Mebendazole

肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）和非催化区酪氨酸激酶（NCK）相互作用激酶（TNIK）是一种定位于染色体3q26.2～3q26.31的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于生发中心激酶（GCK）家族。该蛋白由1 360个氨基酸组成，相对分子质量1.55×105[1]。作为Wnt/β‑连环蛋白（β‑catenin）通路的关键激活因子，TNIK通过磷酸化转录因子4（TCF4）Ser154驱动靶基因转录，同时参与转化生长因子-β（TGF-β）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）及c‑Jun氨基末端激酶（JNK）等多条信号通路的调控[2]。TNIK在多种慢性纤维化、肿瘤及退行性病变中异常高表达，已被视为极具潜力的多疾病治疗靶点[3]。 TNIK抑制剂通过阻断Wnt/β-catenin等信号通路而发挥抗纤维化与抗肿瘤活性，目前主要围绕特发性肺纤维化（IPF）及实体瘤等适应证开展临床及临床前研究。目前，全球唯一进入临床阶段的TNIK抑制剂Rentosertib（研发代号ISM001-055、INS018-055）为人工智能（AI）从头设计产物，其IIa期临床试验已在IPF患者中证实可显著改善用力肺活量（FVC）（P＜0.05）[4-5]。然而，纵观TNIK抑制剂的研发历程，临床转化仍面临激酶选择性不足、构象依赖性活性差异及支架功能干扰等核心挑战。本文从TNIK结构特征与信号网络切入，按化学骨架分类解析代表性TNIK抑制剂的结合模式与构效关系，深入剖析“构象悖论”等临床转化瓶颈，并展望AI药物设计及新型抑制策略的未来方向，为TNIK抑制剂的进一步开发及临床转化提供参考。 1 TNIK的结构生物学信息 TNIK归属于GCK-IV亚家族，其分子架构由3个功能域串联组成：N端激酶结构域（催化核心）、中间结构域（MD）和C端Citron同源结构域（CNH结构域）[1,6]。N端激酶域为典型的蛋白激酶双叶折叠结构，由N-叶（N-lobe）和C-叶（C-lobe）通过柔性铰链区连接而成，其中铰链区的Glu106和Cys108残基是多数三磷酸腺苷（ATP）竞争性抑制剂形成关键氢键的核心锚定点[6]。中间结构域介导TNIK与TRAF2、NCK、β-catenin等适配蛋白的相互作用，可在空间上拉近转录因子TCF4与β-catenin，增强转录复合体的组装稳定性[6]。C端CNH结构域呈β-螺旋桨样折叠结构，可与GTP结合的小GTP酶Ras相关蛋白2（Rap2）特异性结合，参与调控细胞骨架重排和膜转运过程[6-7]。 尽管激酶域的晶体结构已有多篇报道，但全长TNIK的结构解析仍面临挑战，研究者利用蛋白质结构预测工具AlphaFold获得的TNIK结构模型，为理解其支架功能提供了重要线索[6]。该模型揭示，激酶域下游存在一段特征性螺旋片段，对应β-catenin的结合界面，表明TNIK通过特定空间构象将β-catenin与TCF4在三维空间中拉近，促进转录复合体组装。值得注意的是，全长TNIK的构象柔性不仅决定了其催化活性的调节，更直接影响其作为支架蛋白的功能完整性。 2 TNIK介导的信号通路与潜在适应证 基于TNIK蛋白的多结构域特征，TNIK在细胞内信号转导网络中发挥中枢调控作用，广泛参与Wnt、TGF-β、PI3K/Akt、JNK、核因子‑κB（NF-κB）等多条关键通路的调节（图1）[3]。这些通路的异常激活或失调与多种人类疾病密切相关。鉴于TNIK在信号网络中的节点地位，理解其介导的各条通路对于阐明其病理生理作用及指导靶向药物开发具有重要意义。 2.1 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号通路（即经典Wnt通路）是TNIK研究最为深入的通路。在该通路中，Wnt配体与细胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled）受体及共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）结合后，抑制由轴蛋白（AXIN）、腺瘤性结肠息肉病蛋白（APC）、酪蛋白激酶1（CK1）和糖原合成酶激酶3（GSK3）组成的β‑catenin降解复合物，使β-catenin在胞质中累积并进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子结合，启动下游靶基因的转录[3]。