Pafolacianine

本文通讯作者为北京师范大学先进材料研究中心副研究员周凯翔副教授，其主要研究领域为放射性药物化学，荧光分子探针，转化医学。 资料来源于官网（https://zkgyy.bnu.edu.cn/yjjg/xjclyjzx/xjclrcdw/xjclyjzxfjsfyjyxl/113511.htm） 摘要 开发用于高对比度生物成像的小分子近红外二区（NIR-II）荧光染料具有重要的应用价值，但也面临挑战。本文报道了一类新型NIR-II染料（命名为AFlavs）的设计，该设计通过整合花色素与聚甲川骨架构建而成。这些不对称分子具有高亮度（227–2396 M⁻¹ cm⁻¹）、优异的光稳定性以及强大的抗猝灭能力，是先进生物成像的理想选择。其中，AFlav-4在血管成像（包括肿瘤血管破坏评估、缺血再灌注评估以及通过纳米颗粒实现骨靶向递送）方面表现尤为突出。值得注意的是，AFlavs凭借超过100 nm的吸收波长分离，实现了双色、三色及四色多重成像，达到了目前报道的小分子NIR-II荧光染料中罕见的光谱正交性。这些发现表明AFlavs在体内高分辨率、多色及长期NIR-II成像方面具有巨大潜力。 引言 实时血管成像对于深入理解血管生物学、疾病进展及治疗效果至关重要。它提供了一种动态、无创的方法来观察血管功能、适应性与响应，从而改善血管疾病的诊断、治疗和康复。血管可视化技术的应用还能提高肿瘤手术成功率、减少术中并发症，尤其在复杂手术或高风险区域肿瘤切除中尤为关键。近红外生物成像技术因其能够提供快速反馈且具有非电离特性（相比X射线或CT扫描等其他成像方法更为安全），具有显著优势。尽管穿透深度存在局限，近红外荧光血管造影仍能为小型动物的血管系统提供重要洞察，尤其是在高时空分辨率下实时监测血管功能的急性或慢性变化方面。与传统的近红外一区（650–900 nm）相比，近红外二区（1000–1700 nm）光具有更深的组织穿透力、更高的分辨率、更佳的信噪比以及更低的自体荧光，使其在无创活体成像中极具前景。 小分子荧光染料因其结构可控、毒性低且清除机制明确，在临床生物成像中备受青睐，具有较高的临床转化潜力，例如FDA批准的吲哚菁绿（ICG）和Cytalux。尽管其精确设计可优化光学性能，使其成为活体荧光血管造影的理想选择，但构建近红外二区染料仍面临重大挑战。要实现高光稳定性、合适的荧光量子产率（QYs）和摩尔消光系数（MEC）以及多重成像分析极为困难。此外，此类染料的合成通常需要精确的分子工程化，以确保满足活体应用的严格要求，如在生物环境中的稳定性以及对深部组织成像的有效组织穿透性。因此，迫切需要开发适用于近红外二区窗的、具有生物相容性的高质量有机发光分子的设计理念，以满足这些严苛需求并推动临床生物成像的边界。 分子杂合作为药物化学的核心概念，以其在药物设计中的持久重要性和基础性作用而闻名。该方法在20世纪80年代兴起，并因其适应性、历史验证性以及对药物研发发展格局的契合而受到青睐。分子杂合的核心思想是将两个或多个分子中独特、具有生物活性的片段结合，将其药效亚单元整合到一个单一的化学实体中。该策略的主要目标是将单靶点药物转化为多靶点治疗药物，或巧妙地探索保留母体分子理想药理特性的新化学实体。通过整合两个或多个生物活性部分，这些杂合分子通常表现出比其单独组分更强的效力、选择性和药代动力学特性。一个典型范例是贝诺酯，它通过酯化介导的阿司匹林和对乙酰氨基酚偶联合成。该杂合分子不仅减轻了阿司匹林引起的胃肠道刺激，还显示出协同治疗效果。 图1a描绘了一个系统性的杂合工作流程。该过程始于结构交叉偶联和迭代优化，以生成连续的杂合代系。母体分子I和II分别提供不同的取代基（R1/R2和R1′/R3），且R1/R1′在重组过程中保持严格的位置保守性。后续代系通过在位置2（R2或空位）和位置3（R3或空位）进行组合取代，产生六个子代分子（III–VIII）。