨核细胞前体的凋亡。它是利用卡利霉素的 ADCs 的关键毒性，以及使用不可裂解连接子的强大微管作用剂。在 MMAF 和 DM1 结合的 ADCs 的情况下，毒性是通过毒性代谢产物 cys-mc-MMAF 或 lys-SMCC-DM1 分别介导的。在接受 MMAF ADCs AGS-16M8F,SGN-75,和 ABT-414,治疗的患者中，血小板减少症（所有等级）的报告分别为32%、26%和11%。在 SGN-75 试验中，没有累积效应随着重复周期。在 SGN-CD19A 的情况下，3级血小板减少症的发病率约为10%。血小板减少症对于含有卡利霉素的 ADCs 比含有 MMAF 的更为普遍。在非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者中进行的 inotuzumab ozogamicin 的2期试验中，77%的患者经历了血小板减少症，其中53%为3级，并导致22%的患者停止治疗。恢复是可变的，但在大多数患者中，3个月后治疗后降低到1级或得到解决。同时，几乎所有（99%）接受吉妥单抗-奥佐加米辛治疗的急性髓性白血病（AML）患者都经历了3级血小板减少症，15%的患者经历了3级出血。来自 PF06647263 的首次人体研究的早期结果表明，33%的患者经历了血小板减少症。 此外，血小板减少症已报告为 DM1 结合物 ado-trastuzumab emtansine 和 lorvotuzumab mertansine。有趣的是，接受 ado-trastuzumab emtansine 治疗后血小板减少症的发病率在亚洲人中高于高加索人（分别为3级45%和12%）。Trastuzumab 和 ado-trastuzumab emtansine 已被证明可以结合巨核细胞前体上的 FcgRIIa，但只有 ado-trastuzumab emtansine 影响了血小板的产生，表明这种 ADC 诱导的血小板减少症是由于 DM1 或其代谢产物 lys-SMCC-DM1。相反，使用可裂解连接子的微管抑制剂，如 vc-PAB-MMAE 或二硫键连接的 DM4 结合物，血小板减少症在临床上并不特别重要。 3.2.中性粒细胞减少症 骨髓中微管功能在有丝分裂期间的干扰导致中性粒细胞减少症。降低的中性粒细胞计数增加了感染的发生率，包括发热性中性粒细胞减少症和败血症。这是利用 MMAE 的 ADCs 一致的毒性。人们认为这是由于血浆中缬氨酸瓜氨酸可裂解连接子的不稳定性或由于这些结合物中存在的高药物负载物种的快速清除，导致游离药物的系统释放，从而产生更广泛的毒性谱。积极分裂的造血细胞受到 MMAE 的影响，导致中性粒细胞减少症，这在很大程度上是可逆的，随着治疗周期之间中性粒细胞数量的改善而改善。中性粒细胞减少症已报告用于 BV、pinatuzumab vedotin、polatuzumab vedotin、glembatumumab vedotin 和 PSMA-ADC（表2）。 在靶标依赖性毒性中，CD33 特异性 ADCs 吉妥单抗-奥佐加米辛和 SGN-33A 也已知通过与髓系前体细胞表面的 CD33 结合诱导中性粒细胞减少症，而 AVE9633 未观察到骨髓抑制。 3.3.眼部毒性 已报告 ADCs 和各种靶标存在眼部毒性（表2）。最近对 ADCs 报告的眼部毒性的全面回顾强调了与 ADCs 相关的各种眼部事件，其中视力模糊、角膜炎、干眼和微囊性上皮损伤是最常报告的。存在明确的有效载荷关联，通常由包括 DM4 和 MMAF 的 ADCs 诱导眼部毒性。两者倾向于使用稳定的连接子：在 SPDB-DM4 的情况下是稳定的可裂解二硫键连接，在 mc-MMAF 的情况下是不可裂解的连接。SPDB-DM4 最终释放中性可扩散的代谢产物（DM4 和 S-甲基-DM4），这些代谢产物具有旁观者杀死邻近细胞的潜力，而 mc-MMAF 在细胞内产生半胱氨酸-mc-MMAF 作为带电活性代谢产物，没有旁观者效应。目前尚不清楚为什么眼睛对这些有效载荷的毒性特别敏感，但对于 MMAF 结合的 ADC，毒性可能与药物在细胞内的积累有关。相反，使用 MMAE 的 ADCs 很少描述眼部事件。 眼部毒性已被报告为 ABT-414（角膜沉积物）的剂量限制毒性（DLT）；AGS-16C3F；cantuzumab ravtansine（视力下降、角膜沉积物和角膜炎）；mirvetuximab soravtansine（点状角膜炎和视力模糊）；和 coltuximab ravtansine。SGN-75 的眼部毒性的中位发病时间为 44 天，随后多次给予 SGN-75。对于这次试验，眼部事件的发病率为 57%（3级，21%），导致 15% 的患者停止治疗。毒性包括干眼（30%）、角膜上皮病变（15%）、视力模糊（11%）和角膜炎（9%），并且是可逆的，中位解决时间为 79 天。预防性类固醇眼药水已成功用于减少 ABT-414 和 SGN-CD19A 的眼部事件的发生率，而 DM4 结合药物 SAR3419 和 IMGN853 的剂量调整已成功用于减少眼部毒性的发生率和严重程度（见下面关于剂量调整以最小化毒性的部分），并且向 SPDB 连接子添加硫酸基已在 IMGN853 中使用，作为减少眼部毒性的手段（专利号 US20120282282A1）。 许多驱动癌症生长的关键信号分子在眼部组织中表达，特别是表皮生长因子受体（EGFR）在角膜基底上皮细胞中表达，通过该受体的信号传导在许多眼部功能中很重要（例如，皮脂腺、毛囊、结膜、毛细血管）。针对 EGFR 的 ADCs 可能特别容易受到眼部毒性的影响；然而，两种处于临床开发中的 ADCs（AMG-595 和 ABT-414）旨在限制与野生型 EGFR 的结合，从而减少眼部毒性。AMG-595 特别结合 EGFR 的一种突变形式 EGFRvIII，这种形式由一些胶质母细胞瘤患者表达，并且不应该结合野生型 EGFR，这可能防止眼部事件。ABT-806，ADC ABT-414 中使用的抗体，结合到 EGFR 的一个表位，该表位只在激活的和肿瘤特异性的 EGFR 上暴露，不结合正常组织上的野生型 EGFR。36 ABT-414 通过 mc 连接子与 MMAF 结合，而 AMG-595 使用带有 SMCC 连接子的 DM1。ABT-414 的初步结果表明，眼部干扰确实是这种化合物的重要毒性，有 89% 的患者报告眼部事件，这似乎比已报告的其他 MMAF 结合的 ADCs 更多（见上文），但由于报告的差异和小数量的结果，很难得出明确的结论。 AMG-595 的毒性尚未报告。这两种化合物在临床测试中的头对头比较将确定是否针对这种突变会减少毒性，特别是与 EGFR 野生型 ADCs 相关的眼部毒性。 3.4.周围神经病变 肢体麻木和刺痛，蔓延引起刺痛和肌无力，是周围神经病变的特征。这主要见于微管抑制剂药物，如 auristatins 和 maytansinoid 衍生物（表2），以及 taxanes 和 vinca alkaloids。虽然这些药物通常对高度增殖的细胞有效，但成年神经元不积极分裂，但微管在神经元的存活和功能中起着重要作用，通过介导从细胞体到远端突触的蛋白质的主动运输。周围神经病变被认为是由于间期微管功能的破坏而发生的。它特别与具有蛋白酶可裂解连接子（例如，缬氨酸瓜氨酸）的 MMAE 结合物相关。可裂解连接子比其他连接子不稳定，允许游离药物系统释放。 在用 BV 治疗的患者中广泛报告周围神经病变，影响高达 50% 的患者，但 polatuzumab vedotin 和 glembatumumab vedotin 的发生率较低，分别影响 9% 和 4% 的患者。对于 BV，周围神经病变的发生率是累积的，任何级别周围神经病变的中位发病时间超过 12 周。2 和 3 级神经病变的发病时间分别为 27 周和 38 周。周围神经病变导致 10% 的患者减少剂量，13% 延迟剂量，9% 的患者停药。大多数患者的周围神经病变有解决或改善；然而，只有 50% 的患者注意到完全解决。 3.5.皮肤毒性 EGFR 信号通路和受体酪氨酸激酶在表皮细胞的正常功能中很重要。因此，针对这些途径的 ADCs 可能会表现出更高的皮肤毒性发生率，例如 bivatuzumab mertansine，由于正常角质形成细胞上 CD44v6 的表达，它引起了非常严重的皮肤毒性。这种 ADC 针对 CD44v6，它在各种实体瘤中表达，并正在进行头颈鳞状细胞癌和转移性乳腺癌的临床测试。在猕猴的临床前测试中，由于正常角质形成细胞上 CD44v6 的表达，显示了可逆的皮肤毒性。根据临床前数据，预计在临床上会有轻度至中度的皮肤毒性，并且在大多数患者中都有体验；然而，在剂量递增中，一名患者在 140 mg/m2（低于平行研究中确定的 MTD）发展为 4 级表皮坏死，并随后死亡。在这种情况下，人类角质形成细胞上 CD44v6 的表达导致 bivatuzumab mertansine 非常有效的靶向细胞毒性，但目标是不恰当的，导致不可接受的毒性。这突出了在引入临床之前需要彻底评估靶标抗原在正常表达的要求。 3.6.对内皮细胞的毒性 MEDI-547，一种潜在的实体瘤治疗候选药物，针对 EphA2，即受体酪氨酸激酶家族的成员。该抗体在体外与包括大鼠、小鼠和猕猴在内的各种物种的 EphA2 发生交叉反应。第一个人体研究从 0.08 mg/kg 的剂量开始，这比大鼠和猕猴预测的最高非严重毒性剂量低十倍。然而，在人类中，这个剂量超过了最大耐受剂量，接受治疗的患者出现了过度出血、出血和鼻出血。这种意外的毒性被认为是由 ADC 的抗体部分引起的，而不是 auristatin 有效载荷。这表明有时从动物研究预测的毒性水平与人类患者观察到的水平不同，并强调了继续开发合适的动物研究的必要性，这可能更准确地预测人类反应。 3.7.胃肠道 大多数患者在化疗后会经历胃肠道毒性。恶心和呕吐可能影响超过 90% 的患者，特别是那些接受顺铂、环磷酰胺或达卡巴嗪治疗的患者，即使在预防性抗呕吐药物存在的情况下，仍有 20% 的患者出现症状。