研究证实，TNIK是TCF4的相互作用因子，能够直接结合TCF4与β-catenin，并使TCF4发生磷酸化，是Wnt转录程序的必需特异性激活因子[8]。 该通路的异常激活与多种疾病密切相关。在结直肠癌中，超过80%的病例携带Wnt通路基因突变（如APC突变），导致β-catenin的组成性激活，因此抑制TNIK靶点能够阻断由突变引起的异常Wnt/β-catenin信号[3]。此外，该通路的失调还参与卵巢癌、滑膜肉瘤、甲状腺乳头状癌及多发性骨髓瘤等多种肿瘤的发生[3,9]。 2.2 TGF-β信号通路 TGF-β信号通路在早期胚胎发育、器官形成、免疫监视、组织修复及成体内稳态中具有重要作用[10]。在病理状态下，TGF-β的过表达会通过Smad（如Smad2/3与Smad4复合物）与非Smad信号通路（包括Wnt/β-catenin）之间的复杂串扰，触发上皮-间质转化（EMT）、细胞外基质（ECM）沉积及癌相关成纤维细胞的形成，进而促进纤维化疾病与肿瘤的发展[3]。 2.3 膜突蛋白样蛋白（Merlin）/黏着斑激酶（FAK）信号通路 膜突蛋白样蛋白（Merlin）是由神经纤维瘤蛋白2基因编码的肿瘤抑制蛋白，能够负向调控细胞生长[11]。研究证实，TNIK能够直接磷酸化Merlin，影响其结构和活性，而FAK则是Merlin的下游效应分子。该通路在肺鳞状细胞癌中的作用尤为突出，TNIK可能通过Merlin介导的FAK通路激活参与调控细胞迁移、侵袭[12]。 2.4 PI3K/Akt/mTOR信号通路 PI3K/Akt/mTOR信号通路与癌症的侵袭、转移行为密切相关。研究表明，在TNIK扩增的人胃癌细胞系中，TNIK抑制剂可显著下调Akt的磷酸化水平，同时上调自噬标志物微管相关蛋白1轻链3（LC3）的表达[13]。近期研究还提示TNIK在肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病的发生发展中亦发挥重要作用[14]。 此外，TNIK通过调控JNK和NF-κB信号通路参与炎症反应的调节，使其成为自身免疫性疾病治疗的潜在干预靶点[15-16]。最新研究还揭示TNIK可作为内皮细胞通透性的氧化还原传感器，进一步拓展了其生理功能的认知边界[17]。 TNIK通过整合多条信号网络在结直肠癌、IPF、代谢性疾病等多种病理过程中发挥核心调控作用，这为其作为多适应证治疗靶点提供了充分的生物学依据。基于上述信号网络中的关键地位，开发靶向TNIK的小分子抑制剂已成为多个疾病领域的研究热点。 3 TNIK小分子抑制剂分类及结合模式 TNIK小分子抑制剂的研发经历了从筛选发现到结构导向设计，再到AI驱动的从头设计等多阶段演进。理解不同化学骨架抑制剂的结构特征与构效关系，是把握TNIK抑制剂设计逻辑的关键。 截至目前报道的所有TNIK小分子抑制剂均以ATP结合位点为靶标，通过占据ATP裂隙竞争性抑制激酶催化活性[18]。然而，尽管多数化合物在体外酶学水平表现出纳摩尔级的高抑制效力，其在细胞和动物模型中的实际药效却往往存在数量级差异。为厘清这一现象背后的结构机制，本文将尚未进入临床的代表性候选化合物按核心化学骨架分类，剖析其构效关系与结合模式，并在此基础上探讨决定细胞层面药效的关键构象因素。最后，聚焦于目前唯一进入临床阶段的里程碑式分子Rentosertib，系统解析其突破传统设计局限的创新策略。代表性TNIK抑制剂的基本信息见表1。 3.1 单杂环类抑制剂 单杂环类抑制剂以五元或六元含氮杂环为核心骨架，通过杂环氮原子或邻近取代基直接与TNIK激酶域铰链区（Glu106和Cys108）形成氢键网络，是早期高通量筛选中最易命中的骨架类型。该类骨架结构简洁、合成路线成熟，但也存在激酶选择性不足、构象偏好单一等固有缺陷。 KY-05009（IC50＝9 nmol·L−1，图2）是噻唑系列中具代表性的优化产物之一。该化合物能够以剂量依赖方式抑制ATP与TNIK的结合，其抑制常数（Ki）为100nmol·L−1。