简而言之，杂合化合物可通过两种主要策略合成：一种是连接策略，即将生物活性片段通过连接子连接以保持靶点相互作用；另一种是骨架整合策略，即将分子组分合并或融合为单一结构以结合两种母体分子的特性。 图1. (a) 基于杂合方法中构建单元的重组策略示意图。(b) 通过杂合策略对花色素染料Flav7和SRHCYs进行结构骨架整合，从而开发出新型近红外二区（NIR-II）探针，以提升活体成像性能。同时引入二甲氨基萘基团以促进多色成像。(c, d) AFlavs系列染料的归一化吸收（c）与发射光谱（d），显示出该系列光学性质的红移趋势。(e) AFlavs探针的吸收和发射最大值在电磁波谱上的图示，呈现出良好的光谱分离趋势。 借鉴药物研发中成功的分子杂合策略，特别是骨架整合方法，作者将这一思路应用于近红外二区荧光分子的设计与合成。尽管前景广阔，分子杂合物的开发仍面临关键挑战，包括选择合适的靶点组合、实现对多靶点的平衡活性，同时保持理想的类药性质。受到菁染料作为高亮度、可调荧光团潜力的启发，Sletten课题组通过对传统IR26进行化学重构，用二甲基花色素核取代常规的吲哚杂环，开发了一条高效合成路线，获得了高亮度的小分子染料。随后，一系列近红外二区花色素-菁杂合荧光团被开发用于生物传感和实时多重标记。因此，作者选择Flav7作为构建新型近红外二区造影剂的亮度基准。作者先前报道了不对称的供体-π-受体（D-π-A）结构SRHCYs，其中DA-5在产生长波长染料方面展现出比传统菁染料更高的效率（FD-1080和SRHCY-4共享七个甲川单元和相同的电子受体，比较时观察到137 nm的红移；仅含一个甲川单元的DA-5其发射峰达到1088 nm），但受限于较低的摩尔消光系数。因此，作者在花色素染料Flav7和SRHCYs之间进行了骨架整合，以融合并构建不对称的聚甲川染料。此外，先前报道的此类不对称染料在高对比度生物成像和分析检测中已表现出卓越性能，从而为作者的设计策略提供了坚实的理论支持。这些见解共同巩固了作者分子工程设计的合理性，并凸显了作者新开发染料作为下一代近红外二区生物成像探针的潜力。 在本研究中，作者充分利用骨架杂合的优势，通过结合Flav7和SRHCYs的结构单元，构建了一系列新型基于不对称D-π-A结构的小分子近红外二区荧光团，命名为AFlavs。该方法旨在融合花色素染料的高亮度和光稳定性与SRHCYs的扩展共轭和可调性。所得的AFlavs系列展现出定制化的光学性质、优异的稳定性以及光谱正交性特征，共同实现了先进的多色、实时和深部组织成像。本文报道了这些新型探针的设计、合成、表征及活体评估，重点阐述了它们在血管、骨骼及多重成像应用中的实用性。 结果与讨论 设计与合成 骨架融合是一种无需连接子的杂合设计策略。Flav7与SRHCYs共享甲川单元，这些单元是通过共轭长度依赖的光谱调控决定菁染料光物理性质的关键因素。这种分子相容性促进了其发色/芳香体系的自发杂合，通过聚甲川骨架的无损融合，生成了一系列新型染料，命名为AFlav-3–5（图1b）。多色成像通过光谱解耦实现复杂系统的同步多尺度分析，从而为生物研究带来革命性突破。这一范式在使用近红外二区荧光团时达到最大效益，其光子优势体现为厘米级的组织穿透能力、高空间分辨率以及实时血流动力学监测。基于花色素衍生荧光团在近红外二区多重分析中的突破性进展，作者也旨在开发一系列优化用于血管及相关器官系统多通道可视化的染料。多重成像通常通过将不同的生物靶点与发射独特、非重叠波长的探针配对实现。为了在近红外二区范围内用不同荧光团产生良好分离的正交信号，荧光团应具备近红外吸收与近红外二区发射、延伸至近红外二区范围的长波长发射尾部，以及更高的整体亮度以补偿采集到的发射信号比例较小的问题。除了基本的发射参数，多色成像性能还关键取决于多个相互关联的因素。值得注意的是，不同荧光团之间吸收光谱的分离成为控制串扰的主导因素，直接影响成像特异性。由于融合后的AFlav-3–5的光物理性质可预测地由甲川单元数量决定（图1c–e），作者引入了二甲氨基萘基团作为额外的供体组分，以在空间上分离吸收波长。