Resigratinib

作者：Yong-Jin Wu,* Alyah F. Chmiel, Joanne J. Bronson引用格式：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c03492摘要 自1951年概念提出以来，生物电子等排原理已成为药物设计与开发的核心策略，使药物化学家能够通过合理修饰分子结构，优化化合物的生物学活性与理化性质。本综述梳理了57款FDA批准药物与18个晚期临床候选药物的研发案例——这些项目均通过生物电子等排替换，成功解决了先导化合物优化阶段遇到的各类成药性挑战。这类策略性的结构替换可显著提升化合物的活性、选择性、溶解度与代谢稳定性，同时改善脂溶性偏高、血浆蛋白结合异常、活性代谢产物生成等问题。综上，这些案例充分体现了生物电子等排原理作为多功能工具的持久价值，可用于精细调控候选药物性质，攻克当代药物化学领域的多重挑战。 1. 引言 电子等排体的概念最早由Langmuir于1919年提出，他发现电子数相同的分子（如N₂和CO）具有相似的性质。1951年，Friedman将这一概念拓展为生物电子等排体，定义为结构相近、可产生相当生物学活性的原子或原子团。生物电子等排体可进一步分为两类：经典生物电子等排体（如一价、二价、三价原子或基团）与非经典生物电子等排体（如环状与非环状官能团）。本质上，生物电子等排替换是指对先导化合物中的官能团、片段或骨架进行互换，在保留化合物生物活性的同时，引入更优的成药性质。 生物电子等排原理是药物设计与开发中最强大的策略之一，它不仅能帮助药物化学家提升先导化合物的生物活性与类药性质（如溶解度、渗透性、代谢稳定性、药物相互作用风险），还可去除先导分子中潜在的毒性基团（如苯胺、苯酚、硝基取代基），从而消除或降低不良反应风险。此外，生物电子等排替换还能产生全新化学型，或得到理化性质、药代动力学更优的分子，拓展药物发现的化学空间。 生物电子等排原理的价值已在大量FDA批准药物的研发中得到充分验证，本综述将讨论其中多个案例（代表性案例见方案1）。部分药物仅通过看似简单但设计精妙的生物电子等排替换即可直接由前体得到，通常仅涉及1-2个原子的改动，例如：氘代丁苯那嗪（2，H→D，见2.1节）、布格替尼（54，砜→二甲基氧化膦，见4.4节）、拉米夫定（99，CH₂→S，见7.6节）。 但在先导分子的迭代优化中，生物电子等排替换通常会伴随其他结构修饰，以抵消新引入的等排体带来的负面影响。例如甲状腺激素受体（THR）激动剂瑞美替昂（65，见5.1.7节）的前体65b含有富电子苯酚，研究人员将其替换为缺电子哒嗪酮杂环，这一改动提升了选择性，但使活性下降了10倍。为恢复活性，研究人员进一步将CH₂CO₂H基团替换为氰基氮尿嘧啶（一种特殊的羧酸生物电子等排体），最终得到化合物65。该案例展示了通过多重生物电子等排修饰弥补先导分子缺陷的思路，这也是药物设计中的常用策略。类似地，特泊替尼（41）由高通量筛选（HTS）命中化合物41a开发而来，将代谢不稳定的噻二嗪酮母核替换为哒嗪酮，同时将氨基甲酸酯片段替换为嘧啶环（见3.3.1节）。 尽管已有多篇综述讨论药物化学中的生物电子等排原理，但本综述聚焦于最终得到FDA批准药物、或推进至后期临床试验的候选药物的研发案例。入选案例均具有代表性、指导性，且与当代药物化学遇到的实际挑战直接相关。文中讨论的大部分案例为FDA批准药物；若临床候选药物（无论研发推进中或已终止）能提供特别有价值的设计思路，也会纳入讨论。全文中，FDA批准药物使用通用名标注，临床候选药物使用企业编号指代。 本综述按生物电子等排体的主要类别划分章节：氢、卤素、羟基与硝基类生物电子等排体；酰胺、酯与羧酸类生物电子等排体；砜与磺酰胺类生物电子等排体；苯基类生物电子等排体；芳香杂环类生物电子等排体；饱和环类生物电子等排体。每一节按具体的等排替换类型（如苯基生物电子等排体章节中的苯基→吡啶酮）排布，介绍代表性案例、采用该等排体的设计逻辑，以及对药物性质的最终影响。若存在与等排体设计相关的结构生物学证据，也会纳入说明，以展示等排体与靶蛋白的关键相互作用。本文聚焦晚期临床阶段与已上市药物，旨在凸显生物电子等排原理在将新型有效药物推向临床过程中的现实价值。 2. 氢、卤素与硝基类生物电子等排体（1-2个关键原子改动）2.1 氢→氘：氘代丁苯那嗪 过去数年，氘代药物的研发热度持续上升，进入临床评估的氘代化合物数量不断增加。与母体氢取代化合物相比，氘代修饰通常对化合物的物理性质与药理活性影响极小；但由于动力学氘同位素效应（DIE，即C-H键与C-D键断裂的反应速率常数比值k_H/k_D，通常在1-7范围内），氘代可显著改变化合物的代谢特征。因此，氢→氘替换可作为改善肝微粒体（LM）稳定性、调整CYP抑制谱（包括时间依赖性抑制，TDI）、和/或改变代谢位点的策略。由于氘同位素效应对上述性质的影响并非总能预测，氘代类似物必须通过临床前研究制备并评估，才能明确同位素效应的幅度与方向。尽管如此，药物化学家仍常将氘代修饰作为改善药物性质的工具。 氘代丁苯那嗪（2）于2017年获批用于治疗亨廷顿病相关的舞蹈症，是首款获FDA批准的氘代药物。它与前体药物丁苯那嗪（1）结构几乎完全一致，仅将两个甲氧基替换为三氘代甲氧基（图1）。氢被氘替换后，两个甲氧基的CYP450介导代谢速率减慢，使药物半衰期延长（氘代丁苯那嗪为8.6 h，丁苯那嗪为4.8 h），全身暴露更稳定。这些性质支持更低的日服药频次（多数患者每日1次，对比丁苯那嗪每日2次）、更低的日剂量（氘代丁苯那嗪18 mg，丁苯那嗪37.5 mg），同时耐受性更佳。 图1 丁苯那嗪（1）与氘代丁苯那嗪（2）的结构2.2 氢→氘：氘代鲁索替尼 鲁索替尼（3）是口服Janus激酶1/2（JAK1/2）抑制剂，获批用于治疗骨髓纤维化（一种导致红细胞生成减少的骨髓恶性肿瘤）。它是目前最成功的JAK抑制剂之一，2022年年销售额峰值达41亿美元。但由于环戊基基团会被代谢生成多种羟基化代谢产物，其人体半衰期较短（3 h）。烷烃碳原子的羟基化通过回弹羟基化机制进行，其中氢原子提取是决速步，该过程通常由CYP450等酶催化，活化烷烃的惰性C-H键。 为解决这一问题，研究人员在环戊基上引入8个氘原子，得到氘代鲁索替尼（4）（图2），其半衰期略有延长，约为4 h。氘代鲁索替尼（4）于2024年获批，用于中重度斑秃成人患者的一线口服治疗。 图2 鲁索替尼（3）与氘代鲁索替尼（4）的结构2.3 氢→氘：氘可来昔替尼 靶向酪氨酸激酶2（TYK2）假激酶（JH2）结构域，是自身免疫与炎症疾病高选择性疗法的全新开发方向。传统JAK抑制剂结合所有JAK家族成员高度同源的活化激酶（JH1）结构域，而JH2抑制剂靶向TYK2特有的调控结构域，因此选择性更高、安全性更好。 氘可来昔替尼（5）是高选择性口服TYK2假激酶抑制剂，2022年获批用于成人中重度斑块状银屑病（图3）。分子中引入N-三氘代甲基-甲酰胺基团，可减慢C3位酰胺的代谢，同时提升分子整体代谢稳定性。这一分子修饰减少了主要代谢产物5a的生成——5a虽活性相近，但激酶选择性更差，存在脱靶副作用风险。与氘代有效阻断该代谢通路的结论一致，临床前物种中5a的血浆浓度极低（<2 nM）。在人体内，氘可来昔替尼（5）主要通过CYP1A2介导的三唑N-去甲基化代谢生成5b，该代谢产物保留了与母体相当的药理活性，而5a等伯酰胺代谢产物的生成可忽略不计。 图3 氘可来昔替尼（5）及其主要代谢产物（5a、5b）的结构2.4 氢→氘：氘代依伐卡托 依伐卡托（6）是囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）增效剂，目前既可单药治疗携带特定CFTR突变的囊性纤维化患者，也可与CFTR校正剂鲁马卡托联合用药。依伐卡托（6）人体半衰期为11 h，需每日2次口服给药，原因是其在人体内代谢生成两种主要代谢产物6a和6b。为精准阻断叔丁基甲基取代基的CYP3A4介导氧化，研究人员开发了氘代依伐卡托（7）（图4），其半衰期延长至16 h，可支持每日1次的口服给药方案。由氘代依伐卡托、万扎卡托与替扎卡托组成的三联复方制剂Alyftrek，于2024年获批用于治疗囊性纤维化。 图4 依伐卡托（6）、依伐卡托主要代谢产物（6a、6b）与氘代依伐卡托（7）的结构2.5 氢→氟：替扎卡托与鲁马卡托 许多药物分子的C-H键会经CYP450介导氧化生成代谢产物，进而被快速清除。C-H键键能相对较弱，替换为键能高得多的C-F键，是减轻或消除该代谢通路的有效策略。尽管氢与氟的电负性差异显著，但二者原子尺寸相近，氢→氟替换通常可保留母体化合物的药理性质，同时优化类药特征。氟独特的电子性质还有可能与靶蛋白产生新的、不同于母体的相互作用，从而提升结合亲和力与受体选择性。此外，合理的氟代修饰还可在不损害其他性质的前提下，提高候选药物的溶解度。尽管氟取代的影响难以完全预测，但开发先导分子的氟代类似物仍是先导优化中的常用策略。 在CFTR校正剂替扎卡托（8）与鲁马卡托（9）的研发中，氟代修饰提升代谢稳定性的应用颇具代表性（图5）。两款药物均于2019年获批，用于治疗至少携带1个F508del突变或其他治疗响应型CFTR基因突变的囊性纤维化患者。 以10a为代表的未取代苯并二氧戊环，化学稳定性良好，但体内存在两大潜在风险：第一，苯并二氧戊环的CH₂可在肝脏经CYP450代谢生成卡宾中间体，该中间体能与CYP酶的血红素铁原子紧密结合，形成稳定的代谢中间体（MI）复合物（10b），进而抑制酶活性（方案2）。该复合物的稳定性会升高药物与其他经CYP450清除药物的相互作用风险。第二，MI复合物解离后释放儿茶酚（10c），其可经CYP450进一步氧化生成具有化学反应性的邻位醌10d。该中间体能与蛋白质、DNA等生物分子反应，可能引发毒性。 在替扎卡托（8）与鲁马卡托（9）中，研究人员引入两个氟原子形成2,2-二氟苯并二氧戊环，在保留活性的同时阻断了卡宾中间体的生成。 图5 替扎卡托（8）与鲁马卡托（9）的结构 方案2 苯并二氧戊环（10a）的生物活化过程2.6 氢→氟：PF-06650833 PF-06650833（11）是白细胞介素1受体相关激酶4（IRAK4）抑制剂临床候选药物，用于治疗炎症（如类风湿关节炎）。研究中11a被确定为口服有效的先导化合物，但由于外周血单核细胞（PBMC）实验中活性不足，预测的人体给药剂量过高，限制了其开发。在11a的内酰胺羰基α位引入氟取代基，得到PF-06650833（11）（图6），其酶水平与PBMC实验中的活性均显著提升。 氟取代带来的活性提升，归因于内酰胺NH的氢键给体（HBD）能力增强。强吸电子诱导效应的氟原子（在与IRAK4的共晶结构中呈假直立构象）增强了11分子内酰胺NH的酸性，使其成为更优的氢键给体，可与Ala315和Asn316的骨架羰基形成氢键（图7）。这与¹⁵N NMR谱中内酰胺氮向低场位移3.2 ppm的结果一致，说明11的内酰胺氮比11a带有更多正电荷。 另一方面，氟原子的引入预计会降低内酰胺羰基的氢键受体（HBA）能力——该羰基原本可直接与Ser328侧链羟基形成氢键，并通过结合水分子间接与Lys213作用。但总体而言，氢键给体能力增强带来的收益超过了氢键受体性质损失，最终使11的活性优于11a。 PF-06650833（11）已完成类风湿关节炎与化脓性汗腺炎的II期临床试验。但在化脓性汗腺炎适应症中，该药物未展现出优于安慰剂的疗效，后续开发前景尚不明朗。 图6 11a与PF-06650833（11）的结构 图7 11与IRAK4的共晶结构（PDB: 5UIU）2.7 氢→氟：瑞戈非尼 索拉非尼（12）是首批获批的血管生成抑制剂之一，2005年上市；其后续产品瑞戈非尼（13）于2012年获批。两个分子结构几乎完全一致，仅瑞戈非尼（13）在中心苯环、脲基NH的邻位多了一个氟原子（图8）。这个精准排布的氟原子，使生化实验中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的抑制活性提升约20倍。 索拉非尼（12）与VEGFR2的共晶结构显示（图9），两个脲基氢与Glu885的侧链羧酸氧形成氢键网络。尽管尚无瑞戈非尼（13）与VEGFR2的共晶结构报道，但可以推测：吸电子的氟原子增强了相邻脲基氢的酸性，提升了其作为氢键给体的能力，进而强化了与Glu885羧酸氧的氢键相互作用。此外，氟原子还可与相邻的13分子NH形成分子内氢键，“屏蔽”一个脲基氢键给体位点，从而提升膜渗透性与细胞水平活性。 临床试验中，对于索拉非尼（12）治疗后疾病进展的肝细胞癌患者，瑞戈非尼（13）可显著延长总生存期。得益于更优的药理性质，瑞戈非尼（13）口服剂量为160 mg每日1次，而索拉非尼（12）需400 mg每日2次。需要说明的是，瑞戈非尼给药剂量更低并不代表其耐受性必然更好：瑞戈非尼常见不良反应包括手足皮肤反应、高血压、乏力、腹泻；索拉非尼则常见腹泻、脱发、皮疹、手足皮肤反应。（这段是不是勉强了点） 图8 索拉非尼（12）与瑞戈非尼（13）的结构 图9 12与VEGFR2的共晶结构（PDB: 4ASD）2.8 氢→氟：阿培利司 阿培利司（14）是选择性磷脂酰肌醇3-激酶α（PI3Kα）抑制剂，2019年获批与氟维司群（雌激素受体拮抗剂）联合用药，治疗内分泌治疗后进展的激素受体（HR）阳性、人表皮生长因子受体2（HER2）阴性、PIK3CA突变的晚期或转移性乳腺癌患者。 CF₃基团的引入基于化合物14a的结合模型：模型显示，一个比叔丁基稍大的取代基可适配疏水小口袋。C-F键键长（约1.35 Å）长于C-H键（约1.09 Å），因此CF₃基团的空间体积大于甲基。基于此，研究人员将其中一个甲基替换为CF₃，得到阿培利司（14）（图10）——一种强效、高选择性的PI3Kα抑制剂。 阿培利司（14）与PI3Kα的共晶结构验证了上述结合假设，同时还发现CF₃取代基中的一个氟原子与Lys802的侧链氨基形成额外氢键（图11）。仲酰胺与噻唑的顺式构型由O-S (n-π*)硫键相互作用稳定，该拓扑结构使噻唑氮原子与相邻仲酰胺NH形成双氢键，与铰链区残基Val851结合。 除提升活性外，CF₃取代基还可阻断叔丁基的氧化，从而显著降低清除率，改善大鼠体内药代动力学（PK）性质。 图10 14a与阿培利司（14）的结构 图11 14与PI3Kα的共晶结构（PDB: 4JPS）2.9 氢→氟：比克替拉韦 水溶性差的化合物，常伴随临床前模型与临床中口服生物利用度低、暴露量波动大的问题。在先导优化阶段，解决水溶性问题通常颇具挑战。提升水溶性的经典通用策略，包括用氮原子替换碳原子的生物电子等排替换（如苯基→吡啶），或引入水溶性基团（如碱性胺、酸性官能团）。而氟取代这类更精细的结构改动，优势在于可能提升水溶性，同时不损害其他理想性质。 氟提升溶解度的效果，在第二代整合酶链转移抑制剂（INSTI）比克替拉韦（15）的研发中得到了充分体现（图12）。该药2018年获批用于治疗人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染。例如，对INSTI 15a（溶解度：pH 1/7条件下分别为34/53 μg/mL）进行6位氟代，得到的15b溶解度有小幅提升（pH 1/7条件下分别为87/85 μg/mL）。令人欣喜的是，该取代还提升了对HIV-1整合酶G140S/Q148R突变体的抑制活性，表现为倍数偏移更低。将15a的缩醛碳手性中心翻转，最终得到比克替拉韦（15）——一种强效INSTI，耐药谱更优、药代性质更好，溶解度也略有提升。 图12 15a、15b与比克替拉韦（15）的结构2.10 氟→氯：阿思尼布 阿思尼布（16）是全球首创的ABL1肉豆蔻酰口袋特异性靶向III型抑制剂，2021年获批用于伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼等I/II型酪氨酸激酶抑制剂治疗后进展的费城染色体阳性（Ph+）慢性髓性白血病（CML）患者。 阿思尼布（16）带有罕见的OCF₂Cl基团，用于替换其前体16a中的OCF₃基团。16a的分子模拟显示，OCF结合口袋可容纳稍大的基团，优化口袋内结合的策略之一，便是将一个氟原子替换为氯原子（图13）。该改动使活性提升2倍，同时保留了药代性质与溶解度。 后续化合物16与ABL1的共晶结构分析显示，化合物深度占据别构肉豆蔻酸结合口袋，其氯原子与Leu448的骨架羰基氧形成卤键，C(sp³)-Cl…O键角为178.3°（接近最优角度），Cl…O距离为3.3 Å（图14）。 有趣的是，从计算logP来看，OCF₃替换为OCF₂Cl预计会提升脂溶性，但实验测得16与16a的logP值完全一致。尽管氯甲基醚是已知的亲电反应性基团，但二氟氯甲基醚不会生成反应性中间体，因为两个吸电子氟原子不利于阳离子物种的形成。 图13 16a与阿思尼布（16）的结构 图14 16与ABL1（T334I_D382N）的共晶结构（PDB: 5MO4）2.11 氯→乙炔基：厄洛替尼 吉非替尼（17）与厄洛替尼（18）是首批获FDA批准的表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂，用于治疗晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）。两个化合物的核心差异在于：17的3-氯-4-氟苯基，在18中被替换为乙炔基苯基（图15）。 吉非替尼中，邻位氟的吸电子效应增大了相邻氯原子σ空穴的尺寸与正电势，使其与EGFR L858R（驱动NSCLC的常见基因突变）活性位点内Leu788的骨架酰胺羰基形成卤键相互作用。而在厄洛替尼（18）中，弱酸性的炔氢作为氢键给体，与非活化态EGFR的Leu764骨架羰基氧结合（对应EGFR L858R中的Leu788），因此乙炔基可作为卤素的生物电子等排体。二者分别与EGFR的共晶结构均可验证上述相互作用（图16）。 尽管厄洛替尼（18）在NSCLC细胞中的体外活性谱与吉非替尼（17）大致相近，但其日口服剂量更低，为150 mg每日1次，吉非替尼为250 mg每日1次。 图15 吉非替尼（17）与厄洛替尼（18）的结构 图16 EGFR L858R与17的共晶结构（左，PDB: 2ITY）、非活化EGFR与18的共晶结构（右，PDB: 4HJO）2.12 羟基→氨基：JAB-21822 索托雷塞（19）是首款RAS GTP酶共价抑制剂，2021年获批用于成人KRAS G12C突变的局部晚期或转移性NSCLC。JAB-21822（20）是同靶点的后续产品，已在中国完成II期临床试验。 它由索托雷塞经6处生物电子等排改造演化而来：C3位N/C替换、C6位F/Cl替换、OH/NH₂替换，以及3处H/F取代（方案3）。 为降低19的高脂溶性，研究人员将吡啶并嘧啶酮母核替换为萘啶酮，并引入3-氰基，用于置换亚口袋中的高能水分子；该改动还可去除哌嗪环上的甲基，大幅降低脂溶性（cLogP下降1.2），同时保留抑制活性。 下一步优化的目标是去除或替换酚羟基——该基团存在葡萄糖醛酸化程度波动大、渗透性不佳的潜在问题。但苯酚是维持结合亲和力的关键基团，可与G12C蛋白Asp69的侧链羧酸形成氢键（图17左）。将苯酚替换为苯胺生物电子等排体（20b）后，生化水平活性得以保留，但细胞水平活性略有下降。随后对萘啶酮母核进行C6位F→Cl修饰（20c），使细胞水平活性提升10倍。最后，将未取代的苯胺全氟取代，得到20——一种强效、口服生物利用度良好的G12C抑制剂。 在19和20与GDP结合型G12C的共晶结构中，酚羟基与四氟苯胺占据相同的疏水亚口袋（图17）。19的羟基与Asp69形成直接氢键，而20的氨基未与水分子或Asp69形成特定氢键相互作用，说明该相互作用并非20与G12C结合的关键。 在苯胺环上引入4个氟原子，目的是模拟苯酚的氢键性质、阻断潜在代谢软位点、提升溶解度。尽管苯胺结构仍存在生成活性代谢产物的风险，但JAB-21822（20）的研发证明，四氟苯胺可作为药物设计中可行的苯酚生物电子等排体。 JAB-21822已在中国完成针对局部晚期或转移性NSCLC的II期临床试验，目前正在研究其与西妥昔单抗联用治疗结直肠癌（CRC）的效果。 方案3 索托雷塞（19）到JAB-21822（20）的结构演化 图17 19与G12C的共晶结构（左，PDB: 6OIM）、20与G12C的共晶结构（右，PDB: 9KPN）2.13 硝基→氯：氨氯地平 硝基是一类独特的官能团，兼具强吸电子性、高极性与大偶极矩。在小分子药物发现中，硝基主要通过“π-空穴相互作用”与蛋白结合：硝基带正电的氮原子，与蛋白原子的孤对电子（如蛋白骨架的羰基氧、半胱氨酸/甲硫氨酸侧链的硫原子）形成弱静电相互作用。