在非小细胞肺癌A549细胞中，KY-05009可通过削弱Smad及非Smad信号通路，显著而强效地阻断由TGF-β激活的EMT过程，受影响的通路还包括Wnt、NF-κB、FAK-Src-桩蛋白相关黏着斑通路以及JNK信号通路[22]。研究表明，KY-05009与多靶点激酶抑制剂Dovitinib联合使用时，可在人多发性骨髓瘤IM-9细胞中产生协同抑制效应[23]。从成药性角度看，氨基噻唑类化合物合成路线成熟、水溶性较好，但因其与铰链区的结合模式在激酶家族中普遍存在，选择性优化难度较大：早期化合物在400余种激酶谱中常显示数十个脱靶，这一缺陷成为该骨架临床转化的主要瓶颈。 3.1.3 吡啶类抑制剂Koc-Kan等[26]报道了4-苯基-2-苯胺基吡啶类TNIK抑制剂，其中代表性化合物5（图2）的酶活性IC50为8 nmol·L−1。晶体结构（蛋白质数据库编号5AX9，PDB：5AX9）显示其与TNIK呈现精细的结合模式：吡啶环氮原子与Cys108主链氨基形成氢键，苯胺基NH与Cys108羰基形成第二个氢键，末端氰基延伸至ATP结合位点的裂隙深处并与Lys54、Met105和Asp171产生疏水相互作用，同时Lys54与Glu69之间形成盐桥，上述相互作用为蛋白激酶闭合型活性构象的典型结构特征[6,26]。共晶结构解析进一步表明，该系列化合物可将TNIK稳定于αC-helix-in的闭合活性构象，这直接导致其对Wnt靶基因表达的抑制极弱（IC50＞2 μmol·L−1），对结直肠癌细胞活力也无显著影响。此类现象首次系统性揭示了TNIK抑制领域著名的“构象悖论”：即稳定αC-helix-in闭合构象（TypeI型结合）的抑制剂虽能实现极低的酶学IC50值，却无法阻断TNIK与TCF4及β-catenin的支架蛋白相互作用，最终导致“强效酶学抑制但极弱细胞活性”的严重脱节[6]。 3.2 稠合杂环及多环类抑制剂 稠合杂环及多环类抑制剂构成TNIK抑制剂中结构多样性最丰富的类别。该类骨架的共同特征在于包含2个或更多稠合环系统，通过扩展的共轭体系提供更稳定的结合构象与更丰富的空间取代位点，便于进行系统性的构效关系优化。根据核心骨架的化学结构差异，可进一步细分为喹唑啉/喹啉、苯并咪唑、二氢苯并噁嗪酮/苯并噁唑酮、苯并噻嗪酮、吡咯并咔唑、吡咯并吡啶及萘啶等多个亚类。各类骨架虽共享多环稠合的结构共性，但在结合模式、构象选择性和生物学活性方面呈现显著差异，反映了TNIK抑制剂设计中对ATP口袋占据策略的多元化探索。 3.2.1 喹唑啉/喹啉与双喹唑啉类抑制剂喹唑啉类代表了TNIK抑制剂研发史上的重要拐点。NCB-0846（图3）是首个具有口服体内活性的TNIK小分子抑制剂，对TNIK的IC50为21 nmol·L−1[27]。晶体结构解析（PDB: 5D7A）揭示了其独特的结合模式：喹唑啉核心与铰链区Cys108形成2个氢键，末端苯并咪唑环通过分子内氢键与Gln157主链形成第3个氢键[27]。更重要的是，NCB-0846将TNIK稳定在开放非活性构象（αC-helix-out），导致调节棘（R-spine）解体并有效破坏TNIK支架复合物的组装。这一结合模式使其在细胞模型中展现出显著的抗Wnt信号活性，成为早期跨越“构象悖论”的关键突破，为后续抑制剂优化确立了“构象决定细胞功能”的核心准则[6]。体内外活性评估显示，NCB-0846在结直肠癌细胞系中可抑制肿瘤生长和干性，在滑膜肉瘤模型中表现出抗肿瘤活性，并可抑制TGF-β激活的EMT过程[27]。 NCB-0846的立体选择性是其构效关系研究中最值得关注的发现之一。其环己烷末端手性羟基的对映异构体NCB-0970（图3）的抑制活性（IC50＝272 nmol·L−1）是NCB-0846活性的十三分之一，提示手性中心的空间取向直接决定了分子在ATP口袋中的结合亲和力。然而，NCB-0846在0.1 μmol·L−1浓度下对FLT3、Janus激酶3（JAK3）、血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）、原肌球蛋白受体激酶A（TRKA）等靶点抑制率＞80%，其广谱脱靶选择性是临床转化的主要障碍[27]。构效关系分析表明，该选择性不足源于喹唑啉骨架与铰链区的结合模式在激酶家族中的普遍性，仅依赖该核心难以实现TNIK亚型选择性区分。 