这基于作者之前的观察：该特定供体有助于实现具有极大斯托克斯位移的近红外二区染料。在化学合成方面，采用迭代的Wittig反应来延伸共轭双键并获得多种含醛化合物。最终的AFlavs可通过带有二甲氨基取代的芳香醛与二甲基花色素核心进行Knoevenagel缩合反应制备，随后通过传统化学方法进行细致表征。 光学性质 获得这些荧光团后，作者在二氯甲烷中系统评估了AFlavs的光物理性质。如图1c,d所示，随着供体取代和共轭双键的延伸，AFlavs在吸收（675–1038 nm）和发射最大值（864–1088 nm）上均呈现出渐进的红移。上述红移现象通过最高占据分子轨道-最低未占分子轨道能隙的有效减小得以证实。值得注意的是，AFlav-2至AFlav-5的吸收波长相差超过100 nm。这种激发正交性，结合尖锐、明确的发射轮廓，使得AFlavs非常适合用于具有高信号保真度和最小通道重叠的多色近红外二区成像。尤为突出的是AFlav-1（188 nm）和AFlav-2（179 nm）具有异常大的斯托克斯位移，这有助于减少自吸收并提高荧光成像应用中的信号清晰度。尽管AFlav-3至AFlav-5显示出较窄的斯托克斯位移，但仍显著大于已报道的花色素衍生染料（约20 nm）（。有趣的是，AFlav-2和AFlav-4（两者均含两个甲川单元）表现出相同的发射最大值，但吸收波长相差200 nm，这直接证明供体工程可有效调控基态和激发态构型。如表1总结，它们的相对量子产率范围在0.34–1.47%之间（图2a），摩尔消光系数约为50,000–160,000 M⁻¹ cm⁻¹，较SRHCYs有显著提升。这两个参数协同作用使得AFlavs的亮度值分布在227–2396 M⁻¹ cm⁻¹之间。综合来看，光谱正交性（尤其是良好分离的吸收带）和亮度指标使得这一系列分子特别适用于信号重叠最小的多重血管成像。 表1. AFlavs在CH₂Cl₂中的光物理参数 图2. (a) 不同荧光团（Flav7、IR26和AFlavs）的积分荧光随吸光度的变化关系。通过将线性拟合的斜率与标准化合物IR26（在二氯乙烷中量子产率为0.05%）进行比较，计算相对量子产率值。(b–d) AFlav-2、AFlav-4和Flav7在不同极性溶剂（乙腈、乙醇、丙酮、DMSO和二氯甲烷）中的吸收光谱，显示出随溶剂组成变化的明显峰值位移和吸光度变化。(e) 随时间（0–30分钟）的荧光淬灭测量，用于评估光稳定性。(f–h) 代表性染料随含水量增加时的吸收光谱变化，展示了不同程度的聚集效应。(i, j) 对不同分析物（包括Cys、GSH、NaHS、ONOO⁻、H₂O₂和TBHP）响应的相对吸光度变化，以测试对生物硫醇和活性氧的化学稳定性。 溶剂化显色响应、化学稳定性及光稳定性评估 系统研究了AFlavs与参考荧光团（Flav7和IR26）的溶剂响应性，以评估其体内适用性。如图2b–d所示，这些化合物的溶剂极性依赖性表现出不同的行为。AFlav-1和AFlav-2对溶剂极性变化敏感性极低，在各种溶剂中保持稳定的吸收峰。相反，Flav7和IR26表现出明显的溶剂化显色诱导的淬灭现象，特征是在二甲基亚砜（DMSO）等极性溶剂中吸收峰变宽变弱。随着双键共轭的延伸，AFlav-3至AFlav-5显示出逐渐减弱的抗淬灭效应，证实了先前研究表明过多的聚甲川单元与溶剂化显色密切相关。聚集研究进一步突出了AFlavs的稳健性：尽管Flav7和IR26在含水量达50%时表现出明显的聚集诱导蓝移和近乎完全的峰损失，AFlav-1和AFlav-2仍保持其光谱形状，仅损失约20–30%的强度。AFlav-3至AFlav-5显示出中等的聚集效应，但仍优于菁染料类似物（图2f–h）。光稳定性测试显示，所有AFlavs在长时间照射下均具有高度的抗光漂白能力，而ICG则迅速丧失荧光（图2e）。