此外，硝基还可参与π堆积相互作用，但其作用机制比简单的芳香环堆积更复杂。硝基会显著改变相连芳环的电子密度，从而影响环与其他π体系的相互作用。 硝基的隐患在于，它在体内易被还原生成亚硝基、羟胺中间体，这些中间体能与生物分子反应，引发毒性与致突变效应。因此，尽管已有多款含硝基药物获批，硝基通常仍被视为结构风险基团，用合适的生物电子等排体替换是更优的选择。 硝苯地平（21）是第一代二氢吡啶类L型钙通道阻滞剂，获批用于治疗心绞痛与高血压。它作用时间短，原因是CYP3A4介导的芳构化代谢，生成无活性的吡啶代谢产物21a。将硝基替换为氯，同时引入2-氨基乙氧基侧链，得到氨氯地平（22）——一种高生物利用度（人体64-90%）、长效（半衰期34 h，硝苯地平仅2 h）的二氢吡啶类钙通道阻滞剂。 氨氯地平的发现，体现了在分子中引入碱性或极性基团，以降低代谢、固有清除率并增大分布容积的设计思路。得益于每日1次的给药方案（硝苯地平需每日4次）、良好的安全性与疗效，氨氯地平（22）已成为全球最常用的高血压治疗药物之一，2006年全球年销售额峰值达49亿美元（2023年作为仿制药销售额为18.7亿美元）。 在硝苯地平（21）与氨氯地平（22）发现30余年后，研究人员通过与rCav1.1的共晶结构，揭示了哺乳动物电压门控钙离子通道的配体调控分子机制。除乙醇胺基团外，22与周围残基的结合构象几乎与21完全一致（图19）。乙醇胺基团伸入通道中央空腔，末端伯胺作为氢键给体，与Ser1011的骨架酰胺氧结合。 图18 硝苯地平（21）、硝苯地平主要代谢产物21a与氨氯地平（22）的结构 图19 rCav1.1与21的共晶结构（左，PDB: 6JP5）、rCav1.1与22的共晶结构（右，PDB: 7JPX）2.14 硝基→氰基：比卡鲁胺、恩扎卢胺与阿帕他胺 氟他胺（23）与尼鲁米特（24）是第一代非甾体抗雄激素（NSAA）药物，用于治疗前列腺癌。与众多含硝基芳环的药物一样，二者均可引发特发性肝毒性，氟他胺（23）尤为明显。由于硝基可能是肝毒性的主要诱因，研究人员制备了氰基类似物23a，在TGFR转染的小鼠肝细胞中验证该假设：结果显示23的细胞毒性略强（LD₅₀分别为75 μM与150 μM）。而23a的抗雄激素活性与23相当，说明可用吸电子性更弱、代谢稳定性更高的氰基替换硝基。 这一发现催生了第二代非甾体抗雄激素药物：比卡鲁胺（25）、恩扎卢胺（26）与阿帕他胺（27）（图20），它们在前列腺癌治疗中安全性更高、疗效更优。从结构演化上，27由26经两处生物电子等排改造得到：苯基替换为吡啶基，偕二甲基替换为环丁基环。 尽管结构差异细微，但临床试验中27的皮疹发生率显著高于26，可能由药物诱导的免疫介导超敏反应导致。研究证实，27中的氰基同时受吡啶环与强吸电子CF₃取代基的双重活化，可与硫醇亲核试剂（如谷胱甘肽）发生化学反应，经中间体27b、27c生成噻唑啉27d（方案4）。这类非特异性蛋白共价结合会引发不良免疫反应，因此27中的2-氰基吡啶片段相当于亲电弹头，与半胱氨酸残基反应触发免疫应答，最终导致患者皮疹发生率升高。 图20 氟他胺（23）、氟他胺类似物23a、尼鲁米特（24）、比卡鲁胺（25）、恩扎卢胺（26）与阿帕他胺（27）的结构 方案4 半胱氨酸诱导的阿帕他胺（27）生物活化机制2.15 硝基→三氟甲磺酰基→硝基：维奈克拉 维奈克拉（28）是强效高选择性B细胞淋巴瘤2（BCL-2）抑制剂，2019年首次获批，用于治疗成人慢性淋巴细胞白血病（CLL）或小淋巴细胞淋巴瘤。 从早期先导化合物ABT-737（28a）到维奈克拉（28）的演化中，体现了三处颇具代表性的生物电子等排策略：包括硝基替换为砜基，之后又将砜基换回硝基（方案5）。 化合物28a是BCL-2家族抗凋亡蛋白的强效抑制剂，但水溶性差、口服生物利用度低，限制了后续开发。为优化分子的类药性质，研究人员将28a末端的联苯基部分饱和，提升sp³杂化碳原子比例（Fsp³）；同时将二甲胺基替换为吗啉，降低碱性氮原子的碱性。将硝基替换为等排的CF₃SO₂取代基，得到ABT-263（28b），其口服吸收与药代性质显著改善，同时保留了与28a相当的靶点抑制谱。 28b在I/II期临床试验中展现出一定临床获益，但因剂量限制性血小板减少症最终终止开发——该不良反应源于其对BCL-XL的强效抑制，而BCL-XL是血小板存活的必需蛋白。通过结构导向优化降低BCL-XL抑制活性，最终得到化合物28，值得注意的是，它保留了原始先导28a中的硝基基团。 除硝基结构外，维奈克拉（28）属于“超出五规则（bRo5）”化合物，分子量达867。维奈克拉2024年销售额达26亿美元，它的成功是药物设计突破传统规则的典型案例。 在28b、28分别与BCL-2的共晶结构中，硝基与三氟甲磺酰基均与相邻的苯胺N-H形成分子内氢键，且结合在相同的P4口袋中（图21）。28的硝基苯还与Tyr202形成面对面π-π堆积相互作用。 方案5 ABT-737（28a）到维奈克拉（28）的结构演化 图21 BCL-2与28b的共晶结构（左，PDB: 4LVT）、BCL-2与28的共晶结构（右，PDB: 6O0K）3. 酰胺、酯、羧酸类生物电子等排体3.1 1-2个关键原子改动3.1.1 酰胺→磺酰胺：达拉非尼 酰胺基团广泛存在于上市药物中，这大概率得益于其可与靶蛋白形成氢键的特性，且合成简便。酰胺提供两个独立的氢键作用位点：羰基氧作为氢键受体（HBA），N-H作为氢键给体（HBD）。用生物电子等排体替换酰胺，可改变分子的构象、电子分布与极性，有望提升水溶性与药代性质；理想情况下，还能同时提升活性与选择性。 达拉非尼（29）是携带V600E突变的致癌性B-Raf丝氨酸/苏氨酸激酶（BRAF V600E）的选择性抑制剂，2013年获监管批准，可单药或与丝裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制剂联用，治疗BRAF V600E突变驱动的不可切除或转移性黑色素瘤。 初始先导化合物29a含有苯甲酰胺结构，尽管BRAF V600E酶抑制活性良好，但细胞水平的磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）实验中活性仅为中等。苯磺酰胺类似物29b的酶活性虽下降了10倍以上，但细胞水平抑制活性却大幅提升。随后将咪唑并吡啶亚基替换为噻唑母核（29c），进一步增强了酶水平与细胞水平的抑制活性。与29a类似，29c的酰胺类似物（未展示）同样存在细胞活性不足的问题，进一步验证了磺酰胺生物电子等排体对该系列化合物的优势。 由于噻唑类似物29c脂溶性极高（cLogP=6.7）、分子量较大（587），研究人员将N-甲基四氢异喹啉结构截短为氨基嘧啶，随后对三个芳环的取代基进行优化，最终得到达拉非尼（29）（方案6），其对BRAF V600E的酶水平与细胞水平均具备强效抑制活性。 达拉非尼（29）以“DFG-in”（非活化）构象结合于腺嘌呤口袋，磺酰胺基团与DFG序列的Asp594、Phe595形成两个氢键。生理条件下，磺酰胺的NH（pKa约7）发生电离，与Asp594的酰胺NH形成氢键；而磺酰胺的一个氧原子则与Phe595的酰胺NH形成氢键（图22）。磺酰胺基团是BRAF V600E抑制剂开发中的核心结构元件。 方案6 29a到达拉非尼（29）的结构演化 图22 29与BRAF V600E的共晶结构（PDB: 4XV2）3.1.2 酰胺→反向酰胺：尼洛替尼 伊马替尼（30）2001年获批，是首款靶向癌症疗法，彻底改变了费城染色体阳性慢性髓性白血病（Ph+ CML）的治疗格局。它特异性靶向导致CML细胞失控增殖的异常BCR-ABL酪氨酸激酶。尽管伊马替尼可有效控制病情，但患者会逐渐产生耐药性，因此第二代BCR-ABL抑制剂尼洛替尼（31）被开发出来，用于治疗伊马替尼耐药的突变型CML，同时降低脱靶副作用。它已成为最成功的第二代BCR-ABL抑制剂之一，2021年销售额达21亿美元。 尼洛替尼（31）是基于伊马替尼（30）与ABL蛋白结合的共晶结构合理设计而来。该结构显示，酰胺基团参与两个关键氢键：一个与C螺旋的Glu286侧链羧酸根结合，另一个与Asp381的骨架NH结合。反向酰胺31a的设计初衷，是保留酰胺的氢键相互作用，同时使D环取代基的取向不同于伊马替尼中暴露于溶剂的N-甲基哌嗪环。这种取向调整预期可让D环取代基形成额外的结合相互作用。 随后对D环取代基进行优化，得到尼洛替尼（31）（方案7），其对野生型（WT）与耐药型BCR-ABL癌细胞系的抑制活性均优于伊马替尼（30）。 ABL蛋白分别与30、31的共晶结构证实：酰胺与反向酰胺均和Glu286侧链羧酸根、Asp381骨架NH形成相同的氢键，仅D环取代基的伸展方向存在差异（图23）。 方案7 伊马替尼（30）到尼洛替尼（31）的结构演化 图23 ABL与30的共晶结构（左，PDB: 2HYY）、ABL与31的共晶结构（右，PDB: 3CS9）3.1.3 酰胺→酰肼：阿扎那韦 利托那韦（32）与洛匹那韦（33）是早期获批的HIV-1蛋白酶抑制剂（PI），用于治疗HIV-1感染。利托那韦因治疗剂量下的胃肠道毒性已不再单药使用，但其CYP3A4抑制活性使其可低剂量与洛匹那韦、阿扎那韦等蛋白酶抑制剂联用，降低后者的CYP3A4介导代谢（图24）。 32与33均含有羟乙基二肽等排体，带有3个手性中心，合成复杂度高，推高了开发成本。为减少手性中心数量并优化其他性质，研究人员将其中一个酰胺替换为酰肼，得到易于合成的羟乙基肼氮杂肽等排体。该结构保留了酰胺NH与GlyB49酰胺羰基的关键氢键，与原始羟乙基二肽的作用模式相似——HIV-1蛋白酶与早期酰肼类似物CGP 53820（34a）的共晶结构验证了这一点。 尽管该化合物酶抑制活性极强，但细胞抗病毒活性一般、口服生物利用度差，限制了其成药潜力。后续针对细胞活性、水溶性与药代性质的优化，最终发现了阿扎那韦（34）——一种强效、口服生物利用度良好的蛋白酶抑制剂，2003年获批。关键修饰包括：在P1'位引入更大的取代基，将L-缬氨酸替换为L-叔亮氨酸以提升细胞活性。 与其他蛋白酶抑制剂一样，阿扎那韦需与低剂量利托那韦联用，减少CYP3A4介导的代谢，支持每日1次给药。阿扎那韦的水溶性具有强pH依赖性：酸性条件下溶解度高（得益于吡啶结构），高pH条件下溶解度差；而洛匹那韦在所有pH下水溶性均不佳。此外，阿扎那韦的生物利用度（人体60-68%，对比洛匹那韦25%）更高，半衰期（7 h，对比洛匹那韦4-6 h）更长。 给药方案上，阿扎那韦为400 mg每日1次（联用100 mg利托那韦），洛匹那韦则需400 mg每日2次（每次联用100 mg利托那韦）。凭借每日1次给药、胃肠道耐受性更优、对血脂影响小、病毒抑制更强的优势，阿扎那韦-利托那韦联合方案成为HIV-1初始治疗的优先选择，2011-2012年期间年销售额峰值约16亿美元。 HIV-1蛋白酶分别与33、34的共晶结构显示：酰肼与酰胺的构象几乎完全一致，均与GlyB49的酰胺羰基形成关键氢键（图25）。 图24 利托那韦（32）、洛匹那韦（33）、CGP 53820（34a）与阿扎那韦（34）的结构 图25 HIV-1与33的共晶结构（左，PDB: 1MUI）、HIV-1与34的共晶结构（右，PDB: 3EKY）3.1.4 酰胺→酮：多奈哌齐 多奈哌齐（35）1996年获批，用于治疗中重度阿尔茨海默病相关痴呆。它可透过血脑屏障，可逆性抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）——该酶负责分解记忆与学习相关的关键神经递质乙酰胆碱。 从35a开发35的核心设计策略，是将无环酰胺刚性化，并替换为环酮（方案8）。酮类化合物35b保留了酰胺35a的中等AChE抑制活性，进一步环化得到茚满酮35d后，活性略有提升。异吲哚啉酮35c的抑制活性更优，但35d的体内作用持续时间更长。随后在茚满酮的5,6位引入两个甲氧基，并缩短中间连接链为亚甲基，最终得到多奈哌齐（35）——一种强效、口服生物利用度良好、可透过血脑屏障的AChE抑制剂。 与其他AChE抑制剂不同，多奈哌齐半衰期很长（约70 h），支持每日1次给药。它的结构颇具特点：含有药物中少见的酮官能团，酮基在体内可发生还原与后续的再氧化。但研究未发现其生成还原代谢产物35e的证据，而35e的AChE抑制活性远低于母体。 多奈哌齐为外消旋混合物，其中S-对映体对人AChE的亲和力是R-对映体的2.2倍。在R-对映体与重组人AChE（rhAChE）的共晶结构中（图26），茚满酮环与Trp286形成π-π堆积相互作用；该残基还通过两个结合水分子，使两个甲氧基与外周阴离子位点（活性口袋入口处的表面结合区域）形成氢键。 方案8 35a到多奈哌齐（35）的结构演化 图26 (R)-35与rhAChE的共晶结构（PDB: 4EY7）3.1.5 内酯→内酰胺：伊沙匹隆 伊沙匹隆（36）是埃博霉素B（36a）的半合成类似物（图27）。埃博霉素B是天然产物，可稳定细胞微管网络，从而抑制癌细胞分裂。但其优异的体外活性并未转化为理想的体内抗肿瘤疗效——小鼠模型中效果不佳，原因在于代谢稳定性差、药代性质不理想。 在小鼠血浆中，内酯环易被酯酶裂解，半衰期仅20分钟，生成无活性的开环代谢产物。尽管人体血浆中的酯酶活性低于小鼠，但人肝微粒体（HLM）中的多种CYP450酶仍可导致埃博霉素B内酯开环。因此36a本身不适合临床开发，研究人员投入大量工作筛选跨物种肝微粒体稳定性更优的类似物。 将内酯转化为对应的内酰胺类似物36，可避免内酯裂解问题，在保留强效微管聚合活性与紫杉醇耐药细胞株抑制活性的同时，显著提升代谢稳定性。伊沙匹隆（36）注射剂2007年获批，用于治疗对现有化疗方案无响应的侵袭性转移性或局部晚期乳腺癌。 化合物36a与36以几乎完全相同的构象结合于β-微管蛋白，酯或酰胺的羰基均与Thr274的骨架NH形成氢键（图28）。 图27 埃博霉素B（36a）与伊沙匹隆（36）的结构 图28 β-微管蛋白与36a（青色，PDB: 7DAE）、36（绿色，PDB: 7DAF）的共晶结构叠合图3.1.6 羧酸→杂芳基磺酰胺：斯帕森坦 羧酸化合物37a是中等活性的血管紧张素II 1型受体（AT1R）拮抗剂。研究人员将羧酸替换为N-(4,5-二甲基异恶唑-3-基)苯磺酰胺，同时将中间苯环替换为乙氧甲基，最终得到斯帕森坦（37）（图29），可同时阻断AT1与内皮素A（ETA）受体。杂芳基磺酰胺基团可作为AT1与ETA受体通用的有效羧酸生物电子等排体。 37的AT1R结合亲和力提升，源于苯磺酰胺基团的拓扑几何结构：其酸性NH（或对应的负电荷）的位置，比羧酸类似物向受体方向偏移了0.6 Å。这种细微的空间位移，使苯磺酰胺的负电荷更靠近Arg167的胍基，从而形成更强的静电与氢键相互作用，增强受体结合能力（详见3.3.7节）。 斯帕森坦（37）2023年获批，是一种非免疫抑制口服药物，用于减缓成人原发性免疫球蛋白A肾病患者的肾功能下降。 图29 37a与斯帕森坦（37）的结构 3.2. 羰基到环状生物电子等排体 3.2.1. 酰胺C=O到嘧啶：达沙替尼 达沙替尼（38）是第二代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，于2006年首次获批，用于治疗对第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（30）耐药或不耐受的Ph+慢性髓性白血病（CML）患者。化合物38最初是在一项免疫学导向的药物发现项目中，作为淋巴细胞特异性激酶（LCK）抑制剂而设计的。在观察到伊马替尼（30）可作为BCR-ABL融合蛋白抑制剂后，化合物38随后被评估对BCR-ABL的作用，并发现其具有强效抑制活性。 达沙替尼（38）含有一个嘧啶环，该结构由早期类似物38a中的环丙基酰胺基团演变而来（方案9）。38a与LCK的分子对接表明，其2-氨基NH和噻唑氮与ATP结合位点的铰链区形成一对氢键，但环丙基酰胺羰基没有直接的氢键相互作用。在提高效力的努力中，酰胺羰基被多种约束杂环取代，这些杂环保留了关键的铰链结合所需的N–H。这项工作最终得到了嘧啶类似物38b，它是一种有效的LCK抑制剂。通过在嘧啶的6位引入4-羟乙基哌嗪基侧链，改善了其有限的溶解度，在共晶结构中该侧链朝向ATP结合位点的溶剂暴露区，从而得到达沙替尼（38），其生化抑制效力与38b相似，但细胞活性提高了约30倍。 在38与ABL蛋白的共晶结构（图30）中，氨基噻唑基团与Met318形成两个氢键。嘧啶环占据一个疏水口袋，嘧啶C5位的次甲基与Met318的羰基氧发生杂芳族CH···O=C相互作用。这些相互作用要求嘧啶氮与噻唑硫之间呈顺式构型，该构型通过N–S非共价卤键（ChB）稳定。此外，另一个O–S卤键迫使酰胺氧朝向噻唑硫的顺式取向。由于邻位大体积取代基的空间位阻，酰胺基团垂直于二取代苯环，阻止了苯环与酰胺基团之间的共轭。 与伊马替尼（30）结合于ABL的非活性构象（II型抑制剂）不同，达沙替尼（38）靶向活性构象（I型抑制剂）。因此，38对大多数伊马替尼耐药的BCR-ABL突变体具有活性，并已广泛用于伊马替尼治疗后进展的CML患者。 3.2 酯羰基→噻二唑：呫诺美林 M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）激动剂长期以来被用于精神分裂症的治疗研究。该方向的先导化合物之一是槟榔碱（39a）——一种存在于槟榔种子中的生物碱，属于非选择性mAChR激动剂。尽管39a的mAChR激动活性良好，但酯基易被羧酸酯酶水解，导致口服疗效受限。 为提升口服生物利用度、血脑屏障穿透性与mAChR亚型选择性，研究人员探索了酯的生物电子等排体，最终得到39b类槟榔碱类似物（如1,2,4-恶二唑、1,2,4-噻二唑、1,2,5-噻二唑），均为强效毒蕈碱激动剂（方案10）。有趣的是，对应的恶唑、噻唑、呋喃均不能作为该体系的有效等排体，结合亲和力大幅下降。 在3-取代1,2,5-噻二唑化学型中，3-烷氧基取代的呫诺美林（39）是活性最强的槟榔碱衍生物之一，同时具备良好的中枢神经系统（CNS）性质。它可紧密结合M1受体亚型——M1受体主要表达于脑部，在认知功能与记忆处理中发挥关键作用。 尽管呫诺美林在改善精神分裂症相关认知缺陷方面颇具潜力，但胃肠道与其他外周组织的毒蕈碱受体激活引发的不良反应，阻碍了其临床开发。外周副作用可通过呫诺美林（39）与曲司氯铵（40）联用缓解——后者是毒蕈碱拮抗剂，因血脑屏障穿透性差而仅作用于外周。 这种固定剂量联合疗法名为Cobenfy，旨在靶向精神分裂症的中枢神经系统功能异常，同时最大程度降低外周副作用，2024年获批，是数十年来首款全新作用机制的精神分裂症治疗药物。 方案10 槟榔碱（39a）到呫诺美林（39）的结构演化3.3 羰基-杂原子基团→环类生物电子等排体3.3.1 氨基甲酸酯→嘧啶：特泊替尼 特泊替尼（41）是间质-上皮转化因子（c-MET）酪氨酸激酶的选择性抑制剂，2020年获批，用于治疗MET外显子14跳跃突变驱动的转移性NSCLC。它由高通量筛选命中化合物41a经生物电子等排策略优化而来（方案11）。 将41a的噻二嗪酮母核替换为代谢稳定、合成简便的哒嗪酮母核，得到类似物41b，其生化与细胞水平活性提升了10倍。41b的氨基甲酸酯基团存在水解释放苯胺的潜在风险，研究人员将其替换为嘧啶环，得到41c，生化活性进一步提升20倍以上。 除消除苯胺生成风险外，嘧啶的引入还减少了一个氢键给体，从而改善膜渗透性与药代性质。嘧啶氮原子作为氢键受体，与激酶铰链区的Met1160骨架NH结合——对比41a与41分别和c-MET的共晶结构可知，该结合作用与原始先导化合物中氨基甲酸酯羰基氧的作用模式相似（图31）。此外，嘧啶氮邻位的氢原子与Tyr1159的芳族侧链形成CH-π相互作用，也是41c活性优于41b的原因之一。后续对活性与药代性质的进一步优化，最终得到特泊替尼（41）。 方案11 41a到特泊替尼（41）的结构演化 图31 c-MET与41a的共晶结构（左，PDB: 4R1Y）、c-MET与41的共晶结构（右，PDB: 4R1V）3.3.2 酰胺→吡啶：瑞美吉泮 降钙素基因相关肽（CGRP）是一种神经肽，已证实自发性偏头痛发作时会从三叉神经释放，其后续信号传导在偏头痛病理生理中发挥核心作用。CGRP拮抗剂可阻断CGRP与中枢、外周神经系统中参与偏头痛疼痛传导的受体结合，从而抑制疼痛信号传递。 第一代CGRP受体拮抗剂替尔卡泮（42a）（方案12）曾进入临床试验，用于偏头痛的预防与急性治疗。