3.2.2 苯并咪唑类抑制剂Tan等[30]通过计算机辅助药物设计（CADD）策略对1 448种美国食品药品监督管理局（FDA）批准药物进行虚拟筛选，发现广谱驱虫药甲苯咪唑（MBZ，图3）可选择性抑制TNIK（Kd≈1 μmol·L−1）。MBZ的苯并咪唑核心与铰链区Cys108形成氢键，其氨基甲酸酯的羰基也与Cys108产生额外相互作用。在10 μmol·L−1浓度下，MBZ对TNIK的抑制率达91.8%，同时对ABL原癌基因2非受体酪氨酸激酶（ABL2）、EGFR、丝裂原活化蛋白激酶激酶1（MEK1）同源激酶无明显抑制[30]。虽然MBZ安全性好、毒理学数据充分且具备明确的临床用药经验，但微摩尔级效力与专门设计的纳摩尔级抑制剂相比仍存在明显差距，提示药物重定位策略在TNIK靶点上的适用性受限于其非针对性的药效团特征。 Dovitinib（图3）是由Novartis Pharma AG开发的多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，主要靶点包括成纤维细胞生长因子受体1-3（FGFR1-3）、FLT3和巨噬细胞集落刺激因子受体（c-Fms）等，对TNIK具有高亲和力（解离常数Kd＝24 nmol·L−1，Ki＝13 nmol·L−1）[31-32]。2016年，Chon等[32]在研究其对人多发性骨髓瘤IM-9细胞的抗癌机制时，意外发现TNIK参与了其活性机制。作为处于上市前阶段的药物，Dovitinib的药动学特性已知且安全性充分表征，但其多靶点特性使其不适合作为TNIK特异性抑制剂开发，仅可作为机制研究的辅助工具或在联合用药策略中发挥作用。 3.2.3 二氢苯并噁嗪酮/苯并噁唑酮类抑制剂四川大学杨水云、李利团队先后报道了2个系列的新型骨架化合物。其中，二氢苯并噁嗪酮类代表化合物13（图3）的TNIK IC50为26 nmol·L−1，在HCT-116细胞中抗增殖作用的IC50为4.26 μmol·L−1[33]。该化合物在371种激酶谱中展现出优异的选择性，仅在血管内皮生长因子受体4（FLT4，IC50＝30 nmol·L−1）及FLT1（IC50＝191 nmol·L−1）上存在微弱脱靶，对其他所有激酶的IC50均≥500 nmol·L−1。其选择性显著优于早期的氨基噻唑类和喹唑啉类化合物。分子对接结果显示，化合物13的7-氮杂吲哚末端与铰链区形成氢键时不伸入ATP结合口袋最深区域，据此推测其结合模式与NCB-0846类似，即通过稳定激酶的非活性开放构象而发挥抑制作用，因而具备抗Wnt信号通路的潜在结构基础[33]。然而，化合物13的酶学活性与细胞活性之间相差约2个数量级，提示其细胞膜渗透性或胞内靶向效率可能成为优化瓶颈。 苯并噁唑酮代表化合物14（图3）的TNIK IC50为50 nmol·L−1，在HCT-116细胞中的抗增殖IC50约5 μmol·L−1，其主要脱靶靶点为Flt4，次要为KDR[34]。化合物13与14具有相同的7-氮杂吲哚末端基团和类似的结合模式特征。值得注意的是，该2个化合物与TNIK P-loop区域的相互作用较弱，其抑制活性可能主要来源于与溶剂区附近Lys41和Lys118残基通过阳离子-π相互作用产生的额外结合力。尽管选择性显著改善，但二者的口服生物利用度和体内药代动力学数据尚未见报道，限制了对其成药性的全面评价。 3.2.4苯并噻嗪酮类抑制剂苯并噻嗪酮系列中，ON108600（图3）是早期报道的强效TNIK抑制剂（IC50＝5 nmol·L−1）[35-36]。该分子对酪蛋白激酶2α1（CK2α1）和双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1B（DYRK1B）亦表现出同等水平的抑制活性（IC50分别为5、7 nmol·L−1），在三阴性乳腺癌模型中可有效抑制肿瘤干细胞并诱导紫杉醇耐药细胞的凋亡，但其选择性不足限制了作为TNIK特异性抑制剂的开发前景。从成药性角度而言，ON108600在多靶点协同抑制策略中可能具有潜在价值，但作为单一TNIK靶向药物仍需进行深度骨架优化以提高选择性。 3.2.5 吡咯并咔唑类抑制剂PD407824（图3）是最早被解析晶体结构的TNIK抑制剂之一，最初作为细胞周期检查点激酶Wee1和Chk1的抑制剂被开发，对TNIK展现出极强的抑制活性（IC50＝0.7 nmol·L−1）[2,37]。