最后，通过检测荧光团对多种生物相关分析物（如半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、NaHS、过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和叔丁基过氧化氢（TBHP））的响应来评估其化学稳定性（图2i–j）。简而言之，IR26被证明对所有这些物质均化学不稳定。AFlavs、Flav7和ICG在与Cys、GSH、H₂O₂和TBHP孵育后表现出良好的稳定性。对NaHS和ONOO⁻的响应行为显示所有化合物均受到破坏，但程度不同。AFlav-4的量子产率为1.47%（比Flav7的0.61%高2.4倍），摩尔消光系数为1.63 × 10⁵ M⁻¹ cm⁻¹（比SRHCY-3的5.91 × 10⁴ M⁻¹cm⁻¹高2.8倍），其亮度达到2,396 M⁻¹ cm⁻¹，超过了母体染料Flav7（1,470 M⁻¹ cm⁻¹）和SRHCY-3（337 M⁻¹ cm⁻¹）。通过结合亮度、稳定性及在生物环境中的抗淬灭能力，AFlav-4成为血管成像应用的理想候选，该应用需要长期、高对比度的近红外二区可视化。 高分辨率系统性血管成像 为评估AFlav-4用于血管和淋巴管可视化的近红外二区荧光成像适用性，作者对小鼠进行了多角度成像。首先，将AFlav-4装载到胶束中以用于体内应用。如图3a–c所示，背部、腹部和侧位视图展示了详细的血管网络且背景干扰极小，而肠系膜成像（手术暴露，图3d）揭示了精细的血管结构。通过对小鼠四个足垫进行皮下注射，淋巴管和淋巴结能够以高对比度清晰可视化（图3e）。荧光强度剖面的定量分析得出半峰全宽值在约226.2至577.5 μm之间，证实了该成像平台的高空间分辨率。使用1000至1300 nm长通滤波器进行的成像表明，在较长波长下信噪比和血管轮廓描绘逐渐改善（图3f,k）。静脉注射造影剂后立即进行的动态成像实时捕获了通过完整头皮和颅骨（无需开颅）的小鼠脑部血管灌注动力学（图3g,h）。此外，如图3i,j所示，后肢密集且异常的微血管以及肿瘤相关血管能够轻松可视化，突显了该技术对异常血管结构的敏感性。另外，定量分析（图3l–o）进一步支持了AFlav-4在活体中进行深部组织、高分辨率、高保真度的血管和淋巴系统成像的能力。 图3. 使用AFlav-4进行活体正常血管及淋巴系统的高分辨率近红外二区荧光成像。(a–e) 多视角近红外二区成像（a，背侧；b，腹侧；c，侧位）展示了浅表和内部血管结构的清晰可视化；肠系膜血管（d）和淋巴结（e）被清晰成像。横截面强度谱分析证实了血管成像的高空间分辨率，并测定了血管宽度（半峰全宽）并进行了信噪比分析。(f, k) 使用长通滤波器（1000–1300 nm）进行的波长依赖性成像显示，在较长波长下对比度增强且血管轮廓更清晰（k）。(g, h) 注射后的延时成像显示了荧光剂快速灌注到脑血管中，实现动态追踪。(i, j) 后肢微血管（i）和肿瘤相关血管（j）以高灵敏度成像，突显了异常的血管网络。(l–o) 对分别源自（g–i）的荧光强度谱进行的定量分析，验证了不同组织和时间点的成像精度。比例尺：10 mm。 实时成像肿瘤血管破坏 选择血管相关疾病作为AFlav-4的新应用模型，是因为这些疾病代表了临床上迫切需要动态、高分辨率、实时成像的领域。传统成像方式难以捕捉快速且空间异质性的血管变化，且存在辐射暴露风险，而荧光血管造影为此提供了有利工具。考布他汀A4磷酸酯（CA4P）能选择性破坏肿瘤血流以诱导饥饿，迅速使肿瘤血管塌陷，触发破坏性级联反应和广泛的肿瘤坏死。为监测血管破坏剂诱导的肿瘤血管破坏，作者在4T1荷瘤小鼠给药CA4P前后进行了实时近红外二区荧光成像（图4a）。治疗前，多帧近红外二区成像显示血管网络稳定，荧光信号随时间持续，表明血流灌注完整。尤其是肿瘤部位密集分布着肿瘤来源的微血管，遍布整个病灶以支持其生长（图4b）。