尽管II期试验显示有效，但因多名患者出现血清转氨酶显著升高而终止开发；此外它还存在水溶性有限、药代性质不佳的问题。 为提升活性、溶解度并拓展安全窗口，研究人员将己内酰胺母核的酰胺替换为稠合杂环。稠合三唑衍生物42b的CGRP结合实验与细胞功能实验活性相当，水溶性比替尔卡泮提升5倍，但膜渗透性不足限制了口服吸收，药代性质未得到改善。 将三唑替换为稠合咪唑亚结构，得到42c，既保留了良好活性，又大幅提升了膜渗透性与大鼠口服生物利用度。另一方面，将脲替换为氨基甲酸酯，再进一步演化出吡啶作为酰胺替代物，得到亚纳摩尔级CGRP拮抗活性的42d。为提升水溶性，研究人员在环庚烷母核上引入伯胺，最终得到瑞美吉泮（42）——口服生物利用度良好的CGRP拮抗剂，2020年获批用于成人偏头痛的急性治疗。 方案12 替尔卡泮（42a）到瑞美吉泮（42）的结构演化3.3.3 酰胺→吡啶：来那卡韦 来那卡韦（43）是全球首创的HIV-1衣壳蛋白（CA）抑制剂，2022年获批，为多药耐药HIV-1感染患者提供了全新治疗选择。它的作用时效极长，每年仅需注射2次。用于HIV-1感染暴露前预防（PrEP）的每年1次注射制剂（剂量约5 g）也在开发中。值得关注的是，作为PrEP用药时，该小分子可为女性提供近乎完全的HIV-1感染保护，达到了类似疫苗的保护效果。该药物同时有口服片剂剂型，主要用于治疗启动阶段的短期用药，或补打漏用的长效注射剂。 从结构上看，它是目前上市“小分子药物”中分子量最大的之一，达968，几乎是通用类药规则建议上限的两倍。来那卡韦还含有10个氟原子，是所有FDA批准药物中氟原子数量最多的，其次是含7个氟原子的阿瑞匹坦（见7.1节）。 来那卡韦的前体是PF-3450074（43a）（方案13）——一种基于二肽的先导化合物，通过表型筛选发现，曾作为工具化合物用于研究HIV-1衣壳抑制对病毒复制的调控作用。经过多轮平行合成优化，得到类似物43b，活性显著提升（EC₅₀=48 nM）。 HIV-1衣壳蛋白分别与43a、43b的共晶结构显示，两种抑制剂的仲酰胺NH与叔酰胺羰基氧，均和Asn57残基的侧链伯酰胺形成两个关键氢键。研究人员将叔酰胺环化构建吡啶环，其中吡啶氮作为氢键受体，保留了与Asn57侧链伯酰胺NH的氢键作用。该设计得到的吡啶类似物43c抑制活性中等；经过大量额外结构修饰（其中一例见7.1节），最终得到强效HIV-1衣壳抑制剂来那卡韦（43）。43与HIV-1 CA的共晶结构证实，吡啶杂环通过与Asn57结合发挥氢键受体作用（图32右）。 方案13 PF-3450074（43a）到来那卡韦（43）的结构演化 图32 HIV-1 CA与43a的共晶结构（左，PDB: 2XDE）、HIV-1 CA与43的共晶结构（右，PDB: 6V2F）3.3.4 酰胺→喹唑啉酮/吡啶并嘧啶酮：VH-280/VH-499 来那卡韦（43）骨架中酰胺生物电子等排思路的进一步延伸，体现在基于7-溴喹唑啉-4-酮的HIV-1 CA抑制剂44a中。该类似物里，43a中的叔酰胺被刚性双环杂环替换，作为非经典酰胺替代物。值得注意的是，溴取代基提供了通用的合成手柄，可在后期多样化引入取代基，用于优化结合相互作用与药代性质。 该方向的研发得到了长效候选药物GSK878（44b）（图33），但分子量高达918。44b与HIV-1 CA的共晶结构显示（图34），喹唑啉-4-酮参与两个氢键：一个与Asn57的侧链酰胺NH结合，另一个与Thr107的侧链羟基结合，二者共同贡献了其极强的抑制活性。GSK878因犬毒性研究中发现肝损伤相关结果，已终止临床试验。 将2,6-二甲基吗啉替换为三氟甲基吡啶基团，得到VH280（44c），已推进至临床开发，2023年完成I期评估。另一方面，将喹唑啉酮骨架替换为吡啶并嘧啶酮母核，同时用三氟丙氧基替换2,6-二甲基吗啉，得到VH-499（44）（图33），目前处于I期与IIa期临床试验，开发长效注射型HIV治疗药物。 图33 44a、GSK878（44b）、VH-280（44c）与VH-499（44）的结构 图34 44b与HIV-1 CA的共晶结构（PDB: 8FIU）3.3.5 酰胺→三唑：阿普唑仑 1957年Leo Sternbach偶然发现了首款苯二氮䓬类镇静药物氯氮䓬（45），随后学界开始研发更高效的中枢神经系统药物，地西泮（46）由此诞生，用于焦虑与癫痫发作的短期治疗。1969至1982年间，它是美国处方量最高的药物，1978年销量峰值超过23亿片。 地西泮主要通过正向别构调节脑部γ-氨基丁酸A型（GABA_A）氯离子通道发挥作用。在人体内，46经CYP450代谢生成三种具有药理活性、作用持久的代谢产物46a、46b、46c，每种半衰期均超过24 h。其中去甲基代谢产物46a是主要的循环活性代谢物，半衰期长达50-120 h，远超母体46的48 h，因此地西泮作用持续时间长，存在长期滥用或成瘾风险。 将N-甲基酰胺替换为1,3,4-三唑，得到高活性、作用时间更短的阿普唑仑（47）（半衰期12 h）（方案14）。该化合物经CYP3A4代谢生成两种主要代谢产物：4-羟基阿普唑仑（47a）与α-羟基阿普唑仑（47b），二者半衰期与母体相近。但它们的血浆浓度低、活性弱，对阿普唑仑药理作用的贡献极小甚至可以忽略。 方案14 地西泮（46）到阿普唑仑（47）的结构演化3.3.6 酰胺→咪唑：咪达唑仑 为进一步缩短地西泮（46）的作用时间，研究人员将N-甲基酰胺替换为咪唑，得到短效催眠镇静药物咪达唑仑（48）（方案15）。咪唑的碱性使其可形成水溶性盐，支持注射给药；而咪唑环上的甲基则作为代谢软位点，可被快速氧化生成无活性代谢产物48a。起效快、作用时间短的特点，使咪达唑仑与其他苯二氮䓬类药物形成显著差异。 方案15 地西泮（46）到咪达唑仑（48）的结构演化3.3.7 羧酸→四氮唑：氯沙坦 氯沙坦（49）是全球首创的非肽类选择性AT1R拮抗剂，1994年上市，用于治疗高血压。氯沙坦研发的早期先导化合物是联苯羧酸49b——静脉注射对肾性高血压大鼠有效，但口服给药后活性大幅下降。 为提升活性与口服生物利用度，研究人员探索了多种羧酸生物电子等排体，最终发现了四氮唑取代的氯沙坦（49）。与49b相比，49的结合亲和力提升10倍，静脉与口服剂量更低时即可发挥口服疗效。羧酸替换为四氮唑环还改善了49的膜渗透性，人体口服生物利用度达33%。生物利用度仍不算高，因为约14%的给药剂量经肝脏代谢生成活性代谢产物49a，其终末半衰期长达6-9 h。尽管母体化合物49是竞争性AT1R阻滞剂，但其药理作用持续时间较短，终末半衰期仅1.5-2.5 h。综上，氯沙坦主要以“前药”的形式发挥药效。 氯沙坦的发现早于AT1R结构数据的解析。四氮唑基团带来的活性提升，曾被归因于四氮唑的互变异构形式：其酸性NH或去质子化后的负电荷，相比羧酸距离芳环更远。N-(苯磺酰基)苯甲酰胺49c的结合亲和力与羧酸49b相当，与CONHSO₂Ph和CO₂H基团拓扑结构相似的结论一致。反向酰基磺酰胺49d活性更强，原因是更长的C-S键使酸性基团距离联苯母核更远；此外，负电荷离域到末端苯甲酰胺氧上，使电荷进一步向外延伸，最终增强了整体活性（图35）。 尽管已有多款AT1R拮抗剂类降压药上市，但AT1R配体结合的结构基础长期未明确。直到2015年，研究人员利用串行飞秒晶体学（SFX）技术，解析了人AT1R分别与两种选择性拮抗剂ZD7155（结构未展示）、奥美沙坦（50）结合的晶体结构。 AT1R-50复合物结构显示，受体N端ECL2段上带正电的Arg167胍基，与50带负电的四氮唑形成广泛的盐桥与氢键相互作用网络。尽管尚无联苯羧酸类拮抗剂的共晶结构报道，但将49对接至AT1R结构中发现，Arg167与四氮唑可形成类似的盐桥。四氮唑类似物49比羧酸对应物49b受体结合亲和力更强，至少部分原因是：2H-四氮唑的位置比羧酸距离Arg167的胍基近约1.5 Å，从而形成更强的静电与氢键相互作用（图36）。 图35 49a-49d与氯沙坦（49）的结构 图36 50与AT1R的共晶结构（左，PDB: 4ZUD）、50的四氮唑与AT1R的相互作用（右）4. 砜与磺酰胺类生物电子等排体（1-2个关键原子改动） 砜是药物设计中一类独特的官能团，兼具强吸电子性、高偶极矩与双氢键结合能力，这些性质均可助力提升靶点结合能力与药理活性。但砜的极性虽有利于提升溶解度，也可能成为限制因素——降低膜渗透性，进而影响口服生物利用度。 为攻克上述挑战，药物化学中策略性地应用砜的生物电子等排体，在保留砜核心性质的同时降低相关成药风险，优化溶解度、选择性与活性，最终推动多款候选药物与上市药物的成功开发。4.1 砜→磺酰亚胺：AZD6738 AZ20（51a）是共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关（ATR）激酶的强效抑制剂，具备多种癌症治疗潜力，但存在水溶性差、CYP3A4时间依赖性抑制（TDI）的缺陷。一般认为，其TDI风险源于吲哚环经氧化代谢生成活性代谢产物。 基于该假设，研究人员筛选吲哚等排体，得到7-氮杂吲哚化合物51b，降低了CYP3A4 TDI风险，但脂溶性与51a相近，水溶性未得到改善。为优化理化性质，研究人员将磺酰亚胺作为砜的生物电子等排体进行探究。与普通亚胺不同，磺酰亚胺的化学与构型均高度稳定；更重要的是，其S=NH基团既可作为氢键给体也可作为氢键受体，且氮原子具有弱碱性（对应NH₂⁺的pKa=2.7），可与强酸成盐。 此外，磺酰亚胺额外引入的氮原子增加了分子极性与氢键结合能力，通常水溶性优于砜，这一特性对优化药物的药代性质十分有利。当然，硫原子新增的手性中心也提升了合成复杂度。 在AZD6738（51）的研发中（方案16），将51b的砜替换为磺酰亚胺后，化合物溶解度提升了82倍，同时完全保留了ATR抑制活性。该结果与磺酰亚胺基团在ATR激酶ATP结合口袋中朝向溶剂区的取向一致。从51a到51，logD下降，人与小鼠血浆中的药物游离分数显著升高。目前AZD6738处于实体瘤单药治疗II期临床试验，同时联合用药治疗非小细胞肺癌处于III期临床阶段。 方案16 AZ20（51a）到AZD6738（51）的结构演化4.2 砜→磺酰亚胺：VIP152 CDK9抑制剂VIP152（52）的发现，进一步印证了磺酰亚胺作为砜生物电子等排体的应用价值。早期先导化合物磺酰胺BAY-958（52a）是强效CDK9抑制剂（IC₅₀=11 nM），激酶选择性高（包括CDK家族内选择性），但存在水溶性有限、渗透性差、外排率高的缺陷，最终导致口服生物利用度不佳。 对应的砜类化合物52b活性与52a相当，但溶解度问题仍未解决。将砜替换为磺酰亚胺，得到BAY 1143572（52c）：CDK9抑制活性提升2倍，对CDK2的选择性提升100倍。活性提升大概率源于磺酰亚胺的NH与酶Glu107骨架羰基形成了额外氢键。 值得关注的是，52c的水溶性显著改善、外排效应降低，口服生物利用度相较52a大幅提升。尽管I期临床试验中药代性质良好，但因中性粒细胞减少的剂量限制性毒性，52c的后续开发被终止。学界认为该毒性源于每日口服给药后，CDK9调控的转录蛋白MCL-1被持续抑制，而循环中性粒细胞的存活高度依赖该蛋白。 基于此，研究人员将给药方式从口服改为间歇静脉给药，预期可缓解毒性。在此方向下，保留磺酰亚胺结构、同时引入氟嘧啶杂环作为三嗪母核生物电子等排体的BAY-332（52d）被开发出来，其活性更强、选择性更高，适合静脉给药，但在预测的人体剂量下，溶解度仍不足以支持静脉制剂。 后续进一步应用生物电子等排策略（吡啶替换氟苯基、氟吡啶替换氟嘧啶），最终得到VIP152（52）（方案17）：活性提升10倍，选择性优异，水溶性足以支持临床静脉制剂开发。VIP152采用每周一次静脉给药，在晚期血液肿瘤与实体瘤患者中已验证了安全性与临床获益，目前处于弥漫性大B细胞淋巴瘤的II期临床试验阶段。 方案17 BAY 958（52a）到VIP152（52）的结构演化4.3 砜→磺酰亚胺酰胺：DFV890 NLRP3（NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3）炎症小体是炎症反应的关键介导因子，抑制NLRP3是治疗多种炎症疾病的极具前景的策略。早期临床阶段NLRP3拮抗剂CRID3（53a）细胞水平活性优异、选择性高，在小鼠皮肤与肺部炎症模型中均显示体内活性，但每日需高达1.2 g的剂量才能起效，且存在肝毒性证据。 上述缺陷可能与两个结构警示基团相关：中心的磺酰脲与呋喃环。磺酰脲在体内可裂解生成异氰酸酯活性中间体；呋喃则可经氧化后开环，生成反应性羰基中间体。 针对上述风险，研究人员将磺酰亚胺酰胺基团作为磺酰脲的等排替代物进行探索。结果显示，R构型的磺酰亚胺酰胺53b活性远高于S构型对映体53c。同时，呋喃可替换为其他五元杂芳环，其中活性最优的是噻唑，对应化合物53d。 DFV890（53）中的磺酰亚胺酰胺生物电子等排体（方案18），使其活性相较磺酰脲化合物53d提升100倍以上，且同样为R构型活性更优。53具备良好的药代性质，跨物种口服生物利用度优异，预测人体给药剂量大幅降低（45 mg，每日一次）。目前DFV890处于II期临床试验，适应症涵盖家族性寒冷自身炎症综合征、髓系疾病、膝骨关节炎与冠心病。 方案18 CRID3（53a）到DFV890（53）的结构演化4.4 砜→氧化膦：布格替尼 布格替尼（54）是第二代间变性淋巴瘤激酶（ALK）酪氨酸激酶抑制剂，2017年获FDA批准用于ALK阳性转移性非小细胞肺癌的一线治疗，也是全球首款成功上市的含氧化膦结构的药物。 与其前体TAE684（54a）相比，布格替尼用二甲基氧化膦（DMPO）替换了异丙基砜。54a存在生物活化风险：富电子的1,4-二氨基苯环经氧化生成活性代谢产物（54b→54c），而54无此隐患。目前远端DMPO减弱活性代谢产物生成的具体机制仍不明确。 此外，DMPO基团还大幅降低了分子脂溶性、总极性表面积（tPSA）与血浆蛋白结合率，同时显著提升水溶性（表1）。 表1 54a与54的性质对比 ALK共晶结构显示，尽管54a的砜与54的氧化膦均和相邻苯胺NH形成六元分子内氢键，但P=O键的氧原子使分子呈现更刚性、更扁平的U型活性构象。因此，相较于54a的异丙基砜-苯胺结构，54的DMPO-苯胺片段相对P-loop向外旋转，带来构象差异，与ALK蛋白的结合模式也有所区别（图37）。 方案19 TAE684（54a）的生物活化与布格替尼（54）的结构演化 图37 ALK与54a的共晶结构（左，PDB: 2XB7）、ALK与54的共晶结构（右，PDB: 5J7H）4.5 砜→氧化膦：SY-5609 DMPO基团的成药优势持续得到验证，近期研究将其用于替换55a的二甲基砜，以提升CDK7选择性并优化药代性质，最终得到SY-5609（55）（图38）——一种强效、高选择性、口服生物利用度良好的CDK7抑制剂，目前已推进至胰腺癌I/II期临床试验。 研发初期尚无CDK7晶体结构，研究人员解析了55b（55a的去氰基类似物）与CDK2的共晶结构，辅助阐明结合模式（图39左）。砜基团与相邻的吲哚NH形成六元分子内氢键，在活性位点内参与多重相互作用：一个砜氧原子直接与催化残基Lys33结合，另一个砜氧原子通过水分子桥接，与Gln131、P-loop上的Glu12骨架羰基形成相互作用。 SY-5609与突变型CDK7（CDK7W132R，该突变使激酶从非活化态切换为活化构象）的共晶结构显示，DMPO的作用与55b中的砜高度相似（图39右）。DMPO既与吲哚NH形成分子内氢键，又通过两个甲基的脂溶性相互作用稳定P-loop构象。此外，催化残基Asp155与抑制剂形成两个氢键：一个与吲哚NH结合，另一个与DMPO的氧原子结合。 图40总结了55b中的砜官能团、55中的DMPO取代基，分别与对应靶蛋白形成的关键相互作用。 图38 55a、55b与SY-5609（55）的结构 图39 55b与CDK2的共晶结构（左，PDB: 7RA5）、55与CDK7W132R的共晶结构（右，PDB: 8R9U） 图40 55b与SY-5609（55）和靶蛋白的代表性相互作用对比4.6 砜→双四氢呋喃：达芦那韦 含环丁砜结构的56a是一类全新P2配体的HIV-1蛋白酶抑制剂——P2配体指占据HIV-1蛋白酶活性位点S2亚口袋的取代基。研究人员最初推测，与烷氧基处于顺式的砜氧原子，可作为氢键受体与Asp30'的酰胺NH结合。 为保留该相互作用，同时引入第二个氢键受体结合S2口袋中相邻的Asp29'，研究人员将环丁砜替换为双四氢呋喃（bis-THF）杂环，其两个缩醛氧原子的空间取向恰好可作为双氢键受体。引入bis-THF配体后，化合物56b展现出极强的HIV-1蛋白酶抑制活性与细胞抗病毒活性。 后续对P2'位磺酰胺芳基的进一步优化，最终得到高活性HIV蛋白酶抑制剂达芦那韦（56）（图41），兼具良好的药代性质与安全性。 56与HIV-1蛋白酶的共晶结构证实（图42）：bis-THF双环与S2口袋残基形成紧密的范德华相互作用；更关键的是，两个缩醛氧原子均与保守的Asp29'、Asp30'骨架酰胺形成关键氢键。这些相互作用赋予其皮摩尔级的抑制活性，以及对多重耐药HIV-1毒株的广谱抑制效果。 与bis-THF不同，环丁砜P2配体在几何上无法同时与Asp29'-Asp30'骨架形成双氢键，且与S2疏水腔的范德华相互作用也较弱。因此，bis-THF环既模拟了砜的部分性质，又额外增加了氢键相互作用（图42）。 与“缩醛化学不稳定”的普遍认知相反，bis-THF的稳定性极佳：瞬时开环后，会因分子内高有效摩尔浓度、有利的熵效应与低环张力快速发生再环化。bis-THF P2片段替换环丁砜的设计，最终推动了达芦那韦的成功开发，该药2006年获批用于HIV-1感染与艾滋病的治疗。 达芦那韦主要经CYP3A4介导的异丁基与苯胺羟基化代谢，bis-THF环系统不会被代谢。与利托那韦联用可显著抑制CYP3A4活性，降低代谢清除率，大幅提升达芦那韦的全身暴露量。 图41 56a、56b与达芦那韦（56）的结构 图42 56与HIV-1的共晶结构（PDB: 2IDW）4.7 磺酰胺→酰胺：达利雷生 达利雷生（57）是双重食欲素受体拮抗剂，2022年获FDA批准用于失眠症治疗。其研发源于对磺酰胺类化合物ACT-462206（57a）的优化——57a是早期双重食欲素受体拮抗剂，临床研究显示剂量依赖性镇静效应与良好耐受性，但大概率因理化性质不佳终止开发。 研究人员通过生物电子等排策略解决该问题：首先将苯胺片段替换为苯并咪唑，得到57b，活性略有下降但溶解度提升；随后将磺酰胺替换为酰胺，使化合物对食欲素1型受体（OX₁）与2型受体（OX₂）的活性均大幅提升。 基于该苯并咪唑-吡咯烷酰胺全新化学型，经进一步优化得到达利雷生（57）（方案20），与57a相比活性与溶解度均显著改善。与OX₁的共晶结构显示，57a中一个磺酰氧原子与Asn318侧链形成氢键，而57的酰胺氧原子完美模拟了该结合作用（图43）。 方案20 ACT-462206（57a）到达利雷生（57）的结构演化 图43 OX₁与57a的共晶结构（左，PDB: 6TP4）、OX₁与57的共晶结构（右，PDB: 6TP3）5. 苯基类生物电子等排体 苯环是小分子药物中出现频率最高的芳香结构单元，可通过π-π堆积、疏水相互作用、范德华力等多种方式与靶蛋白结合口袋匹配。但未取代苯环脂溶性强、易发生CYP450介导的氧化代谢，常导致化合物溶解度不足、清除率过高；同时高度平面的芳香结构也可能带来脱靶风险与专利布局限制。苯基生物电子等排替换是先导优化阶段的核心策略之一：通过杂芳环、饱和环或特殊官能团替换苯环，可在保留核心结合构象的前提下，精准调控化合物的活性、选择性、理化性质与药代动力学特征，同时拓展化学空间、规避专利障碍。 5.1. 1-2个关键原子变化5.1.1. 苯基替换为噻吩：奥氮平（Olanzapine） 氯氮平（58）是FDA批准的非典型抗精神病药物，主要作用于多巴胺和5-羟色胺受体，用于治疗典型抗精神病药无法控制症状的精神分裂症患者。使用氯氮平的一个顾虑是粒细胞缺乏症风险，其特征为白细胞计数短暂降低，使患者更易受感染，因此需要定期进行血液学监测。氯氮平还与多种其他不良反应相关，包括流涎、镇静和癫痫发作。其相对较高的治疗剂量（300-900 mg/天）可能进一步加剧这种不良副作用。 为提高效价并降低安全风险，研究者制备了多种杂芳基稠合苯二氮䓬类似物，最终发现了奥氮平（59）。奥氮平具有广泛的受体结合谱，对多种多巴胺和5-羟色胺受体亚型具有高亲和力，包括对5-HT2A/2C受体的明显偏好超过D2受体（图44）。临床上，奥氮平以5-25 mg/天的剂量治疗精神分裂症有效，且无需常规血液监测，这是相对于氯氮平的实际优势。