2016年解析的TNIK-PD407824共晶结构（PDB：2X7F）首次揭示了TNIK激酶结构域的抑制剂结合模式：吡咯并咔唑环与铰链区Glu106和Cys108的主链羰基和酰胺基团形成多重氢键网络，同时通过氢键与位于N-lobe的Tyr36残基发生相互作用。这些多重分子间作用力共同稳定了PD407824与TNIK的结合，使TNIK激酶结构域呈现出闭合的活性构象（αC-helix-in）[6]。然而，PD407824因强烈的DNA嵌入毒性和药动学方面的局限而未能进一步开发。作为刚性稠杂环化合物的代表性案例，PD407824提示研究人员在追求极高酶学活性的同时，必须系统评估化合物的安全性和吸收、分布、代谢、排泄与毒性（ADMET）性质。 3.2.6 吡咯并吡啶类抑制剂2021年，Yang等[38]从自建激酶抑制剂化合物库中筛选获得一系列1H-吡咯并[2,3-b]吡啶为骨架化合物，其中最优化合物17（图3）的酶学抑制活性达迄今最高水平，对TNIK的IC50为0.13 nmol·L−1。该化合物在Jurkat细胞中呈浓度依赖性地抑制白细胞介素-2（IL-2）的分泌，抑制效果与已知TNIK抑制剂NCB-0846相当。该系列化合物目前仍处于早期发现阶段，缺乏激酶选择性谱数据。然而，其1H-吡咯并[2,3-b]吡啶骨架作为常见ATP竞争性结合基序，存在潜在的脱靶效应风险；此外，IL-2分泌抑制的体内免疫调节作用及其可能带来的免疫抑制不良反应，以及化合物的体内药动学性质和长期耐受性，均需在后续临床前研究中系统评估。 3.2.7 萘啶类抑制剂Read等[39]于2019年报道了2类萘啶衍生物化合物18和19（图3），其酶学抑制活性IC50分别为8 nmol·L−1和7 nmol·L−1。该类萘啶化合物是从吡啶并嘧啶骨架的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）抑制剂优化而来，故对与TNIK具有高度序列同源性的MAP4K4及MINK1亦表现出交叉抑制活性[40]。化合物18与靶标TNIK的共晶结构（PDB：6RA5）揭示，萘啶骨架通过Glu106和Cys108主链的羰基和酰胺基团与铰链区形成2个氢键；同时萘啶环还与Lys54形成氢键，而Lys54与Glu69之间形成盐桥[6]。上述相互作用使得TNIK再次呈现闭合的活性构象（αC-helix-in），与PD407824及苯胺基吡啶类抑制剂结合靶标后的状态高度相似，从而再度陷入“构象悖论”：此类化合物虽具有优异的酶学活性，其在细胞水平上的抗增殖及抗Wnt信号活性却十分有限。这一结果进一步确证，结合后所诱导的激酶构象状态是决定TNIK抑制剂细胞水平药效的先决因素。在选择性方面，这类化合物的MAP4K4/MINK1交叉抑制问题源于GCK家族激酶ATP结合口袋的高度序列相似性，仅通过萘啶骨架本身难以实现亚家族区分。 纵观传统骨架抑制剂的研发历程，“构象悖论”始终是制约TNIK抑制剂临床转化的核心瓶颈。早期研究多致力于追求极低的酶学IC50值，却忽视了构象选择性对细胞功能阻断的决定性影响：Type I型激酶抑制剂（如化合物5、PD407824、萘啶类）虽酶活性卓越但因稳定闭合活性构象导致细胞活性弱；而以NCB-0846为代表的Type II型激酶抑制剂虽能通过稳定开放非活性构象有效抑制Wnt信号，却又普遍面临激酶选择性差或ADMET性质不佳的挑战。如何在维持高抑制效力的同时，实现特异性的构象调控并兼顾成药性，成为TNIK靶向药物研发的“多重矛盾”。 直至近年来AI驱动药物设计的引入，这一困境方取得重要突破。AI平台不仅能够探索超越传统化学直觉的全新骨架，更能在多维化学空间中同步优化结合模式与理化属性。由AI从头设计并成功进入IIa期临床的里程碑分子Rentosertib为TNIK抑制剂的研发带来了突破，其设计利用结构创新突破构象悖论，引领该靶点药物的研发新阶段。 3.3 咪唑类骨架抑制剂与AI设计的突破 咪唑骨架代表了TNIK抑制剂设计中最新且最成功的策略，其标志性产物Rentosertib（图4）是首个由AI从头设计并推进至临床IIa期的TNIK抑制剂[4-5]。该化合物的研发不仅突破了“构象悖论”的核心难题，更标志着AI驱动药物设计从概念验证走向临床应用的里程碑。 3.3.1 AI辅助设计流程 英矽智能科技（上海）有限公司（Insilico Medicine）利用Chemistry 42平台将TNIK高分辨率晶体结构输入深度生成模型，在确认铰链区Cys108与Glu106的结合区域可被有效占据后，将核心骨架优化为双咪唑结构，并通过强化学习在百万级化学空间中完成虚拟筛选与迭代优化[4]。