相比之下，CA4P治疗后，同一肿瘤位置的近红外二区成像几乎检测不到毛细血管结构，仅能清晰捕捉到少量较大血管（图4e）。尽管治疗前后的具体成像位置无法完全对准，但半定量三维荧光-时间分析清晰证明了荧光信号的显著差异，证实肿瘤毛细血管已被CA4P完全破坏（图4c–d）。这些结果验证了近红外二区成像结合AFlav-4能够动态、无创地捕捉微血管水平的早期血管关闭事件，这些事件是治疗效果的关键指标，但常被传统成像方式遗漏，从而为评估血管靶向治疗提供了有效工具。 图4. (a) 实验时间线示意图：基线近红外二区成像、CA4P给药以及治疗后0.5小时的成像。(b, e) 未经处理和CA4P处理的肿瘤血管在注射后代表性时间点的明场和近红外二区荧光图像，显示未处理肿瘤的血管结构稳定，而经处理肿瘤随时间推移血管逐渐塌陷且灌注丧失。AFlav-4胶束（100 μL，2.5 mg kg⁻¹，按染料浓度计算）在980 nm激光（124 mW cm⁻²）激发下成像，配合使用1300 nm长通滤波器和500 ms曝光时间。(c, d) 未经处理和已处理肿瘤的三维荧光-时间图，显示未处理肿瘤灌注稳定且毛细血管精细，而已处理肿瘤则表现出微血管荧光信号的快速下降。比例尺：10 mm。 后肢缺血再灌注评估 缺血常见于影响四肢的骨折和外周动脉疾病。在肢体抢救手术（如异位再植或功能重建）后，对缺血再灌注动态的实时监测对于评估组织恢复和手术效果至关重要。为研究缺血再灌注损伤的动态过程，作者在小鼠后肢缺血模型中进行实时近红外二区荧光成像。将ICR小鼠后肢剃毛置于仰卧位，通过止血夹对右后肢夹闭1、4、8或12小时诱导暂时性缺血，随后立即松开夹子并对血流恢复进行动态成像（图5a–b）。同时监测健康的左后肢以评估缺血再灌注情况。在后肢双侧选取三个感兴趣区域（ROIs），在图5c中用黄色圆圈标记为前端、中部和末端位置，以监测和评估缺血再灌注过程中的动态变化。如图5c–f所示，在缺血1小时组中，观察到快速且相对完整的血管再灌注。然而，更长的缺血时间导致再灌注逐渐延迟且不完全，特别是在肢体远端区域恢复受损尤为明显。定量荧光-时间曲线证实，随着缺血时间延长，再灌注动力学显著减慢。不同肢体区域灌注异质性的实时可视化显示，长时间缺血不仅延迟了血流恢复，还引起了空间选择性的血管缺损。这些发现证明了近红外二区成像在缺血再灌注损伤的动态、无创监测方面的实用性，并为缺血损伤后血管恢复的时间和空间特征提供了深入见解。 图5. (a) 对ICR小鼠剃毛后，在右后肢使用止血夹以诱发缺血，同时以健康的左后肢作为对照。(b) 缺血再灌注评估示意图。对后肢进行夹闭1、4、8或12小时，随后进行再灌注动态的近红外二区成像。(c–f) 后肢的连续近红外二区荧光图像，展示不同缺血时长下的动态再灌注过程。右侧为定量荧光强度曲线，描绘了缺血肢体和对照肢体不同区域（前端、中部、末端）的灌注动力学。更长的缺血时长与延迟且不完全的血管恢复相关，表现为荧光恢复减弱且不均匀。AFlav-4胶束（100 μL，2.5 mg kg⁻¹，按染料浓度计算）在980 nm激光（124 mW cm⁻²）激发下成像，配合使用1300 nm长通滤波器和500 ms曝光时间。比例尺：10 mm。 使用阿仑膦酸修饰的AFlav-4纳米颗粒进行骨靶向近红外二区成像 荧光成像的一个局限是其穿透深度较浅，难以“透视”身体并监测骨骼等内部组织，而骨骼对于支撑、免疫和代谢至关重要。虽然传统的X射线成像能够检测骨骼状况，但其具有固有的辐射风险。鉴于前述AFlav-4在近红外二区成像中的优异性能，作者评估了其在监测骨骼健康和微观结构方面的潜力。为实现骨特异性荧光成像，通过EDC/NHS介导的偶联反应对AFlav-4纳米颗粒进行修饰，合成了阿仑膦酸偶联的纳米颗粒（AFlav-4-bone NPs）（图6a）。静脉注射AFlav-4-bone NPs后的活体近红外二区成像显示，在脊柱、胸骨节段和四肢等骨骼结构处出现强烈且定位明确的荧光信号，而使用非靶向AFlav-4 NPs处理的小鼠则表现出弥散且微弱的荧光（图6b,e）。