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编者荐语：自然杀伤（NK）细胞疗法已从供者细胞输注发展到细胞因子诱导记忆样NK细胞及CAR-NK平台，在血液肿瘤中显示抗肿瘤活性与较好的安全性，并开始拓展至自身免疫病。近日，浙江大学医学院附属第二医院血液科钱文斌，四川大学华西医院牛挺，上海交通大学医学院附属仁济医院风湿免疫科王晓冰团队在STTT杂志发表综述。本文系统梳理NK细胞发育与亚群、受体信号、表观遗传和代谢调控，重点讨论肿瘤微环境导致的功能障碍，以及细胞内在工程、微环境重塑、桥接分子与递送技术等策略。作者认为，后续发展需转向系统层面的组合设计，并围绕剂量、淋巴清除强度、持久性及生物标志物优化临床方案，以推进精准化NK细胞治疗。 现译介如下。原文PDF在文末小程序免费下载。 自然杀伤（NK）细胞已成为癌症免疫治疗的重要参与者，历经五十年，从基础发现发展为经临床验证的治疗平台。本文综述NK细胞生物学认识的演进，包括亚群异质性、表观遗传调控和代谢控制，并重点讨论肿瘤内NK细胞异质性、表观遗传调节和细胞内免疫检查点，为合理的治疗工程设计奠定基础。我们考察NK细胞临床应用的发展轨迹，从未经修饰的过继转移、细胞因子诱导记忆样NK细胞，直至嵌合抗原受体（CAR）工程化NK细胞。关键临床试验已证实CAR-NK细胞治疗B细胞恶性肿瘤具有显著疗效和更优的安全性；近期研究又将其应用拓展至系统性红斑狼疮和系统性硬化症等自身免疫病，并显示出持久的免疫重置效果和良好的安全性。尽管取得这些进展，实体瘤仍面临严峻挑战，原因包括抗原异质性、物理屏障及代谢不利的微环境。因此，我们分析新一代工程策略如何从单一改造转向系统层面的重编程，涵盖内在功能增强（细胞因子信号、代谢适应能力、检查点破坏）、外在肿瘤微环境重塑及先进递送平台。我们还系统梳理临床转化的实践层面，考察推动精准NK细胞治疗的关键优化参数，包括合理的剂量和给药方案、降低淋巴清除强度的策略、不同疾病适应证所需的持久性，以及不断发展的生物标志物体系。引言 自然杀伤（NK）细胞于1975年首次被描述为能够在未经预先致敏的情况下裂解癌细胞的大颗粒淋巴细胞。此后，它们从一种免疫学现象逐步发展为免疫治疗的核心参与者。20世纪90年代，HLA I类特异性抑制性受体的克隆及功能表征从根本上重塑了这一领域；随后天然细胞毒性受体的发现进一步完善了相关认识，使该领域从形态和功能定义转向分子层面的NK细胞亚群分类。这些亚群能够整合自身识别、应激感知和细胞毒性触发信号。过去五十年间，人们对NK细胞的认识已从简单的先天免疫效应细胞，发展为复杂多能的淋巴细胞：它们整合多种激活性和抑制性受体发出的信号，通过穿孔素和颗粒酶执行直接细胞毒作用，经细胞因子分泌协调下游适应性免疫反应，并在不同解剖部位维持组织稳态。曾经阻碍其治疗应用的这种复杂性，如今已成为理性工程设计的基础。 近年，NK细胞疗法的临床转化显著加快。早期研究证实，在复发/难治性急性髓系白血病（AML）中，过继输注NK细胞具有可行性和安全性；供者来源的NK细胞可产生抗白血病效应，同时不引发移植物抗宿主病（GVHD）。随后，人们通过短期暴露于白细胞介素（IL）-12、IL-15和IL-18，制备细胞因子诱导记忆样（CIML）NK细胞；这一进展表明，先天淋巴细胞也可获得类似免疫记忆的功能持久性增强。最具变革意义的进展是嵌合抗原受体（CAR）工程化NK（CAR-NK）细胞的出现。里程碑式临床试验显示，CAR-NK细胞治疗B细胞恶性肿瘤具有显著疗效和良好安全性，可实现完全缓解（CR），且未出现CAR-T细胞疗法中常见的细胞因子释放综合征（CRS）或神经毒性。 这些成功带来深刻改变，同时也凸显了仍然存在的严峻挑战。免疫抑制性肿瘤微环境（TME）通过代谢应激、抑制性检查点和物理排斥等多层屏障，削弱NK细胞的效力和持久性。尤其是实体瘤，即使面对最复杂的工程改造，也仍难以有效应对。另一方面，CAR-NK细胞在系统性红斑狼疮（SLE）和系统性硬化症（SSc）等自身免疫病中显示出显著疗效，开辟了新的治疗领域，表明免疫重置原理可广泛应用于肿瘤学以外的疾病。与此同时，单细胞技术和功能基因组学彻底改变了人们对NK细胞生物学的认识。NK1、NK2和NK3等具有特定转录及功能程序的亚群得到界定，进一步完善了对NK细胞异质性的认识。具有功能障碍特征的肿瘤相关NK细胞（TaNK）将慢性肿瘤暴露与功能受损联系起来。全基因组CRISPR筛选系统揭示了MED12、CCNC、ARIH2和CREM等新的细胞内检查点；在具有临床相关性的条件下，调节这些检查点可增强NK细胞疗法。这些相互汇聚的研究线索共同指向新一代NK细胞疗法的统一框架：系统层面的工程设计。仅仅“增加”一种CAR或细胞因子已不足以满足需求。相反，需要同步优化正向信号输入并解除多层负反馈机制，包括重编程代谢以抵御恶劣环境、赋予“低免疫原性”特征以逃避宿主排斥，以及引入逻辑门控回路以提高精准性。将NK细胞视为一体化系统，而非彼此独立部件的集合，这种系统观代表了与过去十年还原论方法的根本转变。 本文全面考察NK细胞生物学、分子机制和微环境调控，为理性工程设计奠定基础。我们分析血液系统恶性肿瘤、实体瘤和自身免疫病领域不断演进的临床格局，并依据最新临床试验数据识别疗效和耐药的决定因素。随后，我们综合讨论新兴策略，包括细胞内在工程、外在TME重塑、桥接分子和先进递送平台；这些策略共同勾勒出新一代NK细胞疗法的发展方向。最后，我们概述未来十年将影响这一领域的挑战和机遇，涉及剂量和持久性的优化，以及将治疗范围拓展至肿瘤学以外。NK细胞疗法的临床转化：从首次临床试验到CAR-NK突破的二十年进展 NK细胞被认为是一类独立的淋巴细胞群体。关键受体的发现以及“缺失自身”假说的提出，确立了NK细胞在免疫监视中的基本作用。基于这一认识，NK细胞疗法的临床转化于21世纪初逐步展开。2003年启动了最早一批探索NK细胞疗法的临床试验（NCT00089453），开启了免疫治疗的新阶段（图1）。2005年，在体外研究证实NK-92细胞可扩增并具有抗肿瘤活性的基础上，研究者启动了一项剂量递增临床试验，将NK-92细胞输注用于自体造血干细胞移植后复发的血液系统恶性肿瘤（NCT00990717）。Bachanova等还开展了II期临床试验，采用IL-2-白喉毒素融合蛋白增强单倍型相合NK细胞治疗AML的效果。2008年，CIML NK细胞首次用于治疗肝细胞癌（HCC）（NCT00769106）。与此同时，靶向治疗推动肿瘤学从非特异性细胞毒性化疗转向精准医学；自2008年起，越来越多临床试验探索NK细胞疗法与单克隆抗体联合应用（NCT01181258），包括利妥昔单抗和西妥昔单抗（NCT02845999）。 2011年，Cooley等启动首项将重组人IL-15与异基因NK细胞疗法联合用于晚期AML的临床试验。2013年，Vela等设计了一项临床试验，将挽救性化疗与输注异基因IL-15/4-1BBL活化NK细胞联合应用；在复发/难治性白血病儿童患者中，CR率达到72%。值得注意的是，同年启动了首项采用mRNA电转工程化CAR-NK细胞治疗CD19阳性B细胞恶性肿瘤的临床试验（NCT01974479）。自2016年以来，鉴于异基因NK细胞输注相关GVHD风险较低，且CAR-NK细胞保留天然受体功能，CAR-NK疗法在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中的临床试验迅速增加。 2017年，Liu及其同事开展了首项具有里程碑意义的CAR-NK细胞疗法临床试验，纳入复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）患者。这项I/II期研究纳入37例患者，CAR-NK细胞治疗后第30天和第100天的客观缓解率（ORR）均为48.6%，观察到CR，并获得持久生存获益；1年总生存（OS）率和无进展生存（PFS）率分别为68%和32%，显示出该方法治疗B-NHL的潜力。2021年，Huang等开展I期临床试验，初步证实CD33靶向CAR-NK细胞治疗复发/难治性AML的疗效和安全性。同年，Li等报告了一项I期临床试验，研究腹腔输注NKG2D CAR-NK细胞治疗晚期结直肠癌（CRC）。 2022年，我们团队开发了脐带血（UCB）来源的CD19特异性CAR-NK细胞，用于治疗复发/难治性大B细胞淋巴瘤；治疗第30天ORR为62.5%，其中50%达到CR。2023年，CAR-NK细胞疗法首次用于SLE（NCT06010472）。此后，越来越多临床试验开始评估CAR-NK疗法治疗自身免疫病，并报告了令人鼓舞的结果。最近，Ghobadi及其同事报告了首项完成的I期试验，评估诱导多能干细胞（iPSC）来源的CD19靶向CAR-NK细胞疗法（FT596）治疗复发或难治性B细胞淋巴瘤；研究纳入86例患者。该疗法耐受性良好，未出现剂量限制性毒性，未达到最大耐受剂量；仅13%的患者出现低级别CRS（均为≤2级），且未观察到神经毒性或GVHD。不同组织学类型的患者均出现客观缓解，其中滤泡性淋巴瘤患者ORR为100%、CR率为85%；既往接受CAR-T细胞治疗的患者也获得持久缓解。这些结果凸显了iPSC来源CAR-NK细胞作为现货型平台的潜力，其产品特征均一且安全性良好。图1 图1：不同疾病适应证中NK细胞疗法的临床试验时间分布；本图概述2003—2025年涉及NK细胞疗法的临床试验；每个气泡代表每年新登记的临床试验数量；气泡颜色表示细胞类型：黄色为异基因NK细胞，红色为自体NK细胞，蓝色为工程化NK细胞，包括嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞和T细胞受体（TCR）-NK细胞；气泡大小与每种治疗方式-适应证组合的临床试验数量成正比；试验按治疗领域分为三个横向区域：上方为自身免疫病，中间为实体瘤，下方为血液系统恶性肿瘤；重要里程碑，包括关键研究结果发表、新靶点首次出现，或某一NK细胞疗法首次采用联合方案，均标注于时间轴（x轴）的相应时间点；本图由BioRender.com制作NK细胞生物学：发育、亚群与组织驻留 发育与成熟：NK细胞由造血干细胞（HSC）发育而来，经过CD38⁺CD7⁺CD10⁺CD127⁺共同淋巴祖细胞（CLP）；获得CD122标志着谱系不可逆地定向。