与传统CADD依赖预定义物理力场和打分函数、在有限化学空间内进行分子对接不同，AI驱动的生成式设计依托变分自编码器（VAE）、生成对抗网络（GAN）及Transformer架构，能够在数十亿级化学空间中生成符合预设理化约束的全新分子骨架。Chemistry 42平台通过迁移学习策略，将TNIK有限的结构-活性数据与GCK家族其他成员的大规模构效关系数据相结合，有效提升了模型对小样本靶点的预测精度。上述AI辅助的基于结构的药物设计（SBDD）工作流程，自起始化合物至优化候选药物仅耗时约18个月，显著缩短了传统药物发现周期。 3.3.3 突破构象悖论的三重机制Rentosertib结合后TNIK呈现DFG-in和αC-helix-in构象，按传统分类属于I型（Type I）结合模式，本应受“构象悖论”的制约[41]。然而，Rentosertib通过三重独特机制突破了这一规律：（1）咪唑2与催化位点Lys54的氢键及Asp171-Lys54盐桥的破坏扰动了催化网络；（2）对门控残基Met105构象的强制调节通过长程构象传播影响了中间域与转录复合体的空间适配性；（3）双咪唑骨架在铰链区和催化区域产生的多重交联作用使TNIK锁定在“虽为αC-helix-in但功能受损”的特殊构象状态。这表明突破构象悖论的关键并非简单稳定开放非活性构象，而是通过创新性结合模式在闭合活性构象框架内实现功能阻断。 3.3.5 AI驱动设计的局限与湿实验匹配挑战尽管Rentosertib的成功标志着AI药物设计的重要里程碑，该领域仍有待持续优化。在强化学习多目标优化中，如何系统化设定酶学活性、构象选择性、ADMET和选择性之间的权重分配，仍需进一步标准化。现有AI模型大多基于激酶类靶点的高通量筛选数据训练，对G蛋白偶联受体（GPCR）、离子通道等靶点的泛化能力尚待验证[42]。多目标优化算法能有效平衡“构象悖论”中的多重需求，近期系统综述也指出生成式AI已在罕见病药物开发中展现出缩短研发周期的巨大潜力[42-43]。此外，AI计算生成分子的速度远超传统化学合成与生物活性测试的承载能力，未来的改进方向在于建立“高通量合成与在线表征平台”，使湿实验的验证通量能够更有效地匹配AI生成的分子流，实现工业级循环迭代。2026年发表于《自然》子刊的综述也强调了这一问题，指出AI设计在肿瘤药物发现中虽展现出巨大前景，但临床转化仍面临湿实验验证的“最后一公里”挑战[44]。 4超越传统ATP竞争性小分子抑制剂的新策略 目前报道的绝大多数TNIK小分子抑制剂以ATP结合位点为靶标，通过竞争性占据ATP裂隙发挥抑制作用。然而，ATP口袋在激酶家族中的高度保守性导致了选择性难题，加之“构象悖论”的制约，促使研究者探索超越传统ATP竞争性小分子抑制剂新策略。天然产物、RNA介导抑制以及蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）降解策略等近年来受到广泛关注。 4.1天然产物 天然产物以其结构多样性和通常较低的脱靶毒性优势成为发现新骨架的潜在来源。Ma等[45]通过分子对接与分子动力学模拟筛选出2种天然化合物候选分子，与NCB-0846相比展现出更高的结合亲和力和更优的ADME预测结果。Sun等[46]报道异喹啉类天然生物碱药根碱通过靶向TNIK抑制Wnt/β-catenin信号通路和EMT过程，在乳腺癌模型中显示出抗增殖活性。Vinogradov等[47]利用硫肽从头发现策略产生了具有纳摩尔级TNIK抑制活性的分子。 然而，天然产物普遍存在效力不足（多在微摩尔级）、水溶性差和口服生物利用度低等成药性缺陷，限制了其作为先导化合物直接开发的可行性。尽管如此，它们为新型骨架发现和优化提供了宝贵的结构模板。 4.2 RNA介导的抑制策略 非编码RNA的表观遗传学调控为TNIK抑制提供了全新的视角。Wu等[48]发现miR-5590-3p作为内源性非编码RNA可通过靶向降解TNIK mRNA，有效抑制Wnt/β-catenin信号通路，为TNIK调控提供了表观遗传学层面的新视角。RNA介导的基因沉默策略理论上可以实现对TNIK表达水平的精准调控，完全避免了小分子抑制剂的构象选择性问题。 