大多数 ADCs 也会诱发胃肠道毒性，但它们大多是 1 或 2 级的严重程度。胃肠道毒性，包括恶心、呕吐、腹泻和便秘，最常报告用于 MMAE、卡利霉素和 DM1 结合的 ADCs（表2）。ADCs 诱发胃肠道毒性的机制尚未探讨，但可能源于微管抑制剂对胃肠道内快速增殖细胞的非特异性效应。有各种机制被认为会诱发化疗毒性，但 ADCs 诱发这种毒性的机制尚未确定。 值得注意的是，大约 30% 的接受伊立替康单药治疗的患者会出现腹泻，而来自 SN-38 结合的 ADCs 的早期迹象表明，它们的腹泻发生率比伊立替康显著降低（表3），可能表明 ADC 在胃肠道的分布比裸小分子细胞毒素低。 3.8.肝脏异常，包括肝窦阻塞症 当对肝脏窦状内皮细胞的有毒损伤导致内皮细胞脱落时，就会发生肝窦阻塞症。这些细胞随后栓塞至肝静脉，并导致小静脉纤维化，导致肝充血和无法清除毒素或其他废物。它已被报告为 inotuzumab ozogamicin 和 gemtuzumab ozogamicin,的毒性。其他报告肝转氨酶升高的化合物包括 cantuzumab mertansine、AVE963330 和 bivatuzumab mertansine.已提出这种效应是通过表达在肝脏窦状细胞上的甘露糖受体的 ADCs 摄取介导的。 4.临床前毒性 许多处于临床和临床前阶段的 ADCs 的抗体并不与小鼠或大鼠发生交叉反应，这阻碍了对“靶向”毒性的评估，并且只允许在这些物种中观察到非特异性、抗原无关的效应。对小鼠进行毒性评估可能对不太稳定的 ADCs 有用，但随着更具体、更稳定的 ADCs 开始进入临床，将需要更好地了解动物毒性，并且可能需要更好的临床前模型。 关于耐受性/毒性研究的最佳信息可能来自非人类灵长类动物模型，特别是猕猴，尽管这些模型在预测人类的毒性方面并不准确，例如 MEDI-547、bivatuzumab mertansine（如上所述）。阿多-曲妥珠单抗-埃姆坦辛的第一个1期临床研究的起始剂量是通过猕猴研究确定的。这些毒理学研究发现了坐骨神经的微观轴突变性，这表明周围神经病变将是剂量限制毒性（DLT）。预计人类和猕猴胶质细胞以及周围神经纺锤细胞上低水平的 HER2 表达将驱动这种毒性。然而，在患者中观察到的 DLT 是血小板减少症，在动物模型中很少见。这被认为是一种抗原无关效应，因为阿多-曲妥珠单抗-埃姆坦辛和使用相同连接子-有效载荷（SMCC-DM1）的 ADC 随后在体外被证明会干扰巨核细胞成熟。 5.ADCs 与标准治疗的毒性比较 标准化疗方案的疗效和耐受性都是剂量依赖性的，即，可能通过更高剂量实现更好的疗效，但毒性风险也会增加。由于 ADCs 的靶向特性，它们的耐受性可能与临床结果无关。因此，重要的是确保 ADCs 的毒性比标准治疗更不致残。目前有许多试验正在进行中，将目前批准的药物方案与 ADCs 进行比较，但这些试验的大多数尚未报告结果。随着这些研究的成熟，将 ADCs 的毒性与标准治疗进行比较将变得重要。目前，可以将阿多-曲妥珠单抗-埃姆坦辛、ino-阿霉素-奥佐加米辛和 glembatumumab vedotin 的毒性与对照组进行比较。对照组可能包含与 ADCs 相同或不同的机制的药物。像许多 ADCs 一样，紫杉醇类药物（例如多西他赛）和长春花生物碱（例如长春新碱）是微管抑制剂，因此具有类似的类别效应毒性。其他类别的化疗药物，如酪氨酸激酶抑制剂（例如拉帕替尼）、核苷类似物（例如吉西他滨）和烷化剂（例如苯达莫司汀）每种都有自己的关键毒性，可能比研究中的 ADC 更或更少致残。阿多-曲妥珠单抗-埃姆坦辛诱导了更多的血小板减少症和 AST 升高，但比其他方案包括曲妥珠单抗加多西他赛或拉帕替尼加卡培他滨的中性粒细胞减少症和腹泻更低（表4）。 Inotuzumab ozogamicin（抗 CD22-卡利霉素 ADC）在 INO-VATE ALL 研究中报告的急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者的肝窦阻塞症发生率高于强化化疗（分别为 15% 和 1%）。这项试验显示出比对照组显著更好的反应。在一项针对复发/难治性 NHL 患者的3期试验中，ino-阿霉素-奥佐加米辛与更高发病率的血小板减少症相关，但与苯达莫司汀或吉西他滨的对照组相比，中性粒细胞减少症的发病率较低。这项研究因在这些主要难治性 NHL 患者中的无效性而终止。 在 Emerge 试验中，严重预处理的乳腺癌患者接受了 glembatumumab vedotin 或研究者选择的治疗，后者包括 eribulin（nD15）、ixabepilone（nD7）、gemcitabine（nD5）、vinorelbine（nD5）、doxorubicin（nD3）或与白蛋白结合的紫杉醇（nD2）。接受 glembatumumab vedotin 治疗的患者经历的血小板减少症（4%）、中性粒细胞减少症（29%）和白细胞减少症（10%）低于研究者选择的（分别为 15%、44% 和 27%）。相反，glembatumumab vedotin 治疗的皮疹发生率为 47%，而对照组为 2%，周围神经病变的发生率几乎是研究者选择的两倍（23% 对比 12%）。 在一项针对霍奇金淋巴瘤前线治疗的 BV 结合研究中，患者接受了包含多柔比星、博来霉素、长春新碱和氮烯咪胺（ABVD）加上 BV 或修改方案的多柔比星、长春新碱和氮烯咪胺（AVD）加上 BV 的标准方案。接受 BV 加 ABVD 的患者经历了不可接受的肺毒性效应（44% 的患者），这比单独使用 ABVD 通常看到的比率高。博来霉素以其对肺部的不良影响而闻名，将 BV 添加到含有博来霉素的 ABVD 方案中增强了这种效应。从 BV 组中去除博来霉素消除了肺部效应，并没有减少完全反应的数量。目前有一项新试验正在进行，比较 BV 加 AVD 与单独 ABVD。 SN-38 是伊立替康的活性代谢产物，可以对使用 SN-38 有效载荷的 ADCs（labetuzumab govitecan 和 sacituzumab govitecan）与伊立替康单药治疗的毒性进行直接比较。最显著的区别是，与单药治疗相比，接受 ADCs 的患者经历的腹泻减少（表3）。 尽管这些研究规模较小，但这一研究组表明 ADCs 的毒性表现出一些限制性分布，而不是与对照组看到的总体细胞毒性。然而，仍然清楚的是，在迄今为止开发的 ADCs 中，主要毒性是由有效载荷代谢产物驱动的，表明 ADCs 的非特异性。下一代 ADCs，具有更好的靶向抗体、更稳定的连接子，并对最终有毒代谢产物的化学性质给予关注，希望能够显示出更少的有效载荷特异性毒性。相反，毒性可能更具有器官或细胞类型特异性，可以预测，并且在必要时，可以通过预防性护理进行管理。 6.调整剂量以尽量减少毒性 药代动力学（PK）的评估对于在最小化毒性的同时优化药物的疗效非常重要。IMGN853 和 SAR3419 都有较窄的治疗窗口，但有效的剂量调整降低了高峰血浆浓度并最小化了毒性。IMGN853（mirvetuximab soravtansine）是一种靶向叶酸受体α（FRα）的 ADC，通过磺酸-SPDB 连接子与 DM4 结合，目前正在进行针对 FRαC 铂耐药卵巢癌患者的1期临床研究。使用全体重来确定剂量的早期测试显示，与 mirvetuximab soravtansine 的高早期暴露水平相关的高度可逆的眼部毒性。在较低剂量下观察到临床效益，眼部毒性的发生率较低。基于调整后的理想体重计算的剂量调整减少了血浆浓度的变异性，并将它们保持在眼部毒性的阈值以下。由于这种剂量调整，1期剂量扩展队列继续进行，有早期迹象表明在严重预处理的 FRαC 铂耐药卵巢癌中具有临床效益，总响应率（ORR）为 40%。 另一种为限制毒性而进行剂量调整以最大化抗肿瘤效果的药物是 SAR3419（coltuximab ravtansine）。这是一种靶向 CD19 的 ADC，使用 DM4/SPDB 有效载荷/连接子组合。最初的1期研究每3周（q3w）剂量一次，实现了 22% 的 ORR，并通过增加剂量频率同时减少剂量来尝试提高这一比例。每周一次的 coltuximab ravtansine 给药导致药物累积，由于半衰期长 7 天和清除缓慢，这反过来又导致在第 7 或第 8 周晚发性（3级）周围神经毒性的发展。通过在最初每周一次给药 4 周后，将剂量减少到每2周一次，维持了血浆浓度在稳定水平。这种最佳剂量计划与每周给药相比，减少了神经系统和眼部毒性的发生率，并将 ORR 提高到 33%，与 q3w 给药相比。 吉妥单抗-奥佐加米辛被批准用于首次复发的 CD33 阳性 AML 患者，他们不是其他治疗的候选者。推荐剂量是两次输注，每次 9 mg/m2 吉妥单抗-奥佐加米辛，间隔至少 2 周。接受此剂量药物的患者经历的关键毒性包括血小板减少症（99%）和中性粒细胞减少症（97%），通常持续时间较长。肝脏事件很常见，有 23% 的患者出现 3 级或 4 级高胆红素血症，17% 的患者有 3 级或 4 级丙氨酸转氨酶或天门冬氨酸转氨酶水平升高。26 还有很高的肝窦阻塞症发生率，特别是在接受吉妥单抗-奥佐加米辛治疗后接受造血干细胞移植的患者中。26 最近，对吉妥单抗-奥佐加米辛的分次剂量进行了研究，以便患者接受 9 mg/m2 分为 3 次剂量的 3 mg/m2，分别在第 1、4 和 7 天。65 这种剂量调整导致血小板减少症的发生率降低，肝功能异常指标减少。对吉妥单抗-奥佐加米辛和 inotuzumab ozogamicin 的 PK 分析表明，毒性是由峰值血浆浓度驱动的，而疗效是由 AUC 驱动的。因此，减少剂量将降低峰值血浆浓度并减少毒性，而更频繁的给药将允许更长时间的药物暴露，以维持疗效。 总体而言，研究结果表明，通过剂量调整来优化血浆浓度，从而增加 ADCs 的治疗窗口，并在限制毒性的同时增强临床效益。在1期之后，继续监测患者的 PK 概况将对管理在试验扩展期间观察到的毒性非常重要。 7.