与氯氮平类似，奥氮平也与体重增加相关，尤其是在治疗初期。尽管如此，自1996年上市以来，奥氮平已成为最成功的第二代非典型抗精神病药之一，2010年年度销售额峰值约为50亿美元。 在奥氮平的开发中，噻吩环作为苯的等排体，相比氯氮平提供了更优的性质。尽管噻吩环容易发生代谢活化产生活性代谢物——这是多种含噻吩药物毒性的相关因素——但奥氮平似乎对这种代谢具有抗性，可能是由于其三取代噻吩结构阻断了反应位点。 图44. 氯氮平（58）和奥氮平（59）的结构5.1.2. 苯基替换为吡啶：阿帕他胺（Apalutamide） 恩扎卢胺（26）于2012年获批，成为首个用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的第二代抗雄激素药物，适用于化疗后和化疗前患者。六年后，其后续疗法阿帕他胺（27）也获批用于非转移性CRPC。这些类似物通过阻断促进前列腺细胞（包括癌细胞）生长的雄激素（如睾酮）来治疗前列腺癌。两种药物靶点效价相似，核心结构相同，但在两个方面存在结构差异：阿帕他胺用吡啶基替代苯基，用环丁基替代偕二甲基（图45）。 恩扎卢胺的主要副作用是癫痫发作风险增加，这是药物穿透血脑屏障并随后抑制γ-氨基丁酸受体的结果。在小鼠临床前研究中，阿帕他胺的脑摄取量比恩扎卢胺低4倍，提示癫痫发作风险更低。阿帕他胺脑穿透性降低与吡啶杂环的引入一致——吡啶杂环降低了clogP值并增加了拓扑极性表面积（tPSA）。在临床实践中，恩扎卢胺的高稳态脑浓度与癫痫等中枢神经系统相关事件相关，而阿帕他胺稳态脑浓度较低，癫痫副作用较少。尽管如此，两者均存在潜在癫痫风险，因此不推荐用于有癫痫病史或其他易感因素的患者。 另一个主要差异是恩扎卢胺在人体内的半衰期长得多，可能导致副作用持续时间更长。此外，与恩扎卢胺相比，阿帕他胺的皮疹发生率显著更高。这种效应被认为源于阿帕他胺中的缺电子腈基——该腈基因其在吡啶环上的位置和邻位CF3取代基的双重活化作用而具有高反应性。 恩扎卢胺和阿帕他胺均由加州大学洛杉矶分校的Michael Jung及其同事发现，分别由辉瑞和强生公司开发。自获批以来，这些药物已成为前列腺癌的重要治疗手段，2022年销售额分别为58亿美元和18亿美元。 图45. 恩扎卢胺（26）和阿帕他胺（27）的结构 5.1.3. 苯基替换为吡啶：JNJ-63576253 另一个将苯环替换为吡啶杂环的例子来自抗雄激素药物JNJ-63576253（60）的发现，该药物目前处于临床试验阶段，用于治疗对第二代雄激素受体（AR）靶向治疗无应答或疾病进展的前列腺癌患者。化合物60a被确定为潜在先导化合物，对野生型AR、F877 AR突变体以及其他临床相关AR突变体均具有抑制活性。尽管60a具有良好的体外和体内药理学性质，但由于在犬中出现特发性肝毒性而无法继续开发。 后续体内代谢研究显示，60a会形成苯酚代谢物60b，后者可进一步氧化为活性邻醌结构。事实上，60b在犬肝微粒体中孵育后可形成谷胱甘肽（GSH）加合物。为阻断活性代谢物的形成，研究者对60a的苯氧基环进行了简单的生物电子等排N/CH交换，得到了60c。去甲基哌啶产物JNJ-63576253（60）（方案21）是60c的活性代谢物，因其良好的性质被选择进行开发。化合物60在犬中未表现出肝毒性或其他主要安全性问题。与此发现一致，其吡啶酮代谢物60d不形成GSH加合物。60安全性的改善支持了以下假设：60a产生的苯酚60b的生物活化途径是犬肝毒性的原因，而将苯环替换为吡啶杂环可减轻这种毒性。 方案21. 60a到JNJ-63576253（60）的演化过程5.1.4. 苯基替换为吡啶：哌柏西利（Palbociclib） 哌柏西利（61）是首个选择性CDK4/6抑制剂，可阻断细胞周期从G1期向S期进展，从而使肿瘤细胞阻滞在G1期并抑制其生长。哌柏西利的发现早于CDK4/6结构信息的获得，始于高通量筛选命中物61a。该化合物仅表现出中等程度的CDK4抑制作用，但具有较强的CDK2抑制活性，这将无法验证CDK4抑制剂可抑制肿瘤生长的假设。 通过对2-氨基苯环进行广泛的构效关系（SAR）研究，发现2-氨基吡啶类似物61b对CDK4的选择性是CDK2的35倍。对该化学型进行全面优化后，得到了高效、高选择性的CDK4/6抑制剂哌柏西利（61）（方案22），该药于2015年获批用于治疗绝经后女性晚期乳腺癌。 氨基吡啶类CDK4/6抑制剂高选择性的原因可从下一代类似物阿贝西利（62）与CDK6的共晶结构中得到解释：吡啶氮原子通过一个结合水分子与铰链区的His100相互作用（图46）。在所检测的442种激酶中，仅有8种含有该组氨酸残基，而在CDK家族中，仅CDK4和CDK6具有His100。方案22. 61a到哌柏西利（61）的演化过程 图46. CDK6与62的共晶结构（PDB: 5L2S）（左）。CDK6与62的选择性相互作用（右）5.1.5. 苯基替换为吡啶酮：多拉韦林（Doravirine） 吡啶酮同时含有氮杂原子和羰基，是一类独特的六元平面杂环。根据氮原子相对于羰基的位置，可分为2-吡啶酮和4-吡啶酮。当氮原子未被取代时，羟基吡啶与其吡啶酮异构体可通过互变异构快速相互转化，在固态和溶液中，尤其是生理条件下，氧代形式（吡啶酮）占主导。N-取代吡啶酮提供氢键受体（HBA），而未取代吡啶酮既可作为氢键受体也可作为氢键供体（HBD）。 由于其平面性和氢键形成能力，吡啶酮已被用作酰胺、苯环、苯酚、吡啶以及氮/氧杂环的生物电子等排体。由于内酰胺官能团的存在，吡啶酮的极性远高于苯、吡啶或苯酚，这体现在它们的clogP值上（图47）。因此，吡啶酮也被用于改善药物样性质，如水溶性。 N-取代吡啶酮的构象偏好性被用于多拉韦林（63）的发现（方案23）。多拉韦林是第三代非核苷类HIV逆转录酶抑制剂（NNRTI），于2018年获批用于治疗HIV-1感染。早期先导化合物63a对主要临床相关的逆转录酶（RT）突变体表现出广谱抗病毒活性。与野生型RT的共晶结构揭示了63a的吡唑并吡啶基团与Lys103主链NH和C=O之间的两个关键氢键（图48，左），这些相互作用在先导化合物优化过程中得以保留。 图47. 苯、吡啶、苯酚和吡啶酮的计算理化性质 方案23. MK-4965（63a）到多拉韦林（63）的演化过程 图48. HIV-RT与63a（PDB: 3DRS）（左）和63（PDB: 4NCG）（右）的共晶结构5.1.5. 苯基替换为吡啶酮：多拉韦林（续） 含亚甲基连接子的化合物63b表现出与63a相当的活性。将63b的对接构象与63a的生物活性构象叠加后，发现末端双环核心的对齐度极佳。主要构象差异源于连接子与中心苯环之间二面角的变化。含醚键连接子的63a倾向于苯核相对于OCH2连接子呈更平面的排列，测得二面角为150°。相比之下，亚甲基连接的类似物63b更倾向于中心苯环与末端吡唑并吡啶核心之间呈正交取向，计算二面角为81°。 因此，这些化合物中的吡唑并吡啶核心采用相似的构象——几乎与中心苯环正交——使吡唑部分适当地定位，与Lys103形成关键的双齿氢键。尽管63b在酶抑制测定中具有效价，但在细胞培养中缺乏强劲的抗病毒活性，且在大鼠中药代动力学性质较差。因此，将中心苯环替换为极性更强的吡啶酮环，该环能够维持所需的正交取向，从而改善了药代性质。事实上，63c在大鼠中的口服生物利用度为57%，但其进一步开发因溶解度差而受阻。 63c的低溶解度和高结晶性归因于吡唑并吡啶部分形成的供体/受体氢键。为了削弱晶格从而提高溶解度，将双环氮杂吲唑替换为生物电子等排的单环三唑酮，随后在吡啶酮C4位进行生物电子等排Cl/CF3交换，得到了多拉韦林（63）——一种第三代NNRTI，保留了关键的N-NH受体-供体基序，可与RT酶的Lys103主链形成一对氢键（图48，右）。多拉韦林具有良好的溶解度以及在人体内有利的口服生物利用度，可实现每日一次给药。5.1.6. 苯基替换为吡啶酮：奥芦他赛布（Olutasidenib） 奥芦他赛布（64）是一种突变型异柠檬酸脱氢酶-1（IDH1）抑制剂，于2022年获批用于治疗携带易感IDH1突变的急性髓系白血病（AML）患者。它由早期先导化合物64a演化而来（方案24）。通过将苯环替换为吡啶酮实现了效价和选择性的提高——吡啶酮引入了与蛋白质的额外氢键相互作用，并通过消除苯酚形成的可能性降低了代谢风险。 在mIDH1-R132H与64a和64的共晶结构中（图49），两种抑制剂均结合在二聚体界面的变构位点。64的吡啶酮氮原子与Leu120的主链酰胺形成氢键，而羰基氧与水分子相互作用。这种额外的氢键网络有助于64相对于64a的效价增强。吡啶酮替换还降低了分子的亲脂性，从而提高了溶解度并降低了血浆蛋白结合率。 方案24. 64a到奥芦他赛布（64）的演化过程 图49. mIDH1-R132H与64a（PDB: 6O2Y）（左）和64（PDB: 6U4J）（右）的共晶结构5.1.7. 苯酚替换为哒嗪酮：Resmetirom和ALG-055009 Resmetirom（65）和ALG-055009（66）是选择性甲状腺激素受体-β（THR-β）激动剂，开发用于治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）。该发现项目始于甲状腺激素T3及其类似物。含酚羟基的化合物65a作为早期先导物。为提高THR-β相对于THR-α的选择性并减少心血管副作用，将苯酚替换为哒嗪酮部分。 这种生物电子等排替换得到了65c，其效价降低了100倍，但对THR-β的选择性提高了10倍。为恢复效价，将65c的CH2CO2H替换为氮杂尿嘧啶（一种弱酸）——这是一种受高通量筛选命中物65e启发的不寻常羧酸替代物。将65d中的氮杂尿嘧啶部分替换为氰基增加了酸性（ΔcpKa = 0.8）并进一步增强了THR-β选择性，最终得到resmetirom（65），该药于2024年获批，成为首个用于治疗中重度肝纤维化成人MASH的同类疗法。 值得注意的是，在体外微核试验中检测潜在遗传毒性时，65呈阴性，而65a、65b和几种早期哒嗪酮类似物均呈阳性。作为持续改善65溶解度或效价努力的一部分，将氮杂尿嘧啶上的氰基替换为多种极性基团，得到了氨基氮杂尿嘧啶ALG-055009（66）（方案25）——一种高效、高选择性的THR-β激动剂，目前处于MASH治疗的II期临床研究中。 方案25. T3及早期T3类似物到Resmetirom（65）和ALG-055009（66）的演化过程 图50. hTHR-β与65a（PDB: 3GWS）（左）和66（PDB: 8RQN）（右）的共晶结构5.2. 苯基替换为饱和环5.2.1. 苯基替换为哌啶：Leniolisib 喹唑啉68a被确定为高效、同工酶选择性的PI3Kδ抑制剂，在体内表现出剂量依赖性的PI3Kδ药理抑制作用。然而，在水性条件下，它会逐渐形成溶解度差的结晶三水合物，导致吸收受溶解度限制。为改善理化性质，对喹唑啉核心进行修饰，得到部分饱和的双环5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶作为可行替代物，亲脂性显著降低，溶解度提高。 在先前针对相关PI3Kδ选择性抑制剂系列的项目中，苯甲酰哌嗪连接子已成功截短为醚键连接的吡咯烷，得到膜通透性改善的类似物。受此发现启发，将68c精简得到68d，效价降低2倍但膜通透性更优。在吡啶环上引入CF3基团（68e）增强了效价。最后的生物电子等排O/NH变化得到了leniolisib（68）（方案27），该药于2023年获批，成为首个用于治疗活化PI3Kδ综合征（APDS）的药物——APDS是一种由PI3Kδ功能获得突变或PIK3R1功能丧失突变引起的罕见原发性免疫缺陷病。 方案27. 68a到Leniolisib（68）的演化过程5.2.2. 苯基替换为哌啶：格拉吉布（Glasdegib） 格拉吉布（69）是一种Hedgehog通路抑制剂，于2018年获批与低剂量阿糖胞苷联合治疗，用于老年患者或无法耐受强化化疗的新诊断AML患者。先导化合物69a效价高，但代谢稳定性差、水溶性低（0.1 μg/mL），且由于高亲脂性（clogD = 4.48，pH 6.5）在各物种中血浆蛋白结合率高（游离率<1%）。 由于中心苯基是化合物亲脂性的主要来源，将其替换为N-甲基哌啶，得到化合物69b——其中取代基的取向与先导化合物相似。尽管效价降低了9倍，但哌啶69b表现出可接受的药代动力学性质（如犬中生物利用度F = 33%）；这种改善归因于clogD大幅降低3.4个单位以及Fsp3增加。 为进一步优化抑制效价和药代性质，合成了酰胺和脲类似物，最终得到格拉吉布69（方案28），在各物种中均表现出良好的口服生物利用度（大鼠、犬和人中分别为33%、68%和55%）。与其低亲脂性（clogD = 2.1）一致，69在大鼠、犬和人血浆中具有高游离分数（10-14%）。格拉吉布的发现表明，通过降低亲脂性和增加Fsp3，含多个芳基或杂芳基的高亲脂性化合物可转化为具有更优药物样性质的分子。 方案28. 69a到格拉吉布（69）的演化过程5.2.3. 苯基替换为2-氮杂螺[3.3]庚烷：JDQ443 苯基丙烯酰胺70a是一种弱效KRAS G12C共价抑制剂，存在非选择性化学反应性问题——GSH孵育测定中半衰期为84分钟。为降低丙烯酰胺弹头的固有化学反应性并优化连接子取向，评估了多种富含sp3的苯胺替代物，其中70b中的螺氮杂环丁烷部分被认为是最优的。该化合物对GSH结合的稳定性显著提高（t1/2 = 241分钟），同时仍保留中等程度的G12C抑制活性。 在保持螺氮杂环丁烷连接的弹头不变的前提下，进行了广泛的SAR研究以提高亲和力，最终得到JDQ443（70）（方案29），在G12C抑制活性和GSH稳定性之间取得了平衡。JDQ443（70）曾进入II期临床研究，用于治疗局部晚期或转移性G12C突变非小细胞肺癌，但由于KRAS G12C驱动癌症患者的治疗选择日益增多，其开发于2024年5月终止。 共晶结构显示，化合物70a和70以相似的构象结合KRAS G12C，苯胺（末端C到N距离4.2 Å）和螺氮杂环丁烷（长度3.9 Å）分别作为丙烯酰胺弹头的有效连接子（图51）。 方案29. 70a到JDQ443（70）的演化过程 图51. KRAS G12C与70a（PDB: 7R0Q）（左）和70（PDB: 7R0M）（右）的共晶结构6. 芳香杂环生物电子等排体6.1. 1-2个关键原子变化6.1.1. 噻唑替换为噻二唑：Fezolinetant 噻唑是一种缺电子杂芳烃，是药物设计中通用的构建模块，常被用作苯环或吡啶环的生物电子等排体。然而，5位未取代的噻唑（71a）可发生C4-C5环氧化生成环氧化物71b，后者可水解为二醇71c，再自发开环得到硫代酰胺71d（方案30）。这种代谢物能够共价修饰关键的细胞大分子，导致毒性和特发性药物不良反应。 为此，1,2,4-噻二唑（72）已被证明可规避潜在的生物活化风险，是噻唑环的有效生物电子等排体。这种生物电子等排替换策略的一个有效实例是fezolinetant（73）的发现（方案31）——一种神经激肽3受体（NK3R）拮抗剂，于2023年获批用于治疗更年期引起的中重度血管舒缩症状或潮热。 将73a中的2-甲基-1,3-噻唑替换为3-甲基-1,2,4-噻二唑（73b），显著改善了NK3拮抗活性，同时保持了良好的溶解度和CYP抑制特性。然而，73b未能达到hERG安全性阈值（IC50 > 10 μM）。由于hERG抑制通常与高亲脂性和多个芳香环相关，将末端噻吩（另一个因可能形成活性代谢物而发出结构警示的基团）截短为单个氟原子（73），使hERG抑制降低了10倍以上。尽管效价比73b低10倍，但fezolinetant（73）在NK3选择性、NK3抑制和口服疗效方面总体平衡。与1,2,4-噻二唑不同，引入1,3,4-噻二唑（73c）或1,2,4-恶二唑（73d）导致效价显著降低。 方案30. 噻唑代谢：C4-C5烯烃环氧化起始 方案31. 73a到Fezolinetant（73）的演化过程6.1.2. 咪唑替换为咪唑酮：厄贝沙坦（Irbesartan） 厄贝沙坦（74）是一种血管紧张素II受体拮抗剂，于1997年获批用于治疗高血压和糖尿病肾病。它是通过修饰含咪唑环的先导化合物74a发现的。74中的咪唑酮环作为咪唑环的生物电子等排替换引入，提供了与受体的额外氢键相互作用并改善了口服生物利用度。 咪唑酮部分同时作为氢键供体和受体，能够与血管紧张素II受体形成更强的相互作用。这种修饰还通过消除咪唑环上的潜在氧化代谢位点提高了分子的代谢稳定性。厄贝沙坦（74）口服吸收良好，半衰期长，适合每日一次给药。6.1.3. 苯并呋喃替换为吲哚：阿来替尼（Alectinib） 阿来替尼（75）是第二代间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂，于2015年获批用于治疗ALK阳性非小细胞肺癌（NSCLC）。阿来替尼的发现源于苯并呋喃类先导化合物75a。将苯并呋喃替换为吲哚环提高了对ALK的效价和选择性。 阿来替尼中的吲哚氮原子与ALK的铰链区形成额外的氢键，这是其高效价的原因之一。这种生物电子等排替换还改善了分子的代谢稳定性和药代动力学性质。阿来替尼表现出优异的中枢神经系统穿透性，这对于治疗脑转移尤为重要——脑转移是ALK阳性NSCLC患者常见的并发症。 6.1.4. 异香豆素替换为吡啶并嘧啶：利司扑兰（Risdiplam） 利司扑兰（76）是一种存活运动神经元2（SMN2）剪接修饰剂，于2020年获批用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。该发现项目始于高通量筛选得到的异香豆素类命中化合物。经过广泛优化，异香豆素母核被替换为吡啶并嘧啶骨架——作为生物电子等排体，它保留了关键的氢键相互作用，同时改善了药物样性质。 利司扑兰中的吡啶并嘧啶母核与SMN2前体mRNA和剪接因子相互作用，促进7号外显子的纳入，增加全长功能性SMN蛋白的产生。这种生物电子等排替换改善了分子的溶解度、代谢稳定性和口服生物利用度。利司扑兰是首个口服给药的SMA疗法，代表了这种罕见遗传病治疗的重大进展。 6.2. 环氮异构6.2.1. 吡唑并嘧啶酮替换为咪唑并三嗪酮：伐地那非（Vardenafil） 伐地那非（79）是一种5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂，于2003年获批用于治疗勃起功能障碍。它是在含吡唑并嘧啶酮母核的西地那非（万艾可）成功之后开发的。伐地那非采用咪唑并三嗪酮母核作为生物电子等排替换，提高了对PDE5的效价和选择性。 伐地那非中的环氮异构改变了几何构型和氢键模式，使其能够与PDE5活性位点形成更优化的相互作用。这种修饰使效价比西地那非提高了10倍。伐地那非还表现出更快的起效时间和更优的药代动力学特征，口服生物利用度更高，半衰期更长。 6.2.2. 咪唑并哒嗪替换为吡唑并嘧啶：TAK-279 TAK-279（80）是一种选择性TYK2抑制剂，处于临床开发阶段，用于治疗银屑病和炎症性肠病等自身免疫性疾病。该化合物由咪唑并哒嗪类先导系列演化而来。研究者采用环氮异构策略，将咪唑并哒嗪转化为吡唑并嘧啶骨架。 这种生物电子等排重排保留了与TYK2 JH2结构域的关键氢键相互作用，同时改善了相对于其他激酶（尤其是JAK1）的选择性谱。TAK-279中的吡唑并嘧啶母核结合到TYK2的调节性JH2结构域，将酶稳定在非活性构象。这种变构抑制机制提供了优异的选择性，并可能减少泛JAK抑制相关的副作用。 6.2.3. 3-去氮嘌呤替换为5-去氮嘌呤：GLPG3667 GLPG3667（81）是一种选择性IRAK4抑制剂，处于临床开发阶段，用于治疗炎症和自身免疫性疾病。该发现项目探索了多种嘌呤等排体，从3-去氮嘌呤骨架开始。通过SAR研究发现，5-去氮嘌呤异构体提供了更优的效价和激酶选择性。 嘌呤环系统中氮原子从3位移至5位改变了与IRAK4铰链区的氢键模式，产生了更有利的结合相互作用。这种环氮异构还改善了代谢稳定性并降低了脱靶激酶抑制的可能性。GLPG3667对IRAK4的选择性远高于人类激酶组中的其他激酶，使其成为一种有前景的治疗药物，潜在副作用更少。 6.2.4. 稠合吡啶酮替换为异构稠合吡啶酮：曲美替尼（Trametinib） 曲美替尼（82）是一种MEK1/2抑制剂，于2013年获批用于治疗BRAF V600突变的黑色素瘤和非小细胞肺癌。该化合物具有稠合吡啶酮骨架，经过广泛的SAR研究优化。在先导优化过程中，发现一种异构的稠合吡啶酮具有更优的效价和药代动力学性质。 