此外，肠道中偶发的荧光可能源于纳米颗粒的被动积聚，这或许得益于肠道的渗漏性血管系统或靶向递送前的体循环。定量分析证实，与AFlav-4 NPs组相比，AFlav-4-bone NPs组的脊柱与软组织荧光比值显著更高，且荧光强度剖面的高斯拟合显示出更优的定位效果，其峰值更窄，反映了脊柱的宽度（图6c–d）。高分辨率成像进一步实现了对椎体、棘突、肋骨和指骨等精细骨骼结构的清晰可视化（图6f–h）。离体骨骼的体外成像结果也支持了这些发现，如整个骨骼系统、颅骨、指骨、股骨、肋骨笼、脊柱和坐骨的清晰可视化，突显了AFlav-4-bone NPs有效的骨靶向能力（图6i–j）。这些结果表明，AFlav-4-bone NPs能够实现对整个骨骼系统的无创、高对比度近红外二区荧光成像，为骨特异性诊断和治疗应用提供了一种有前景的策略。 图6. (a) AFlav-4 NPs合成及其通过阿仑膦酸表面修饰获得骨靶向AFlav-4-bone NPs的示意图。(b, e) 注射AFlav-4-bone NPs和AFlav-4 NPs（100 μL，5 mg kg⁻¹，按染料浓度计算）后小鼠的活体近红外二区荧光图像。成像在980 nm激光（124 mW cm⁻²）激发下进行，配合使用1150 nm长通滤波器和200 ms曝光时间。(c, d) 对图像（b）和（e）中白色虚线区域进行脊柱与软组织荧光比值定量比较（c）及沿白色虚线的强度分布高斯拟合分析（d）。白色虚线圆圈指示软组织区域。(f–h) 活体与离体骨骼成像对比，显示了包括后肢骨骼和尾椎在内的精细骨结构。(i, j) 小鼠整体骨骼系统（i）及不同解剖部位骨骼（j）的近红外二区成像。比例尺：5 mm。 无串扰双色成像 近红外二区多色成像处于生物医学成像的前沿，能够实现对多个目标的实时同步可视化。在多色近红外二区成像中避免信号串扰对于实现不同生物靶标的高保真多重可视化至关重要。当一个荧光团的信号渗入另一个荧光团的检测通道时，就会产生串扰，导致误读。使用发射峰分离良好但亮度差异较大的荧光团可能导致荧光团亮度和发射尾迹失衡，其中高发射强度的染料可能掩盖较弱探针的信号，且这种影响通常难以预测。采用具有不同激发波段的荧光团仍然是从源头消除串扰的有效方法。幸运的是，AFlav-2至AFlav-5的吸收峰分离超过100 nm，可实现选择性激发且交叉激活极低。为验证AFlavs在多色近红外二区成像中的实际应用价值，作者选择了激发峰高度分离的AFlav-2和AFlav-5（激发峰分别为660 nm和1064 nm）在活体小鼠模型中进行双色成像。吸收光谱（图7a）清晰地展示了两种染料之间的强分离性：AFlav-2在近红外一区/二区交界处吸收，而AFlav-5则延伸至近红外二区深处。激发选择性测试（图7b）证实，每种染料均可被独立激发，交叉激活极低。具体而言，荧光强度比值（AFlav-2在660 nm激发下为9.6:1，AFlav-5在1064 nm激发下为1:23.6）反映了优异的光谱正交性，显著降低了信号串扰风险。利用AFlav-2（红色通道）和AFlav-5（蓝色通道）通过不同注射途径（i.g.，胃内；s.c.，皮下；i.v.，静脉；i.p.，腹腔），作者实现了对多个生物结构的同步、高特异性可视化，且光谱重叠几乎为零。这种成像方法提供了全面的解剖和功能信息：在侧位成像中（图7c），淋巴系统和胃均清晰可见，突显了区分不同组织类型的能力；腹部成像（图7d）实现了血管系统和淋巴网络的精确描绘；背部成像（图7e）则有效追踪了背部血管和淋巴系统。在腹部区域（图7f），血管系统和肠道蠕动均被动态可视化，展示了该系统的实时运动追踪能力。此外，肠系膜和肠壁的动态成像（图7g）揭示了快速的血液灌注以及血管与肠道结构之间明显的互补空间分布模式。