降低毒性的药物修改 Agensys, Inc.，Astellas Pharma Inc. 的子公司，已开发 AGS-16M8F 和 AGS-16C3F 用于治疗肾细胞癌。这些是完全人 IgG2k 抗 ENPP3 抗体，通过 mc 连接子与 MMAF 结合。AGS-16C3F 在中国仓鼠卵巢细胞中产生，与杂交瘤衍生的 AGS-16M8F 相比，允许增加生产。在临床前测试中，它们显示出类似的 PK 和毒理学概况，但1期研究确实显示出一些差异。在最初的1期研究中，使用 AGS-16M8F，4.8 mg/kg 未达到 MTD，但有显著的眼部毒性，导致 3/8 的受试者停止治疗。然而，4.8 mg/kg 超过了 AGS-16C3F 的 MTD，导致降低剂量以找到 1.8 mg/kg 的 MTD。AGS-16C3F 报告的副作用是疲劳和血小板减少症。由于观察到疾病控制，AGS-16C3F 正在继续进行临床试验。给予任一种药物的患者血小板减少症的发生率相似，这可能表明诱导眼部毒性和血小板减少症的机制不同。这两种化合物的毒性差异令人惊讶，因为临床前结果发现 AGS-16M8F 和 AGS-16C3F 的抗体结合、细胞毒性和肿瘤大小减少相似。尚不清楚为什么这些化合物有不同的 MTDs，但可能是由于蛋白质糖基化的差异。差异表明制造过程以及 ADC 的每个组成部分在驱动毒性方面的作用。这是一个需要进一步调查的领域。 Cantuzumab mertansine（Can M）和 cantuzumab ravtansine（Can R）是两种靶向 CanAg 的 ADC，CanAg 在结肠和胰腺肿瘤上过度表达。它们在有效载荷和连接子组合上有所不同。虽然 Can M 有一个相对不稳定的二硫键连接在 SPP 连接子和 DM1 之间，但 Can R 有一个更受阻碍的、相对稳定的二硫键，通过将 DM4 连接到 SPDB 形成。这两种药物有不同的毒性概况；在 Can M 的情况下是转氨酶升高，而在 Can R 的情况下是眼部毒性。转氨酶升高的发生率在有肝转移的患者中最高，表明对正常肝细胞的旁观者效应。两种化合物都没有超过1期，可能是由于它们的抗肿瘤效果最小。 8.在不同疾病类型中的不同毒性 在不同疾病类型中使用相同药物可能出现不同的毒性。在 polatuzumab vedotin 的剂量递增过程中，CLL（慢性淋巴细胞性白血病）患者的剂量限制毒性（DLTs）出现在比 NHL（非霍奇金淋巴瘤）低得多的剂量下。NHL 的最大耐受剂量（MTD）定义为 2.4 mg/kg，但在 5 位接受 1.8 mg/kg 治疗的 CLL 患者中，有 2 位经历了 4 级中性粒细胞减少症和 4 级真菌感染的 DLTs。这导致 CLL 的 MTD 为 1.0 mg/kg，低于所需的临床效益水平。对 PK 概况的分析显示，与 NHL 相比，CLL 患者的暴露量更低，清除速度更快，这与由于 CLL 中循环 B 细胞数量更多而导致的靶标介导清除一致。 在一项针对 43 名黑色素瘤患者使用 glembatumumab vedotin（CDX-011）的研究中，皮疹作为不良事件的发生率是 74%，在 30% 的患者中这是 3 级或更高严重程度，影响了超过 50% 的体表面积，而乳腺癌患者的发生率为 47%，只有 4% 为 3 级。研究发现，皮疹的发生率与黑色素瘤患者的改善 ORR（客观响应率）和无进展生存期以及乳腺癌患者总体生存期的改善相关。黑色素瘤患者还经历了更高水平的瘙痒（63%）和脱发（65%），而乳腺癌患者分别为（21% 和 25%）。两组患者的血液学不良事件的发生率相似，大约 30% 的患者经历了中性粒细胞减少症（其中 20% 为 3 级）和 5% 的患者经历了血小板减少症。 来自 sacituzumab govitecan（IMMU-132）的早期报告表明，不同的患者群体中中性粒细胞减少症的发生率可能存在差异，三阴性乳腺癌患者中有 30%，胃肠道癌症患者中有 24%，肺癌患者中有 18% 报告了中性粒细胞减少症。由于患者数量较少，现在下结论这些是真正的差异性毒性可能为时过早，随着每个疾病群体中更多患者的加入，需要进一步监测。 9.ADCs 的未来，临床前证据 减少 ADC 的 DAR（药物-抗体比率）异质性可能会导致更好的临床概况，无论是在疗效还是毒性方面。目前大多数正在进行临床测试的 ADC 是不同 DAR 的化合物的异质混合物，通常范围是每个抗体 0-8 个药物。多种 ADC 变体可能导致广泛的 PK 值，这可能限制治疗窗口。 设计 ADC 的新技术，能够生产每个抗体具有特定数量药物的化合物，可能会产生具有更好治疗指数的 ADC。例如，对一系列传统结合的 CD30-MMAE ADCs 的研究表明，DAR 为 2、4 或 8，DAR 8 在小鼠研究中比 DAR 4 或 2 更快地被清除，治疗指数更低。通过位点特异性结合或改进连接子设计，可能通过减少高 DAR ADCs 的疏水性，从而增加药物在体内的暴露量，提高 ADCs 的治疗指数。 有几种潜在的方法可以位点特异性结合 ADC，包括用半胱氨酸（THIOMAB）或非天然氨基酸替换氨基酸，以及使用细菌转谷氨酰胺酶进行酶促结合。使用 THIOMAB 技术，通过将重链丙氨酸 114 替换为半胱氨酸，产生了一个平均 DAR 为 1.6 的 THIOMAB 药物结合物（TDC），相比之下，原始抗 MUC16 ADC 的 DAR 为 3.5。在小鼠异种移植模型中，TDC 显示出优于原始 MUC16 ADC 的体内效果和耐受性，肝脏和骨髓毒性较低。使用细菌转谷氨酰胺酶方法将 cAC10（与 BV 中的抗体相同）与 MMAE 结合，产生一个 DAR 为 4 的均一 ADC。在大鼠中，这种新的 ADC 显示出比 BV 更好的肿瘤摄取，并且在肝脏和脾脏中的非靶向摄取更低，这允许更高的最大耐受剂量。 第一个公开披露的正在进行临床开发的位点特异性 ADC 是 SGN-33A，这是一种靶向 CD33 的 ADC，它使用位点特异性工程化半胱氨酸稳定地连接到 PBD 二聚体。这产生了每个抗体有 2 个 PBD 二聚体的 ADC。已经报告的初始毒性包括中性粒细胞减少症（表 2）。SGN-70A 也使用了这项技术，但毒性尚未报告。 10.结论 这篇综述表明，对于大多数化合物而言，毒性是由有效载荷和最终代谢产物的性质驱动的。有一些特定的例子是靶标介导的毒性。了解 ADC 的不同部分在药物毒性中所起的作用（除了对疗效所需的作用），将有助于设计具有更好安全概况的候选药物。在可行的情况下，讨论了与其他治疗选择的比较。进入 3 期测试的化合物（BV、ino-阿霉素-奥佐加米辛、阿多-曲妥珠单抗-埃姆坦辛和 glembatumumab vedotin）确实比标准治疗的毒性更少。然而，大多数 ADC 处于 1 期临床测试中，其中一些报告的毒性是无法管理的，可能会导致它们无法进展。随着该领域扩展到包括具有特定 DARs 的更合理设计的 ADC，监测毒性将变得重要，以确保药物的改进靶向将提高治疗指数。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注前言抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成,兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。ADC对抗原的识别导致ADC通过内吞途径进入细胞内，通过溶酶体降解后，有效载荷以生物活性形式释放并发挥作用，导致癌细胞死亡。细胞内有效载荷的数量由每个细胞表面抗原的数量、每个ADC的药物有效载荷分子的数量（也称为药物抗体比率，DAR）以及抗原返回细胞表面所需的时间决定。有效载荷可能在癌细胞死亡和降解后逃逸，也可能从胞浆中透膜而出。这种释放的后果可能是有益的（也称为旁观者效应），也可能是有害的，导致全身毒性。2009年gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg) 是美国食品和药物管理局（FDA）批准的第一个ADC药物。目前，FDA已经批准上市了15个ADC药物，还有上百个ADC药物正处于临床研究阶段。   2009年，卡利霉素、金盏花素和美登素类药物是用于ADC开发的主要细胞毒素。十年来，这些分子仍然被用作有效载荷进行优化，以获得更好的稳定性和亲水性。新的细胞毒性物质也被开发出来，如PBDs、杜卡霉素和喜树碱衍生物等。抗体工程在10年间也已经取得了相当大的进展，允许更多的位点特异性偶联，提高了ADC的均一性和稳定性。新的第二代和第三代ADC已经进入临床，以期获得更好的治疗效果和安全性。几十种基于半胱氨酸残基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶联技术也已经在临床前研究获得了验证。此外，更多的肿瘤特异性抗原靶点和肿瘤内细胞毒性药物的释放机制使ADC获得了爆炸式的发展，ADC药物进入了黄金时代。ADC的有效载荷1. 微管破坏药物金盏花素Auristatins是ADC中使用的重要有效载荷，最著名的家族成员MMAE存在于两种上市药物Adcetris和Polivy中。目前，超过10种以金盏花素（如MMAE）或一甲基金盏花素F（MMAF）为有效载荷的ADC正在进行临床试验。上图描述了auristatine及其常用的连接位点。金盏花素的构效关系（SAR）已被广泛研究，主要集中在末端亚单位：P1（N-末端）和P5（C-末端），最常见的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。2015年，西雅图遗传学的研究人员将ADC有效载荷的范围扩大到包括叔胺，特别是N-二甲基auristatine，首次通过铵键将药物与单克隆抗体结合。所得ADCs在生理条件下稳定，体内外活性高，免疫特异性强。这些结果扩大了ADC可用于靶向给药的药物种类。最近，Agensys公司通过调节中心亚基P2-P3-P4，将叠氮化物基团引入P2和P4亚基，在与蛋白酶可裂解的连接子偶联后，产生了在体外和体内效力提高的亲水性衍生物，这为连接子的连接提供了新途径。