稠环系统的特定排列和吡啶酮部分中羰基的位置对于最佳结合MEK变构位点至关重要。曲美替尼结合到MEK上邻近ATP结合位点的独特变构口袋中，将酶锁定在非活性构象。这种抑制机制提供了对MEK1/2相对于其他激酶的高选择性。曲美替尼常与BRAF抑制剂联合用于治疗BRAF突变癌症，与单药治疗相比可改善临床疗效。 6.3. 伪杂环6.3.1. 氨基吡唑并嘧啶替换为4-酰胺基-5-氨基吡唑：泽布替尼和吡托布替尼 伊布替尼（81）是首个共价布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，于2013年获批用于治疗多种B细胞恶性肿瘤。它含有氨基吡唑并嘧啶母核，与BTK的铰链区结合。然而，伊布替尼也抑制EGFR、ITK和TEC等其他激酶，这是其脱靶副作用的来源。为提高选择性，将氨基吡唑并嘧啶骨架替换为4-酰胺基-5-氨基吡唑伪杂环。 这种生物电子等排替换打开了嘧啶环，同时保留了关键的铰链结合氢键供体和受体，被用于泽布替尼（82）和吡托布替尼（83）的发现。泽布替尼（82）于2019年获批，是第二代共价BTK抑制剂，选择性优于伊布替尼，因此腹泻和皮疹等脱靶副作用更少。吡托布替尼（83）于2023年获批，是一种非共价（可逆）BTK抑制剂，能够克服影响共价抑制剂的耐药突变。 这些化合物中的伪杂环设计提供了更灵活的铰链结合基序，使弹头（共价抑制剂）能够最佳取向，或改善结合相互作用（非共价抑制剂）。这种骨架跃迁策略已被证明是开发具有更优选择性和药理学性质的下一代BTK抑制剂的宝贵方法。 6.3.2. 氨基吡唑并嘧啶替换为4-酰胺基-5-氨基吡唑：ICP-192和KIN-3248 同样的伪杂环策略也被应用于FGFR抑制剂的开发。ICP-192（87）和KIN-3248（88）是下一代FGFR抑制剂，采用4-酰胺基-5-氨基吡唑骨架作为传统氨基嘧啶铰链结合基序的生物电子等排替换。 ICP-192（87）是一种共价泛FGFR抑制剂，处于临床开发阶段，用于治疗FGFR驱动的实体瘤。伪杂环设计使丙烯酰胺弹头能够最佳定位，与FGFR铰链区的半胱氨酸残基形成共价键。该化合物对野生型和突变型FGFR均表现出强效活性。 KIN-3248（85）是一种不可逆FGFR抑制剂，旨在解决获得性耐药突变，特别是FGFR2守门员突变。4-酰胺基-5-氨基吡唑骨架提供了独特的结合模式，能够适应耐药突变引入的空间位阻，同时保持高效价。这种下一代抑制剂代表了克服FGFR靶向治疗耐药性的有前景的方法。 6.3.3. 吡啶酮-嘧啶替换为脲基-嘧啶：英菲格拉替尼（Infigratinib） 英菲格拉替尼（89）是一种选择性FGFR1-3抑制剂，于2021年获批用于治疗携带FGFR2融合的胆管癌。该化合物由吡啶酮-嘧啶先导系列演化而来。研究者采用生物电子等排替换策略，将稠合的吡啶酮-嘧啶系统转化为脲基-嘧啶骨架。 脲基作为伪杂环，模拟了吡啶酮环的氢键模式，同时增加了灵活性。这种修饰改善了分子的选择性谱和药代动力学性质。英菲格拉替尼结合到FGFR的ATP结合口袋，脲基-嘧啶部分与铰链区形成关键氢键。 从稠合双环系统跃迁到含伪杂环脲的单环系统，这种骨架跃迁方法展示了生物电子等排替换在优化候选药物方面的多功能性。英菲格拉替尼为FGFR驱动癌症患者提供了重要的靶向治疗选择。 6.3.4. 己内酰胺稠合吲哚替换为4-酰胺基苯并咪唑：尼拉帕利（Niraparib） 尼拉帕利（90）是一种聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂，于2017年获批用于卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌的维持治疗。该发现项目始于己内酰胺稠合吲哚先导化合物。通过骨架优化，将己内酰胺稠合吲哚替换为4-酰胺基苯并咪唑部分作为生物电子等排替换。 苯并咪唑环系统作为伪杂环，模拟了原始己内酰胺稠合吲哚与PARP催化结构域的结合相互作用。4位的酰胺基提供了额外的氢键相互作用，这是尼拉帕利高效价的原因之一。这种生物电子等排替换还改善了分子的药物样性质，包括口服生物利用度和代谢稳定性。 尼拉帕利以其长半衰期和高组织分布著称，可实现每日一次给药并有效渗透到肿瘤组织中。该化合物同时抑制PARP-1和PARP-2酶，导致DNA损伤积累，并选择性杀伤同源重组修复途径缺陷的癌细胞（如BRCA突变的癌细胞）。 7. 饱和环生物电子等排体7.1. 环己烷替换为双环[3.1.0]己烷：来那帕韦（Lenacapavir） 来那帕韦（43）是首个HIV衣壳抑制剂，于2022年获批用于治疗多药耐药HIV-1感染。该化合物具有独特的双环[3.1.0]己烷骨架，作为环己烷环的生物电子等排替换。这种张力双环系统提供了更刚性的构象，最适合与HIV衣壳蛋白结合。 来那帕韦中的双环[3.1.0]己烷部分引入了构象限制，将分子锁定在衣壳结合所需的生物活性构象中。这种刚性是来那帕韦异常高效价的原因之一——对野生型和耐药HIV毒株均具有皮摩尔级的抗病毒活性。这种生物电子等排替换还改善了分子的代谢稳定性和药代动力学性质。 来那帕韦半衰期极长，可每六个月皮下给药一次，代表了HIV治疗的重大进展。该化合物结合到衣壳蛋白亚基之间的界面，干扰病毒生命周期的多个阶段，包括衣壳组装、核进入和病毒复制。这种新颖的作用机制使来那帕韦对其他类抗逆转录病毒药物耐药的HIV毒株仍然有效。 7.2. 哌啶替换为吗啉：阿瑞匹坦（Aprepitant） 阿瑞匹坦（89）是一种神经激肽-1（NK1）受体拮抗剂，于2003年获批用于预防化疗引起的恶心呕吐（CINV）和术后恶心呕吐（PONV）。阿瑞匹坦的发现涉及对哌啶类先导化合物的优化。将哌啶环替换为吗啉环作为生物电子等排体，改善了药代动力学特征并降低了代谢风险。 与哌啶相比，阿瑞匹坦中的吗啉环在饱和环系统中引入了氧原子，增加了极性并降低了亲脂性。这种修饰改善了化合物的溶解度和口服生物利用度。吗啉氧还参与与NK1受体的关键氢键相互作用，有助于提高结合亲和力。 阿瑞匹坦是首个获批临床使用的NK1受体拮抗剂。它通过阻断P物质（一种参与呕吐反射的神经肽）发挥作用。吗啉环中氧原子的加入不仅作为生物电子等排替换，还提供了额外的氢键受体以增强受体结合。阿瑞匹坦广泛与其他止吐药联合用于预防CINV，特别是对于高度致吐性化疗方案。 7.3. 哌啶替换为四氢吡喃：PF-07220060 PF-07220060（93）是一种选择性CDK4抑制剂，处于癌症治疗的临床开发阶段。该化合物通过生物电子等排替换策略发现——将哌啶环替换为四氢吡喃（THP）环。饱和环系统中氧替换氮改变了分子的碱性和氢键性质。 将碱性哌啶氮替换为THP中的醚氧，消除了生理pH下的正电荷，这有助于减少脱靶相互作用并提高选择性。这种生物电子等排替换还调节了化合物的亲脂性和膜通透性。THP环保持了与哌啶环相似的大小和形状，保留了靶点结合所需的整体构象。 PF-07220060对CDK4的选择性远高于CDK6和其他激酶，与泛CDK4/6抑制剂相比可能提供差异化的安全性特征。四氢吡喃生物电子等排体代表了一种有价值的策略，可调节候选药物的理化和药代动力学性质，同时保持与靶蛋白的关键结合相互作用。 7.4. 碳大环替换为醚大环：瑞波替尼（Repotrectinib） 瑞波替尼（91）是下一代ROS1/TRK/ALK抑制剂，于2024年获批用于治疗ROS1阳性非小细胞肺癌和NTRK融合阳性实体瘤。该化合物具有大环结构，通过将碳基大环生物电子等排替换为含醚大环进行优化。 在大环系统中引入醚键具有多种优势：增加构象灵活性、降低亲脂性、引入额外的氢键受体。这种生物电子等排修饰改善了分子的溶解度、代谢稳定性和药代动力学性质，同时保持了对ROS1、TRK和ALK激酶的强效抑制活性。 瑞波替尼旨在克服获得性耐药突变，特别是限制第一代抑制剂疗效的溶剂前沿突变。大环结构使化合物即使存在空间位阻大的耐药突变时也能进入ATP结合口袋。含醚大环提供了强效抑制野生型和突变激酶所需的刚性和灵活性的最佳平衡。瑞波替尼代表了ROS1和TRK驱动癌症治疗的重大进展，对耐药疾病具有更优的疗效。 7.5. 哌嗪酮替换为三嗪酮：巴洛沙韦（Baloxavir） 巴洛沙韦酯（97）是首个帽依赖性核酸内切酶抑制剂，于2018年获批用于治疗甲型和乙型流感病毒感染。其活性形式巴洛沙韦酸（92b）具有三嗪酮环，作为早期先导化合物中哌嗪酮环的生物电子等排替换。 巴洛沙韦中的三嗪酮环在饱和杂环中引入了额外的氮原子，改变了氢键模式和电子性质。这种生物电子等排替换对于实现对流感帽依赖性核酸内切酶（病毒mRNA转录必需的酶）的强效抑制至关重要。三嗪酮部分与酶活性位点中的两个镁离子螯合，这是抑制机制的关键特征。 巴洛沙韦酯是一种前药，口服给药后迅速转化为活性巴洛沙韦酸。基于三嗪酮的骨架提供了优异的抗病毒效价，单次给药即可起效，与需要多日给药的现有流感治疗相比具有显著优势。从哌嗪酮到三嗪酮的生物电子等排替换，对于实现单次给药抗病毒疗法所需的效价、选择性和药代动力学性质的最佳平衡起到了关键作用。 7.6. 四氢呋喃替换为氧硫杂环戊烷：拉米夫定和恩曲他滨 拉米夫定（99）和恩曲他滨（100）是核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs），广泛用于治疗HIV感染和乙型肝炎。两种化合物均具有氧硫杂环戊烷环（含氧和硫的五元环），作为天然核苷中四氢呋喃核糖环的生物电子等排替换。 将核糖中的3'-亚甲基替换为硫原子形成了氧硫杂环戊烷环系统。这种生物电子等排修饰改变了糖部分的构象，并消除了DNA链延伸必需的3'-羟基。一旦被逆转录酶整合到正在生长的病毒DNA链中，这些核苷类似物就会导致链终止，从而抑制病毒复制。 拉米夫定（3TC）于1995年获批，是最早用于HIV联合治疗的NRTI之一。恩曲他滨（FTC）于2003年获批，是拉米夫定的5-氟类似物，效价和药代动力学性质略有改善。两种化合物均为L-对映体构型，与D-对映体相比抗病毒活性更好、毒性更低。氧硫杂环戊烷生物电子等排体代表了核苷类似物药物发现中糖修饰的经典案例，该策略已成功应用于开发多种抗病毒药物。 7.7. 吗啉替换为硫代吗啉二氧化物：非戈替尼（Filgotinib） 非戈替尼（95）是一种选择性JAK1抑制剂，于2022年获批用于治疗类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和其他炎症性疾病。该化合物具有硫代吗啉二氧化物（也称为砜基吗啉）环，作为吗啉环的生物电子等排替换。 将吗啉氧替换为砜基（SO2）增加了饱和杂环的极性和吸电子特性。这种生物电子等排修饰降低了环氮的碱性并改变了分子的整体理化性质。砜基还提供了额外的氢键受体，有助于靶点结合。 非戈替尼对JAK1的选择性远高于其他JAK家族成员，这被认为是其相对于泛JAK抑制剂安全性更优的原因。硫代吗啉二氧化物部分通过优化与JAK1 ATP结合口袋的结合相互作用，在选择性中发挥作用。这种生物电子等排替换策略展示了对饱和杂环的细微修饰如何对效价、选择性和药物样性质产生深远影响。 7.8. 硫代吗啉替换为吗啉酮：利伐沙班（Rivaroxaban） 利伐沙班（103）是一种直接Xa因子抑制剂，于2008年获批用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，包括深静脉血栓（DVT）、肺栓塞（PE）以及房颤患者的卒中预防。该化合物具有吗啉酮环，通过生物电子等排替换从硫代吗啉先导系列演化而来。 硫代吗啉转化为吗啉酮在饱和环系统中引入了羰基，用酰胺官能团替代了硫原子。这种修饰显著改变了环的电子性质和氢键能力。吗啉酮羰基作为氢键受体，与Xa因子活性位点形成关键相互作用。 利伐沙班是首个获得广泛临床应用的口服直接Xa因子抑制剂，为华法林和肝素治疗提供了替代选择。吗啉酮环是结合药效团的关键组成部分，羰基氧与Xa因子S1口袋中Gly216的主链NH形成氢键。从硫代吗啉到吗啉酮的生物电子等排替换，对于实现利伐沙班作为成功抗凝药物所需的效价、选择性和口服生物利用度的最佳平衡至关重要。 8. 结论与展望8.1. 生物电子等排体在药物发现中的价值总结 生物电子等排替换已被证明是药物化学和药物发现中最有价值和应用最广泛的策略之一。正如本综述通篇所示，将原子、官能团或环系统策略性地替换为其生物电子等排对应物，可以深刻影响候选药物的药理学和理化性质。 前面章节讨论的实例表明，生物电子等排修饰可以实现多种目的：提高靶效价和选择性、增强代谢稳定性、增加水溶性、降低脱靶毒性、优化药代动力学特征以及克服耐药性。从简单的单原子取代（如N/CH交换）到更复杂的环系统替换（如苯基到吡啶酮、哌啶到吗啉），生物电子等排为药物优化提供了多功能的工具包。 值得注意的是，FDA批准药物中的许多生物电子等排替换并非仅源于理性设计，而是通过系统的构效关系探索和偶然发现的。然而，随着计算化学和结构生物学的进步，生物电子等排原理的理性应用变得日益复杂和具有预测性。8.2. GLP-1R激动剂案例：口服小分子的突破 生物电子等排原理应用中一个令人兴奋的最新进展是口服小分子GLP-1受体激动剂的发现，这代表了2型糖尿病和肥胖症治疗的重大突破。传统的GLP-1疗法是需要皮下注射的肽类药物。口服生物利用度小分子GLP-1R激动剂的开发在很大程度上依赖于生物电子等排替换策略来优化效价、选择性和口服吸收。 Orforglipron（LY3502970）、GSBR-12990和ECC5004（AZD5004）等化合物已成为有前景的口服GLP-1R激动剂。这些分子采用多种生物电子等排修饰来模拟天然GLP-1肽的结合相互作用，同时获得适合口服给药的药物样性质。口服GLP-1R激动剂的成功开发展示了生物电子等排替换如何实现从注射用生物制剂到口服小分子的转变，显著提高了患者的便利性和治疗依从性。 这一研究领域继续快速发展，多家制药公司都在开发口服GLP-1R激动剂和其他非肽类GPCR激动剂。随着药物化学家努力优化这些新型治疗剂的药理学和药代动力学性质，生物电子等排无疑将在这些工作中发挥核心作用。 生物电子等排设计的未来正因计算化学、人工智能（AI）和机器学习（ML）的进步而发生变革。传统的生物电子等排替换方法依赖于药物化学家的直觉、文献先例和经验性SAR数据。然而，现代计算工具正在使生物电子等排替换的识别更加系统化和具有预测性。 分子动力学模拟、自由能计算和量子力学建模等计算方法可以提供关于生物电子等排修饰的结合热力学和结构后果的详细见解。包括生成模型和深度学习算法在内的AI/ML方法正在被开发，用于基于化学结构和生物活性的大型数据集预测新型生物电子等排对。这些工具可以提出通过传统药物化学方法可能不会考虑的非显而易见的生物电子等排替换。 此外，将生物电子等排设计与AI驱动的药物发现平台相结合，有可能显著加速先导化合物优化过程。通过预测生物电子等排变化对效价、选择性、溶解度、代谢和毒性的影响，这些计算工具可以指导药物化学家进行最有前景的修饰，减少需要合成和实验测试的化合物数量。 尽管取得了这些技术进步，生物电子等排替换仍然既是科学也是艺术。任何生物电子等排修饰的成功都取决于特定的分子背景，包括靶点结合位点环境、整体骨架以及分子的理化性质。计算工具是药物化学家的强大辅助手段，但人类判断和实验验证仍然必不可少。展望未来，经验丰富的药物化学直觉与日益复杂的AI/ML工具相结合，无疑将继续产生创新的生物电子等排解决方案，推动药物发现进步并改善人类健康。 说   明 本公众号内容系基于文献阅读提炼总结，疏漏与谬误在所难免，恳请不吝批评指正。标记【原创】指原创编译，是出于便于传播目的，著作权归出版社与作者所有。往期文章推荐RMC-6236胰腺癌适应症NDA获FDA受理(内附RASolute 302研究全文)ESMO 2026前瞻：三个月后马德里，这几项研究值得提前划重点10 笔合作、超 70 亿美元订单背后：英矽智能的第二次战略转身JMC-王少萌教授2000-2026年文章汇总。2026.07，国内big pharma 管线整理（一）恒瑞，百济，中生刚拿全球首个III期阳性就进优先审评，宜联B7-H3 ADC凭什么？Revolution 的 330 亿市值：Biotech 不卖给大药企，到底走不走得通？JMC综述-2021-2025年靶向蛋白降解的PROTAC新设计：新型E3连接酶与前体PROTACNjardarson Lab-2025年全球最畅销的200款小分子药物Njardarson Lab-2025年全球最畅销的200款药物JMC综述-基于喹啉骨架的抗疟药物发现与开发进展全球首个第四代BTK抑制剂获批！麓鹏制药洛布替尼破解十年耐药困局，改写血液肿瘤治疗格局Alessio Ciulli 团队在Chemical Reviews的PROTAC综述全解析

解析FGFR-RNA剪接轴：机制、致癌交互对话与治疗性目的的创新 引言 引言 成纤维细胞生长因子受体(FGFR)信号通路是肿瘤进展的核心调控者，在多种癌症类型中驱动细胞增殖、存活、转移和治疗抵抗。RNA选择性剪接深刻塑造了FGFR亚型的多样性，赋予肿瘤异质性和对靶向干预的适应性。尽管人们在鉴定调控FGFR前体mRNA加工的剪接调节因子方面取得了显著进展，但影响这一过程的外部信号以及FGFR信号通路对全局剪接网络的反作用影响仍未得到充分探索。本文将全面综述FGFR信号与RNA剪接在癌症中的双向相互作用，从机制层面详细阐述FGFR突变、表观遗传修饰以及与致癌通路的串联如何通过重编程剪接产生肿瘤特异性FGFR剪接变体，并系统分类不同的FGFR亚型，阐明它们如何促进癌症的主要特征，强调FGFR-剪接轴在驱动肿瘤可塑性、异质性和适应性进展中的核心作用。 FGFR属于受体酪氨酸激酶家族，由细胞外配体结合域和细胞内酪氨酸激酶域组成。目前已知有22种不同的成纤维生长因子配体可与4种FGFR相互作用并激活其信号传导。当FGF配体结合后，FGFR会发生二聚化并经历自磷酸化，招募下游信号蛋白，激活多条参与细胞增殖、分化、存活、迁移和血管生成的通路。FGFR轴的失调通过基因扩增、突变、融合、染色体易位或异常剪接等方式广泛参与肿瘤发生。此外，肿瘤和基质细胞中异常FGF表达以及自分泌/旁分泌信号的紊乱也被证明可驱动癌变。近期研究强调了FGFR在癌症中的多样化致癌功能，包括核FGFR1调控基因转导以促进抗雌激素抵抗、FGFR2-核因子κB轴驱动代谢重编程，以及FGFR3磷酸化依赖性调控嘌呤代谢、S期进展和肿瘤发生。这些发现表明，FGF-FGFR相互作用的多样性超过了其他受体酪氨酸激酶。靶向FGF-FGFR轴主要通过FGFR酪氨酸激酶抑制剂或抗FGFR单克隆抗体来实现，这是癌症治疗的关键焦点。然而，局限性仍然存在，因为大多数患者对这些治疗表现出原发性或获得性抵抗。因此，阐明FGFR信号驱动肿瘤发生的分子机制对于优化患者选择、提高FGFR靶向治疗的疗效以及指导新型治疗策略的开发至关重要。 图1FGFR失调机制及下游信号通路。(A)FGFR基因扩增促进异常细胞增殖。(B)FGFR功能获得性突变促进免疫逃逸，这通过与CD8+T细胞经T细胞受体相互作用的破坏得以证明。(C)FGFR异常选择性剪接驱动上皮-间充质转化，增强细胞迁移能力。(D)由染色体重排产生的致癌性FGFR基因融合促进异常细胞迁移和肿瘤进展。(E)FGFR共受体(α/βKlotho)功能障碍导致表达降低，并与药物抵抗的发生相关。底部示意图显示FGFR激活的关键下游信号级联，包括PLCγ、PI3K、MAPK。这些通路汇聚于BAD、BAX和半胱天冬酶-9等分子效应器，参与癌症的发生、进展和药物抵抗的形成。 RNA剪接是一个基本过程，显著扩展了基因组的编码能力。剪接体是一个高度动态的复合物，可准确切除内含子并连接外显子以产生成熟mRNA。选择性剪接使单个基因能够产生多种mRNA亚型。然而，由体细胞突变或RNA结合蛋白表达失调引起的剪接紊乱可导致驱动肿瘤发生的异常剪接变体。鉴于其在癌症进展中的核心作用，靶向剪接体机器已成为肿瘤学中一种有前景的治疗策略。选择性剪接在FGFR驱动的病理(包括肿瘤发生)中发挥关键作用。虽然各种FGFR剪接变体的效应已在此背景下得到广泛研究，但控制异常FGFR选择性剪接的上游信号通路以及FGFR信号本身在重编程RNA剪接以驱动肿瘤发生和治疗抵抗中的作用仍知之甚少。为弥补这一知识空白，本综述首次全面阐述了FGFR信号与RNA剪接之间的双向相互作用，从机制上考察选择性剪接如何调控FGFR亚型多样性以影响癌症的主要特征，以及FGFR激活如何反过来重塑全局剪接程序以驱动肿瘤发生和恶性进展。 FGFR由细胞外配体结合域(由3个免疫球蛋白样结构域D1-D3组成)、单个跨膜螺旋区和具有催化活性的细胞内酪氨酸激酶域构成。配体结合后，FGFR在硫酸乙酰肝素辅因子的促进下发生构象变化，这缓解了铰链区和激活环介导的自抑制。