除CLP外，在适宜条件下，共同髓系祖细胞（CMP）和粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）也可生成NK细胞，显示其发育具有分支潜能。NK细胞现被认为是先天淋巴细胞（ILC）的一类，这一共识完善了对其发育关系的认识。在当前ILC分类框架中，NK细胞被视为先天淋巴细胞中的细胞毒性对应群，在功能上类似CD8⁺细胞毒性T细胞；ILC1、ILC2和ILC3则分别类似Th1、Th2和Th17程序。在这些亚群中，NK细胞与ILC1共同构成1型ILC群，均参与产生IFN-γ的1型免疫；但NK细胞维持由EOMES和T-bet支持的细胞毒程序，而ILC1主要依赖T-bet，具有组织驻留特征且细胞毒作用较弱。ILC2和ILC3属于辅助样谱系，分别由GATA3/RORα依赖的2型细胞因子程序（主要产生IL-5和IL-13）及RORγt依赖的IL-17/IL-22程序所界定。早期NK祖细胞（ENKP）和ILC祖细胞（ILCP）分别产生两条分化谱系：ENKP生成常规细胞毒性NK细胞；ILCP则在组织信号影响下产生辅助样ILC，包括ILC1、ILC2和ILC3。早期谱系定向涉及ID2、RUNX3和NFIL3等关键转录因子；晚期成熟和细胞毒性则受T-bet/EOMES调控。IL-15是必需细胞因子，通过由IL-15Rα、CD122（IL-2/15Rβ）和共同γ链（γc）组成的异源三聚体受体复合物传递信号，激活调节NK细胞存活、增殖和功能成熟的下游通路（图2A）。这些由转录因子和细胞因子驱动的回路共同稳定NK细胞的细胞毒性身份，但这一身份仍处于更广泛的ILC连续谱之中，可受局部细胞因子和组织微环境信号影响而发生可塑性变化。 NK细胞亚群与记忆样表型的分类：传统分类将成熟NK细胞分为CD56brightCD16⁻免疫调节细胞和CD56dimCD16⁺细胞毒效应细胞；CD57则标记杀伤能力更强的终末成熟亚群。单细胞技术进一步细化了这一分类。例如，一项研究发现具有稳态激活特征的“活化NK”细胞簇；另一项研究提出CD56bright NK0亚群可能是成熟NK细胞的前体。近期，通过整合转录组和蛋白质组特征，研究者在人外周血中识别出三个主要NK细胞亚群：NK1为细胞毒效应细胞，NK2为免疫调节细胞，NK3为适应性细胞；这三类细胞还可进一步分为六个具有独特分子特征、功能特化和代谢谱的亚群（图2B）。这一细化分类对免疫治疗具有重要意义，例如，肿瘤中富集的NK2亚群可能属于细胞毒性较弱的免疫调节细胞群，可作为重编程的靶点。 适应性NK细胞可由巨细胞病毒（CMV）暴露或细胞因子诱导产生，代表一种高度成熟且终末分化的亚群。尽管NK细胞属于缺乏抗原特异性重排受体的先天淋巴细胞，它们仍可表现出免疫记忆，其特征为长期存留，并在再次接触特定病原体（尤其是CMV）时增强应答，这一现象称为训练性免疫。除病原体特异性记忆NK细胞外，暴露于特定细胞因子组合也可产生适应性NK细胞表型，形成CIML NK细胞。这些适应性NK细胞表达NKG2C、CD57和颗粒酶H，同时缺乏多种信号分子，包括PLZF、FcεRγ、EAT-2和SYK。其核心机制涉及肽特异性识别、共刺激信号、促炎线索及表观遗传修饰，共同驱动克隆扩增、分化和功能特化。在TME中，TaNK表现为功能障碍状态，其KLF6、EGR3和NR4A1表达升高，这为慢性肿瘤暴露与功能障碍之间提供了机制联系。效应功能 活化NK细胞通过穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒作用、由CD16介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），以及死亡受体通路（FasL/TRAIL）清除靶细胞。这一过程不受主要组织相容性复合体（MHC）限制，也不需要预先进行抗原呈递。NK细胞接触靶细胞时，其效应功能取决于动态平衡：NK细胞表面的抑制性和激活性受体分别与靶细胞上的配体相互作用。“缺失自身”和“诱导自身”识别信号均可促进NK细胞活化。图2 图2：NK细胞的发育轨迹、亚群多样性及组织分布；a NK细胞主要在骨髓中发育，沿分支级联过程由造血干细胞（HSC）经多能祖细胞（MPP）、共同淋巴祖细胞（CLP）依次发育为早期NK祖细胞（ENKP）、未成熟NK细胞（iNK）和成熟NK细胞（mNK）；NK细胞也可由共同髓系祖细胞（CMP）、粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）及先天淋巴细胞祖细胞（ILCP）产生；这一发育过程受关键转录因子和必需细胞因子严格调控；b 外周血NK细胞可分为沿连续分化轨迹发展的NK2、NK1和NK3三个亚群；NK2为CD56brightCD16−免疫调节细胞，NK1为CD56dimCD16+细胞毒效应细胞，NK3与CMV感染或细胞因子诱导的适应性免疫反应相关；各亚群具有独特的表面标志、细胞毒特征以及细胞因子和趋化因子产生模式；c CD56brightCD16−和CD56dimCD16+ NK细胞亚群在人体不同组织中的分布，反映其组织驻留特征；柱状图显示两类亚群在不同组织中的相对比例；CD56brightCD16− NK细胞通常富集于次级淋巴组织和子宫，呈现较强的组织驻留表型；CD56dimCD16+ NK细胞主要见于外周血和肺部，与循环及经典细胞毒功能相关；不同组织中的亚群分布差异体现了NK细胞对局部微环境的功能适应；本图由BioRender.com制作迁移与组织驻留 NK细胞的迁移受整合素、选择素、趋化因子、细胞因子诱导信号、鞘氨醇-1-磷酸及细胞微环境调控。CD56dimCD16⁺ NK细胞主要循环于血液、骨髓、脾脏和肺部；CD56brightCD16⁻细胞则分布于淋巴结和肠道，并具有组织驻留分子特征。组织驻留NK细胞（trNK）表达CD69及更具特异性的标志RGS1；与常用标志相比，RGS1在不同组织中识别trNK细胞的表现更佳。trNK细胞可在不同转录调控下由循环或组织驻留前体产生，在局部巡查并维持组织稳态。例如，皮肤驻留NK细胞可在再次感染时更快发挥效应；蜕膜NK（dNK）细胞则是适应生殖生理的典型trNK亚群。妊娠早期，dNK细胞在蜕膜淋巴细胞群中占主导，并呈现适应蜕膜生态位的CD56brightCD16⁻CD49a⁺CD9⁺EOMES⁺CD69⁺驻留表型，可调节滋养层侵袭、血管重塑及母胎耐受（图2C）。代谢调控 静息NK细胞依赖氧化磷酸化（OXPHOS）；活化后，它们在OXPHOS之外上调有氧糖酵解，以满足生物合成需求。活化NK细胞将葡萄糖来源的丙酮酸转入柠檬酸-苹果酸穿梭通路，固醇调节元件结合蛋白（SREBP）是该过程必需的调控因子。CD56bright细胞表达较高水平的葡萄糖摄取受体GLUT1，因此代谢活性高于CD56dim细胞。IL-2、IL-12和IL-15等细胞因子通过mTOR信号通路增强糖酵解和OXPHOS。相反，转化生长因子β（TGF-β）通过诱导FBP1并抑制c-MYC和mTOR信号，抑制糖酵解及线粒体代谢。新近证据提示翻译后修饰也参与其中：TME中的乳酸蓄积可诱导ROCK1等蛋白发生赖氨酸乳酰化（Kla），继而导致线粒体碎片化和功能受损。联合使用NAD⁺前体和SIRT3激活剂可逆转这一过程，为在恶劣环境中代谢重编程并增强NK细胞适应能力提供了新策略。NK细胞分子机制：受体信号整合与检查点 平衡之道：激活性与抑制性受体。Moretta团队的开创性工作鉴定了HLA I类特异性抑制性受体和天然细胞毒性受体，并揭示它们是人NK细胞识别的分子决定因素。NK细胞表达多种胚系编码的激活性和抑制性受体，可识别靶细胞表达的相应配体，分别传递刺激性和抑制性信号。激活性与抑制性信号之间的平衡精细调控NK细胞功能，并构成缺失自身识别、应激感知和靶细胞杀伤的机制基础（图3）。 激活性受体对于杀伤过度表达应激诱导配体的异常细胞至关重要，也能促成NK细胞与其他细胞类型之间的生理性相互作用。激活性受体可分为MHC I类特异性受体（包括激活性杀伤细胞免疫球蛋白样受体[aKIR]，如KIR2DS和KIR3DS）以及非MHC I类特异性受体，包括CD16、天然细胞毒性受体（NCR；NKp30、NKp44、NKp46）、NKG2C/CD94、NKG2D、DNAM-1、NKp80和NTB-A。不同人群的MHC分子具有多样性，KIR也因此表现出高度多态性。 KIR基因家族在等位基因多态性和基因含量方面存在显著个体差异。在单细胞水平，NK细胞利用DNA甲基化维持高度同源KIR基因的克隆性受限表达。aKIR具有较短的胞质尾，通过免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）传递激活信号；ITAM通常位于接头蛋白DAP12的胞质结构域中。NKG2D与下游鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV1发生空间聚集，可形成放大生化信号的正反馈环。NK细胞表达的抑制性受体则调节激活信号强度，并参与生理性控制过度免疫反应和维持免疫耐受。与激活性受体类似，抑制性受体也包括MHC I类特异性和非MHC I类特异性受体。前者称为抑制性KIR（iKIR，如KIR2DL和KIR3DL），胞质尾较长并含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）。后者包括NKG2A/CD94、NKR-P1A、Siglec-7、LAIR-1和IRp60。酪氨酸磷酸化后，ITIM可募集含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP1）、SHP2及含SH2结构域的肌醇-5-磷酸酶（SHIP），传递抑制性信号。细胞因子与共刺激信号 细胞因子和共刺激分子发出的整合信号，精密协调NK细胞的发育、增殖和活化。关键促活化细胞因子包括IL-1β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-33；其中，IL-15被认为是调控NK细胞整个生命周期的关键细胞因子。CISH是IL-15信号的负调控因子。