然而，非编码RNA的体内递送效率、组织特异性和免疫原性仍然是临床转化的主要障碍，目前该策略仍处于概念验证阶段。 4.3 PROTAC靶向降解策略 Zhou等[49]报道了基于蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术的TNIK降解剂。相较于传统的小分子抑制剂，PROTAC具有催化性质、可靶向非活性位点区域、潜在规避耐药突变等理论优势。 然而，PROTAC相对分子质量通常＞800，口服生物利用度和细胞渗透性仍需大幅优化。此外，TNIK的支架功能是否会被PROTAC介导的完全降解所破坏，以及过度降解是否引发代偿性通路激活，均需在体内外模型中进行系统验证。 4.4 不同抑制策略的比较评价 PROTAC降解策略和RNA靶向抑制在理论上可彻底消除TNIK蛋白表达，规避ATP口袋保守性带来的选择性难题。然而，这3种新型策略的临床转化同样面临独特挑战（表2）。PROTAC相对分子质量通常＞800，口服生物利用度和细胞渗透性仍需大幅优化；RNA介导的基因沉默策略则受限于体内递送效率、组织特异性和免疫原性；天然产物则普遍受限于理化性质和成药性缺陷。尽管如此，这些新型策略为应对ATP竞争性抑制剂的固有局限提供了重要补充，未来可能与传统小分子抑制剂形成互补的治疗格局。 5 临床转化瓶颈：深层机制剖析与应对策略 TNIK抑制剂从优秀体外化合物到成功临床药物的转化面临多重挑战。整合既往文献与最新研究证据，从机制层面分析关键矛盾及其解决路径。 5.1 激酶选择性：保守ATP口袋与脱靶毒性的矛盾 丝氨酸/苏氨酸激酶的ATP结合口袋在进化上高度保守，TNIK所属的GCK家族成员（如MAP4K4、MINK1）在活性位点序列同源性超过60%，这是多数早期TNIK抑制剂脱靶效应的结构根源[26]。早期氨基噻唑类（如NCB-0001）和喹唑啉类（如NCB-0846）化合物在激酶谱中均显示数十个高亲和力脱靶靶点[19,27]。二氢苯并噁嗪酮类（化合物13）和苯并噁唑酮类（化合物14）通过独特的结合位点投射策略将脱靶范围大幅缩小至Flt4和Flt1，选择性显著改善[33-34]。 5.2 效力-暴露量-毒性的三角矛盾 高系统暴露量导致的脱靶毒性在TNIK抑制剂开发中反复出现。四川大学研究的喹啉衍生物化合物9是典型案例：其TNIK抑制活性达6 nmol·L−1，口服生物利用度高达84.64%，但在HCT-116异种移植瘤模型中即使高剂量给药TGI仅52%～59%，且伴随动物体质量减轻和死亡[8]。药动学分析揭示，10 mg·kg−1剂量下AUC₀～ₜ已达45 694 μg·h·L−1，提示高系统暴露量导致的脱靶毒性是效力受限的根本原因[8]。这一现象的机制可归结为：TNIK在肠道干细胞、肝细胞和中枢神经系统中均有基础表达。当抑制剂系统暴露量过高时，不仅靶向肿瘤或纤维化组织中的TNIK，也会广泛抑制正常组织中的生理性TNIK功能。特别是肠道TNIK的抑制可能损害肠道屏障功能并扰乱菌群稳态，这与临床前模型中观察到的胃肠道毒性高度一致[7,20]。解决这一矛盾的可能路径包括：（1）开发组织靶向递送系统（如纳米载体或肺部吸入制剂）以提高病灶局部分布，降低全身暴露；（2）优化化合物在靶组织中的选择性富集能力，通过理化参数调控实现组织偏好性分布；（3）采用间歇给药策略替代持续抑制，保留TNIK在正常组织中的基础生理功能[50]。 5.3 支架功能干扰的双刃剑效应 TNIK独特的支架蛋白功能（通过中间域介导TCF4-β-catenin相互作用）使其抑制剂设计面临双刃剑困境。开放非活性构象抑制剂（如NCB-0846）虽能有效破坏支架复合物组装，但也可能引发转录复合体解体后的代偿性信号上调[6]。近期研究提示，TNIK抑制可能间接激活替代性Wnt非经典通路（如Wnt/PCP通路），这解释了部分动物模型中单药疗效受限的现象[6]。 此外，TNIK的支架功能在不同细胞类型中发挥差异化作用——在肠道干细胞中是维持干性的关键因子，而在神经元中参与突触蛋白稳定[3,27]。这种组织与细胞类型依赖性使得抑制剂的安全窗设计更为复杂：同一分子在不同适应证中可能呈现迥异的安全性谱。因此，未来TNIK抑制剂的开发需针对不同适应证建立特异性的安全性评价体系。 