定量荧光强度剖面分析（图7g-i,-ii）证实了成像结果，显示出良好分离的信号峰和在测试条件下通道间可忽略的重叠，验证了该双通道成像系统的高特异性、高灵敏度及无串扰性能。这些结果凸显了激发波长分离作为消除信号串扰主要策略的价值，并展示了AFlavs平台作为活体实时多重近红外二区荧光成像的稳健工具包的潜力。 图7. 使用AFlav-2和AFlav-5进行双色近红外二区荧光成像。(a) AFlav-2和AFlav-5在二氯甲烷中的归一化吸收光谱及其在PBS中胶束形式的吸收光谱，显示出完全分离。(b) 在660 nm（AFlav-2）和1064 nm（AFlav-5）激光下的激发选择性成像显示出优异的光谱正交性，串扰近乎为零。(c–g) 活体无串扰双色成像（红色通道：AFlav-2；蓝色通道：AFlav-5）。(c) 侧位视图下的淋巴系统和胃成像；(d) 腹部血管系统和淋巴网络定位；(e)背部血管和淋巴系统追踪；(f) 腹部血管系统和肠道蠕动可视化；(g) 肠系膜及肠壁血管与肠道的动态成像，显示快速灌注及互补的空间分布。定量荧光强度剖面（g-i和g-ii）展示了明显的信号定位和极小的通道重叠。比例尺：10 mm。 三色成像验证活体光谱正交性与多通道分辨率 随后，作者进一步评估了AFlavs的多色成像能力，采用由AFlav-2、AFlav-3和AFlav-5组成的三色系统。这些染料在二氯甲烷中的归一化吸收光谱及其在PBS中胶束形式的吸收光谱显示出良好分离的激发波段，表明染料之间存在清晰的光谱区分（图8a）。然而，在胶束形式下使用等浓度染料时，基于激发的成像谱显示在808 nm通道存在中度信号渗漏（图8b）。为解决此问题，作者通过浓度补偿调整胶束浓度为：AFlav-2 0.3 mg mL⁻¹、AFlav-3 0.5 mg mL⁻¹和AFlav-5 0.1 mg mL⁻¹，从而成功在三个激发波长下实现了完全的光谱正交性，并进一步通过相应的信号强度比验证（图8c–d）。如图8e所示，作者利用不同的激发通道和给药途径（AFlav-2，胃内；AFlav-3，皮下；AFlav-5，静脉）进行活体三色标记。在各自激发波段下的荧光成像及后续通道合并显示清晰的解剖分离：AFlav-2突出显示淋巴结构（淋巴管、腹股沟淋巴结），AFlav-3积聚于胃部，而AFlav-5则清晰呈现血管系统和肾脏形态（图8f）。注射后3.6秒和39.6秒的延时图像显示出快速的生物分布和稳定的定位，且未检测到通道间干扰。荧光强度剖面（图8f，右侧）显示每种荧光团具有尖锐且空间分离的峰，支持高分辨率的多通道区分。值得注意的是，在后续时间点（99.4秒、129.4秒和159.4秒）的延伸成像证实了信号的持续性和一致性，突显了AFlavs在复杂生物环境中的生物分布兼容性和长期追踪能力（图8g-i）。 图8. 使用AFlav-2、AFlav-3和AFlav-5进行三色近红外二区荧光成像。(a) 染料在二氯甲烷中的归一化吸收光谱及其在PBS中胶束形式的吸收光谱，显示清晰的激发波段分离。(b) 在相同染料浓度下（胶束形式，0.1 mg mL⁻¹），基于激发的成像谱显示在808 nm通道存在中度信号串扰。(c) 浓度补偿（胶束形式：AFlav-2 0.3 mg mL⁻¹，AFlav-3 0.5 mg mL⁻¹，AFlav-5 0.1 mg mL⁻¹）促进三个激发波长下的光谱正交性，并由相应的信号强度比支持。(d) 合并的三通道信号。(e)活体实验方案示意图：AFlav-2（胃内）、AFlav-3（皮下）和AFlav-5（静脉）给药途径以突出不同器官和血管。(f) 活体三色成像实现淋巴管和淋巴结（AFlav-2）、胃（AFlav-3）及侧位血管（AFlav-5）的同步可视化。延时成像捕获了染料的快速分布和区域特异性信号定位。线剖面图（右侧面板）显示各通道的空间分辨率和强度分离。(g–i) 后续时间点腹部区域的时间分辨成像显示稳定的三色定位与一致的荧光分离，证实了AFlavs平台用于动态多重成像的稳健性。比例尺：10 mm。 