剪接型X盒结合蛋白1（XBP1s）是IL-15-AKT信号下游的重要转录因子，可促进T-bet募集至GZMB和IFNG基因位点。IL-12主要通过STAT4启动多方面的转录程序，参与记忆样NK细胞的产生。相反，TGF-β会下调激活性受体并抑制穿孔素和GZMB。共刺激信号是NK细胞活化的重要放大机制，与细胞因子信号协同触发完整的效应功能。核心共刺激受体包括SLAM家族受体和肿瘤坏死因子受体超家族成员。在临床应用中，共刺激结构域是CAR的重要组成部分，使CAR-NK细胞在识别肿瘤后能够充分活化。细胞教育与自身耐受 NK细胞发育过程中会经历“教育”过程：当MHC特异性抑制性受体与相应的自身MHC I类配体结合后，NK细胞获得功能能力并建立自身耐受。NKG2A/CD94是分化过程中最早表达的MHC特异性受体，可识别非经典HLA-E，使NK细胞能够区分自身与非自身。KIR也可通过经典MHC-I依赖方式教育NK细胞，某些非MHC分子亦可独立于MHC-I参与这一过程。当靶细胞下调或缺失MHC I类分子时，就容易受到NK细胞杀伤。这一过程称为“缺失自身识别”，对清除下调MHC I类分子以逃避免疫T细胞的癌细胞或病毒感染细胞至关重要。该现象有利于造血干细胞移植和过继NK细胞治疗，因为MHC I类错配可诱发NK细胞介导的移植物抗白血病效应，且不引起GVHD。NK细胞介导的细胞毒作用也可由“诱导自身识别”启动，即靶细胞上调或新表达激活性受体的应激诱导配体或病原体来源配体。NK细胞的免疫检查点通路 免疫检查点调节免疫反应，防止过度活化。表达免疫检查点的TaNK细胞会出现功能障碍，这是肿瘤免疫逃逸的重要机制。NK细胞表面的免疫检查点包括抑制性KIR、NKG2A、PD-1、TIM-3、LAG-3、CTLA-4和TIGIT，以及IGSF8、IL-1R8和GPR132。近期研究发现，含ITIM的C型凝集素受体CLEC12B是一种抑制性检查点，可限制HCC中的NK细胞抗肿瘤免疫。CLEC12B在肿瘤浸润NK细胞上选择性上调；肿瘤细胞表面锚定的脂蛋白脂肪酶（LPL）与其结合后，会触发SHP-1介导的SYK-PI3K-AKT-S6信号轴抑制，导致细胞因子产生和细胞毒功能受损。 靶向CLEC12B的高亲和力纳米抗体可逆转NK细胞功能障碍，并在临床前模型中与PD-1阻断产生协同作用，提示CLEC12B可能成为有前景的治疗靶点。NK细胞还表达分布于胞质或细胞核内的多种检查点，包括CIS、TIPE2、Cbl-b、EZH2、FBP1、HIF-1α和BIM。细胞内检查点的发现将NK细胞功能调控拓展至多个关键层面：代谢重编程，例如FBP1介导的糖酵解抑制及HIF-1α调控的OXPHOS；表观遗传调控，例如EZH2介导的H3K27三甲基化沉默效应基因表达；翻译后修饰，例如Cbl-b依赖的信号蛋白泛素化和降解；以及由促凋亡分子BIM驱动的凋亡调控。这些发现表明，细胞内检查点通过基本细胞过程发挥作用，为理解TME中的NK细胞功能障碍提供了更广阔的框架。近期研究还发现了新的细胞内检查点：CREM是IL-15和CAR信号下游的关键转录检查点，可将持续活化与功能障碍性表观遗传程序联系起来；SYK负向调节ITAM介导的信号；BCL9通过GATA1介导的NOTCH-IL-18R1信号抑制NK细胞功能；EAT-2使NK细胞对SLAM相关受体信号的反应减弱。SMAD4通过TGFβ/activin A信号抑制NK细胞抗肿瘤功能，SAMSN1则抑制NK细胞活化、增殖和GZMB产生。有研究还将自噬视为细胞内检查点，其受抑会损害线粒体稳态。除这些候选靶点外，全基因组CRISPR筛选还系统鉴定出Mediator复合物亚基MED12和CCNC以及ARIH2等新的细胞内检查点（图3）。图3 图3：调控NK细胞活化与抑制的整合信号和检查点通路；NK细胞通过形成免疫突触与靶细胞接触，并整合激活性受体（如CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C/CD94、NKG2D、DNAM-1、2B4及激活性KIR）和抑制性受体（如抑制性KIR、NKG2A/CD94、PD-1、TIGIT、Siglec-7/9、TIM-3、LAG-3和CTLA-4）的信号；激活信号主要汇聚于PI3K-AKT、PLCγ-Ca²⁺和MAPK级联，继而引发钙流、转录因子活化、脱颗粒和细胞因子产生；抑制性受体主要通过募集磷酸酶SHP-1/2和SHIP1拮抗上述反应；此外，TIPE2、CISH、BCL9和CREM等细胞内检查点进一步调节NK细胞效应功能；本图由BioRender.com制作效应阶段：靶细胞杀伤的动力学与机制 NK细胞介导的靶细胞杀伤动力学高度动态，体现了分子通路的顺序性激活及NK细胞连续杀伤的能力。NK细胞与靶细胞接触后，在界面处形成免疫突触（图3）。突触形成涉及细胞表面受体和信号蛋白的动态空间组织，以及微管组织中心（MTOC）的极化，从而促进裂解颗粒定向释放，并协调死亡受体-配体相互作用，共同启动细胞毒反应。含PDZ结构域的胞内支架蛋白Scribble在细胞极性中发挥重要作用；加入PDZ结合基序可增强突触信号。裂解颗粒含有成孔蛋白穿孔素及可激活半胱天冬酶原的颗粒酶。关于死亡受体-配体相互作用，NK细胞表面表达FasL或TRAIL，分别与靶细胞上的Fas及TRAIL-R1/R2结合。死亡受体活化会启动半胱天冬酶级联，最终导致细胞凋亡。上述两种不同的细胞毒机制具有不同的时间尺度：颗粒介导的杀伤触发快速细胞毒作用，随后由死亡受体介导较慢的凋亡过程。靶细胞死亡后，NK细胞脱离被杀伤的细胞，恢复迁移并依次攻击其他靶细胞。在这一连续杀伤过程中，后续杀伤事件通常更快，且多发生于相邻细胞。NK细胞在最初杀伤事件中通过颗粒酶快速诱导细胞死亡，在随后遭遇肿瘤细胞时则转为较慢的死亡受体介导杀伤。对既往杀伤事件的短期记忆可形成动力学预激。图4 图4：NK细胞可塑性与功能重编程的表观遗传图谱；NK细胞功能状态（从静息到活化及记忆样表型）受到整合细胞外线索与细胞内代谢状态的多层表观遗传程序动态塑造；静息NK细胞可根据外界刺激形成不同功能状态，包括活化和记忆样表型；感染或恶性细胞诱导NK细胞活化，CMV相关信号或IL-12/IL-15/IL-18预处理促进记忆样分化；NKG2C和CD57代表CMV诱导的适应性特征，CD25是细胞因子诱导型记忆样NK细胞的标志（上部）；组蛋白修饰、DNA甲基化、mRNA甲基化和非编码RNA构成共同调控NK细胞身份与功能的四个调节层（中部）；组蛋白修饰（如H3K4me3、H3K9ac、H3K27me3）调节IFNG和NKG2D等关键效应基因位点的可及性，从而精细调控活化阈值和细胞因子产出；DNA甲基化通过选择性抑制抑制性程序、允许激活性受体表达，进一步稳定谱系定向和受体谱；转录后层面，METTL3-METTL14复合物介导的mRNA甲基化（m⁶A）由YTHDF家族和IGF2BP蛋白识别，调节Prf1和Gzmb等效应转录本的稳定性和翻译，将IL-15等细胞因子信号与AKT/MAPK通路连接至细胞毒能力；与此同时，miRNA和lncRNA等非编码RNA调节Myb、NLK、Id2和Eomes等转录因子网络，协调NK细胞发育、活化和功能记忆；下部显示乙酰辅酶A、α-酮戊二酸和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等关键代谢物对表观基因组重塑的代谢支持NK细胞可塑性与功能的表观遗传和转录后调控 NK细胞可塑性是指NK细胞根据环境线索调整表型、功能和代谢谱的能力，其根本基础由表观遗传机制塑造。表观遗传调控除影响效应功能外，还塑造染色质可及性和调控图谱，从而支持ILC可塑性，并可能稳定环境诱导的NK细胞身份重编程（图4）。感染驱动的NK细胞向ILC1样细胞转变伴随EOMES下调及广泛染色质重塑，支持表观基因组重构是细胞状态持久转变的一种机制。在富含TGF-β的TME中，这种可塑性可使NK细胞转向ILC1样状态，削弱细胞毒性并促进肿瘤免疫逃逸。表观遗传指不依赖DNA序列、可遗传的表型和功能改变，其由调节染色质结构和转录活性的生化修饰动态作用所驱动。表观遗传调控的主要机制包括：（1）DNA甲基化；（2）组蛋白修饰；（3）RNA甲基化（表转录组学）；（4）非编码RNA（ncRNA）调控，包括微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）。这些相互关联的调控层会改变肿瘤免疫原性，并深刻影响NK细胞功能、细胞身份及微环境驱动的重编程，对利用NK细胞可塑性开发下一代免疫疗法至关重要（图4）。DNA甲基化：协调NK细胞发育与命运决定 DNA甲基化是指向CpG二核苷酸可逆地添加甲基，传统上与转录沉默相关。这一过程由DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）和去甲基化酶（TET2）动态调控。在NK细胞中，DNA甲基化是调控发育轨迹、受体表达和免疫记忆的基本“调节器”。 发育与分化调控。 NK细胞成熟过程中获得完整效应功能，与关键基因位点去甲基化密切相关。例如，人NK细胞在激活性受体参与下产生IFN-γ的能力是在终末分化过程中获得的，这一过程依赖IFNG启动子去甲基化以及TBX21（编码T-bet）转录增强。类似地，HSC向NK细胞分化期间的KIR基因表达遵循精细的两步表观遗传模型：首先出现由活性组蛋白标志所界定的许可阶段，随后发生基因特异性DNA去甲基化，从而锁定表达潜能。抑制性受体NKG2A的等位基因特异性表达，则由编码NKG2A的Klrc1启动子处DNA低甲基化和组蛋白乙酰化协同维持。联合使用5-氮杂胞苷（DNMT抑制剂）和曲古抑菌素A（HDAC抑制剂），可协同增加组蛋白乙酰化和NKG2A表达，凸显这些表观遗传层之间的相互作用。 激活与受体表达的调节。 DNA甲基化控制KIR的克隆性受限表达，这对调节抑制性与激活性信号之间的平衡至关重要。位点特异性甲基化决定这种差异表达：去甲基化CpG岛允许已表达KIR基因转录，高甲基化则使未表达基因沉默。TET2突变可导致基因组高甲基化，降低激活性KIR、穿孔素和TNF-α表达，进而抑制NK细胞功能；这一现象凸显了该机制的功能意义。除KIR外，HCC患者中编码NKG2D的KLRK1启动子也常发生高甲基化，并与功能障碍相关。 记忆样NK细胞形成的表观遗传基础。 