一般来说，在同时含有胺和醇反应的auristatin中，首选的连接点是胺通过氨基甲酸酯键偶联。西雅图遗传学开发了一种新的策略，将含醇的有效载荷与亚甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶联。为了稳定MAC键，碱性基团和吸电子基团都靠近氨基键，结果表明，该偶联物在生理条件下是稳定的，具有很高的效价，并且在体内外都具有免疫特异性。此外，乌普萨拉大学的研究人员还开发了AZASTATIN，作为一类新的强有力的auristatin衍生物，包含一个中心胺侧链的抗体结合位点。他们的研究结果证实，这些auristatin衍生物是一类新的细胞毒性有效载荷，适合ADC开发。美登素衍生物（DM2，DM4）美坦辛是一种非常有效的微管组装抑制剂，可诱导细胞的有丝分裂停止。但是这种结构很难共轭，因为它没有反应性官能团，为了克服这个问题，一系列含有SMe基团的非常有效的衍生物被创造出来。这一类分子的第一个例子是DM1和DM4，它们带有甲硫丙酰基而不是天然N-乙酰基。从有效载荷DM1和DM4中，通过使用二硫键与连接子偶联。稳定的二硫键连接子在血液循环中表现出良好的稳定性，同时在细胞内保持有效的分裂。此外，几种基于maytansine的ADC利用相同的二级羟基作为附着点，并在大多数情况下携带转谷氨酰胺酶生物结合的连接子。例如，一种基于Daratumumab的ADC被证明能向CD38过度表达的癌细胞特异性地传递DM4。最近ImmunoGen开发了一种新型的ADC，它包含一种含硫的maytansinoid，通过一种高度稳定的三肽连接体连接到抗体上，附着点与上述羟基相同。与先前的美登素ADC相比，增加连接物中亚甲基单元的数量增加了旁观者杀伤活性，并提高了小鼠体内的疗效。在类似的方法中，保持核心大环不变，Regeneron和Abzena的研究人员研究了N-甲基丙氨酸氮取代的影响，也改变了大环上侧链的长度，以及通过伯胺和仲胺连接的连接子。微管溶素Tubulysins是微管聚合的有效抑制剂，可导致分裂细胞的细胞骨架迅速解体，并导致细胞凋亡。它们是一个天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3=OH或Tup，R3=H。利用Tubulysins作为ADC有效载荷，其广泛的附着点已被充分开发。这种结构中一个明显的附着点是Tut或Tup模块的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通过酰肼部分连接到连接子。Oncomatryx公司也采用了同样的方法，以同样的方式安装了可切割的PABAValCit马来酰亚胺连接子。阿斯利康、百时美施贵宝和辉瑞使用的另一种方法依赖于Tup或Tut中苯环的衍生化。连接子与Mep基团的连接也得到了广泛的研究。Ingenica研究人员报告说，去甲基Mep类似物保留了强大的细胞毒性活性，可被视为有价值的有效载荷，允许在仲胺上引入不可切割的马来酰亚胺己基连接子。Oncomatryx的研究表明，当Mep被另一个拥有仲胺的基序取代时，通过氨基甲酸酯键引入可切割的连接体是产生ADC的有效途径。特别有趣的是，基因泰克关于通过季铵基团将连接子连接到含叔胺的有效载荷上。在有效载荷上引入mc-Val-Cit-PABA连接子导致更多亲水性结合物并改善了血液中的稳定性。西雅图遗传学也采用了同样的方法，通过过度表达葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸连接子也可以改善亲水性和选择性的细胞内切割通过癌细胞中过表达的β-葡萄糖醛酸酶。隐粘菌素隐粘菌素（Cryptomycins，CR）是一个具有抗肿瘤活性的六元大环二肽家族。已有的临床试验的结果表明，在达到治疗效果所需的剂量下，其毒性水平是不可接受的。几个小组尝试将CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶联位点，目前，有两种不同的方法通过引入其它基团，使得能够连接ADC的连接子。一种是由基因泰克的研究人员将苯转化为苄胺以产生有效的有效载荷，这种有效载荷适合通过氨基甲酸酯键连接。在第二种方法中，四川大学的研究人员利用了隐霉素-52的前药形式（CR55），它可以在生理条件下重新环化为CR52。 抗有丝分裂EG5抑制剂纺锤体驱动蛋白（KSP，也称为Eg5或KIF11）是一种ATP依赖性运动蛋白，参与细胞周期中心体的分离。因此，用KSP抑制剂（KSPis）阻断有丝分裂中的这一重要事件可产生抗肿瘤效力。拜耳发现了一个新的吡咯亚类的KSPis，他们研究了该分子不同位置与保持对KSP强亲和力的连接子的连接兼容性。同样，诺华的研究人员使用含咪唑的KSP抑制剂作为Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他们安装了带有马来酰亚胺端基的不可裂解连接子。当与靶向HER2和c-KIT的抗体偶联时，得到的ADC显示出优于Kadcyla的体内疗效。2. DNA损伤药物吡咯苯并氮卓类和吲哚氯苯并氮卓类吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂卓（PBD）是一类具有抗肿瘤活性的天然产物。它们的作用方式是在DNA的小凹槽中进行选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD上的亲电N10/C11亚胺形成共价键。西雅图遗传学使用SGD1882的苯胺作为附着点，模仿可切割连接子中常用的PAB单元，释放自由的PBD有效载荷。StemCentrx与Spirogen合作，利用PBD的N-10位置连接一个氨基甲酸酯的连接子。同样的氨基甲酸酯键也被Immunogen用于结构相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚体（IBD）有效载荷。他们还报道了同一类IBD的不同方法，其中一个取代的苯环被用作两个IBD单体的C8/C8'位置之间的连接物。以类似的方法，Spirogen和Genentech设计了一种碘苯连接的PBD，允许在过渡金属催化反应中引入不同的连接子。通过使用Sonogashira偶联、Buchwald–Hartwig偶联或叠氮化物-炔烃点击反应，分别获得炔烃、哌嗪或三唑连接的连接子有效载荷共轭物。杜卡霉素杜卡霉素是一种强大的细胞毒性物质，通过其高活性的环丙烷环与DNA的小凹槽结合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非环化的，卤甲基形式的杜卡霉素细胞毒性活性显著降低。由于分子中苯酚基团可作为内消旋体激活剂，从而形成亲电环丙烷，因此杜卡霉素ADC开发中的连接策略集中于酚官能团的连接子连接。在Synthon开发的SYD985中，苯酚基团是通过双氨基甲酸酯连接连接子与Mc-val-cit-PABC有效载荷的位置。组织蛋白酶B裂解后，游离苯酚促进分子内重排成亲电环丙基形式。Medarex采用了一种不同的方法，通过分子非烷基化部分的芳香胺连接连接子，并用N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前药。在体内，苯酚将被释放，随后活性环丙烷将在羧酸酯酶的作用下形成。喜树碱喜树碱（CPT）及其衍生物是拓扑异构酶I抑制剂的经典例子。它们稳定了拓扑异构酶诱导的DNA单链断裂，当三元DNA-TOP1-抑制剂复合物遇到复制叉时，DNA发生双链断裂。天然喜树碱是一种五环结构，其极低的溶解性阻止了其作为癌症治疗药物的广泛应用。其水溶性前药伊立替康获得了转移性结直肠癌的上市许可。SN-38是伊立新坦的活性代谢物，通过人体肝脏羧酸酯酶的作用在体内生成，其可通过打开内酯环而失活。Immunomedics建立了两种不同的策略，通过其羟基部分结合SN-38。在一个例子中，连接子通过反应性更强的C-10苯酚基团连接，从而产生稳定的氨基甲酸酯键，而在另一个例子中，通过C-20羟基，同时稳定内酯形式，而C-20羟基对体内效力至关重要。另一种适合ADC的非常有效的药物是依沙替康（DDX-8951f）。这种喜树碱类似物在其环己烷环上具有胺取代基，桥接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而环己烷环赋予的刚性被认为有利于活性内酯形式与非活性水解羟基酸的平衡。氨基羟基乙酰化生成DXd（1），而4-氨基丁酰化生成DXd（2），这两种化合物都保留了依沙替康的生物活性。悬垂的羟基和氨基是明显的附着点，可使用酶可切割的Gly-Gly-Phe-Gly四肽连接子连接有效载荷。与抗HER2抗体偶联产生的ADC在临床环境中显示出对抗HER2表达癌症的巨大潜力。DXd的环己胺环虽然被认为稳定了生物活性内酯形式，但它携带了一个手性中心，使合成工作和SAR研究复杂化。为了克服这一困难，Immunogen的研究人员研究了一组新的喜树碱类似物，这些类似物能够与单抗偶联。并且在这里，这个环被打开，额外的手性中心被消除。从一种常见的中间产物开始，研究人员尝试了三种类型的结构，并随后使用不同的聚苯胺连接子连接有效载荷。当与抗人表皮生长因子受体（HuEGFR）的抗体偶联时，产生的ADC对EGFR阳性的HSC-2肿瘤异种移植模型有效。卡奇霉素卡奇霉素是一类被广泛研究的烯二炔类抗生素，其结构和作用机制特别有趣和复杂，使其成为ADC有效载荷领域的一类抗生素。在ADC中连接calicheamicin的策略以市场上的adc Mylotarg为例，还有Besponsa。有效载荷的释放分两步进行：在酸性细胞内环境中对腙进行敏感的裂解，然后通过细胞内谷胱甘肽还原二硫键。释放的硫醇发生分子内1，4-加成的烯酮触发伯格曼环化反应，产生一个二自由基。这种活性中间体能够从脱氧核糖骨架中提取氢原子，产生双链DNA断裂，进而导致细胞死亡。