纵观TNIK抑制剂研发历程，临床转化面临的核心矛盾可归纳为3点：（1）强效闭合构象抑制剂的细胞活性困境——酶学IC50与细胞活性存在2～3个数量级差距；（2）高选择性分子的体内药效不足——细胞膜渗透性与胞内靶点占有率不匹配；（3）口服制剂暴露量与脱靶毒性的失衡——高生物利用度未必转化为高治疗指数。Rentosertib的成功表明，通过AI驱动的多目标优化和变构后门腔占据策略，可以在一定程度上突破上述矛盾，但彻底解决仍需在组织靶向递送和支架功能精准调控方面持续创新。 6 结语与展望 TNIK作为Wnt/β-catenin通路的关键激活因子，在肿瘤、纤维化及代谢性疾病等多种病理过程中发挥中枢调控作用。TNIK抑制剂的临床转化需从“一刀切”的广谱抑制策略转向基于适应证的精准开发：在结直肠癌等Wnt依赖性肿瘤中，应建立基于通路激活状态的生物标志物体系用于患者分层，并探索与Porcupine同源蛋白（PORCN）抑制剂或β-catenin降解剂的联合用药以应对信号网络代偿性激活[51]。在纤维化领域，Rentosertib的IIa期数据奠定了TNIK靶向治疗的基础，未来适应证应从IPF进一步向肝纤维化和肾纤维化拓展[4-5]；这些器官纤维化同样涉及TGF-β/Wnt通路的异常激活与EMT驱动的组织重构，且临床需求更为迫切，可通过开发组织靶向递送系统（如吸入制剂、纳米载体）提高病灶局部药物浓度，降低全身暴露量引发的脱靶毒性[7]。对于代谢性疾病与神经退行性疾病等新兴适应证，则需优先开发组织选择性富集的抑制剂，并采用适度剂量或间歇给药策略以兼顾疗效与基础生理功能保护[50]。 随着AlphaFold3、冷冻电镜等结构生物学技术的持续进步，全长TNIK及其与TCF4-β-catenin转录复合体的高分辨率结构解析将为变构抑制剂和支架-催化双重调控策略提供精准模板。同时，AI辅助药物设计平台（如Chemistry42）的多维优化算法与自动化合成表征平台的闭环联用将进一步加速创新分子的发现与验证。Rentosertib的成功已证明“构象悖论”并非不可逾越、多重矛盾可通过系统性优化实现平衡。未来，随着结构生物学、计算化学与AI技术的深度融合，以及组织靶向递送和精准临床分层策略的不断完善，TNIK靶向药物有望在肿瘤、纤维化等多适应证领域实现从概念验证走向临床获批，成为下一代精准医疗的重要武器。返回搜狐，查看更多

靶点识别是药物发现的核心环节，涉及表型筛选机制解析、脱靶效应评估、新靶点发现和药物重定位。传统实验方法通量低且覆盖有限，而计算方法已从早期基于化学相似性的模型，演进为整合配体特征、蛋白结构和多组学数据的AI框架。 计算方法分为六大类：配体中心方法基于“相似分子靶向相似蛋白”假设，利用机器学习（如随机森林、神经网络）和指纹相似度预测靶点，代表工具有MolTarPred、SuperPred等，但难以处理新颖化学型；靶点中心方法依赖蛋白3D结构，通过结合口袋几何/理化互补或反向对接（如TarFisDock、idTarget）预测，近期结构感知AI（如EquiPocket、DeepSite）和AlphaFold3等考虑了构象动态；混合方法整合配体相似性与靶点结构信息，如COMET、PTFinder；基于设计的方法（如CRD）从配体出发逆向构建结合位点假说；系统水平方法整合知识图谱、多组学网络（如TarIKGC、CMap），实现全基因组范围预测；不可知靶点筛选则针对疾病蛋白质组识别可成药靶点（如DrugTar）。 表2列举了目前已经有多类成功案例：MolTarPred预测抗类风湿关节炎药actarit靶点为碳酸酐酶II并实验验证；SEA预测孤儿药和GPCR药物的脱靶受体；KronRLS预测tivozanib的激酶脱靶；BenevolentAI知识图预测baricitinib抗COVID-19靶点AAK1等，临床显示病毒载量下降；mebendazole被预测为MAPK14抑制剂用于胶质母细胞瘤并在体外确认；全基因组流程发现血吸虫病p97靶点并获体内验证；多组学识别特发性肺纤维化的TNIK靶点，其抑制剂已进入IIa期临床。这些案例表明计算预测需实验验证形成闭环。 当前局限包括训练数据偏向知名蛋白、对新颖化学型泛化能力差、多数方法未充分捕捉蛋白构象动态、难以将主靶点排首位并区分有益/有害脱靶。未来需提升AI可解释性，融合生物物理机制实现原子级预测解释，并推动精准医疗中患者特异性靶点识别。 总体而言，AI驱动的多模态计算策略正变革药物靶点识别，但数据偏差、动态建模和可解释性仍是突破关键，有望加速药物研发和个性化治疗。