NK细胞记忆研究为环境接触如何留下持久表观遗传印记提供了有力例证。CMV诱导的NKG2Chi NK细胞在IFNG位点保守非编码序列1（CNS1）出现稳定去甲基化，使其仅经NKG2C再次刺激也能产生强烈IFN-γ反应。缺乏FcεRγ/SYK/EAT-2的适应性NK细胞，其全基因组甲基化模式与细胞毒性T细胞相似，与经典NK细胞则不同。相反，在AML中，DNMT1过表达会通过抑制自噬削弱记忆样特性；阿扎胞苷或沉默DNMT1可重新激活AMPK/mTOR介导的自噬通路，恢复NK细胞细胞毒性。 组蛋白修饰：NK细胞活化和记忆中的染色质动态。 组蛋白修饰可动态改变染色质结构并调控基因可及性。乙酰化（例如组蛋白H3或H4赖氨酸残基的乙酰化）通常与开放且具有转录活性的染色质相关，并由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和去乙酰化酶（HDAC）动态调控。组蛋白甲基化的功能取决于具体情境：H3K9me和H3K27me属于抑制性标记，H3K4me、H3K36me和H3K79me则与基因活化相关。这种平衡由组蛋白甲基转移酶（HKMT、PRMT）和去甲基化酶（KDM）的拮抗作用维持。 活化与效应基因调控。 NK细胞具有独特的染色质景观，使其具备快速发挥效应功能的条件。静息NK细胞的IFNG位点处于许可状态，表现为组蛋白高度乙酰化。受到刺激后，这种乙酰化向邻近区域扩展，促进IFN-γ快速而强烈地产生，且不需要预先致敏。KLRK1转录也受组蛋白乙酰化调控：外周NK细胞及NKL细胞系中H3K9ac水平较高，而抑制性标记H3K27me3/H3K9me2水平较低。姜黄素抑制HAT会破坏这一平衡，降低H3K9ac，抑制NKG2D表达并损害细胞毒性。 活化的人NK细胞会发生H3K27甲基化动态重塑；JMJD3/UTX驱动的H3K27去甲基化有助于促炎细胞因子产生。此外，H3K4me3去甲基化酶KDM5A与NF-κB亚基p50协同，在Socs1启动子处维持抑制性染色质状态。该抑制可增强IL-12诱导的JAK2-STAT4信号，促进IFN-γ产生，揭示组蛋白修饰因子精细调节细胞因子反应性的机制。 记忆与耗竭通路调控。 系统性炎症可通过在IFNG增强子处沉积H3K4me1，促进记忆样NK细胞形成；这一过程依赖甲基转移酶活性。与此相反，TME中的慢性刺激（例如可溶性MICA持续激活NKG2D）可通过circARAP2介导的CTCF-PRC2募集受阻而诱发耗竭。该干扰使RAB5A启动子无法沉积抑制性H3K27me3和H3K9me3标记，反而导致RAB5A异常高表达，增强NKG2D受体内吞并使其下调，进而促成耗竭。耗竭是一种由激活性受体持续刺激驱动的功能障碍状态，表现为效应功能（尤其是细胞因子产生）逐步丧失，并伴有稳定的表观遗传重塑和转录重编程。 RNA甲基化（m⁶A）：调控NK细胞效应分子的转录后命运。 N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是哺乳动物mRNA中最丰富的内部修饰，常富集于终止密码子附近及3′非翻译区（3′ UTR）。这种动态可逆修饰由“写入酶”（METTL3/METTL14复合物）安装，由“擦除酶”（FTO、ALKBH5）去除，并由“读取蛋白”（YTHDF家族、IGF2BPs）识别，是转录后调控的重要层面。m⁶A可通过影响mRNA稳定性、剪接、输出和翻译，调节免疫效应物在刺激后的产生速度和持续时间。 m⁶A写入模块：细胞因子信号的守门者。 机制研究将m⁶A写入复合物定位于NK细胞对IL-15等关键细胞因子的响应上游。NK细胞特异性敲除Mettl3会削弱IL-15驱动的信号传导，损害NK细胞稳态。METTL3依赖的m⁶A修饰可稳定编码SHP-2的Ptpn11转录本，保障IL-15下游AKT和MAPK通路充分激活。因此，m⁶A可优先维持NK细胞在高需求条件下所需的代谢和效应功能。NK细胞活化还伴随全局m⁶A水平迅速升高，提示该修饰是动态诱导而非持续恒定表达。mTORC1通过促进甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的供应，调控这一升高过程，将营养感知直接连接到穿孔素和GZMB等效应分子的转录后调控；这些效应分子已被鉴定为m⁶A直接靶标。 m⁶A读取层：将甲基化转化为功能效应。 细胞因子刺激可经STAT5诱导NK细胞表达YTHDF2；YTHDF2是有效抗病毒和抗肿瘤活性所必需的，提示m⁶A读取参与NK细胞的应激适应，并非可有可无的精细调节。机制上，YTHDF2促进m⁶A修饰的Tardbp转录本降解，进而支持IL-15驱动的增殖和存活。由此形成正反馈环：IL-15/STAT5信号诱导YTHDF2，维持活化的NK细胞状态。YTHDF1等其他读取蛋白可促进靶标翻译，其在NK细胞中的作用仍有待研究。写入与读取活动整合后揭示了一个统一原则：m⁶A编程可将细胞因子信号和代谢线索转化为对特定转录本的精准调控，控制NK细胞效应程序部署的速度、幅度和持久性，形成连接染色质层面预备状态与可执行蛋白输出的机制桥梁，也解释了为何扰动m⁶A酶会深刻重塑NK细胞发育、活化和持久性，包括在非恶性炎症环境中。非编码RNA：NK细胞转录图谱的关键调节因子 非编码RNA（ncRNA）可多方面调控基因表达网络，影响NK细胞发育、活化和效应功能。ncRNA包括多种分子，如微小RNA（miRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）。其中，miRNA和lncRNA作为表观遗传调节因子研究最为深入。miRNA与靶mRNA中的互补序列结合，导致转录本降解或翻译受抑。lncRNA长度超过200个核苷酸，可通过染色质重塑、转录干扰和吸附miRNA等多种机制调控基因表达。 发育与功能成熟。 miR-15/16和miR-150可通过抑制c-Myb（Myb）促进NK细胞成熟；敲除miR-15/16或过表达Myb会损害这一过程，miR-150也可靶向Myb。miR-181通过靶向Notch信号抑制因子NLK（nemo样激酶），促进CD34⁺ HSC向NK细胞发育并增强IFN-γ产生。相反，白血病相关NK细胞中miR-29b升高会下调T-bet和EOMES，损害NK细胞成熟并促进白血病免疫逃逸。lncRNA是决定NK细胞发育能力的重要因素。例如，小鼠围产期CMV感染后，lncRNA Ifng-as1下调，并与NK细胞成熟受损及IFN-γ产生能力下降相关。从机制上看，Ifng-as1丢失与EOMES表达失调相关，降低效应细胞因子诱导的转录概率。Rroid基因座是一种顺式调控元件，可维持Id2表达，支持包括NK细胞在内的ILC1谱系定向和成熟。 细胞毒性与受体调控。 miRNA通过直接靶向关键效应分子，协调NK细胞的细胞毒作用和细胞因子产生。例如，GZMB可被miR-378直接靶向，PRF1则可被miR-150和miR-30e靶向。此外，在静息及活化NK细胞中，miR-27a和miR-378均可靶向GZMB和PRF1。除效应分子外，miRNA还通过不同信号通路微调IFN-γ产生。例如，miR-146a靶向IRAK1和TRAF6，负向调控IFN-γ并抑制NF-κB信号；它还可通过靶向STAT1抑制NK细胞活性。miR-218-5p通过靶向SHMT1抑制IFN-γ和TNF-α分泌；miR-552-5p则抑制IFN-γ，并下调NKp30、NKp46和NKG2D等激活性受体。相反，部分miRNA可正向调节IFN-γ：miR-155通过PI3K、NF-κB和钙调神经磷酸酶通路增强IFN-γ产生，miR-181则经Notch信号促进IFN-γ产生。除调节效应分子外，miRNA还可控制NK细胞激活性和抑制性受体表达。激活性受体NKG2D是一个重要靶点：人miR-1245会下调NKG2D表达，损害NKG2D介导的功能。相反，miR-30c-1通过直接靶向抑制性转录因子HMBOX1，增强NK细胞对肝癌细胞的细胞毒作用。HCC患者NK细胞中miR-182过表达可调节NKG2D和NKG2A水平，增加穿孔素表达和细胞毒性。抑制性受体也受miRNA调控：miR-146a-5p与KIR2DL1/KIR2DL2 mRNA的3′UTR相互作用，调节其表达，并可能影响NK细胞许可和细胞毒性；miR-26a-5p、miR-26b-5p和miR-185-5p则调控抑制性受体KIR3DL3的表达。 lncRNA也是重要调节因子。在活化NK细胞中，miR155HG可吸附miR-6756，解除对JAK3的抑制，从而增强细胞因子反应性，并与STAT3形成正反馈环。NK细胞与非恶性疾病 感染性疾病：病毒压力下NK细胞命运的变化。 急性病毒感染：快速控制。 适应性免疫成熟前，NK细胞可在急性病毒感染早期限制病原体。I型干扰素与IL-12、IL-15和IL-18共同驱动快速活化，优先作用于分化程度较低的CD56bright和早期CD56dim亚群。这些细胞因子协同发挥作用：IL-15支持存活和增殖，IL-12与IL-18则协同诱导IFN-γ产生。急性炎症可短暂降低激活阈值，却不会永久改变受体谱，从而带来快速但可逆的功能增强。在SARS-CoV-2感染中，早期I型干扰素反应与有效病毒控制相关，延迟反应则与疾病进展相关。 慢性病毒感染：HIV与HBV。 持续抗原暴露会逐步重编程NK细胞。HIV感染中，功能障碍性CD56⁻CD16⁺ NK细胞扩增，CD56bright细胞减少；PD-1、TIGIT和NKG2A等抑制性受体上调，而NCR和NKG2D等激活性受体下调。不过，Vpu和Nef等病毒蛋白会下调激活性受体配体，损害NK细胞识别通路。尽管如此，ADCC相对保留，为增强Fc介导杀伤的策略提供依据。HBV感染中，细胞毒活性通常得以维持，但富含IL-10和TGF-β的肝脏环境会抑制IFN-γ产生。肝脏微环境持续接触肠道来源抗原和代谢信号，因而对NK细胞功能具有独特影响。聚乙二醇干扰素α（Peg-IFN-α）可增强NK细胞通过IFN-γ抑制调节性T细胞（Treg），从而部分恢复免疫平衡；这一变化与HBV特异性T细胞反应改善及HBsAg下降相关。不过，持续激活NK细胞也可能加重肝损伤。 急性重症感染：以COVID-19为例的NK细胞失调。 