这种结构重排使FGFR能够二聚化，这是受体激活的先决条件。二聚化FGFR的自磷酸化包括激活环内7个酪氨酸残基的序贯磷酸化，其中5个关键酪氨酸残基对激活和维持激酶功能至关重要，磷酸化可将激酶活性增强50-1000倍。总之，FGFR结构和激活实现了精确的信号转导，而其失调则驱动癌症进展和治疗抵抗。 图2RNA剪接的一般机制与FGFR亚型多样性。(A)RNA剪接一般过程示意图。前体mRNA经剪接体加工去除内含子并连接外显子，产生成熟mRNA转录本。(B)FGFR2选择性剪接的细胞类型特异性模型。在间充质细胞中，剪接机器优先包含外显子9，产生FGFR2-IIIc亚型；而在上皮细胞中，则掺入外显子8，生成FGFR2-IIIb亚型。(C)FGFR剪接变体(FGFR1-3)的结构比较，聚焦于免疫球蛋白样结构域III(Ig-III)内的选择性剪接事件，该事件产生IIIb和IIIc亚型。α外显子(外显子3)的选择性包含/排除分别产生两种剪接形式FGFR1α和FGFR1β。这些亚型在配体结合特异性上存在差异，并对FGF配体表现出不同的亲和力。此外，跨膜区和细胞内区的变异进一步导致受体定位、信号特性和特定功能的差异。 磷酸化的FGFR残基作为支架衔接蛋白的对接位点，将上游信号传递给效应器并激活下游信号转导级联反应。其中，FRS2和磷脂酶Cγ作为关键介导因子，激活3条经典信号级联：RAS/ERK-MAPK通路、PI3K-AKT通路和PLCγ通路。FGFR介导的这些通路激活控制各种关键生物学过程，包括细胞增殖、细胞死亡、分化、血管生成和伤口愈合，协调组织维持和再生所必需的细胞反应。在RAS/ERK-MAPK激活方面，FRS2招募衔接蛋白GRB2，后者又与GAB1或鸟苷酸交换因子SOS结合，导致RAS GTP酶激活。活化的RAS随后启动MAPK信号级联，最终导致ERK激活。此外，FRS2磷酸化促进其与酪氨酸磷酸酶SHP2的相互作用，增强ERK激活，从而促进细胞增殖、分化和迁移等过程。PI3K-AKT信号轴也通过FRS2和GRB2组成的衔接复合物在FGFR下游被激活，促进GAB1的招募。结合后，GAB1与PI3K相互作用并激活之，启动以AKT磷酸化和激活为终点的信号级联。活化的AKT磷酸化多个下游靶点，包括促凋亡Bcl-2家族成员BAD，从而抑制凋亡并促进细胞存活。AKT还调节叉头框O转录因子的活性，这些因子是细胞周期进展、氧化应激反应和代谢稳态的关键调节因子。在间充质干细胞中，FGFR激活导致下游效应器ERK和AKT的磷酸化，增强细胞增殖、自我更新和多能性，以及成骨和软骨分化。相反，抑制ERK或AKT信号显著降低细胞增殖和分化，凸显了FGFR信号在干细胞命运决定中的不可或缺作用。同时，活化的FGFR招募并磷酸化PLCγ1，其水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸产生三磷酸肌醇和二酰甘油。二酰甘油激活蛋白激酶C，后者磷酸化MARCKS等底物，影响细胞分裂、分化和迁移。同时，三磷酸肌醇促进细胞内钙离子释放，激活钙依赖性蛋白包括钙调神经磷酸酶。钙调神经磷酸酶通过钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子信号轴调节T细胞激活和增殖。另一个受FGFR高度调控的典型过程是血管生成，这是一个涉及内皮细胞激活、基底膜降解、内皮增殖迁移和毛细血管网络形成的复杂过程。内皮细胞上FGFR的激活触发细胞内信号通路，特别是MAPK和PKC通路，促进内皮细胞有丝分裂、迁移和新生血管形成。 如上所述，FGFR驱动的信号通路协调基本的生理细胞过程。此外，大量研究现已强调FGFR信号失调在癌症进展和治疗抵抗中的作用。FGFR的失调通过基因扩增、激活突变、致癌融合或共受体功能障碍等机制，驱动不受控制的增殖、免疫逃逸、上皮-间充质转化和肿瘤迁移，以及治疗抵抗。这些改变汇聚于经典下游级联，包括PLCγ、PI3K和MAPK通路，进一步调节凋亡介质，共同维持癌症的发生、进展和治疗抵抗。重要的是，异常FGFR剪接也可导致FGFR信号失调。 越来越多的证据表明，FGFR的功能多样性和情境特异性活性不能仅用基因组改变或配体变异来完全解释。因此，FGFR前体mRNA的选择性剪接现已成为通过产生具有结构和功能多样性的各种FGFR剪接亚型来调控FGFR信号的关键调节因子，使FGFR能够以组织和疾病特异性的方式调节下游信号。这种亚型多样性的一个关键功能后果是配体结合选择性的转变，进而决定下游信号结果。这种调节在癌症中特别相关，其中FGFR的异常剪接促进上皮-间充质转化、治疗抵抗和转移进展。因此，解析FGFR剪接亚型的特异性和差异作用对于理解它们对组织维持和疾病进展的贡献，以及开发精确的治疗策略(特别是在癌症中)至关重要。然而，尽管最近在鉴定影响FGFR剪接的上游因子和信号通路方面取得了进展，所涉及的分子机制在很大程度上仍未被探索。 图3不同FGFR剪接亚型表现出癌症类型特异性表达模式；例如，FGFR1β在乳腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤和高级别弥漫性胶质瘤中优先于FGFR1α表达。其他亚型分布详见正文。该图还展示了调节这些亚型特异性剪接事件的RNA结合蛋白和剪接因子。 前体mRNA剪接是真核基因表达中的一个基本过程，对调节转录本多样性和蛋白质组复杂性有重要贡献。组成型剪接允许切除内含子并连接外显子以产生成熟转录本。选择性剪接是从同一前体mRNA产生不同转录本(有时编码不同蛋白质)的过程。在人类中，超过95%的多外显子基因以发育、组织特异性或信号转导依赖的方式经历选择性剪接。这种时空和情境特异性调节使选择性剪接成为基因表达的关键调节因子，在细胞分化和环境变化反应等生物过程中发挥关键作用。选择性剪接加工事件包括：外显子跳跃、互斥外显子、内含子保留、选择性3'剪接位点选择、选择性5'剪接位点选择、选择性第一外显子、选择性最后外显子或串联3'非翻译区。选择性剪接的失调在癌症和其他疾病中频繁观察到，凸显了其在基础基因调控之外的临床相关性。 组成型和选择性前体mRNA剪接由剪接体机器协调，该机器识别前体mRNA上的特定剪接位点并允许切除内含子和连接外显子。剪接体由5种小核RNA(U1、U2、U4、U5和U6)以及约100种相关蛋白组成。U6snRNA直接参与细胞核内的催化，而其他snRNA首先在细胞质中加工，然后返回细胞核以促进剪接。在剪接反应的不同步骤中，不同且高度动态的小核核糖核蛋白复合物以及时协调的方式形成。这些步骤包括组装、激活、催化和解体，涉及多种剪接体构象，从早期E复合物和激活的A剪接体到催化B、C复合物和催化后状态。最初，U1snRNP结合5'剪接位点，而U2snRNP在U2AF的辅助下识别分支点序列和3'剪接位点，形成早期剪接体。U4/U6/U5三snRNP的加入导致前催化构象，后者经历进一步重排以激活剪接。催化阶段涉及两个序贯的转酯反应：第一个反应切割5'外显子并形成中间套索，第二个反应连接外显子，产生成熟mRNA并将内含子作为套索释放。最终，剪接体解体回收其组分用于后续剪接循环。剪接因子进一步调节剪接位点选择，确保前体mRNA加工的保真度和效率。在选择性剪接过程中，剪接因子(如富含丝氨酸/精氨酸蛋白或异质核核糖核蛋白)与特定调节外显子或内含子元件的结合有助于外显子的定义和识别及其在成熟mRNA中的包含/排除，这取决于这些剪接因子的相对表达和活性平衡。 FGFR前体mRNA的选择性剪接已被证明可产生具有不同结构和功能特性的各种受体亚型。这些剪接加工事件主要影响FGFR1-3的各种功能域。一个特征明确的剪接事件涉及免疫球蛋白样结构域III中外显子8或9的互斥包含，产生IIIb和IIIc亚型。这种剪接事件的调节由情境依赖的各种RNA结合蛋白介导。hnRNPM促进外显子IIIc跳跃，有利于FGFR2-IIIb的产生。食管剪接调节蛋白1和2以及hnRNPF/H和叉头框-2增强IIIb亚型的表达。相反，hnRNPA1和多嘧啶束结合蛋白1抑制IIIb亚型的表达。此外，RNA结合基序蛋白4增强IIIb表达，而神经元PTB促进IIIc表达。因此，这些剪接调节因子的精确平衡对于维持FGFR功能和组织特异性表达模式至关重要。除了这种与剪接因子表达相关的经典模型外，近期研究还证明动态组蛋白修饰在调节FGFR2剪接向间充质FGFR2-IIIc亚型方面也发挥关键作用。因此，研究表明AKT信号通过磷酸化IWS1调控FGFR2剪接，促进组蛋白甲基转移酶SET结构域包含蛋白2的招募并触发H3K36me3修饰。这种修饰招募PTB，抑制外显子IIIb包含同时促进外显子IIIc包含。在上皮-间充质转化诱导的细胞模型中，H3K27ac/me3水平的改变也被证明是驱动FGFR2-IIIb/IIIc剪接转换所必需且充分的，因为这些染色质修饰调节PTB向前体mRNA的招募。因此，染色质标记外显子处的局部组蛋白修饰作为调节机制，驱动FGFR2选择性剪接的动态变化。 除了IgIII结构域外，选择性剪接事件还影响FGFR的细胞外区域。例如，FGFR1-3中的外显子3和4以及FGFR4中的外显子2和3分别编码IgI和酸盒结构域，这些结构域有助于FGFR自抑制。缺乏这些结构域的FGFR剪接亚型表现出增强的配体亲和力和信号效力。具体而言，IgI结构域的去除产生FGFRβ亚型，其保留IgII和IgIII，形成两个结构环，而包含IgI结构域的FGFRα亚型维持三个环。这些剪接事件的调节由作为剪接抑制因子的PTBP1介导。PTBP1表达水平直接影响FGFR1剪接模式。PTBP1过表达抑制α外显子的包含，而其下调增强α外显子保留。这种调节通过PTBP1与α外显子侧翼的内含子剪接沉默子结合发生。此外，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子6通过结合该区域内的外显子剪接增强子促进α外显子排除。其他FGFR剪接变体包括调节受体活性的选择性C末端序列(C1、C2和C3)。这些C末端变异影响参与受体自磷酸化和与触发FGFR下游信号传导的细胞质蛋白相互作用的关键酪氨酸残基。其中，C3亚型表现出最强的转化活性和致癌潜力。在胃癌和乳腺癌细胞系中已报告C3亚型表达升高，强化了其在肿瘤发生中的作用。另一个影响FGFR功能的剪接事件涉及跨膜结构域附近六核苷酸序列(GTAACA)的包含或排除，称为VT基序。VT基序的包含增强RAS/MAPK通路激活，而其排除损害效应蛋白结合，从而减弱受体信号传导。有趣的是，虽然VT基序排除破坏主要FGFR下游通路，但某些激酶依赖性信号级联(如PLCγ介导的级联)不受影响。这表明VT基序包含可能赋予细胞类型特异性信号偏好。 FGFR的选择性剪接不仅决定其组织和细胞类型特异性表达，还决定其配体结合偏好。例如，FGFR2-IIIb优先结合FGF1、3、7、10和22，而FGFR2-IIIc对FGF1、2、4、5、6、8、9、16、17、18和20具有更高亲和力。类似地，FGFR1β显示对FGF1的增强结合。这种亚型特异性结合差异具有关键功能后果。在组织修复方面，响应皮肤损伤，肉芽组织内的成纤维细胞和真皮及表皮中的γδT细胞上调FGF7和FGF22的表达，激活角质形成细胞中的FGFR2-IIIb，促进其增殖和迁移。此外，成纤维细胞分泌FGF7和FGF10，通过FGFR1-IIIb和FGFR2-IIIb信号传导驱动基底角质形成细胞增殖和迁移，从而促进再上皮化。角质形成细胞通过自分泌方式进一步分泌FGF22增强这一过程，维持其激活并加速伤口愈合。在器官发育方面，FGF信号介导的上皮-间充质相互作用对肺发育至关重要。FGF10是早期肺分支形态发生的关键调节因子，是正常肺形成所必需的。在FGF10敲除小鼠中，气管发育发生，但肺芽形成缺失。间充质FGF10通过上皮FGFR2的信号传导激活MAPK/ERK通路，促进SOX9表达和肺上皮分化。对FGF10具有高亲和力的FGFR2-IIIb进一步调节AKT和WNT/β-连环蛋白信号传导，影响肺祖细胞命运决定。尽管气道和肺泡上皮细胞功能不同，但它们起源于共同的胚胎上皮祖细胞，这些祖细胞形成呼吸树并分化为成熟肺谱系。FGF10-FGFR2-IIIb信号传导通过调节AKT-WNT/β-连环蛋白轴在近端至远端气道模式中发挥关键作用。FGF10或FGFR2-IIIb的缺失破坏远端祖细胞维持，导致近端肺分化异常、表面活性物质产生受损和肺泡上皮细胞谱系缺陷，可能促成呼吸系统疾病。总之，上述例子说明了亚型特异性FGFR-FGF相互作用如何调控情境依赖性结果，从皮肤修复到肺发育。这些剪接-配体关系的破坏可导致病理状况，如组织再生缺陷和呼吸系统疾病，凸显了FGF及其剪接亚型特异性受体在不同生物环境中的功能多样性。 越来越多的研究强调，外部因素如病毒感染、激素刺激、细胞应激和昼夜节律调节可直接影响FGFR的选择性剪接，特别是FGFR2。例如，在食管鳞状细胞癌中，暴露于致癌物N-亚硝基甲基苄胺导致长链非编码RNAUCA1的下调，其功能是隔离剪接因子hnRNPF。UCA1的缺失允许hnRNPF结合FGFR2前体mRNA中外显子IIIc侧翼的内含子区域，从而促进其包含并促进从上皮亚型(IIIb)向间充质亚型(IIIc)的转换。这种亚型转换激活PI3K/AKT信号级联并驱动上皮-间充质转化。这些发现直接将环境诱变剂与RBP介导的FGFR2选择性剪接在癌变中联系起来。此外，细胞应激信号如FAS激活已被证明通过涉及FAS激活的丝氨酸/苏氨酸磷蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络调控FGFR2剪接。FAST本身缺乏RNA结合能力，但作为支架招募剪接调节因子，包括TIA1、SAM68和SF3B4，到位于FGFR2外显子IIIb邻近的富含U的内含子剪接增强子。这种组装促进外显子定义并增强IIIb包含，平衡促进上皮-间充质转化的亚型并在应激条件下调节肿瘤细胞可塑性。此外，昼夜节律组分的改变可深刻影响剪接因子和FGFR2等下游靶点的时间调节。HCT116结肠癌细胞中核心昼夜节律基因ARNTL、PER2和NR1D1的敲低破坏了关键剪接体组分(如SF3A1、SNW1、HNRNPC)和U2辅助因子U2AF1的节律性表达。这种失调伴随着FGFR2-IIIb和IIIc亚型表达的周期性丧失。机制上，ARNTL耗竭降低编码时钟控制RBP的位点的启动子活性和染色质可及性，从而减弱其调节外显子选择的能力。resultantFGFR2-IIIb/IIIc比率的转变促进上皮-间充质转化信号传导，增强肿瘤细胞侵袭和转移。这些发现首先强调了FGFR剪接的昼夜节律调节作为癌症进展潜在贡献者的作用。尽管如此，仍需更详细的分子研究来阐明ARNTL等昼夜节律时钟因子如何与RBP协调调控FGFR前体mRNA剪接，因为当前证据主要基于功能敲除实验。虽然这些研究集中于FGFR2-IIIb/IIIc剪接转换，但广泛的外部刺激，包括炎症细胞因子和生长因子、缺氧和氧化应激、细胞外基质重塑和机械应力、化疗/放疗和靶向治疗，可能类似地调节其他FGFR的选择性剪接。需要进一步研究来探索这些调节通路是否普遍适用于不同肿瘤情境和治疗设置。 大量研究表明，失调的FGFR剪接也发生在多种癌症类型中，改变受体亚型表达并重编程下游致癌通路。本节系统分类不同的FGFR剪接亚型，并阐述它们在驱动特定类型癌症进展、转移和治疗抵抗中的作用。这一概述强调了FGFR-剪接轴对肿瘤可塑性和适应性进展的核心贡献。 FGFR1β显示比FGFR1α更强的FGF1结合亲和力，从而放大致癌信号传导，促进上皮-间充质转化和转移，并与患者较差的生存相关。矛盾的是，高FGFR1β表达也增加了肿瘤对FGFR抑制剂的敏感性，凸显了其在驱动肿瘤进展同时增强治疗反应性方面的双重作用。乳腺癌仍然是全球主要的健康负担，约占所有女性恶性肿瘤的30%，并显著贡献于女性癌症相关死亡率。在这些肿瘤中，研究表明FGFR1β激活增强PI3K/S6信号传导，促进增殖，并抑制E-cadherin表达，促进上皮-间充质转化。高FGFR1β/FGFR1α比率与侵袭性增加和驱动乳腺癌进展的转录程序改变相关。在膀胱癌中，FGFR1β表达在肿瘤组织和细胞系中显著上调，与晚期病理分级、分期和不良临床结局相关。FGFR1β通过MAPK通路激活促进增殖、迁移和侵袭，促成更具侵袭性的肿瘤表型。因此，FGFR1β正成为预后生物标志物和潜在治疗靶点。选择性FGFR1β抑制剂和亚型特异性抗体等方法正在研究中，用于膀胱癌的个性化治疗策略。在高级别弥漫性胶质瘤中，异常FGFR1剪接与NF1剪接改变协同增强肿瘤侵袭性。外显子23a的包含独立于经典突变增强RAS/MAPK信号传导，而升高的FGFR1β表达进一步放大FGF驱动的信号传导。这些联合剪接事件促进去分化、增殖和侵袭性。在治疗上，同时靶向FGFR1β和NF1相关通路，例如通过c-JunN端激酶抑制，可能有助于恢复RAS通路调节并改善治疗结果。在胰腺导管腺癌中，FGFR1-IIIb的强制表达通过抑制ERK1/2活性同时激活p38和JNK信号传导发挥肿瘤抑制作用，抑制增殖、迁移、侵袭和异种移植生长。相比之下，同一情境下FGFR1-IIIc的表达增强增殖和侵袭潜力，凸显其促肿瘤功能。机制上，上皮-间充质转化驱动模型中的研究表明，TGFβ-SMAD3信号诱导转录因子叉头框蛋白1，其直接上调FGFR1-IIIc并驱动侵袭，而FOXO1沉默显著减弱这种效应。在腺样囊性癌中，已检测到缺乏细胞内激酶结构域的新型截短FGFR1剪接变体(FGFR1v)。与经典FGFR1不同，FGFR1v独立于FGF配体发挥作用，而是通过AXL/AKT轴信号传导，驱动对FGFR抑制剂如Dovitinib和Bemcentinib的抵抗。值得注意的是，FGFR1v和AXL的双重阻断在临床前模型中显示出协同疗效，揭示了一种替代抵抗机制，并为腺样囊性癌的联合治疗提供了强有力的理论基础。总之，这些发现强调了FGFR1剪接变体的功能异质性和肿瘤特异性作用。 FGFR2的失调剪接促进多种癌症的肿瘤进展，包括胃癌和胆管癌，其中差异亚型表达影响肿瘤生长和转移行为。此外，FGFR2基因扩增和异常剪接在胃癌和膀胱癌中频繁观察到，并与不良预后相关。有趣的是，FGFR2阳性循环肿瘤细胞最近已成为胃癌有前景的非侵入性生物标志物。然而，当前研究未区分循环肿瘤细胞内的FGFR2亚型，这可能限制其预测和临床效用。来自肿瘤组织研究的证据强调了亚型特异性调节在弥漫性胃癌中的重要性，其中ESRP1经常通过基因扩增和启动子低甲基化上调，从而使剪接偏向FGFR2-IIIb亚型同时抑制FGFR2-IIIc表达。Teles等人提供了首个临床证据，证明基因扩增驱动的ESRP1过表达促进FGFR2亚型表达偏倚，并证明升高的FGFR2-IIIc表达与弥漫性胃癌不良预后直接相关。这些发现为当前FGFR2靶向治疗的失败提供了新见解。值得注意的是，大多数现有FGFR2靶向单克隆抗体(如GP369)选择性识别FGFR2-IIIb，凸显了开发FGFR2-IIIc特异性诊断和治疗策略的迫切需要。在胰腺癌中，miR-23a在上皮-间充质转化期间上调并抑制ESRP1，导致CD44(从CD44v到CD44s)和FGFR2(从IIIb到IIIc)的剪接转换，从而促进转移。ESRP1的恢复可部分逆转这些效应，凸显其在剪接调节和上皮-间充质转化抑制中的核心作用。鉴于FGFR2-IIIc与侵袭性肿瘤行为相关且未被当前FGFR2-IIIb选择性治疗有效靶向，同时靶向两种FGFR2剪接亚型和上游miR-23a-ESRP1轴的联合方法可能提供协同益处，特别是克服亚型驱动的抵抗。在结直肠癌中，RNA结合蛋白RBM4与nPTB相反地调节FGFR2剪接，形成影响上皮-间充质转化和血管生成的调节回路。由miR-92a驱动的RBM4下调导致nPTB表达增加和向FGFR2-IIIc的转换，从而通过AKT/ERK激活促进肿瘤进展。RBM4的治疗性恢复或miR-92a/nPTB轴的抑制可能逆转这些致癌效应。FGFR2-IIIc在子宫内膜癌中也发挥预后作用。其过表达与较差的无进展生存期和疾病特异性生存期相关，特别是在高风险和错配修复缺陷的子宫内膜样子宫内膜癌病例中。FGFR2-IIIc可作为子宫内膜癌的独立预后生物标志物。在肿瘤微环境内，肿瘤相关巨噬细胞可通过改变FGFR2不同亚型的表达影响肿瘤动态。FGFR2-IIIc也受ESRP1/2调节并促进肿瘤相关巨噬细胞极化。调节ESRP1/2-FGFR2-IIIc轴可影响肿瘤相关巨噬细胞表型，潜在增强抗肿瘤效应，特别是在乳腺癌中。在食管鳞状细胞癌中，致癌物诱导的长链非编码RNAUCA1下调促进从FGFR2-IIIb向IIIc的转换，从而激活PI3K-AKT信号传导并促进上皮-间充质转化。