最近，从不列颠哥伦比亚地衣中发现的链霉菌中分离出一种新的烯二炔类天然产物，称为uncialamycin。这种结构通过全合成得到证实，从那时起，一些高效的合成类似物被制备成ADC的潜在有效载荷。BMS的研究人员表明，由于在各种肽偶联条件下反应活性较低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一个合适的连接点。研究人员合成了一种类似物，其中一个氨基直接引入到芳香环上，但这种苯胺的反应性也太弱，不能作为连接子引入的基团。另一方面，使用氨基乙基延伸物安装脂肪族胺，为连接子提供了合适的连接点。从后一个有效载荷中，他们使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的连接子制备前体。CD70-ADC具有可切割连接体，对肾癌细胞株具有高度特异性的细胞毒活性，而相应的不可切割ADC在同一细胞株上不具有活性。最近，为了继续这项工作，BMS的研究人员在设计的、高效的、化学稳定的uncialamycin类似物中使用苯酚基作为附着点。使用新开发的苯酚烷基化，在有效载荷的苯酚基团上添加了一个经典的可裂解连接子。将产生的有效载荷与抗体偶联，其在体外和体内均显示抗原特异性抗肿瘤活性。3. 创新药物凋亡诱导剂（Bcl-xL抑制剂）抗凋亡Bcl-2家族成员（包括Bcl-xL）的过度表达是癌细胞获得凋亡抵抗的机制之一。能够阻断Bcl-xL上BH3结合域的药物可以触发癌细胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL-xL抑制剂的有效载荷，其靶向表达EGFR的特定细胞或组织。有趣的是，研究人员在有效载荷上使用了三个不同的连接点来连接可切割的连接子。氨基烷基延伸的核心修饰用于在需要时建立合适的连接位点。泰兰司他丁及其类似物靶向剪接体是一种参与mRNA加工的大型核糖核蛋白复合物，为靶向癌症治疗提供了一种有希望的治疗选择。有几种天然产物能够通过与不同的剪接体亚单位结合来抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以与剪接体的SF3b亚单位结合，从而阻止RNA剪接。Thailanstatin A缺乏一个适合连接连接子的基团。为了解决这个问题，将羧酸与乙二胺偶联以引入含有胺的间隔基，该间隔基通常用于连接子的安装。将这种天然产物用于ADC的另一个困难是存在多种反应性功能。例如，中心核中的二烯可以通过Diels–Alder反应与用于生物结合的马来酰亚胺部分反应。这个问题是通过使用另一个共轭部分，卤代乙酰胺来解决的。结合这两种修饰并包含可切割连接子的ADC首次在专利文献中报道，并且声称它们在几个表达HER2的细胞系中具有适度的活性。最近，辉瑞报告说，羧酸直接与抗体的有效表面赖氨酸（无连接子偶联）结合导致迄今为止最有效的Thailanstatin ADC。这些赖氨酸偶联物的活性与药物负载有关，而其他有效载荷类通常没有观察到这种特性。ADCs在胃癌异种移植模型中显示出良好的作用。鹅膏毒素 在ADC技术领域，使用类似amatoxins的转录抑制剂是一种相对较新的方法。九种天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架结构，一个由八个L-构型氨基酸组成的大环，通过亚砜部分连接在色氨酸和半胱氨酸残基之间。amatoxins的三个侧链是羟基化的，OH基团具有良好的水溶性并与目标分子结合。两种肽，α-鹅膏糖蛋白和β-鹅膏毒素，占所有毒素的90%。在amatoxins上共使用过三个附着点产生ADC。第一次尝试是将β-鹅膏毒素的羧基偶联到IgG上赖氨酸的氨基，这种连接具有良好的血浆稳定性和高细胞毒性，但这种生物偶联的产率很低。二氢异亮氨酸的羟基也被认为是一个连接点，引入谷胱甘肽作为连接子，然后通过赖氨酸结合，可获得体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性优异的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解连接子，导致其循环稳定性差。第三种方法，附着于色氨酸的6-羟基代表了目前的标准程序，苯酚与各种连接子的醚化导致了高度稳定和有效的ADC。由于鹅膏毒素其它氨基酸要么不具化学活性，要么是与RNA聚合酶II结合的关键，因此不能将其它的鹅膏毒素氨基酸（即羟脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸）用于偶联。基于amanitin的代表性的ADC为HDP-101。有效载荷本身是一种合成的金刚烷醇衍生物，优化了稳定性。与天然天麻素相比，两个差异是色氨酸中没有6′-OH，硫醚链取代亚砜。通过天冬氨酸侧链上酰胺的形成，引入组织蛋白酶B-裂解连接子。最近，Park及其合作者为含苯酚的有效载荷设计了一种新的连接基序（OHPAS）。它是一种二芳基硫酸盐，一个芳基部分来自有效载荷，另一个来自连接基序的潜在苯酚基团。将该技术应用于曲妥珠单抗ADC中的a-鹅膏毒素，在体外和体内表现出强大的细胞毒性。烟酰胺磷酸核糖转移酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是一种负责将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的酶，其抑制剂在各种临床前和临床研究中显示出有效性，但其临床应用受到靶向毒性和剂量限制性毒性的限制，如血小板减少和胃肠道不良反应。诺华公司的研究人员在NAMPT抑制剂有效载荷中的苯环对位中引入哌嗪部分，确定了合适的连接子附着点。这种分子在c-Kit和HER2表达细胞系上表现出纳摩尔水平的效力，并且耐受性良好，在体内表现出靶向依赖性。卡马霉素从库拉索菌中分离得到两种新的蛋白酶抑制剂，卡马霉素A和卡马霉素B。两者都具有亮氨酸衍生的α,β-环氧酮弹头直接连接到甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜。他们被发现能抑制酿酒酵母20S蛋白酶β5亚单位活性（糜蛋白酶样活性）。此外，它们对肺癌和结肠癌细胞株具有很强的细胞毒性。然而，由于它们的高效价，它们的选择性较差，经常表现出毒副作用。因此，剧毒的卡马霉素衍生物适合作为ADC的弹头，可以保持所需的效力，并获得更好的耐受性。所设计的类似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡马霉素B），而不是卡马霉素A中的亚砜甲硫氨酸，因为这消除了亚砜基立体异构体混合物产生的结构复杂性。 第一代类似物在P4末端含有胺基，不幸的是，这个附着点并不合适，因为有效载荷显示细胞毒性活性降低。第二代卡马霉素类似物在P2侧链上含有一个胺基，当短乙基氨基链延伸磺酰基时，效果最好。在第三代类似物中，芳基连接砜和胺，因此降低了它的碱性。第二代和第三代有效载荷都显示出强大的体外活性，并用可切割或不可切割的连接子连接。不幸的是，没有一种ADC对受试癌细胞系表现出比曲妥珠单抗更高的细胞杀伤能力。点击关注小白学药~连接子连接子不仅是抗体与小分子有效载荷之间形成共价连接的分子部分，而且是靶向药物治疗中具有设计性质的关键元件。连接子的加入不应诱导聚集，并且需要确保可接受的PK特性，同时限制有效载荷在血浆中的过早释放（稳定性），并使活性分子在靶向作用位点有效释放。连接子分为两类：不可切割型和可切割型。1. 不可切割连接子基于不可切割的连接子的ADC必须被内化，抗体部分需要被溶酶体蛋白酶降解以释放活性分子。在ADC开发过程中已经探索了许多不可切割的连接子，最具代表性的是N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC），Kadcyla就是使用的此类型连接子。这种结构的分解代谢导致Lys-SMC-DM1成为主要的肿瘤代谢物。此外，与这种连接子相连的药物通常不能发挥旁观者效应，因为释放的分解代谢产物通透性较差。目前的研究主要集中在可切割的连接子上。使用可切割连接子对于具内化和不具内化ADC的设计同样可行，因为释放是由切割位点（溶酶体和/或肿瘤环境）的性质触发的。连接子可以分为两大类：酶依赖性和化学（即非酶）依赖性。2. 化学依赖性连接子含有二硫键的连接子受到硫醇的亲核攻击以释放活性载荷。尽管血浆中人血清白蛋白（HSA）的还原形式就是最丰富的硫醇，但它对大分子的反应性很差。胞浆中还含有高水平的谷胱甘肽（GSH），这是一种含有巯基的三肽，很容易与S-亲核蛋白发生反应。血液（微摩尔范围）和细胞质（毫摩尔范围）中GSH浓度的差异以及癌细胞引起的氧化应激有助于药物在癌细胞内的优先释放。含有二硫键的连接子主要与maytansinoid类有效载荷相关。二硫键的反应性可由空间位阻调节：α-甲基替换显著影响还原速率和对硫醇-二硫键交换的抗性，如SAR-3419的连接子通过偕二甲基替换获得SPDB-DM4最佳的抗肿瘤活性。腙连接子显示出依赖于pH的稳定性，在中性pH下稳定，并在酸性介质中水解（内体的pH<6，溶酶体的pH<5），形成相应的酮和肼。该方法已成功应用于IMMU-110，包含一个可裂解酰基腙连接子，由4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC）的酰肼与阿霉素中存在的酮基反应中形成。腙连接体也经常用于卡利霉素家族的有效载荷，在这种情况下，释放是由两步活化过程触发的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫键被GSH还原，使巯基中间体环化。这种连接子已经在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它们在血浆中的稳定性不如预期，也不如其他可切割连接子吸引人。3. 酶依赖性连接子为了限制有效载荷在内化前的释放，从而防止或最小化目标细胞外的降解，溶酶体的蛋白质组分成为寻找能够降解ADC并以高浓度存在的酶的合理场所。 