慢性病毒感染会随时间重编程NK细胞，重症急性感染则可能迅速引发全身性NK细胞失调。住院COVID-19患者出现明显淋巴细胞减少，但外周NK细胞表现出广泛活化，Ki-67、HLA-DR和CD69均升高。单细胞及多组学分析显示，轻症进展至中度疾病的过程中，炎症升级并伴随免疫状态重组。NK细胞亚群转向细胞毒性和终末分化表型，重症病例中尤其可见NKG2C⁺适应性样细胞。高水平全身IL-6与颗粒酶A表达降低相关，提示尽管表型上出现活化，细胞毒潜能仍可能受损。COVID-19表明，急性炎症应激可使NK细胞活化与有效抗病毒控制脱耦。 记忆和适应性样反应：CMV印记。 CMV感染可形成持久的适应性NK细胞状态。在小鼠中，CMV编码糖蛋白m157与激活性受体Ly49H结合，驱动克隆样扩增；受体信号（如DNAM-1）、IL-12/STAT4及特定转录调节因子共同作用，形成长期存留的记忆细胞群。在人类中，CMV再激活（尤其是移植后）可扩增适应性NKG2C⁺ NK细胞；这一过程由HLA-E呈递病毒UL40肽并与CD94-NKG2C结合所驱动。 这些细胞的一个标志是稳定的表观遗传重塑。持续高甲基化可沉默信号接头蛋白（如FCER1G、SYK），而细胞因子位点低甲基化则使其在CD16参与时易于增强IFN-γ和TNF产生。 治疗性重编程。 当内源性免疫不足时，治疗性重编程旨在恢复或重新定向NK细胞功能。在病毒性疾病中，这一策略已沿三条互补路径发展：过继NK细胞转移、细胞因子驱动的增强，以及CAR介导的重新定向。例如，在HIV免疫学无应答者中，输注活化异基因NK细胞与CD4细胞持续恢复相关。另一种共表达可溶性IL-15的ACE2-CAR NK平台可特异性识别SARS-CoV-2刺突蛋白，并在致死性小鼠模型中降低病毒负荷。另一种CAR策略采用通用CAR-NK平台并由适配抗体引导，能够识别HIV-1 gp160的多个表位，有效清除表达gp160的细胞及HIV感染的原代CD4⁺ T细胞。为进一步提升疗效，CAR-NK设计开始采用适配NK细胞的信号结构域、细胞因子装甲化，以及克服TGF-β或抑制性检查点等抑制环境的策略。这些进展反映出一个更广泛的转变：从单纯增强天然细胞毒作用，转向工程化构建可编程抗病毒效应细胞。 自身免疫性和炎症性疾病：双刃效应。 在自身免疫病中，NK细胞既可抑制自身反应性免疫，也可能放大炎症。这种双重作用源于NK细胞的异质性，并受受体信号和局部细胞因子线索影响。 系统性红斑狼疮。 SLE体现了慢性I型干扰素压力下的NK细胞失衡。转录组分析显示，SLE中存在显著的I型干扰素特征，同时静息NK细胞比例降低，炎症性单核细胞和其他髓系亚群增加。对狼疮性肾炎肾组织开展的单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了复杂的免疫景观：在广泛的干扰素程序下，NK细胞与T细胞、B细胞及髓系亚群共定位。CXCR4和CX3CR1等趋化因子轴广泛表达，提示组织特异性迁移信号可能使NK细胞定位于发炎肾小球。值得注意的是，这些分析提示NK细胞相关程序具有治疗靶向潜力。例如，一项随机双盲试验的证据显示，低剂量IL-2治疗改善了临床反应，狼疮性肾炎患者尤为明显；与此同时，Treg、NK细胞及CD56bright NK亚群增加。这种治疗似乎重新校准了免疫平衡，而非广泛抑制免疫；这与NK细胞在适当信号指导下参与恢复耐受的模型一致。 类风湿关节炎。 类风湿关节炎（RA）患者的NK细胞亚群在外周和发炎关节之间呈现区室化重塑。外周血中NK细胞比例升高，但细胞毒功能受损；相反，滑液中CD56bright NK细胞富集，可通过产生促炎细胞因子参与局部免疫活化。新近机制研究还显示，这些浸润组织的NK细胞表达颗粒酶K，可直接激活补体级联反应。在滑膜中，成纤维样滑膜细胞提供丰富的补体底物，因此颗粒酶K-补体轴可能形成自我强化的炎症循环，加重关节破坏。尽管NK细胞在局部可能具有致病作用，特定细胞毒性亚群也被认为可抑制破骨细胞活动，在某些情况下限制骨侵蚀。 炎症性肠病。 炎症性肠病（IBD）的特征包括上皮屏障完整性破坏及肠黏膜先天免疫通路持续活化。作为黏膜第一线免疫群体的一部分，NK细胞需要在抗微生物防御与对共生菌群的耐受之间保持平衡。慢性炎症期间，这种平衡遭到扰乱，提示NK细胞可能从免疫调节性监视转向参与持续性黏膜炎症。值得注意的是，微生物特征与发炎黏膜中上皮细胞、巨噬细胞和NK细胞群富集相关。这些发现将NK细胞置于具有情境依赖性的宿主-微生物互作网络中，表明IBD中的NK细胞功能状态可能受局部炎症线索和微生物信号调控，而非仅由内在细胞毒程序决定。其他非恶性疾病 代谢性疾病。 肥胖脂肪组织中的CD56bright NK细胞可获得组织适应性表型（CD63⁺、CCR5⁺），其IFN-γ产生与胰岛素抵抗呈直接相关。在非酒精性脂肪性肝炎中，肝NK细胞可推动疾病病理过程；清除这些细胞可减轻脂肪性肝炎。相反，慢性2型糖尿病患者NK细胞功能障碍与TIM-3上调和NKG2D丢失相关，TIM-3水平与糖化血红蛋白A1c相关，阻断TIM-3可恢复细胞因子产生。这些发现共同支持一种双向作用模型：局部活化与全身性耗竭并存。NK细胞是代谢应激的重要感知者，可将炎症与组织重塑联系起来，也为其在肿瘤中的重编程提供了依据。 动脉粥样硬化。 对人颈动脉斑块进行的单细胞分析证实，NK细胞是动脉粥样硬化免疫景观中的驻留成分。值得注意的是，与常规NK细胞密切相关的ILC1在早期人类斑块中富集，可能占浸润淋巴细胞的较大比例，提示ILC从斑块形成早期便参与其中。NK细胞与单核细胞之间存在双向交流：髓系来源的IL-12和IL-18活化NK细胞，使其产生IFN-γ；IFN-γ反过来促进单核细胞分化、维持炎症性巨噬细胞表型并增强IL-12产生，形成前馈炎症环。包括CCL2和CX3CL1在内的趋化因子及细胞因子，可支持斑块内NK细胞募集和活化。脂质应激会放大这种募集-活化轴：氧化低密度脂蛋白刺激抗原呈递细胞增加IL-12产生，增强NK细胞细胞毒性和IFN-γ输出；它还可诱导应激配体（如NKG2D配体），提供额外激活信号。多民族动脉粥样硬化研究（MESA）的群体数据表明，基线循环NK细胞比例较高与新发冠状动脉钙化风险增加及纵向收缩压较高相关，而经典单核细胞则呈负相关。这些发现将NK细胞相关免疫特征与血流动力学应激及早期动脉粥样硬化改变联系起来，使其意义从斑块生物学拓展至亚临床血管表型。 妊娠。 子宫NK（uNK）细胞是特化的组织驻留淋巴细胞（CD49a⁺EOMES⁺），其表型和功能与外周NK细胞有明显差异。人类妊娠早期，dNK细胞构成主要的CD56brightCD16⁻驻留NK细胞群，表达CD49a、CD9、CD69、KIR、CD94/NKG2A和EOMES，细胞毒性有限，尽管其细胞毒性颗粒丰富。dNK细胞位于螺旋动脉和绒毛外滋养层附近，处于母胎界面，可通过分泌VEGFA、血管生成素和基质金属蛋白酶（MMP）等促血管生成因子协调胎盘血管重塑。这一营养支持程序还受到dNK细胞来源趋化因子和生长因子（如IL-8、VEGF、SDF-1和IP-10）的增强，促进滋养层迁移、新生血管形成、组织重塑和胎盘形成。一个CD49a⁺EOMES⁺ dNK亚群可产生促生素和骨糖蛋白，直接支持胎儿生长；在小鼠中，破坏这一程序会导致胎儿生长受限，输注子宫样NK细胞可逆转该表型。细胞因子调节至关重要：子宫平滑肌来源的IL-18可维持受控的1型炎症状态，在促进螺旋动脉重塑的同时避免NK细胞过度细胞毒；条件性删除IL-18会导致血管重塑受损、胎儿生长受限和母体高血压，表现出与子痫前期相似的表型。免疫耐受由特定受体-配体相互作用介导：胎儿HLA-C、HLA-E和HLA-G分别与uNK细胞上的KIR、NKG2A和ILT2结合，某些母体KIR-胎儿HLA-C组合与复发性流产和子痫前期相关。这些HLA特异性受体系统使dNK细胞能够感知绒毛外滋养层，并调节滋养层侵袭、血管重塑和母胎耐受，而不是执行经典细胞毒作用。HLA-G-ILT2信号促使uNK细胞呈现支持生长的表型；CXCR4⁺CD56bright dNK亚群则通过IL-4驱动Th2极化，复发性流产患者中该亚群减少。因此，Th2极化只是更广泛dNK程序的一部分；这一程序还整合了组织驻留、滋养层互作、促血管生成重塑和免疫耐受。 Treg可上游维持uNK细胞的促血管生成功能并抑制细胞毒通路。妊娠早期短暂清除Treg会损害螺旋动脉重塑并减少DBA⁺ uNK细胞，输注Treg可逆转这些影响。与此同时，dNK细胞与蜕膜髓系单核细胞之间的交流可促进IDO和TGF-β相关的Treg诱导，为dNK介导的组织重塑增加免疫调节层。临床研究强调，决定妊娠结局的是uNK细胞的功能表型，而非绝对数量；外周NK测量值难以反映子宫内状态。因此，转化策略侧重恢复uNK发育程序，例如调节CXCR4-CXCL12信号以扩增调节性NK亚群、增强HLA-G依赖的耐受通路并加强Treg-uNK互作，而非非特异性抑制。 衰老与细胞衰老。 衰老与CD56bright调节性NK细胞减少及终末分化CD56dimCD57⁺亚群扩增相关，后者增殖储备较低。从机制上看，衰老NK细胞会积累线粒体损伤和活性氧（ROS），Vps34依赖的自噬对其长期存留具有关键作用。衰老细胞分泌衰老相关分泌表型（SASP）因子CCL2和IL-15，招募NK细胞；这一过程在肝脏中需要CCR2依赖的髓系许可。识别衰老细胞依赖上调的NKG2D/DNAM-1配体和ICAM-1；胞外钙网蛋白则可结合NKp46并触发脱颗粒。关键在于，NKG2D配体（NKG2DL）在多种诱导细胞衰老的刺激下均持续上调，包括致癌应激、复制耗竭、DNA损伤和P16INK4a过表达；在老龄小鼠和非人灵长类动物的多个组织中也可检测到NKG2DL，提示其可作为普遍的衰老相关细胞表面标志。尽管如此，衰老细胞可获得免疫检查点以逃避免疫清除：PD-L1与PD-1结合，复制性细胞衰老还可通过ST8SIA1上调GD3，使其结合抑制性受体Siglec-7/E。阻断GD3可恢复NK细胞杀伤，并减轻老龄小鼠纤维化。表观遗传层面上，衰老细胞中上调的SWI/SNF染色质重塑因子SMARCA4会抑制先天免疫感知；抑制SMARCA4可解除对cGAS/STING和MAVS/MDA5通路的抑制，放大SASP并增强NK细胞杀伤，在卵巢癌模型中可与化疗诱导的细胞衰老协同。