四色近红外二区成像展示全面多重分析能力 为展示AFlavs平台的全部多重成像潜力，作者使用AFlav-2至AFlav-5进行了四色近红外二区成像。吸收光谱（图9a）证实了正交激发所需的光谱分离。在优化探针浓度以补偿亮度后，每种荧光团均对其对应的激光激发产生选择性响应，强度比值验证了良好的信号隔离（图9b–d）。在活体中，染料通过不同途径给药（图9e）以靶向不同的解剖区域：AFlav-2（静脉注射）标记肝脏；AFlav-3（胃内给药）积聚于胃部；AFlav-4（皮下注射）追踪淋巴结构，包括腹股沟淋巴结和集合淋巴管；AFlav-5（静脉注射）增强腹部深层血管系统成像。在各自激发波长下以及给药后13.5秒的合并图像显示，四种探针间空间区分清晰，通道干扰极低（图9f）。沿多个解剖平面的线剖面分析（图9g–h）确认了锐利的信号分辨率和极小的光谱重叠。然而，由于AFlav-5在较晚时间点（50秒）血管信号逐渐增强，导致各通道间出现串扰（图9i）。此次四色成像验证了AFlavs设计的可扩展性和模块化特性，为需要高分辨率、多通道荧光对比的复杂生物成像任务提供了广泛适用的解决方案，这也是小分子荧光团在近红外二区窗口内罕见达成的技术里程碑。 图9. 使用AFlav-2、AFlav-3、AFlav-4和AFlav-5进行四色近红外二区荧光成像。(a)染料在二氯甲烷中的归一化吸收光谱及其在PBS中胶束形式的吸收光谱，显示出适用于多色成像的独特激发波段。(b) 激发特异性体模成像（激发波长：660、808、980和1064 nm）显示四通道间存在串扰。(c) 精细调控各探针浓度实现了高度信号独立性，四通道间无干扰。信号强度比值说明了每种染料的强选择性响应。(d) 合并的四通道信号。(e)活体染料给药途径示意图：AFlav-2（静脉注射）、AFlav-3（胃内给药）、AFlav-4（皮下注射）和AFlav-5（静脉注射），以及成像时间点。(f) 活体四色成像揭示了解剖区室化分布：AFlav-2标记肝脏；AFlav-3定位于胃；AFlav-4描绘淋巴管和淋巴结；AFlav-5显影腹部血管系统。13.5秒和50秒的合成图像显示同步信号检测和解剖清晰度。(g–i) 荧光强度线剖面图（I–III）显示所有四种染料的空间分辨率及极小的通道重叠，验证了该平台实时四色成像的能力。比例尺：10 mm。 结论 本工作中，作者提出了AFlavs，这是一类通过花色素与SRHCY骨架进行框架杂合而构建的小分子近红外二区荧光团家族。该设计融合了花色素染料的亮度/模块化特性与聚甲川系统的光谱覆盖范围和可调性，产生具有定制化光学特征、大斯托克斯位移（40–189 nm）以及相对于SRHCY类似物提升的亮度（227–2396 M⁻¹ cm⁻¹）的紧凑型发光分子。在该系列中，AFlav-4因其在生物相关介质中的均衡性能和稳健性，成为活体成像的实用先导化合物。利用AFlav-4，作者实现了深部组织、实时的血管及淋巴系统成像，并进行了血管相关疾病的诊断。骨靶向纳米颗粒进一步实现了高对比度的骨骼成像。AFlav-2至AFlav-5的吸收最大值分离超过100 nm，使得在测试条件下可实现激发正交的双色、三色及四色成像，并具有清晰的通道隔离。重要的是，虽然碳纳米管、量子点和稀土纳米颗粒等无机近红外二区平台已展现出强亮度和多色成像能力，但其临床转化常受限于长期生物相容性、清除机制及合成复杂性等方面的考量。相比之下，AFlavs保留了小分子有机探针的优势，具有精确结构、可调性和良好药代动力学特性，同时实现了有竞争力的光学性能。总体而言，AFlavs拓展了近红外二区探针的化学空间，并确立了框架整合作为实现功能增强型发光分子的通用路径。该平台支持高保真、实时、多通道的生物成像，并为靶向诊断、影像引导干预和诊疗一体化发展奠定了基础。 本文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04745