组织蛋白酶-B组织蛋白酶B是一种半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳动物的晚期内体和溶酶体中，在许多癌细胞中也过度表达。最初，一种可切割的二肽作为组织蛋白酶B的底物用作阿霉素前药，这项工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要亲水性残基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的亲脂性残基增强血浆稳定性（苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸）。此外，还引入了一个自降解间隔子来促进酶的进入，从而限制了有效载荷的空间位阻：对氨基苄基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介质中自发1,6-消除，释放二氧化碳、对氮杂醌甲酰胺和阿霉素。最终，这一发现从前药转移到ADC领域，证明了Val-Cit和Phe-Lys二肽连接子的抗原驱动的细胞活性。Val-Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解连接子，目前有多达25个分子处于临床阶段，可能是因为其整体良好的血浆稳定性、释放行为和化学可牵引性。两个已获批的ADC药物（Adcetris和Polivy) 都使用了相同的连接子mc-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺基间隔子、作为组织蛋白酶底物的标准Val Cit二肽序列和PABC自降解间隔子。Val-Ala二肽也被广泛应用，有7个分子处于临床阶段，进展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一个聚乙二醇化间隔子，以平衡属于PBD二聚体家族的有效载荷SG3199的亲脂性。研究表明，由于沉淀和聚集，Val-Cit很难实现高DAR。相反，Val-Ala连接子允许DAR高达7.4，且聚集有限（<10%）。与Val-Cit相比，Val-Ala的疏水性较低，这解释了为什么这种连接子在亲脂性的有效载荷（如PBD二聚体）方面表现卓越，7个临床候选ADC的Val-Ala连接子都连接PBD。一些研究将Val-Cit和Val-Ala二肽结构与MMAE的有效载荷连接进行了比较。在非内化抗体的情况下，结合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala连接子都表现出类似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg类似物表现出更好的性能。在使用随机半胱氨酸结合的抗Her2 ADC的情况下，与Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR结构中显示出较少的聚集性。另一方面，两种连接子显示出相似的缓冲稳定性、组织蛋白酶B释放效率、细胞活性和组织病理学特征。四肽Gly-Gly-Phe-Gly显示出稳定和有效的可切割连接子的所有特性，已上市的ADC药物Enhertu使用了此类连接子。第一三共的Enhertu是一种血浆稳定的ADC，DAR为7.7，在溶酶体中发生蛋白酶降解，释放DX-8951f，这是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，来源于exatecan。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的DAR是非常可观的，因为它与广泛确立的原理相矛盾，即高DAR结合物可能具有较差的药代动力学特征。这里使用的自降解间隔子是简单和紧凑的半胺化，而不是Val-Cit连接子使用的PABC。磷酸酶和焦磷酸酶与组织蛋白酶一样，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶体中选择性表达的水解酶。2016年，默克公司的研究人员设计了含有磷酸和焦磷酸的连接子与组织蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在传递糖皮质激素：磷酸盐/焦磷酸盐部分结合在自降解间隔子PABA和有效载荷之间。内化后，有效载荷可通过组织蛋白酶B、自降解间隔子和磷酸酶（n=1）的顺序释放。对于焦磷酸酯（n=2），可能需要另一个涉及焦磷酸酶的步骤。这种亲水性和永久性带电基团的优点是溶解性，不仅能够与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，而且促进ADC纯化， ADC中的残余连接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在体外都具有活性。默克公司的同一组研究人员还开发了一种独特的基于焦磷酸酶的连接子，用于释放含羟基有效载荷地塞米松和丙酸氟替卡松。此外，羟基附着点的性质对有效释放至关重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一个缩醛间隔子，从而实现可接受的释放。两种ADC在体外均表现出良好的稳定性，对肿瘤细胞系具有较强的活性。 β-葡萄糖醛酸酶β-葡萄糖醛酸酶是一类糖苷酶，催化β-葡萄糖醛酸残基的水解，它在溶酶体和肿瘤间质中高表达。西雅图遗传学的研究人员于2006年发表了一项开创性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的连接子，葡萄糖醛酸附着在自降解间隔子上。这种连接子表现出低水平的聚集、高血浆稳定性、以及强大的体内功效。该连接子还通过一个额外的二甲基乙二胺（DMED）自降解间隔子应用于其他含胺的有效载荷，如喜树碱类似物、SN38、杜卡霉素和苦参碱。释放顺序从水解β-葡萄糖醛酸到自降解间隔子，DMED的另一个环化反应自发发生，形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，并最终释放含羟基药物。由于连接子的亲水性，与组织蛋白酶敏感连接子相比，该技术使ADC的DAR=8制备更为容易。β-半乳糖苷酶最近报道了一种使用β-半乳糖苷酶裂解连接子的ADC，其中包含PEG10间隔子。间隔子被硝基取代，以提高自降解速率。类比β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它赋予化学前体亲水性。另一个优势是β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中表达，也在实体瘤的微环境中表达。研究证明，在抗HER2-ADCs释放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶连接子的 ADC在体外和体内均比T-DM1更为有效。硫酸酯酶最近，出现了硫酸酯酶裂解的连接子，硫酸酯酶在几种癌症类型中过度表达，表现出潜在的选择性。研究涉及以MMAE为有效载荷的抗Her2抗体，与经典的可切割Val-Cit和Val-Ala连接子相比，硫酸酯酶连接子对Her2+细胞系显示出相似的效力。生物偶联技术1. 基于化学的特异性原位抗体修饰单克隆抗体的天然结构为生物偶联提供了多种可能性，基于化学的、特异性的天然（非工程）抗体偶联具有一些优点。它可以避免抗体特定位点突变的复杂性，以及在细胞培养的放大和优化方面可能面临的挑战。偶联位点根据抗体序列，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等内源性氨基酸在二硫键间的连接位点非常具有吸引力。所有经FDA批准的ADC，直到2021年，都利用这些内源性氨基酸进行偶联。然而，抗体支架还包含聚糖，这是在单克隆抗体生产过程中，FC区域的翻译后修饰所导致的。一些研究报告了糖工程化的新策略，这似乎是一种有趣的生物偶联替代方法。与内源性氨基酸的偶联最常见的偶联方法之一是利用抗体的赖氨酸残基，氨基酸亲核NH2基团与利克有效载荷上亲电的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团发生反应。尽管反应简单，但可利用赖氨酸残基的高丰度导致了许多ADC在随机分布下的不均匀混合物的形成。DAR受药物/抗体化学计量比的控制，该方法得到广泛应用，包括已获批的ADC，如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。最近，同样也报道了对赖氨酸位点和残基的特异性修饰。通过计算机辅助设计，磺酰丙烯酸酯被用作中间试剂，用于在天然蛋白质序列上对单个赖氨酸残基进行修饰。反应的区域选择性归咎于磺酰丙烯酸酯的设计以及每个赖氨酸周围独特的局部微环境。通过计算预测，pKa最低的赖氨酸容易以位点特异性的方式在弱碱性pH下优先反应。即使在其他亲核残基如半胱氨酸存在的情况下也观察到了这种反应。该技术已应用于5种不同的蛋白质和曲妥珠单抗，在偶联后均保留了原有的二级结构和蛋白质功能。2018年，Rai等人报告了另一种利用“化学关键蛋白”的可逆分子间反应进行的位点特异性修饰。该试剂携带多种官能团，这些官能团在所有可获得的赖氨酸残基上可逆地形成亚胺部分。然后，关键蛋白通过试剂中的环氧化物与近端组氨酸残基反应。因此，在生理条件下，关键蛋白从赖氨酸中分离，醛被再生，从而能够通过肟结合标记抗体。这种关键蛋白的定向修饰技术后来发展成单赖氨酸残基标记技术，即使在存在N-末端胺的情况下也具有毋庸置疑的选择性。方法的成功依赖于Fk1-间隔子-Fk2试剂。Fk1官能团与赖氨酸可逆反应，调节Fk2近端赖氨酸部分的微环境。然后通过酰胺键在Fk2处的赖氨酸残基（K169和K395）进行偶联，间隔子的设计调节偶联的位置。