将NKG2DL鉴定为普遍的衰老细胞表面标志，推动了NKG2D靶向衰老细胞清除免疫疗法的发展。Yang等显示，NKG2D-CAR T细胞可在体外选择性清除衰老细胞；用于老龄或接受照射的小鼠后，可缓解多种衰老相关病理并改善身体机能。值得注意的是，自体NKG2D-CAR T细胞在老龄非人灵长类动物中能够安全清除自然产生的衰老细胞，未观察到不良影响，为转化至年龄相关疾病提供了概念验证。后续研究证实，NKG2D-CAR T细胞可有效靶向基因毒性或氧化应激诱导的衰老成纤维细胞和星形胶质细胞，而对非衰老细胞影响较小，拓展了其在神经退行性疾病中的潜在应用。总体而言，这些发现将NKG2D靶向CAR-T细胞定位为强效且具有选择性的衰老细胞清除工具。 这些发现共同揭示了免疫监视失效的分层架构：代谢应激和自噬下降削弱NK细胞适应能力；靶细胞检查点（PD-L1、GD3）抑制细胞毒性；染色质状态决定免疫原性。临床策略包括通过恢复自噬改善代谢状态、调节检查点（阻断PD-1/PD-L1）、阻断细胞衰老相关检查点（抗GD3）、进行表观遗传致敏（抑制SMARCA4），以及采用NKG2D靶向CAR-T细胞免疫疗法，从而将NK细胞重新定位为衰老生物学中的主动治疗节点。 神经退行性疾病。 神经退行性疾病日益被视为区室化炎症性疾病，NK细胞则是神经免疫界面上的动态参与者。在炎症条件下，CD56bright NK细胞穿越血脑屏障的能力高于CD56dim亚群。未经治疗的多发性硬化（MS）患者脑脊液单细胞分析显示，NK细胞与细胞毒性T细胞和B细胞稳定共富集，提示中枢神经系统边缘存在“细胞毒性淋巴细胞转变”。在功能上，MS中的NK细胞可能通过穿孔素-颗粒酶介导的机制清除致脑炎性T细胞，从而抑制自身免疫；而在阿尔茨海默病（AD）中，淀粉样蛋白β可激活NK细胞释放促炎细胞因子，增强小胶质细胞活化并形成神经毒性反馈环。除细胞因子信号外，一项针对AD患者的自体NK细胞（SNK01）I期研究显示，这些细胞可摄取并降解Aβ和α-突触核蛋白聚集体；部分参与者的胶质纤维酸性蛋白和磷酸化tau水平随之降低，提示NK细胞可直接参与蛋白稳态调节。与胶质细胞的双向交流进一步塑造NK细胞功能：NK细胞来源的IFN-γ和TNF-α增强胶质细胞活化，而胶质细胞来源的IL-15和应激配体则维持炎症组织中的NK细胞活性。因此，NK细胞沿双重作用轴发挥功能：在MS中抑制适应性自身免疫，在AD中则可能加剧先天炎症。这界定了狭窄的治疗窗口：增强NK细胞清除自身反应性淋巴细胞或蛋白聚集体的能力时，需兼顾避免附带神经元损伤的风险。早期临床数据支持向AD患者输注NK细胞的可行性，但仍需对照试验验证其疗效和机制。图5 图5：肿瘤微环境中NK细胞功能障碍的机制；肿瘤微环境（TME）施加多层抑制程序，逐步削弱NK细胞的抗肿瘤活性；a 受体-配体轴：TME通过脱落型MICA/B和TGF-β等因素抑制NKG2D、NKp30和NKp44等激活性受体，同时通过HLA-E和外泌体递送的circUHRF1等配体上调NKG2A、PD-1、TIGIT和TIM-3等抑制性受体，破坏NK细胞受体平衡；b 代谢重编程：葡萄糖缺乏、乳酸积聚、酸中毒、缺氧、腺苷、前列腺素E2（PGE2）和衰老相关分泌表型（SASP）共同损害糖酵解、线粒体适应能力、细胞因子应答和细胞毒性；c 免疫互作：Treg、髓源性抑制细胞（MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）及肿瘤细胞通过TGF-β等因素抑制NK细胞功能，促使其转变为细胞毒能力有限且具有抑制特征的功能障碍状态；这些功能障碍性NK细胞又可产生IL-6，强化前馈抑制回路，同时进一步抑制树突状细胞（DC）成熟和启动，并削弱T细胞应答；d 表观遗传与转录重编程：DNA甲基化、组蛋白修饰、m⁶A调节因子和非编码RNA共同重塑肿瘤细胞及NK细胞程序，改变配体表达、趋化因子信号、效应基因表达及耗竭相关通路；上述相互关联的机制为恢复NK细胞受体平衡、代谢适应能力、免疫协调和转录完整性的治疗策略提供概念框架NK细胞功能的微环境调控：从生理状态到病理性耗竭 生理性印记：非恶性组织中的NK细胞。 生理状态下，NK细胞通过情境依赖性印记获得组织驻留身份，重新校准其转录和功能优先级。由Hobit和Blimp1参与的保守转录模块可通过抑制组织外流相关基因，维持细胞在组织内驻留；腺体组织中的trNK身份需要自分泌TGF-β1维持。 在肝脏中，持续抗原暴露要求炎症受到抑制。与循环NK细胞相比，肝脏CD56bright NK细胞EOMES水平较高、T-bet水平较低、IFN-γ产生减少，表明其受组织生态位主动重塑。不过，这种适应也带来易感性：急性炎症期间，肝trNK细胞对乳酸诱导的线粒体凋亡更为敏感。在子宫内，dNK细胞表现出明显不同的特征，可产生促生素和骨糖蛋白等支持胎儿发育的因子。滋养层上的HLA-G与dNK细胞ILT2结合，诱导这一营养支持程序，将经典抑制性信号转化为组织重塑线索。子宫微环境中的多层信号，包括TGF-β、IL-15、低氧张力和激素调节，共同塑造这一表型。在屏障组织中也可观察到诱导性驻留：小鼠皮肤感染可募集循环NK细胞，并驱动其分化为长期存留的Tcf1hiCD69hi trNK细胞，使其能够更快产生回忆应答。 总体而言，这些观察揭示三项原则：生理性印记由转录程序执行，驻留模块抑制外流并稳定局部持久性；组织来源和自分泌信号持续维持该状态；印记可重新校准效应功能优先级，例如降低肝脏炎症性细胞因子输出、促进子宫营养支持或加快屏障组织的回忆应答，同时不完全丧失细胞毒能力。因此，生理性印记代表一种受控适应，而非功能障碍。转变视角：免疫抑制性TME概述 癌症中的NK细胞已由这种经过校准的状态转向主动重编程：TME不仅以被动抑制的方式降低NK细胞活性，还通过细胞、可溶性、代谢和物理线索构成的协调性多层网络，主动重塑NK细胞迁移、受体图谱、代谢和效应功能，最终形成持久功能障碍（图5）。 髓源性抑制细胞（MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、Treg和癌相关成纤维细胞（CAF）共同构成抑制性生态位，限制NK细胞浸润、活化和持久性。CAF的作用尤为多方面：既可促进致密细胞外基质（ECM）沉积，形成限制迁移的物理屏障，也可分泌TGF-β等免疫抑制因子。TME中的多种可溶性因子也会抑制NK细胞。TGF-β是一种强效抑制因子，可下调NKG2D、NKp30和NKp44等激活性受体，抑制IFN-γ产生，并可能驱动NK细胞向细胞毒性较弱的ILC1样身份转化。在缺氧肿瘤中，腺苷积累并通过A2A受体抑制NK细胞活化，将代谢应激与检查点样抑制联系起来。前列腺素E2（PGE2）也可通过下调激活性受体表达进一步抑制细胞毒性。除广为人知的PD-1/PD-L1轴外，NKG2A/HLA-E轴已成为重要的NK细胞检查点。多种肿瘤类型中，肿瘤细胞常上调HLA-E；它与NKG2A结合后传递抑制信号，可压过激活性受体输入，提高NK细胞活化阈值。 异常理化条件会进一步强化抑制。缺氧、酸中毒和营养缺乏并非肿瘤生长的偶然副产物，而是许多实体瘤的结构性特征，可主动塑造免疫细胞功能。例如，缺氧可改变趋化因子梯度、调节受体表达并重定向NK细胞代谢，从而同时损害其向肿瘤部位募集以及到达后的效应功能。致密ECM和异常肿瘤血管还会形成额外物理屏障，限制NK细胞外渗和肿瘤穿透，使其局限于抗肿瘤作用较弱的基质区域。TME诱导NK细胞可塑性和功能障碍的机制 受体-配体轴失调。 NK细胞免疫监视依赖免疫突触处激活性和抑制性受体-配体相互作用之间的精细平衡。在肿瘤中，这一平衡会被主动重塑，而非被动丧失；多个机制协同削弱激活通路并增强抑制信号（图5A）。 NKG2D轴体现了激活通路的瓦解。肿瘤细胞从表面脱落MICA和MICB，产生可溶性配体（sMIC），诱导NKG2D内化和下调，减弱细胞毒信号。多种恶性肿瘤中均可检测到可溶性NKG2D配体，并与NK细胞活化受损相关。除NKG2D外，NKp46等激活性受体的调节也会影响NK细胞控制肿瘤的能力，提示激活性受体下调是TME诱导功能障碍的普遍特征。与此同时，TME内抑制性受体的结合逐步增强。肝癌来源的外泌体circUHRF1可通过吸附miR-449c-5p诱导NK细胞表达TIM-3，减少IFN-γ和TNF-α产生。NK细胞表达的TIGIT也会内在抑制效应功能；晚期肿瘤中，PD-1和TIM-3共表达可界定一类耗竭样NK细胞，其T-bet表达下降、脱颗粒受损。肿瘤还可通过增加抑制性配体表达强化抑制信号。在经典HLA I类阴性的乳腺肿瘤中，非经典HLA-E和HLA-G可作为替代性抑制配体，其表达与不良临床结局相关。近期证据显示，PSAT1可通过YBX1维持HLA-E转录，从而持续激活抑制性受体NKG2A。除经典HLA配体外，IGSF8也可作为抑制性配体与NK细胞受体结合；遗传性删除IGSF8可增强NK细胞依赖的肿瘤控制。 代谢重编程与功能障碍。 光标记研究近期发现，NK细胞浸润肿瘤后数小时内即可迅速丧失效应功能。这一早期下降与代谢崩溃密切相关，包括线粒体碎片化、OXPHOS受损、线粒体活性氧（mROS）增加和糖酵解缺陷。这些发现支持一种模型：代谢破坏既驱动也强化NK细胞耗竭（图5B）。 营养缺乏是主要的代谢打击。肿瘤细胞高表达GLUT1等葡萄糖转运蛋白，会与浸润NK细胞竞争有限的葡萄糖。活化NK细胞转向有氧糖酵解，以支持IFN-γ产生和细胞毒颗粒合成；因此，葡萄糖缺乏会直接损害这些效应功能。氨基酸耗竭也是关键因素：肿瘤会大量消耗谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸。谷氨酰胺缺乏会抑制NK细胞c-Myc表达和mTOR活性，损害增殖并降低效应功能；吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）介导的色氨酸分解则产生犬尿氨酸，导致NK细胞丢失并促进铁死亡。免疫抑制性代谢物蓄积会放大这一功能障碍。TME中的乳酸可抑制NK细胞浸润、克隆扩增、细胞毒性和IFN-γ产生，同时损害代谢适应能力并诱导凋亡。从机制上看，这些影响共同作用于LDHA依赖的糖酵解-乳酸轴破坏、乳酸和酸中毒诱导的线粒体氧化应激及生物能崩溃，以及免疫生态位重塑。例如，高乳酸可支持Treg代谢及其抑制功能，间接加重NK细胞抑制。