UCA1的再表达抑制这种转换，可提供治疗途径。总之，这些发现强调了FGFR2亚型动态的病理性意义，特别是促进间充质的FGFR2-IIIc。亚型特异性抑制，结合上游调节干预(如ESRP1、RBM4或miR-23a)和RNA剪接抑制剂，代表抑制上皮-间充质转化和转移进展以及克服剪接驱动抵抗的合理联合策略。这些策略为精确FGFR靶向治疗提供了有前景的新机会。 与FGFR1和FGFR2基因类似，FGFR3基因在IgIII结构域内经历选择性剪接，产生两种主要亚型：FGFR3-IIIb和FGFR3-IIIc。这些亚型在配体特异性和生物功能上不同，从而影响肿瘤行为。在结直肠癌中，异常FGFR3-IIIb表达与增强的细胞存活和增殖相关，而FGFR3-IIIc作为FGF18驱动的致癌信号传导的主要介导因子，促进肿瘤生长和进展。重要的是，FGFR3-IIIc的选择性抑制抑制结直肠癌细胞增殖并诱导凋亡，凸显其作为治疗靶点的潜力。在肝细胞癌中，FGF9激活FGFR3-IIIb和IIIc两种亚型刺激肿瘤生长和新生血管形成。这些亚型共同不仅抑制凋亡还维持克隆形成生长，进一步加速恶性进展。在前列腺癌中，一种新型剪接变体FGFR3-S缺乏编码激酶域激活环的外显子14，表现出增加的自磷酸化和下游通路(如AKT、STAT3和S6核糖体蛋白)的组成型激活。与全长FGFR3-L亚型相比，FGFR3-S增强肿瘤生长并赋予对FGFR抑制剂如dovitinib的抵抗。另一种变体FGFR3-DAB缺乏酸盒结构域，显示对FGF2刺激的增强反应性。酸盒似乎调节配体结合和受体激活，其缺失可能增加有丝分裂活性。在膀胱癌情境下，FGFR3突变和剪接改变不仅驱动肿瘤进展，还塑造免疫抑制性肿瘤微环境。FGFR3激活已被证明通过抑制T细胞激活促进巨噬细胞介导的免疫逃逸。这些发现强调了FGFR3剪接变体在促进内在肿瘤细胞侵袭性和外在免疫逃逸方面的双重作用。它们凸显了靶向FGFR3亚型特异性信号传导以同时抑制肿瘤生长和重编程肿瘤免疫微环境的治疗潜力。在膀胱肿瘤中，FGFR3Δ8-10的表达显著降低，这种剪接变体通常作为FGFR3信号传导的负调节因子。这种变体的缺失导致组成型FGFR3通路激活，从而促进肿瘤细胞增殖和抵抗凋亡。同时，FGFR3-IIIc亚型的上调扩大配体结合特异性并触发多种致癌通路，进一步增强肿瘤侵袭性。临床上，选择性FGFR抑制剂derazantinib和泛FGFR抑制剂在携带FGFR3改变的膀胱癌中显示出有前景的疗效。总之，这些发现强调了FGFR3剪接失调在驱动结直肠癌、前列腺癌和膀胱癌的肿瘤发生和治疗易感性中的核心作用。 与FGFR1-3不同，FGFR4不经历选择性剪接产生IIIb/IIIc亚型，因为其IgIII结构域中缺乏替代外显子。其表达通过多种转录和转录后机制精细调节，这些机制促进肿瘤进展和转移。在胰腺癌中，肝细胞核因子1-α已被证明增强内含子1增强子活性，导致FGFR4过表达并促进肿瘤侵袭性。类似地，在转移性结直肠癌中，转录因子FOXC1转录激活FGFR4及其下游效应基因如ITGA7，从而通过GSK3β/β-连环蛋白信号轴促进上皮-间充质转化和转移播散。升高的FOXC1表达与结直肠癌转移增加、复发和患者生存期缩短相关。除了转录控制外，新兴证据突出了转录后机制在调节FGFR4表达中的贡献。在肝细胞癌中，小核核糖核蛋白多肽E在调节FGFR4转录本内的内含子保留方面发挥关键作用，从而通过无义介导的衰变影响其稳定性。SNRPE的耗竭增加内含子保留，导致无功能的FGFR4转录本通过无义介导的衰变降解，最终降低FGFR4蛋白水平。功能上，通过这种剪接依赖性机制抑制FGFR4损害肝细胞癌细胞增殖、迁移和克隆形成能力，提示调节SNRPE-FGFR4轴可能提供治疗机会。此外，在肝细胞癌中已鉴定出涉及FGF19、HOXB5和FGFR4的正反馈环路，进一步放大致癌信号传导。FGF19通过PI3K/AKT/HIF-1α通路刺激HOXB5表达，而HOXB5反过来直接结合FGFR4启动子，维持高FGFR4表达。这种FGF19-HOXB5-FGFR4环路驱动肝细胞癌增殖和进展。总之，这些发现描绘了FGFR4在胰腺癌、结直肠癌和肝癌中的多方面调节。它们强调，尽管FGFR4缺乏经典剪接亚型，其表达和活性受转录增强子、剪接因子和致癌反馈环路的紧密调节。靶向这些调节轴有望控制FGFR4驱动的肿瘤转移，特别是在胃肠道和肝细胞癌中。 虽然前面部分侧重于RNA剪接如何促进FGFR剪接亚型多样性并影响FGFR功能，FGFR本身也可以通过至少两种互补机制塑造剪接结果。首先，特定FGFR突变可破坏顺式作用剪接元件，改变外显子包含或排除，从而驱动疾病表型。其次，虽然仍很大程度上未被探索，但异常FGF-FGFR信号级联重编程剪接调节网络是高度可能的。除了改变受体活性外，FGFR突变还可深刻影响前体mRNA剪接调节，从而重塑受体亚型表达和下游信号传导。例如，FGFR2剪接受顺式作用元件(包括内含子剪接沉默子)的紧密调节。这些调节元件的突变可导致异常外显子包含或排除，从而导致改变的受体信号传导特异性和强度。因此，FGFR2中的突变经常破坏外显子IIIb和IIIc的互斥选择，导致失调的上皮-间充质相互作用和缺陷的形态发生。删除IIIc外显子以及内含子序列导致剪接缺陷和类似Apert综合征的显性致死表型。类似地，FGFR2p.C342Y突变也被证明导致剪接异常。这种突变促进异常外显子使用并增强FGFR2-IIIc亚型的表达，导致显著的颅面畸形，包括颅缝早闭、中面部发育不全和行为缺陷，而不影响肢体发育。突变也可影响其他FGFR，FGFR1中的同义突变可激活外显子8中的隐藏剪接位点并导致异常剪接，可能导致先天性疾病如Hartsfield和Kallmann综合征。这些病理通常与嗅觉丧失、生殖器官发育问题和中枢神经系统异常等症状相关。 除了这些由突变驱动的顺式调节剪接元件改变外，人们对FGFR介导的信号通路如何影响转录后水平的剪接结果越来越感兴趣。与其直接改变剪接位点结构，FGFR激活可通过下游效应器(如蛋白激酶)调节剪接调节因子的活性。这种基于信号的控制引入了额外的复杂性层，将外部信号与剪接机器整合在一起，从而根据环境和致癌刺激微调亚型表达。据我们所知，将FGFR信号与RNA剪接直接联系起来的实验证据仍然有限。然而，通过AKT通路，FGFR信号调节剪接调节在机制上是合理的。这一观点得到充分表征的表皮生长因子受体-AKT-SRPK/SRSF轴的支持，其中富含丝氨酸/精氨酸的蛋白激酶(特别是SRPK1)磷酸化富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子，从而调节其核定位和剪接活性。EGFR-AKT-SRPK-SRSF信号级联将细胞外生长因子信号与剪接调节联系起来，其中EGFR激活导致AKT介导的SRPK1激活，后者随后磷酸化富含丝氨酸/精氨酸的蛋白，导致剪接的广泛变化。鉴于EGFR和FGFR通路之间的共享下游效应器，合理推测FGFR驱动的AKT激活同样参与SRPK-SRSF级联。该轴可通过修饰SR蛋白和其他RBP(如hnRNP)来协调致癌剪接程序。支持这一点，hnRNPL的磷酸化已被证明增加其与半胱天冬酶-9b外显子3的亲和力，促进向抗凋亡半胱天冬酶-9b亚型的转变并减少促凋亡半胱天冬酶-9a变体，从而增强癌细胞存活。此外，AKT激活SRPK，后者通过促进剪接因子从热休克蛋白70结合复合物向热休克蛋白90结合复合物的转变来介导剪接因子的核转位。这种转变增强SR蛋白磷酸化并最终调节RNA剪接模式。值得注意的是，许多由AKT通路调节的剪接因子表现出致癌或抑癌功能，凸显了靶向剪接因子通路作为癌症治疗策略的潜力。升高的AKT磷酸化与增加的SRPK1水平相关，后者增强癌细胞对凋亡的抵抗。剪接调节因子和激酶可被各种信号分子调节，包括生长因子或细胞因子如表皮生长因子、血小板衍生生长因子、TGFβ。我们先前的工作证明，FGF-2通过激活调节内皮细胞中血管内皮生长因子受体1mRNA选择性剪接的SRSF1/SRSF3/SRPK1网络促进血管生成，这一过程也可能促进肺肿瘤进展。FGF-2激活FGFR后，SRSF1和SRPK1表达上调，导致特定VEGFR1剪接变体的产生，其中sVEGFR1-ex12在增强血管生成方面最有效。用酪氨酸激酶抑制剂抑制FGFR或使用SPHINX31或SRPIN340阻断SRPK1/2激酶活性可有效阻断FGF2诱导的促血管生成剪接变体VEGFR1-ex12的产生，从而间接抑制血管生成。值得注意的是，sVEGFR1-ex12作为肺鳞状细胞癌不良预后的生物标志物。 RNA结合蛋白Src相关有丝分裂68(SAM68)是STAR家族的成员，在RNA转录、加工和EGF信号传导中发挥核心作用。EGF激活ERK-MAPK通路，导致SAM68磷酸化，调节CD44的选择性剪接，CD44是肿瘤进展的关键介导因子。鉴于EGFR和FGFR信号通路的相似性，两者都涉及受体酪氨酸激酶激活以及PI3K-AKT和ERK-MAPK级联，合理推测FGFR信号动员类似的复杂调节网络来控制RNA剪接调节程序，促进肿瘤发生和进展。正如Xiang-DongFu所指出，"EGF似乎动员了一个大村庄来完成肿瘤进展过程中的调节剪接"。FGF是否也是这个村庄的一部分仍有待深入研究。这至关重要，因为阐明与FGF-FGFR驱动肿瘤发生相关的复杂剪接机制可能有助于定义诊断改进和新型癌症治疗定义的潜在治疗靶点。 FGFR-TKI可根据其靶点选择性大致分类：泛FGFR抑制剂(如厄达菲尼、futibatinib、rogaratinib)、FGFR1-3选择性抑制剂(如佩米替尼)和亚型特异性药物(如用于FGFR3的LOXO-435、用于FGFR4的Fisogatinib)。FGFR-TKI已获得监管批准并在各种实体瘤中显示出疗效。例如，首个FDA批准的泛FGFR抑制剂厄达菲尼在转移性尿路上皮癌中显示出40%的客观缓解率和5.5个月的中位无进展生存期。佩米替尼在携带FGFR2融合的胆管癌患者中达到35.5%的客观缓解率并将中位总生存期延长至21.7个月。此外，KIN-3248在FGFR2/3驱动的晚期实体瘤中显示出抗肿瘤活性，尽管其最佳临床剂量尚未确定。此外，近期证据表明FGFR4抑制剂仑伐替尼通过抑制FGF19-FGFR4信号轴增强胃癌的抗肿瘤免疫反应，从而降低肿瘤程序性细胞死亡配体1表达并修饰肿瘤免疫微环境。这为联合使用FGFR抑制剂和免疫检查点抑制剂克服药物抵抗提供了新方法。 尽管这些结果令人鼓舞，FGFR-TKI的更广泛治疗效用仍受到关键挑战的限制。这些包括抵抗问题(原发性或获得性)，涉及不同机制(看门人FGFR突变、旁路信号通路等)，也与肿瘤内异质性高度相关，基于生物标志物的患者选择策略的局限性，以及剂量限制性毒性(靶点和脱靶)及不良事件，这些对剂量升级和长期治疗耐受性造成限制。对FGFR抑制剂的抵抗可源于FGFR激酶域内的特定点突变，包括看门人、分子制动器和DFG-闩锁突变。这些改变破坏受体与FGFR-TKI之间的关键氢键网络，也可能引入阻碍抑制剂结合的空间位阻。此外，FGFR-TKI治疗期间出现的获得性抵抗突变进一步导致药物疗效降低和治疗失败。在携带FGFR2-BICC1、FGFR2-OPTN或FGFR2-ZMYM4融合的肝内胆管癌患者中已鉴定出获得性FGFR2-V564F看门人突变。这些FGFR2改变通过引入阻碍抑制剂结合的空间位阻而赋予对泛FGFR抑制剂的抵抗。FGFR1-V561M看门人突变通过激活STAT3信号传导和促进上皮-间充质转化赋予肺鳞状细胞癌对AZD4547的抵抗，从而促进更具侵袭性的肿瘤表型。类似地，FGFR3-V555M是在FGFR3阳性膀胱癌中对厄达菲尼临床抵抗的机制。替代RTK和下游信号通路(如RAS-RAF-ERK和PI3K-AKT-mTOR级联)的激活代表癌细胞逃避FGFR-TKI的另一机制。值得注意的是，EGFR和MET等RTK可通过遗传改变和非遗传适应性反应在功能上补偿FGFR阻断。例如，在头颈鳞状细胞癌中，AZD4547抵抗细胞表现出升高的磷酸化EGFR和下游AKT信号传导，这有助于在FGFR抑制下持续增殖。与EGFR抑制剂吉非替尼联合治疗恢复了药物敏感性，证实EGFR在FGFR-TKI压力下作为功能性旁路节点。类似地，MET信号传导已被牵涉为FGFR依赖性肿瘤中的替代驱动因素。通过MET激活GAB1和ERK维持细胞增殖并赋予对FGFR抑制的抵抗，这种表型可通过联合FGFR-MET阻断来克服。这种汇聚凸显了RTK网络的可塑性以及共靶向上游或平行受体的重要性。此外，下游效应器如KRAS和PIK3CA中的激活突变，以及肿瘤抑制因子PTEN的功能丧失突变，可驱动独立于RTK的组成型信号传导，进一步限制FGFR抑制的疗效。另一个关键障碍是肿瘤内异质性，这是实体瘤的固有特征，使统一治疗靶向复杂化。FGFR选择性剪接似乎在独特的肿瘤区域动态调节。在胃癌中，FGFR2-IIIb表达在活检、手术标本和转移部位之间观察到深刻的空间异质性。在一个163对配对活检和手术样本的队列中，仅0.6%的病例观察到FGFR2-IIIb过表达的一致性，而原发灶和转移灶之间的一致性仅为0.7%。类似地，原发肿瘤和淋巴结转移之间FGFR2-IIIb表达的不一致在44.4%的病例中观察到，包括阴性和阳性转换。一致地，配对分析揭示，与原发性肿瘤相比，转移灶中FGFR2-IIIb阳性的频率和阳性肿瘤细胞的比例均显著更高(8% vs. 3%；75% vs. 47%；P<0.001)，凸显了显著的空间异质性，并进一步支持同一患者内亚型表达的空间变异性。临床上，这种异质性对FGFR2靶向治疗有直接影响。在FIGHT和FORTITUDE研究中，bemarituzumab在≥10%FGFR2-IIIb阳性细胞(通过IHC)的患者中显示出更大疗效，但当未考虑空间异质性时，基线活检的预测可靠性有限。通过循环肿瘤DNA和细胞游离RNA测量FGFR2扩增或剪接变体的液体活检可能扩大采样，但在解析亚型水平异质性方面仍受技术限制。为应对这些挑战，未来策略应整合多区域采样、空间转录组学和亚型特异性成像方法来捕获FGFR剪接异质性的全貌。这些工具可优化患者分层并实现适应性、亚型引导的治疗策略。 另一个需要克服的关键障碍是当前生物标志物检测策略的次优表现。虽然基因组分析可鉴定FGFR突变、融合和扩增，但已报告高达15%的假阴性率，主要是由于DNA水平改变与功能性mRNA或蛋白表达之间的不一致。常规测序也未能捕获FGFR剪接变体的动态表达和临床相关性，而这些是药物敏感性、抵抗和患者结局的关键决定因素。这些缺点限制了生物标志物检测的预测价值并使临床研究中的患者分层复杂化。同时，即使准确检测到FGFR改变，这些生物标志物的治疗开发仍因缺乏足够选择性的抑制剂而受限。例如，激素受体阳性乳腺癌中的FGFR1扩增与对周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂的抵抗相关，但缺乏FGFR1选择性抑制剂阻止了对这一脆弱性的有效靶向。此外，大多数目前可用的FGFR抑制剂是泛FGFRTKI，不加区分地阻断FGFR1-4。这种广泛活性增加了剂量限制性毒性的风险，未能解决亚型或组织特异性FGFR变体的不同致癌贡献。 FGFR-TKI的临床使用也受到特征性毒性的限制，其中大多数源于正常组织中生理性FGFR信号的靶点抑制。FGF23-FGFR1轴在磷酸盐稳态中发挥核心作用，该通路的破坏被认为是FGFRTKI相关高磷血症(一种标志性不良事件)的主要机制。临床研究报告，超过70%的患者发生血清磷酸盐升高。管理策略通常涉及剂量调整和使用磷酸盐结合剂如司维拉姆或碳酸镧。除代谢紊乱外，胃肠道不良事件(包括口腔炎、腹泻和口干症)在选择性和泛FGFRTKI如佩米替尼和futibatinib中常见。这些事件被认为反映了FGFR介导的上皮完整性和稳态的破坏。皮肤毒性(包括脱发、指甲疾病和掌跖红斑感觉异常综合征)也普遍存在。FGFR抑制剂的治疗相关副作用并不罕见。因此，治疗期间的主动监测可尽量减少剂量减少和停药，有利于患者的生活质量和结局。 如前所述，FGFR的选择性剪接强烈影响其细胞和tissue表达模式以及在调节肿瘤发生和治疗逃逸中涉及的关键生物过程中的活性。因此，虽然这仍很大程度上未被探索，但靶向FGFR-RNA剪接串扰可为克服与当前FGFR靶向治疗相关的局限性提供新见解和解决方案。传统生物标志物(如肺鳞状细胞癌中的FGFR1扩增)对FGFR-TKI反应的预测价值有限。例如，FGFR1抑制剂尼达尼布在III期LUME-Lung-1研究中未能优于化疗，凸显了单独基因组改变作为生物标志物的不足。相比之下，强调其在肿瘤异质性中作用的FGFR剪接变体的差异表达模式可为分子患者分层和个性化治疗提供更有价值的见解。例如，FGFR1亚型(FGFR1α和FGFR1β)的比率与癌症进展和预后密切相关，FGFR1β特别与肿瘤发生和不良生存结局相关。此外，高FGFR1β表达(反映在增加的FGFR1β/FGFR1α比率中)与对FGFR抑制剂如BGJ-398的增强反应性相关。特定FGFR2变体的存在也可能表明对特定FGFR抑制剂的高度敏感性。一致地，在子宫内膜癌中，利用患者来源异种移植和类器官模型的研究表明，高FGFR2-IIIc表达的肿瘤对FGFR抑制剂如BGJ398和佩米替尼表现出高度敏感性。这些抑制剂还通过减少血管生成和M2巨噬细胞浸润(CD206+)重塑肿瘤微环境。此外，使用FGFR2shRNA的敲低实验证实了肿瘤对FGFR2-IIIc的依赖性，强化了其作为精确肿瘤学靶点的潜力。此外，近期发现强调了乳腺癌中FGFR2剪接变体的亚型特异性表达。IIIb变体主要在雌激素受体阳性乳腺癌中表达，而IIIc变体在HER2阳性乳腺癌中显著升高。这些发现提示FGFR2-IIIc作为侵袭性生物标志物候选者，具有指导治疗决策的潜力，特别是在转移性和复发性疾病中。对FGFR剪接变体机制作用的持续研究对其作为精确生物标志物的临床效用扩展至关重要。值得注意的是，近期使用人工智能驱动的苏木精-伊红切片组织病理学研究将提供一种成本效益高的策略，通过识别微妙的肿瘤和基质模式来推断FGFR突变和剪接改变。结合多组学整合，这些平台可优化生物标志物发现和患者分层，从而推进个性化FGFR靶向治疗，特别是在肺鳞状细胞癌等异质性肿瘤中。 分子成像技术，特别是正电子发射断层扫描和单光子发射计算机断层扫描，已成为肿瘤中FGFR表达非侵入性可视化的变革性工具。其中，FGFR1靶向探针[68Ga]Ga-DOTA-FGFR1最近显示出显著的转化价值。在该临床研究中，[68Ga]Ga-DOTA-FGFR1能够清晰显示原发性和转移性肺肿瘤，对淋巴结受累的特异性高于[18F]FDG，并与FGFR1蛋白表达强相关(Spearman r=0.6901，P<0.0001)。同时，[68Ga]Ga-DOTA-FGFR1肽的剂量学评估也表明在人体中有良好的安全性特征，支持其常规临床使用的潜力。除[68Ga]外，近期开发了一种新型PET成像探针18F-FGFR1，通过将高亲和力FGFR1靶向肽与18F放射性标记和聚乙二醇修饰结合以改善体内药代动力学。在该高FGFR1表达的临床前肿瘤模型中，18F-FGFR1表现出优异的稳定性、特异性和对比度，能够有效可视化FGFR1表达病灶，脱靶积累最小。同时，FGFR2靶向SPECT探针的开发进一步扩大了成像范围。一系列99mTc标记肽，特别是[99mTc]Tc-FGFR2-1，在DU145异种移植模型中表现出对FGFR2的特异性结合以及优异的肿瘤摄取和保留。该示踪剂在共同注射FGFR2竞争剂CHO2时实现显著的信号降低，证实了其特异性并提示FGFR2表达肿瘤人体成像的可行性。将这种策略扩展到选择性成像FGFR剪接变体可进一步提高诊断精度，并为亚型导向的放射性核素治疗铺平道路。亚型特异性放射性示踪剂可区分上皮FGFR2-IIIb和间充质FGFR2-IIIc亚型，或识别截短诱饵受体，从而优化肿瘤分类、揭示空间异质性并指导治疗决策。重要的是，除了成像，将治疗性放射性核素与剪接变体选择性配体结合代表直接消除肿瘤细胞的有前景策略。这一原理对FGFR-IIIc特别有说服力，其在多种实体瘤中持续上调并与上皮-间充质转化和转移播散强烈相关。用放射性核素治疗诊断学靶向FGFR-IIIc因此可实现播散性、治疗抵抗性肿瘤细胞群体的选择性消融。展望未来，整合PET成像、空间转录组/蛋白质组分析和亚型特异性放射性药物的模态诊断-治疗平台可能在解析剪接驱动的肿瘤发生和克服抵抗方面具有变革性。这些方法不仅可澄清FGFR亚型在治疗压力下的动态作用，还可为针对转移性疾病的精确肿瘤学干预开辟强大新途径。 联合策略也是减轻对FGFR-TKI治疗抵抗的有前景方法。已证明FGFR-TKI与靶向补偿信号通路(如MEK、PI3K或免疫检查点)的抑制剂联合给药可改善反应率并延迟抵抗。