该方法已成功应用于ADC（trastuzumab-emtansine）的合成，证明其细胞活性与已获批准的Kadcyla相当。 Merlul等人最近报道了一种不同的结合策略，有效地靶向天然抗体上的组氨酸残基。他们引入了一种基于阳离子有机金属铂（II）的连接子，[乙二胺铂（II）]2+，图中表示为Lx。这种技术基于络合和偶联两个步骤。氮杂环配体如哌啶与Lx配位形成络合物前体，稳定的中间体包含有效载荷和配体上的一个氯离子。该复合物含有带正电荷的Pt（II）中心，这提高了连接子和有效载荷复合物的水溶性并最小化抗体聚集，该方法还扩展到类似的碘络合物。在最近的一份报告中，碘化钠的使用被证明可以显著提高该技术的偶联产率和选择性。Cl-Lx-药物载荷络合物上残留的氯配基与碘化物的交换生成更具活性的I-Lx-药物载荷，从而获得更高的偶联产率。这项技术已被应用于ADC药物的大规模生产。二硫化物重桥接策略IgG抗体包含四个链间二硫键，两个连接轻链和重链，两个位于连接两条重链的铰链区，它们维持着单克隆抗体的完整性。另一个经典的生物偶联途径探索了这些半胱氨酸作为有效载荷连接点的作用。四个二硫键的还原通常会产生八个巯基，它们能够与马来酰亚胺的连接子反应，从而产生DAR为8的ADC。Doronina及其同事报告了嵌合抗CD30单克隆抗体偶联MMAE，DAR=8的 ADC实例。与经典的赖氨酸偶联相比，这种有效载荷加载方式得到了更好的控制。然而，据报道，较高的药物负荷会增加聚集的风险，从而导致高血浆清除率，并降低体内疗效。Badescu和al在2014年报告了一种新的位点特异性重桥接偶联策略，他们是第一个证明新的双砜（bis-sulfone）能够烷基化来自抗体和抗体片段中还原二硫键的两个巯基，对抗原结合的影响最小。后来，Wang和al描述了一种新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），该试剂在没有原位活化的情况下提高了反应活性。它表现出高稳定性、高水溶性和位点特异性。此外，还有巯基炔与末端炔烃和环辛炔生物偶联的再桥接技术，其进一步发展出新一代马来酰亚胺，如二溴-（DBM）和二硫代马来酰亚胺（DTM），用于位点特异性偶联。这些马来酰亚胺类似物在第3位和第4位含有良好的脱离基团，从而实现快速、高效和高产率的偶联。最近报道了结合二溴和二硫代马来酰亚胺性质的杂化硫代溴马来酰亚胺（TBM），这种TBM试剂结合更快，显示出更高的DAR=4的百分比，这可能是由于溴减少了空间位阻。2015年，Chudasama等人引入了一类新的重桥接试剂，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他们证明了它能有效地插入到二硫键中，得到的结构即使在高温下也表现出了极好的水解稳定性。然而，随着还原步骤上的温度升高，也观察到不均一性，这种结构也允许选择性地引入不同的功能基团。二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一种有效的重桥接试剂，能够产生稳定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基杂芳基支架对半胱氨酸再桥接的作用，他们认为用嘧啶取代吡啶可以使杂芳环成为更好的电子受体，从而提高交联效率。他们的工作扩展到二乙烯基三嗪，在高温下，重桥接显示出更高的效率。为了避免与经典马来酰亚胺偶联相关的体内不稳定性的缺点，Barbas等人研究了甲基磺酰基苯基恶二唑，该试剂对半胱氨酸具有特异性反应。与血浆中的半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物相比，他们的稳定性更高。受此启发，Zeglis设计了DiPODS试剂，该试剂含有两个通过苯基连接的恶二唑基甲基砜部分， DiPODS以重桥接的方式与两个硫酸根形成共价键。与马来酰亚胺偶联相比，以这种方式偶联具有优越的体外稳定性和体内性能。聚糖偶联由于IgG是一种糖蛋白，它在Fc片段每个重链的CH2结构域N297位置包含一个N-聚糖，这种糖基化可以作为连接有效载荷的附着点。多糖与Fab区域间远距离定位降低了在偶联后损害抗体的抗原结合能力的风险，此外，与抗体的肽链相比，它们的化学组成不同，允许位点特异性修饰，使它们成为合适的偶联位点。聚糖生物偶联可根据用于靶向碳水化合物的技术来区分：包括聚糖代谢工程化、聚糖氧化后的糖转移酶处理、内糖苷酶和转移酶处理后的酮或叠氮化物标记。Neri等人报道了在IgG抗体的N-糖基化位点处岩藻糖的位点特异性修饰。这种糖含有一个顺式二醇部分，适合选择性氧化。他们用偏高碘酸钠氧化岩藻糖残基，生成一个能够与含联氨的连接子反应的醛基，这样，抗体通过腙键与药物相连。Senter及其同事向细胞培养基中添加硫基类似物，通过代谢将6-硫代岩藻糖带入抗体修饰。他们认为，取代是通过劫持岩藻糖基化途径来完成的，这样就引入了化学位点来实现位点特异性结合。与经典半胱氨酸偶联物相比，这种方法显著降低了异质性水平，并产生具有更可预测的药动学和药效学特性的偶联物。重组IgG中很少含有唾液酸，然而，已经证明，利用半乳糖基和唾液酸转移酶可以酶法改造甘氨酸。通过酶反应添加半乳糖以获得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。这种修饰通过高碘酸氧化生成醛基，可以偶联带羟胺基团的连接子-有效载荷。所得的偶联物具有较高的靶向选择性，体内抗肿瘤活性良好。高碘酸还可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影响与FcRn的结合。除这些偶联策略外，半乳糖残基也可以作为修饰位点。多项研究报告了通过使用突变的β- 1，4-半乳糖转移酶，将半乳糖替换为一种含酮或叠氮官能团的半乳糖，这种具有双正交官能团的半乳糖衍生物为高效偶联开辟了途径。这些技术已被开发用于成像和抗癌应用。从化脓性链球菌中发现的内糖苷酶EndoS和EndoS2，这些酶能够水解IgG的N-聚糖，从而使水解后的残基成为生物偶联的有效位点。这种方法有助于使单抗的聚糖结构均匀化，同时它也适用于任何IgG亚型。此类方法应用于trastuzumab-maytansine，制备出具有良好体外和体内药效的糖偶联ADC。2. 工程化抗体的位点特异性生物偶联生物正交化学和蛋白质工程领域的进展有助于产生更均匀的ADC。尽管在天然单抗上有许多可用的附着方法可供选择，但在工程化抗体上的位点特异性生物偶联能够更有效地控制DAR，并且避免改变与抗原结合的亲和力。这样，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有优良药代动力学和药效学特征的同质产品。酶法有效载荷的附着可以通过在抗体序列中插入特定的氨基酸标签以非常有选择性的方式实现。这些标签被特定的酶所识别，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而能够执行位点特异性偶联。Aaron等人探索了一种新的利用醛标记蛋白质的位点特异性偶联。该技术利用了基因编码的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达期间被共翻译氧化为甲酰甘氨酸。这样，工程化抗体通过HIPS（hydrazino-Pictet–Spengler）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）策略也经常被开发用于定位特异性偶联。MTGase催化在脱糖抗体295位置的谷氨酰胺侧链与底物的伯胺之间形成肽键。与其他酶策略相比，MTG是一种灵活的技术，不需要肽供体来实现偶联。只要酰基受体含有一种伯胺，就没有结构限制。谷氨酰胺残基自然存在于单抗的每个重链的Fc区域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺残基通过MTGase介导的反应偶联，可以产生均一的DAR=2的ADC。为了提高效率，可以偶联带支链的连接子，从而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺也可增加DAR。NBE Therapeutics开发了基于S金黄色葡萄球菌转肽酶A介导的偶联。他们的策略利用转肽酶A（SrtA），在LPXTG（X=任何氨基酸）五肽的基序中切割苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键。然后，它催化甘氨酸相关的有效载荷与新生成的C-末端的偶联，在生理温度和pH下生成肽键。该方法应用于不同抗体，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸标记的连接子偶联maytansine和MMAE，两种ADC均显示出与经典偶联相似的体外细胞杀伤活性。酶法产生的trastuzumab-maytansine在体内试验中完全匹配Kadcyla。在另一个例子中，利用转肽酶法生成了高效蒽环素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是，通过这项技术，偶联效率甚至高于Adcetris和Kadcyla类似物。此外，所制备的PNU-159682 ADC具有较高的体外和体内稳定性，并且显示出的效力超过了含有微管蛋白靶向有效载荷的ADC。另一个新兴的新方法是通过酪氨酸标签进行位点特异性抗体标记，酪氨酸标签与单克隆抗体轻链的C末端基因融合。考虑到位点可及性，Bruins及其同事使用了一种工程化的四甘氨酰酪氨酸残基作为标记，它为偶联提供了一个容易触及的位点。酪氨酸酶将酪氨酸氧化成1,2-醌，从而允许与各种双环[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物的环加成反应。这种方法可以与含有BCN连接子的MMAE有效地偶联。半胱氨酸工程：硫单抗技术随机半胱氨酸偶联和重桥接是利用抗体结构内天然存在的半胱氨酸残基的技术。