乳酸除破坏生物能状态外，还可通过组蛋白乳酰化改变染色质。细胞外腺嘌呤核苷酸经CD39/CD73生成的腺苷可结合A2A受体，抑制OXPHOS和糖酵解，损害NK细胞代谢适应能力。PGE2通过双重机制进一步加重NK细胞功能障碍：一方面经cAMP诱导破坏LCK-ERK信号轴，直接抑制激活信号；另一方面下调激活性受体表达，从而叠加其他代谢物造成的代谢损伤。缺氧还会带来额外代谢限制。HIF-1α活化虽可短暂支持糖酵解，持续信号却会导致线粒体功能障碍并促进GZMB降解，削弱持久性NK细胞反应；抑制HIF-1α可恢复NK细胞抗肿瘤活性。治疗或应激诱导的衰老肿瘤细胞可活化NF-κB和mTOR，形成富含趋化因子和代谢物的SASP；其中大量乳酸会加剧局部酸化，将衰老细胞蓄积与NK细胞代谢功能障碍联系起来。 免疫细胞互作与抑制网络。 单靠代谢破坏不足以解释肿瘤浸润NK细胞（TiNK）的持久功能障碍。在已形成的肿瘤中，NK细胞处于由TAM、MDSC、Treg及基质成分构成的致密免疫网络之中。该网络不只是抑制NK细胞细胞毒性，还会将其重编程为局部免疫抑制的主动放大器（图5C）。 TGF-β信号是其中一个核心抑制轴。TAM、Treg和肿瘤细胞来源的TGF-β会激活SMAD依赖的转录程序，削弱NK细胞效应功能。遗传性破坏SMAD3可增强NK细胞对肺癌的免疫刺激能力；删除SMAD4则可抵消TGF-β介导的抑制。上游肿瘤内在程序也可放大这一轴，例如黑色素瘤细胞Notch1信号上调TGF-β1，增强免疫抑制。与TGF-β-SMAD信号并行，IL-6-STAT3轴作为动态细胞间放大器发挥作用。TaNK细胞本身也可成为IL-6来源，激活MDSC中的STAT3并促进抑制性髓系细胞蓄积。抑制基质IL-6产生进一步凸显该通路的重要性：抑制CAF可降低IL-6释放，增强NK细胞介导的细胞毒作用。检查点强化构成抑制性互作的第三层。TaNK细胞可塑造CD8⁺ T细胞分化程序，导致对免疫检查点阻断（ICB）产生耐受。在接受ICB治疗但免疫细胞排斥的黑色素瘤中，细胞毒性NK细胞在病灶内蓄积与检查点免疫治疗耐受相关，部分原因是其限制了CD8⁺ T细胞浸润和功能。除直接抑制外，慢性细胞互作还可将NK细胞重编程为促血管生成表型，非小细胞肺癌中已有报道。TME中的NK-树突状细胞（DC）轴也容易受到破坏。抑制性NK细胞可抑制DC成熟并限制DC依赖的启动过程，削弱CD4⁺ T细胞活化和肿瘤特异性CD8⁺ T细胞反应。在HCC中，TLR7/8激动剂可通过增强NK-DC互作重新激活该环路，增强NK细胞抗肿瘤活性。 表观遗传和转录重编程。 生理条件下，表观遗传重塑赋予NK细胞灵活的应答阈值；TME中持续的抑制性线索则会将这些调控层重编程为功能障碍程序（图5D）。 DNA甲基化和组蛋白修饰是TME挪用以沉默NK细胞效应程序的两个相互联系的染色质调控层。慢性刺激可使LAG3、PDCD1和TIGIT位点出现与耗竭相关的低甲基化，驱动NK细胞功能障碍。肿瘤来源信号还可通过不同表观遗传回路重塑NK细胞功能：IDH1/2突变会抑制TET2活性，在AML中造成组织特异性后果，如HLA高甲基化并增强NK细胞易感性；胶质瘤中ULBP1/3沉默则促进免疫逃逸。MUC1-C通过NF-κB-EZH2-DNMT信号介导MICA/B表观遗传沉默，促进NK细胞免疫逃逸。组蛋白修饰酶也会强化这一抑制：EZH2在HCC中催化ULBP1/MICA启动子沉积H3K27me3，抑制NK细胞活性；HDAC10则促进EZH2募集至CXCL10启动子，抑制NK细胞向肿瘤迁移。组蛋白甲基转移酶DOT1L缺失会使NK细胞偏向CD49a⁺CD49b⁺ intILC1/ILC1样状态，损害实体瘤控制，说明组蛋白甲基化可作为NK细胞身份的内在守门因子。 除染色质调控外，m⁶A介导的转录后调控也是NK细胞功能障碍的重要决定因素。TiNK的一个特征是m⁶A“写入”活性下降：TME内NK细胞的METTL3表达显著降低。从机制上看，METTL3缺失会减少编码SHP-2的Ptpn11转录本上的m⁶A修饰，降低SHP-2蛋白表达，削弱IL-15诱导的AKT和MAPK通路活化。m⁶A“去除”酶也会增加抑制：FTO通过稳定细胞因子信号抑制因子（SOCS）家族转录本，负向调节NK细胞细胞毒性。在结直肠癌（CRC）中，TiNK的SMAD4表达降低，导致m⁶A阅读蛋白YTHDF2表达下降和NKG2D表达受损。 ncRNA构成另一调节层，与上述表观遗传程序整合并强化其作用。miR-146a通过直接靶向STAT1，抑制NK细胞细胞毒性和IFN-γ产生；miR-29家族则降解肿瘤细胞上的免疫检查点蛋白B7-H3，从而抑制NK细胞耗竭。lncRNA可通过外泌体递送进入NK细胞；在顺铂耐药舌癌中，外泌体SNHG26抑制NK细胞增殖、活化和细胞毒性。 circRNA也会强化NK细胞功能障碍：HCC来源的外泌体circUHRF1进入NK细胞后，通过吸附miR-449c-5p上调TIM-3；circARAP2则通过解除CTCF/PRC2介导的RAB5A抑制，增强NKG2D内吞运输，放大脱敏。 转录因子是这些表观遗传和转录后输入的下游整合者。Egr2和DGKα是发育性无反应与肿瘤耗竭的共同负调控因子；KLF2促进NK细胞归巢至富含IL-15的生态位；HIF-1α介导的缺氧适应损害TiNK功能；代谢应激可激活HSF1，抑制效应基因Irf8和Il2rb，同时促进抑制性受体表达；TGF-β驱动EOMES下调，使NK细胞转化为ILC1。SMAD4具有双重作用：它在富含TGF-β的TME中抑制IFN-γ产生，同时通过非经典TGF-β信号阻止NK细胞向ILC1样状态转化。 界定TME中的NK细胞状态。 TME中NK细胞的命名日趋细化，反映出其功能状态超越了传统“活化”或“细胞毒性”标签。需要明确区分广义描述术语与功能定义明确的特定亚群（表1）。 TiNK是对所有迁入实体瘤的NK细胞的总称。该群体具有内在异质性，包含处于不同分化、活化和功能障碍阶段的细胞，其组成在不同癌种间差异显著，是局部抗肿瘤免疫景观的重要决定因素。在这一异质性TiNK群体中，已发现多种功能障碍状态。Tang等定义的TaNK特指终末功能障碍性CD56dimCD16hi亚群（c6-DNAJB1），其应激基因表达高、细胞毒性低，并与不良预后及ICB耐药密切相关。Netskar等发现的应激型CD56bright状态也具有类似的应激和免疫抑制功能特征，但来源于CD56bright谱系，提示两种主要NK细胞亚群均可能发生功能障碍。除功能障碍外，部分NK细胞还会主动抑制免疫。Song等描述的一类细胞可通过竞争IFN-α和IL-2等关键细胞因子抑制CD8⁺ T细胞反应，进而参与ICB耐药；这一状态在功能上不同于主要损害NK细胞自身效应能力的“耗竭”或“功能障碍”表型。 TME驱动的动态转变，尤其是TGF-β作用，可使NK细胞转向类似ILC1的命运。小鼠研究已界定一种intILC1过渡状态，先于终末分化的非细胞毒性ILC1样细胞出现。尽管人类中的对应关系仍在研究，这一转化途径是免疫逃逸的重要机制。与这些功能障碍状态不同，Netskar等描述的强效、TME耐受性CD56dim效应状态具有较高细胞毒性和氧化磷酸化水平，并与有利预后相关，凸显癌症中保护性与有害NK细胞反应之间的关键平衡。总之，当前研究支持一种更精细的模型：TiNK并非单一细胞群，而是复杂生态系统，包含保护性细胞毒亚群和多种不利状态；后者可大致分为内在功能障碍亚群（如TaNK、应激型CD56bright细胞）及主动抑制性亚群。认识这种功能异质性，对于判断患者预后以及设计新一代免疫疗法至关重要；相关疗法可选择性恢复保护性NK细胞功能，或清除妨碍抗肿瘤免疫的NK细胞。TiNK的功能结局与表型图谱 TiNK的功能状态受癌种、疾病阶段、免疫结构及既往治疗影响。不同肿瘤中的NK细胞数量和表型差异很大，并具有重要预后意义。在实体恶性肿瘤总体人群中，NK细胞丰度通常与更好生存相关。不过，这一总体关联掩盖了显著异质性：黑色素瘤中，外周CD56brightCD16⁻KIR3⁺ NK细胞增加与疾病晚期相关；膀胱癌中，肿瘤内CD56bright NK细胞则与有利结局相关。肿瘤中的主要趋同特征是抑制性受体占优势并伴随细胞毒功能崩溃。肺癌TiNK的受体谱和效应功能发生协同变化；HCC中NKG2A高表达标志功能障碍性NK细胞表型并预测不良预后；HBV相关HCC中，TIGIT⁺TIM-3⁺ NK细胞与疾病进展和功能受损相关。NK细胞功能障碍需要细致解读：耗竭不是二元状态，而是在慢性刺激和持续抑制压力下逐步演进的动态谱系。区分耗竭、细胞衰老和无反应状态十分重要，因为每种状态均有不同的转录和代谢程序。NK细胞进入肿瘤后可迅速发生功能受损；持续细胞因子或代谢应激则可能强化该状态，例如长期暴露于IL-15会诱导人NK细胞代谢缺陷和耗竭特征。这种表型异质性也影响生物标志物开发。NK相关基因特征可用于患者分层和临床结局预测。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，NK相关预后特征可描绘免疫景观并与生存相关；三阴性乳腺癌中类似的NK风险模型也可预测预后。值得注意的是，NK细胞还可能塑造适应性免疫轨迹：在免疫细胞排斥型黑色素瘤中，细胞毒性NK细胞与对检查点免疫治疗反应受损相关；TaNK细胞可调控CD8⁺ T细胞分化程序，参与ICB耐药。因此，NK细胞不仅是肿瘤诱导免疫抑制的被动受害者，也是其表型身份记录微环境压力历史的动态节点。 表1：肿瘤微环境中NK细胞状态的术语及定义性特征表1 表1：肿瘤微环境中NK细胞状态的术语及定义性特征过继NK细胞疗法：来源、平台与工程策略 NK细胞疗法的来源与平台。自体NK细胞：局限性和临床经验。 自体NK细胞疗法是最早的过继NK细胞免疫疗法。输注回体内的NK细胞虽可在一定程度上扩增，但在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中，实现强效且持久的抗肿瘤活性仍较困难。一个关键局限是，自体NK细胞受抑制性受体与自身MHC I类分子相互作用所触发的抑制信号约束。此外，许多自体NK细胞疗法候选者在采集白细胞单采细胞时已接受大量既往治疗，进一步损害NK细胞增殖能力和功能状态，导致起始细胞产品质量较弱。