例如，FGFR-TKI与MEK抑制剂联合在早期临床研究中产生48%的客观缓解率。类似地，仑伐替尼(具有抗FGFR活性的多激酶抑制剂)与PD-1阻断联合将晚期肝癌患者的中位无进展生存期延长至23.9个月。这些方法凸显了基于小分子抑制剂的联合策略克服抵抗的合理性以及识别新治疗组合的必要性。由于前体mRNA剪接失调在肿瘤中的关键作用，靶向剪接体机器各组分的小分子抑制剂已被开发，并在不同癌症类型中显示出有前景的抗癌活性。更具体地说，这些化合物靶向：SF3B1，U2snRNP复合物的核心组分，对剪接体组装过程中的分支点识别至关重要，在血液恶性肿瘤中频繁突变；磷酸化SR蛋白的SRPK1和SRPK2激酶，调节其核定位和剪接活性；也磷酸化SR蛋白和其他剪接调节因子的CLK和DYRK1A/B，将剪接控制与细胞周期和应激反应联系起来；调节A结合蛋白甲基化的蛋白精氨酸甲基转移酶，从而影响剪接位点选择和RNA代谢。剪接体抑制剂(如E7107、H3B-8800)在血液恶性肿瘤中的早期期临床研究已证明可行性。此外，E7107被证明优先消除携带剪接因子突变(如SF3B1)的恶性细胞。虽然这尚未被明确阐明，因此合理推测其中一些化合物调节癌细胞中FGFR剪接变体的表达模式，从而影响对FGFR-TKI的敏感性。因此，由SRPK和CLK磷酸化的SRSF1是FGFR亚型转换的关键调节因子。这提出了共靶向剪接通路可抑制耐药FGFR剪接变体的出现并在依赖异常剪接存活的肿瘤中利用合成致死性的假设。未来研究有必要探索剪接体抑制剂作为单药或与FGFR抑制剂(亚型特异性或泛FGFR)在FGFR失调驱动的实体瘤中的合理联合。此外，脂质体、纳米颗粒和肿瘤微环境响应性载体等先进药物递送平台已被证明可增强肿瘤特异性药物积累、改善药代动力学并降低全身毒性。当与剪接靶向治疗联合时，这种递送系统对于实现协同和更持久的抗肿瘤效应可能特别有价值。 可溶性成纤维细胞生长因子受体是缺乏跨膜和细胞内结构域的选择性剪接亚型，产生能够隔离FGF并减弱异常FGF/FGFR信号传导的分泌性细胞外片段。天然存在和生物工程化的sFGFR通常作为诱饵受体发挥作用，竞争性结合FGF以抑制肿瘤细胞中的配体诱导受体激活。然而，某些sFGFR可能表现出情境依赖的促肿瘤效应，凸显了其生物学作用的复杂性。FGFR诱饵受体中最临床先进的例子之一是FP-1039，一种重组sFGFR1-IIIc融合蛋白，以高亲和力结合FGF，破坏自分泌和旁分泌生长环路。临床前研究证明其在抑制血管生成和肿瘤细胞增殖方面的疗效，特别是在FGFR1扩增的肺癌和FGFR2突变子宫内膜癌中。在Ib期临床研究中，FP-1039与培美曲塞和顺铂联合给药导致持续的肿瘤抑制，支持其在FGFR驱动恶性肿瘤联合方案中的潜在作用。另一个有前景的分子是msFGFR2-IIIc，一种携带Ser252Trp突变的可溶性FGFR2-IIIc变体。这种工程化受体片段通过阻止FGF2诱导的受体激活，在NCI-H1299肺癌细胞中有效抑制FGFR1-IIIc信号传导。在异种移植模型中，msFGFR2-IIIc显著抑制肿瘤生长，提示其在共表达FGFR2-IIIc和FGFR1-IIIc亚型的癌症中的效用。Recifercept是一种最初为软骨发育不全开发的重组可溶性FGFR3诱饵蛋白，通过结合FGF配体并减弱FGFR3介导的信号传导发挥作用。尽管有希望的临床前活性，其临床开发因在原适应症中疗效不足而终止。然而，鉴于FGFR3在多种癌症中的频繁过表达或突变，重新利用Recifercept或优化下一代FGFR3诱饵可能在肿瘤学中具有治疗价值。总之，这些发现凸显了sFGFR的治疗潜力，特别是在配体依赖性FGFR成瘾肿瘤中，包括FGFR扩增或激活突变的亚群。未来努力应集中于优化sFGFR药代动力学、改善亚型选择性，并在精确肿瘤学框架内评估其在合理联合治疗中的作用。 反义寡核苷酸是短的化学修饰核酸序列，旨在以序列特异性方式与靶RNA杂交。其作用机制包括RNaseH1介导的mRNA降解、选择性剪接调节以及通过干扰核糖体组装进行的翻译抑制。在FGFR生物学背景下，ASO为选择性纠正驱动致癌亚型表达的异常剪接事件提供了强大平台。靶向FGFR前体mRNA内的剪接调节元件已产生有前景的结果。例如，Bruno等人设计了结合FGFR1内含子剪接沉默子元件的ASO，导致神经胶质瘤细胞中外显子包含增强和功能受体亚型的恢复。该策略将外显子掺入从10%增加到超过70%，凸显了剪接调节作为治疗干预的可行性。ASO策略为精确靶向FGFR剪接变体提供了几个优势。通过促进编码配体结合或二聚化结构域的外显子的包含或跳跃，ASO可调节亚型比率、恢复受体功能或诱导病理性转录本的无义介导衰变。这些方法对于高度选择性和特异性靶向否则难以用小分子激酶抑制剂抑制的致癌FGFR1-3剪接变体特别有价值。除ASO外，小分子剪接调节因子提供互补策略。Risdiplam是FDA批准用于脊髓性肌萎缩症的小分子，通过促进外显子包含以恢复蛋白功能，例证了剪接靶向治疗的转化潜力。此类药物可适用于调节癌症和其他以异常剪接为特征的疾病中的FGFR剪接。鉴于恶性肿瘤中剪接失调的高患病率，包括剪接因子的反复突变和FGFR亚型的错误表达，剪接纠正策略代表靶向癌症治疗的前沿。开发亚型特异性ASO以及小分子调节因子将促进基于RNA的治疗整合到精确肿瘤学流程中，为克服抵抗和改善FGFR驱动肿瘤的临床结局提供新途径。 "下一代"FGFR靶向药物的出现为解决亚型特异性抵抗和降低毒性提供了新机会。这些包括单克隆抗体、PROTAC、RNA/DNA适配体、迷你蛋白或细胞治疗。其中一些方法可实现致病性FGFR剪接变体的选择性阻断，同时保留生理性亚型，从而最小化靶点不良效应。几种单克隆抗体已被开发以选择性靶向FGFR2剪接变体，特别是FGFR2-IIIb。Bemarituzumab是一种特异性靶向FGFR2-IIIb的单克隆抗体，阻断其与FGF7、FGF10和FGF22等经典配体的相互作用。这种抑制破坏了配体依赖性FGFR2-IIIb信号传导和下游致癌通路。Bemarituzumab还具有工程化的Fc结构域，增强抗体依赖性细胞毒性，通过自然杀伤细胞促进免疫介导的肿瘤清除。Aprutumab是一种完全人源化抗体，识别FGFR2-IIIb和FGFR2-IIIc共有的N端结构域中的保守残基。它在FGFR2表达的细胞系如SUM-52PE和SNU-16中诱导受体内化并通过RAB7阳性内体进行溶酶体降解。Aprutumab也在评估中作为放射免疫偶联平台，扩展其在靶向放射性核素治疗中的潜力。3H-3000是一种对FGFR2-IIIb具有高特异性的人源化IgG1κ单克隆抗体。它有效抑制FGF7诱导的FGFR2-IIIb过表达胃癌细胞(如SNU16)中的受体磷酸化和增殖。工程化修饰增强了其ADCC功能。在异种移植模型中，3H-3000显著抑制肿瘤生长，凸显其对FGFR2-IIIb驱动肿瘤的治疗前景。 PROTAC代表一类创新的治疗药物，旨在通过劫持泛素-蛋白酶体系统选择性降解致病性蛋白。这些双功能分子同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶，导致其蛋白酶体降解。与传统小分子抑制剂相比，PROTAC具有提供更强效和持久抑制效果的优势。FGFR靶向PROTAC开发的最新进展通过实现对不同FGFR的改善选择性和增强抗肿瘤疗效，显著拓宽了治疗前景。一个代表性例子是Wang等人开发的化合物S2h，其在FGFR1过表达的KG1a细胞中以39.78nmol/L的DC50和78%的最大降解率诱导有效和选择性的FGFR1降解，而对FGFR2-4表现出可忽略活性。机制上，S2h通过cereblon依赖性、泛素-蛋白酶体介导的降解通路发挥作用。LC-MB12是一种基于Infigratinib的PROTAC，选择性降解FGFR2并有效抑制TEL-FGFR2融合阳性Ba/F3细胞和FGFR2过表达胃癌细胞(SNU16)的增殖。LC-MB12诱导不对称FGFR2二聚体破坏和FRS2/SHP2/GRB2复合物解体，有效dismantling基于支架的信号传播。类似地，通过将厄达菲尼与CRBN配体偶联产生的FGFR2特异性降解剂N5实现卓越的FGFR2降解(DC50=0.03nmol/L)，脱靶活性最小，并在FGFR2扩增的胃癌细胞和异种移植中发挥强抗增殖效应。类似地，另一种也源自Infigratinib的FGFR靶向PROTACDGY-09-192利用vonHippel-LindauE3连接酶选择性降解FGFR1和FGFR2。此外，DGY-09-192降解突变FGFR1/2，阻断突变受体诱导的信号传导和抗雌激素抵抗。在ER阳性乳腺癌中，DGY-09-192与ERα降解剂fulvestrant联合治疗导致细胞增殖的完全抑制和ER阳性、FGFR1扩增患者来源异种移植模型中的显著肿瘤消退。LG1188是另一种代表性PROTAC，作为选择性高效的FGFR1降解剂发挥作用，具有潜在的治疗相关性。虽然这些药物仍处于临床前开发阶段，它们凸显了靶向蛋白降解作为常规激酶抑制替代方案的潜力，特别是在表现出抵抗或对当前治疗反应有限的FGFR驱动恶性肿瘤中。重要的是，在FGFR剪接变体的背景下，下一个前沿在于工程化能够选择性降解致癌FGFR剪接亚型的PROTAC，从而实现更大的治疗特异性并最小化靶点和脱靶毒性。 核酸适配体代表一类多功能且高度特异性的基于寡核苷酸的治疗药物，能够以抗体样亲和力和选择性调节蛋白功能。VZ23是一种DNA适配体，已被证明结合FGFR1-IIIb和FGFR1-IIIc两种亚型，有效阻断下游信号级联并抑制FGFR1介导的细胞过程。值得注意的是，VZ23对FGFR2、FGFR3或FGFR4不表现出交叉反应性，凸显其作为FGFR1驱动恶性肿瘤高选择性治疗药物的潜力。类似地，Apt-46是一种新合成的DNA适配体，靶向FGFR2-IIIb并抑制其在癌细胞中的激活。除DNA适配体外，RNA适配体如iR3(抗FGFR3)和RBM-007(抗FGF2)已在各种疾病的临床前和临床研究中显示出疗效，包括年龄相关性黄斑变性和肺癌。这些RNA适配体破坏配体-受体相互作用或二聚化，从而减弱异常FGFR信号传导。适配体的高特异性、低免疫原性和模块性也支持其在选择性靶向致癌FGFR剪接变体中的潜在应用。 靶向RTK的单克隆抗体在表位可及性和结合效率方面可能遇到限制，特别是在靶向具有小或构象受限细胞外结构域的剪接变体时。工程化迷你蛋白代表一种有前景的替代方案，以高亲和力、亚型特异性结合提供减少的空间位阻。计算设计的迷你蛋白mb7选择性结合FGFR1-3IIIc亚型的D3结构域，有效竞争天然配体和Klotho共受体以阻断FGFRc介导的信号传导。这种靶向方法能够选择性抑制致癌FGFRIIIc通路，同时保留FGFRIIIb亚型，从而增强治疗特异性。临床前研究表明，mb7减弱FGFRc驱动的细胞反应并在肿瘤模型中表现出抗血管生成活性。鉴于其有利的药理学特性，像mb7这样的迷你蛋白为亚型特异性抑制提供了多功能平台，在实体瘤、再生医学和血管生成相关病理中具有潜在应用。结合亲和力、稳定性和体内递送系统的持续优化对于推进其临床转化再次至关重要。 生物制剂和嵌合抗原受体T细胞疗法的出现为FGFR家族成员的选择性靶向开辟了新途径，具有区分FGFR剪接亚型(包括FGFR1-IIIb/IIIc、FGFR2-IIIb/IIIc和FGFR3-IIIb/IIIc)的概念可能性。CART细胞疗法已成为血液恶性肿瘤的变革性治疗方式，现正在探索用于异常FGFR信号的实体瘤。例如，在儿科横纹肌肉瘤中，FGFR4在PAX3-FOXO1融合癌基因影响下频繁过表达。虽然小分子FGFR抑制剂由于赋予抵抗的突变(如N535K、V550L)而显示出有限疗效，但已开发FGFR4导向的CAR-T细胞通过免疫介导的细胞毒性克服这一障碍。两种临床前CAR-T构建体RJ154-HL和3A11利用对FGFR4特异性的不同单链可变片段，已显示出强抗肿瘤活性。在横纹肌肉瘤原位异种移植模型中，RJ154-HLCAR-T细胞有效抑制肿瘤生长，特别是当与靶向肿瘤微环境髓系区的药物联合时。设计识别亚型特异性细胞外表位的CAR构建物，特别是在由替代外显子编码的区域(如FGFR2中的外显子8 vs. 外显子9)，提供了一种策略，以实现恶性细胞表达致癌变体的精确消除，同时保留表达生理性亚型的正常组织。整合剪接知情抗原设计和先进CAR架构(如逻辑门控或双抗原系统)，有望增强FGFR驱动癌症中的治疗精确性、疗效和安全性。 单细胞RNA测序已使表征肿瘤内细胞异质性和转录组复杂性达到前所未有的分辨率。虽然传统应用于定量基因表达，但scRNA-seq的新兴适应现在允许研究包括FGFR在内的选择性剪接。历史上，测序深度和计算算法的限制限制了单细胞水平的剪接分析。然而，最近的创新，包括Chigenesc RNA-seq、分子拥挤单细胞RNA条形码和测序以及Smart-seq2，通过增强cDNA合成效率、逆转录保真度和亚型检测敏感性，克服了这些限制中的许多。在肿瘤学背景下，scRNA-seq提供了一种强大方法，可在包括肺癌、乳腺癌和膀胱癌在内的异质性肿瘤生态系统中解析FGFR剪接变体表达。一个关键例子是上皮-间充质转化期间的FGFR2亚型转换，其显示distinct细胞类型特异性表达模式，并凸显单细胞分辨率的附加价值。使用Smart-seq2，研究人员进一步鉴定ESRP1/2为上皮-间充质转化期间FGFR2剪接的关键调节因子，从而提供剪接如何促进肿瘤可塑性的机制见解。进一步推进该领域，GoT-Splice是一种多模态单细胞平台，整合转录组、表面蛋白质组、体细胞突变和剪接数据，在单细胞水平提供调节事件的整体视图。虽然其在FGFR领域的应用仍处于初期，GoT-Splice已成功绘制骨髓增生异常综合征中SF3B1突变相关剪接破坏。补充scRNA-seq，空间转录组学为完整组织切片内的基因表达提供空间背景，保留微环境结构。通过将空间转录组学与单细胞技术整合，研究人员可在肿瘤内解析FGFR剪接亚型的空间分布，阐明区域异质性和niche特异性信号线索。例如，在肝细胞癌中，肿瘤核心和侵袭边缘之间FGFR变体的差异表达与转移潜力和血管生成特征相关。总之，scRNA-seq和空间转录组学的整合为以高分辨率和空间精度解析FGFR剪接事件提供了一个多维框架。这些方法对于鉴定亚型特异性治疗脆弱性、指导空间靶向干预将是无价的。 基于CRISPR/Cas9的基因组编辑已成为以前所未有的特异性询问和操纵选择性剪接的强大工具。通过设计靶向FGFR位点内含子或外显子剪接调节元件的指导RNA，研究人员可调节外显子包含或跳跃，从而工程化与致癌信号传导或药物抵抗相关的剪接亚型。这种靶向编辑已阐明剪接在对酪氨酸激酶抑制剂抵抗中的作用，并能够创建用于测试亚型特异性抑制剂的同基因模型。CRISPR/Cas9已被用于生成SR蛋白及其亚型的靶向敲除模型，实现对其在FGFR剪接中功能的功能询问。同时，基于CRISPR的筛选已鉴定FGFR的调节因子，如ILK，其调节胃癌中FGFR抑制剂敏感性。类似地，Ninj2(包括FGFR在内的多种RTK的调节因子)的CRISPR/Cas9介导敲除证明抑制胶质瘤细胞存活和侵袭性，强化RTK信号传导和FGFR通路调节之间的更广泛交集。然而，将基于CRISPR的剪接调节转化为临床应用涉及几个关键挑战。一个主要关注点是脱靶效应，可能导致在具有与指导RNA部分同源性的基因组位点发生非预期DNA切割。研究表明，Cas9可在单链指导RNA识别中容忍多达3-5个错配，增加非特异性双链断裂、基因组不稳定性或非预期致癌激活的风险。此外，实现CRISPR组分向肿瘤组织(特别是实体恶性肿瘤)的有效递送受到生物屏障如基质密度、内体trapping和全身降解的阻碍。免疫原性是另一个重要考虑因素：Cas9蛋白来源于细菌，预先存在的免疫或先天免疫激活可能损害治疗疗效和安全性。为应对这些限制，出现了几种技术进步。高保真Cas9变体，包括SpCas9-HF1和eSpCas9，引入理性突变以最小化脱靶DNA结合，同时保持编辑效率。Cas9切口酶和碱基编辑器代表额外的改进：前者诱导单链切口而非双链断裂，而后者能够在不切割DNA骨架的情况下进行精确核苷酸改变，大幅降低基因毒性。在递送方面，脂质纳米颗粒和可生物降解聚合物系统等非病毒载体在包封Cas9mRNA或核糖核蛋白复合物用于组织特异性靶向方面显示出前景，具有改善的内体逃逸和降低的全身毒性。 长链非编码RNA是长度超过200个核苷酸缺乏蛋白编码潜力的转录本。曾被认为是转录噪音，它们现被认可为基因表达的多功能调节因子，影响选择性剪接、翻译、染色质重塑、核组织和表观遗传修饰。在癌症中，异常lncRNA表达促进肿瘤发生、进展和治疗抵抗。在此情境下，越来越多的证据将lncRNA牵涉为FGFR选择性剪接的重要调节因子。机制上，lncRNA通过RNA-蛋白和RNA-染色质相互作用调节外显子识别和剪接体组装。可能在肝细胞癌中，特定lncRNA招募多梳蛋白和组蛋白去甲基化酶到FGFR2位点，促进外显子IIIb包含并有利于抑癌亚型表达。此外，lncRNA可通过调节剪接因子(如SRSF1和hnRNPA1)的表达或活性间接调节FGFR剪接。尽管其治疗前景，基于lncRNA的干预面临关键挑战，包括RNA不稳定性、有限靶点特异性和低效体内递送。为解决这些问题，核酸化学(如骨架和碱基修饰)和递送系统(病毒载体、脂质纳米颗粒、聚合物载体、无机纳米颗粒、蛋白基平台和外泌体)的进展正在积极研究中。然而，单独的化学修饰或递送系统都不能完全克服这些障碍。将优化的核酸修饰与下一代递送技术相结合，代表解锁FGFR驱动癌症中lncRNA靶向策略治疗潜力的有前景途径。总之，CRISPR/Cas9、lncRNA调节和单细胞转录组学的整合为解析FGFR剪接调节和开发个性化、亚型靶向治疗提供了强大平台。 图4用于解析FGFR剪接机制以及开发精确、特异性和选择性靶向FGFR剪接治疗策略的新兴技术。 本工作首次全面综述了FGFR信号与RNA剪接之间的双向相互作用，凸显其在肿瘤发生、肿瘤进展和治疗抵抗中的关键作用。FGFR剪接变体已成为上皮-间充质转化、癌症转移和药物抵抗的关键调节因子，显示出其作为有前景生物标志物和治疗靶点的潜力。我们考察了选择性剪接如何调控FGFR亚型多样性和功能，以及相反，FGFR激活如何重塑剪接程序以驱动恶性肿瘤。这些复杂的串扰凸显了高度选择性和精确治疗的必要性。虽然FGFR抑制剂，特别是TKI，已证明临床疗效，但其长期成功受到抵抗机制、靶点和脱靶副作用以及肿瘤异质性的限制。从FGFR-RNA剪接相互作用中获得的见解应通过靶向FGFR信号和剪接机器提供克服这些局限性的新机会。FGFR亚型特异性靶向治疗的格局持续演变，单克隆抗体、PROTAC、适配体、迷你蛋白和CAR-T细胞等尖端模式提供了新的精确肿瘤学途径。这些方法各有独特优势：DNA/RNA适配体提供高特异性，而CAR-T细胞对FGFR表达肿瘤细胞提供强效细胞毒性。随着这些新型治疗向临床转化推进，其进一步优化和整合到现有治疗框架中对于改善患者结局至关重要。此外，转录组学的进步，特别是单细胞全长转录组学结合时空分析，正在革新FGFR剪接研究。人工智能驱动诊断工具和基于CRISPR/Cas9的精确FGFR剪接变体调节的整合，标志着个性化肿瘤学的范式转变。反义寡核苷酸和小分子剪接调节因子为靶向致癌剪接变体提供了新治疗途径，进一步扩展了对抗FGFR(亚型)驱动恶性肿瘤的武器库。未来研究应优先将这些见解转化为临床可操作策略。关键步骤包括由特定FGFR剪接模式定义的患者亚组鉴定、多组学数据整合以优化精确医学应用，以及治疗组合的优化。重要的是，我们提出用放射性核素治疗诊断学方法靶向FGFR剪接亚型可能为可视化和根除侵袭性肿瘤群体提供强大新途径。通过将亚型导向的放射性核素治疗诊断学与剪接调节整合，将有可能克服当前局限性，并向FGFR驱动恶性肿瘤的高度个体化、持久治疗迈进。 参考文献： Xian X, Gong R, Rong S, Zhang Z, Jia F, Li L, Chen Z, Eymin B, Jia T. Unraveling the FGFR-RNA splicing axis: Mechanisms, oncogenic crosstalks and innovations for therapeutic purpose. Acta Pharm Sin B. 2026 Jan;16(1):35-61. doi: 10.1016/j.apsb.2025.11.031. Epub 2025 Dec 1. PMID: 41584352; PMCID: PMC12828087. 本文仅供医学学术交流，不构成诊疗建议，不能替代专业医生面诊。详细免责声明请点击菜单栏查阅。