然而，随机半胱氨酸方法的异质性以及重桥接策略中的单抗片段化需要在ADC合成中加以考虑，特别是当疏水性药物被偶联时。与它们不同的是，硫单抗技术通过利用不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，在抗体上实现所需位点的选择性和均匀修饰。一般来说，半胱氨酸突变的设计是为了促进细胞毒性有效载荷偶联的同时，保持单克隆抗体的稳定性、亲和力和最小化ADC聚集。为了确定突变的最佳位置，通常采用几种技术，包括计算建模、模型系统筛选和高通量扫描。Junutula等人首先报道了一种硫单抗策略，用工程化半胱氨酸残基取代了抗MUC16抗体重链114位的丙氨酸（HC-A114），工程化位置内的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子反应。合成的抗MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出效力，在大鼠和食蟹猴中表现出高剂量耐受性，这个发现建立了硫单抗偶联策略的一般性方法。此外，琥珀酰亚胺连接在胞浆内可以经历两个平行反应：反向Michael反应导致连接子-有效载荷的损失，以及琥珀酰亚胺的水解，这两种反应都对体内ADC活性有显著影响。为了提高稳定性，Lyon和合作者设计了一个与马来酰亚胺相邻的碱性氨基整合进来的连接子。在连接子中加入二氨基丙酸（DPR）促进了硫琥珀酰亚胺在中性pH和室温下的快速定量水解，这样，非特异性的去偶联作用被阻止，从而提高了体内的稳定性。除了常用的马来酰亚胺外，还探索了不同的半胱氨酸反应剂，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N-烷基乙烯基吡啶盐。3. 与工程化非天然氨基酸的生物偶联除了硫单抗技术外，非标准氨基酸（ncAA）的加入为位点特异性偶联提供了另一种可能性。该技术使用含有独特化学结构的氨基酸，从而能够以化学选择性的方式引入连接子-有效载荷复合物。该技术需要对抗体序列重组，利用与宿主细胞内所有内源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于响应未赋值密码子将ncAA带入蛋白质。通常，ncAA在发酵过程中被添加到培养基中。选择非天然氨基酸是很重要的，因为它们可能激发免疫原性。常用的ncAA是具有独特基团的天然氨基酸的类似物，如酮、叠氮、环丙烯或二烯。已有研究将对乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗体中。有效载荷Auristin通过肟连接与抗体有效偶联，从而生成化学均一的ADC。该ADC在小鼠体内表现出良好的体外活性和完全清除肺肿瘤的作用。由于肟连接所需的酸性条件和ADC缓慢释放的动力学，另一种选择是加入含ncAA的叠氮化物。广泛应用的对叠氮哌苯胺（pAzF）可在生理条件下快速进行CuAAC或SPAAC反应，利用这种策略成功地在抗CD74抗体上偶联糖皮质激素有效载荷。除了pAcF技术外，还成功地将含叠氮的赖氨酸类似物（AzK）带入到抗体中，以产生具有Auristin、PBD二聚体或微管蛋白有效载荷的位点特异性ADC。此外，赖氨酸的环丙烯衍生物（CypK）以及自然发生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合进入抗体中。所产生的ADC表现出良好的稳定性、选择性以及体外和体内活性。点击关注小白学药~ADC的进化史Mylotarg、Besponsa和第一代可切割连接子Mylotarg于2000年被FDA批准用于治疗急性髓细胞白血病（AML）。它是由卡奇霉素通过一个包含腙键的可切割连接子与gemtuzumab（一种突变的抗CD33 IgG4亚型单抗）偶联而成。这种ADC的平均药物抗体比(DAR)只有1.5，含有约50%的未偶联单克隆抗体。ADC内化后，腙键可在内体酸性环境中水解，释放出卡奇霉素的前体，然后由谷胱甘肽还原为自由活性的卡奇霉素。后者与DNA小凹槽结合并经历Bergman环化，从而产生高度反应性的双自由基，引起序列选择性DNA双链切割。从理论上讲，腙在生理pH值下应在血液循环中保持稳定，并在酸性条件下内化后进行选择性水解。然而，Mylotarg的连接子表现出一定的不稳定性，导致卡奇霉素在血浆循环中过早释放，严重的毒性导致随后辉瑞公司在2010年将Mylotarg退市。得益于近年来在临床上积累的经验以及技术的进步，Mylotarg于2017年重新获批，优化后提高了连接子的稳定性，以较低剂量使用，并修改给药计划，适用于不同的患者群体。一个类似的连接子被开发出来并用于将卡奇霉素偶联到inotuzumab，一种突变的CD22靶向抗体上， inotuzumab-ozogamicin (Besponsa）于2017年被FDA批准用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）。Kadcyla和第二代不可切割连接子鉴于这些发现，人们继续开发连接子设计的替代策略。然而，一个偶然的发现使Immunogen得以识别出一种出人意料的有效ADC。DM1通过含有N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC）的不可切割的连接子与曲妥珠单抗的赖氨酸残基偶联，这种ADC（T-DM1，Kadcyla）于2013年经FDA批准用于HER2阳性乳腺癌患者。这种新型的ADC在HER2阳性乳腺癌模型中非常有效，只有ADC在内化后在溶酶体中经酶完全消化后，原始结构才具有活性，以获得活性代谢物Lys-MCC-DM1。Adcetris, Polivy和第二代可切割连接子与此同时，西雅图遗传学设计了自己的偶联技术，通过可切割连接子mc-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺基间隔子、作为组织蛋白酶底物的标准Val Cit二肽序列和PABC自降解间隔子，将金盏花素（MMAE）生物偶联到抗CD30 抗体的半胱氨酸残基上，这种ADC（Adcetris）于 2011年被FDA批准用于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的治疗。Adcetris在肿瘤细胞内化后，可切割连接子降解，释放出的MMAE能破坏靶细胞并扩散到细胞膜上，到达并杀死邻近的癌细胞。这种现象被称为旁观者效应，允许释放的MMAE杀死CD30阳性和CD30阴性的肿瘤细胞。类似地，这种第二代连接子（mc-VC-PABC）被用于Polivy，一种将MMAE与polatuzumab（抗CD79b单抗）偶联的ADC，于2019年6月被FDA批准用于治疗成人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。第三代位点特异性的ADC尽管ADC取得了越来越大的成功，但直到2019年，市场上每一个批准的ADC都是以异质混合物的形式存在的，单抗上的细胞毒性药物数量不同且分布在不同的地方，导致了生产过程中的分析问题。事实上，DAR是不受控制的，这种复杂的混合物会显著影响ADC的药代动力学和药效。裸抗体可能是一种竞争性抑制剂，弱DAR偶联物的疗效较差，而具有高DAR的抗体在血浆中会被迅速消除，从而损害了ADC的治疗窗口。为了拓宽ADCs的治疗指数，自2008年以来，区域特异性生物结合方法得到广泛发展。这些位点特异性方法可分为三类：（i）天然或非天然氨基酸的生物偶联，（ii）使用酶的生物偶联或（iii）基于连接物的生物偶联。第一种方法是通过抗体工程引入特定的氨基酸。Junutula和他在Genentech的同事是先驱者，他们通过在靶向卵巢癌抗原MUC16的单克隆抗体的265位氨基酸与Adcetris®连接子进行定点生物偶联，开发出一种ADC。为此，他们在单克隆抗体的氨基酸序列中引入了两种半胱氨酸，选择了这两种半胱氨酸来保持IgG折叠和与抗原结合。将得到的TDC（ADC-硫单抗）与使用传统随机生物结合方法生成的ADC进行比较。两种ADC在小鼠异种移植模型中均有效，但TDC在大鼠和食蟹猴体内的耐受性高于ADC，并且在体内表现出较低的全身毒性。受此策略的启发，Seattle Genetics和Spirogen开发了一种类似的技术，称为MAIA，通过在mAb关键区域的239位引入丝氨酸半胱氨酸突变，实现PBD二聚体的生物偶联。第二种可能性是使用酶介导的区域特异性生物结合技术。谷氨酰胺转胺酶催化天然单抗的谷氨酰胺侧链与含有伯胺的分子之间形成酰胺键。基于此，Innate Pharma已经开发了一种使用谷氨酰胺转胺酶构建ADC的三步方法，如下图所示。最后，区域特异性ADC也可以从天然单抗中产生。在这一策略中，由创新的二溴甲基酰胺（DBM）或二噻吩基马来酰亚胺（DSPh）组成的异质双功能连接体可以通过区域特异性生物偶联产生更均匀和更稳定的ADC，DAR为4。小结在过去的十年中，ADCs已经通过选择更好的细胞毒性药物、生物偶联方法、更好的靶向抗原和优化的抗体工程得到了改进。然而，它仍存在一些局限性（如有限的实体瘤渗透性和毒性）以及耐药机制的出现。为了克服这些局限性，人们研究了新的抗体形式、新的传递系统、非内化抗原靶点、新的细胞毒性药物和位点特异性生物偶联方法来促进ADC的发展。虽然许多创新尚未在临床方案中得到验证，但这一领域的研究为我们提供了许多令人鼓舞的结果。相信ADC未来的十年将会迎来更加辉煌的前景。参考文献：1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442.2. Antibody–Drug Conjugates: The Last Decade. Pharmaceuticals 2020, 13, 245文章信息源于公众号小白学药，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读