由于异基因NK细胞不会引发GVHD，具备现货型细胞治疗的重要安全优势，领域研究日益转向更利于规模化生产且效力稳定的异基因来源。 异基因NK细胞来源。 异基因NK细胞主要来源包括永生化克隆NK细胞系、外周血（PB-NK）、脐带血（UCB-NK）和骨髓来源的原代NK细胞，以及由造血干/祖细胞（HSPC）和多能干细胞（尤其是iPSC）分化而来的NK细胞。NK-92是研究最充分的NK细胞系，可快速扩增、便于标准化大规模生产及高效基因工程改造；但为降低成瘤风险，输注前必须进行照射，限制其体内持久性。健康供者PB-NK更接近生理成熟NK细胞，保留完整受体谱和细胞毒机制。PB-NK产品也可定向制备为功能增强亚群：CIML-NK细胞IFN-γ产生增加、体内功能持久性改善；“适应性样”NK细胞则表现为NKG2C高表达和FcεRγ缺失，具有强ADCC能力，适用于联合单克隆抗体或作为工程化细胞骨架。UCB-NK细胞来源便利，适合冻存建库，但供者间差异较大，且可能需要更强的体外处理以获得最佳效应功能。iPSC-NK和CD34⁺ HSPC来源NK细胞可建立主细胞库并提高批次间一致性，还可在分化阶段实施工程改造（如表达CAR、敲除抑制通路或增强IL-15信号），适用于现货型产品。不过，这些分化流程通常耗时较长，包含多个质量控制节点，需要严格监测残余未分化细胞及成熟状态。HSPC或多能干细胞来源NK产品通常分两步生产：先进行谱系诱导和成熟，再扩增、制剂化。近期研究改进了这一流程的早期阶段：无类胚体、类器官聚集体式多能干细胞分化策略可在约4周内制备具有功能的多能干细胞诱导NK（iNK）细胞，并可在不依赖传统饲养细胞扩增的情况下放大生产。另一种可规模化的脐带血CD34⁺ HSPC逐步分化流程可高产制备成熟iNK和CD19 CAR-iNK细胞，具有较强CD16表达、T细胞污染低及冻存后活性保留等特征。近期，直接重编程NK（drNK）策略试图绕过iPSC阶段，通过短暂重编程和定向培养将体细胞转化为NK样效应细胞。这些策略的一个核心机制是破坏决定T细胞谱系的转录因子BCL11B；BCL11B耗竭可促成T细胞向NK谱系转化。新证据还表明，表观遗传调控与BCL11B协同维持T细胞身份。DNMT1可与BCL11B发生物理相互作用并稳定其表达，维持由DNA甲基化介导的NK细胞相关基因抑制。药理学或遗传学抑制DNMT1会使BCL11B不稳定，解除NK谱系转录程序的抑制，生成细胞毒性和抗肿瘤活性增强的NK样细胞。drNK可能缩短制备周期，理论上可用于自体或异基因治疗；其批次一致性、可扩展性、基因组稳定性和长期安全性仍需未来临床级研究严格验证。 体外扩增与制备。 体外NK细胞扩增平台通常采用细胞因子驱动活化和增殖，随后进行制剂化和冻存。许多稳健流程采用K562饲养细胞系统提供共刺激和持续IL-21信号。为避免使用饲养细胞，PM21系统采用携带膜结合IL-21的膜颗粒，提供无饲养细胞的替代方案。这些方法旨在约2–3周内实现约10³倍扩增，同时保持复苏后的存活率和效力。适配NK细胞的CAR设计依据 CAR-NK细胞可能是最具前景的过继NK细胞疗法模式，可增强靶向性和功能。典型CAR由抗原结合结构（通常为单链可变片段[scFv]或替代性配体）、铰链/跨膜区和胞内信号结构域组成。为改善CAR-NK细胞体内存活、扩增和功能维持，通常还会引入IL-15信号轴。CAR技术在T细胞中取得显著成功，但将其设计原则直接移用于NK细胞并非最优。NK细胞的激活信号网络遵循不同于T细胞的机制，主要由激活性和抑制性受体信号之间的平衡决定，而非抗原特异性识别。NK细胞细胞毒功能不像T细胞那样依赖TCR等单一主导受体，而由NKG2D、2B4、DNAM-1等激活性受体和KIR、NKG2A等抑制性受体发出的信号动态整合而成。因此，CAR-NK工程设计应利用NK细胞内在的信号结构，而不是直接照搬针对T细胞优化的经典CD28或4-1BB-CD3ζ构型。 获得抗原特异性只是第一步；抗肿瘤反应的强度和持久性还取决于对CAR识别和信号结构的合理优化。在抗AML CAR-NK模型中，Rahnama等发现，scFv亲和力更高并不必然更好；系统调整亲和力和构象特征，可在体内样免疫压力下增强持续细胞毒性及抗原密度辨别能力，并在快速活化、降低肿瘤外活性和减轻耗竭之间取得平衡。这符合更广泛的原则：表位选择可调节受体活化阈值。针对同一抗原（如B7-H3）不同表位的纳米抗体CAR比较研究显示，表位选择会显著影响触发效率和体内抗肿瘤表现，说明表位亲和力与抗原密度的耦合是可工程化设计的维度。此外，与抗原无关的scFv聚集可在CAR构建体中引发持续性信号，促成过早耗竭；这一现象在CAR-NK细胞中的影响尚未完全明确。CAR-Toner等计算工具可预测并优化抗原结合结构域特征（例如带正电区域），以减少不必要的持续性信号并维持功能持久性。在信号层面（跨膜区、共刺激/活化模块和ITAM构型），早期研究已强调适配NK细胞的CAR结构的重要性，例如采用NKG2D跨膜结构域，连接2B4共刺激和CD3ζ信号。Wang及我们团队系统比较多种CD19 CAR设计后发现，不同跨膜结构域和胞内结构域组合可显著改变NK细胞脱颗粒、细胞因子分泌谱、持续杀伤能力及耗竭相关表型。因此，CAR模块应依据NK细胞内在信号拓扑重新组合，而非直接套用CAR-T设计经验。机制研究显示，Acharya等将CD28与CD3ζ连接后形成NK细胞信号支架，优先募集LCK和ZAP70等近端激酶，从而增强信号幅度，维持体外细胞毒功能及体内抗肿瘤效力；相应地，比较研究表明，在部分CAR-NK情境中，CD28-ζ可能优于4-1BB-ζ，MAPK通路节点（如MAP3K8）也可能参与其中。受CAR-T细胞混合高通量CAR文库筛选启发，一种可行的CAR-NK理性设计策略是结合组合型scFv变体文库、系统性共刺激结构域/骨架置换及可规模化NK平台中的功能筛选，以数据驱动方式优化抗原识别和信号结构，而非依赖经验性、一次性的构建体选择（图6A）。 尽管CAR设计方面的进展增强了靶向和信号传导，CAR-NK细胞的临床疗效仍受一系列体内屏障限制，包括NK细胞内在寿命较短导致的持久性有限、活化诱导的耗竭，以及外源性清除机制（如宿主T细胞和NK细胞介导的HLA依赖性排斥、巨噬细胞介导的清除和胞啃后的自相残杀）。即使到达肿瘤，CAR-NK细胞仍面临不利的肿瘤微环境；营养缺乏、缺氧和酸中毒等代谢应激，以及TGF-β和腺苷等抑制性介质，会削弱效应功能和免疫突触质量。肿瘤还可通过下调或脱落激活性配体（包括NKG2D配体MICA/B），并上调HLA-E等抑制性信号逃避免疫识别。正常组织表达共享抗原也会增加靶向肿瘤外毒性的风险，缩窄治疗窗口。应对持久性、迁移、代谢适应和抵抗免疫抑制等多重挑战，需要超越CAR本身，对细胞进行更系统的重编程；下一节将对此作详细讨论。新一代NK细胞免疫治疗的工程与增强策略 NK细胞内在工程：系统层面方法。 NK细胞内在活性由激活性和抑制性表面受体之间的动态平衡决定，并受细胞因子微环境持续调节。早期工程策略聚焦于简单“增加”单一元件（如CAR），新一代策略则越来越像系统控制工程问题：同时优化正向信号输入，并精准拆解多层负反馈机制。这种双重系统视角旨在将NK细胞重编程为持久、强效且可控的“智能杀手”，使其即使处于恶劣TME中也能发挥作用。 实现这一目标需要稳健、高效且安全的基因递送和编辑工具。在病毒载体方面，狒狒内源性逆转录病毒（BaEV）包膜假型化慢病毒载体取得重要进展；与常规VSV-G假型化相比，该载体可显著提高原代及扩增NK细胞的转导效率。我们的一项I期研究使用BaEV假型化慢病毒载体制备UCB来源的CD19 CAR-NK细胞，患者为复发/难治性大B细胞淋巴瘤，研究结果显示安全性良好并有临床活性证据，进一步支持了该方法的可行性。非病毒技术也拓展了工程工具箱：脂质纳米颗粒介导的mRNA递送可实现高效、非整合的短暂表达，降低插入突变风险并支持快速迭代构建体；piggyBac和Sleeping Beauty等转座子系统则提供非病毒的稳定基因组整合途径，可能更利于规模化生产。此外，CRISPR-Cas9基因编辑通常采用电转递送Cas9与向导RNA核糖核蛋白（RNP）复合物，可稳健实现基因敲除和编辑；与供体模板共同递送时，还可支持CAR的定点敲入。全基因组CRISPR-Cas9筛选则成为发现限制NK细胞细胞毒性和持久性遗传检查点的有力平台。这些无偏功能基因组学方法正加快多重工程策略的理性设计。近期，病毒样颗粒作为补充性短暂递送平台，可递送CAR mRNA，为工程化受体表达提供潜在更安全、更灵活的途径。总体而言，这些递送和编辑技术使NK细胞活性能够得到系统且精准的重编程，支持开发细胞毒性更强、持久性更佳的新一代产品，用于有效的过继免疫治疗。 细胞因子工程：增强存活和活化。 体内持久性是NK细胞疗效的前提。因此，主要工程任务是持续提供并优化存活信号，即有效启动“加速器”。IL-15是NK细胞稳态的主调节因子，也是最成熟的“武装”模块。临床经验证实，共表达IL-15或IL-15R融合蛋白的CAR-NK细胞持久性显著提高。 不过，单纯补充IL-15正在被更精细的策略取代。例如，共表达IL-15和趋化因子CCL21不仅可增强CAR-NK细胞存活，还能协同募集T细胞并重塑免疫微环境。针对实体瘤，新一代细胞因子构建体Neo IL-2/15有望增强生物能状态，通过c-Myc和NRF1相关程序支持持久功能。IL-21工程化则提供一种不同机制，可通过明确的转录调控（包括CEBPD依赖通路）增强抗肿瘤活性。细胞因子生物学还可用于制备过程：IL-15联合IL-18预处理可保护冻存NK细胞，减少与GZMB相关的凋亡通路，改善复苏后适应能力，进而提高持久性转化为临床活性的可能性。充分发挥细胞因子作用，还需要解除其可能触发的细胞内负反馈。IL-15可上调转录检查点CREM，抑制下游程序并与表观遗传重编程相关，提示增强IL-15信号时应同步破坏CREM。类似地，CISH及相关抑制因子会通过JAK-STAT轴降低细胞因子受体信号增益，并使细胞在持续暴露下偏向低反应状态。Nikolic等的研究还在这一制动体系中揭示了受体近端环节：涉及UBE2F和ARIH2的CUL5 RING连接酶通路可介导IL-15受体β链（IL-15Rβ）泛素依赖性降解，这是限制NK细胞IL-15R信号的主要机制。遗传性清除这些节点会增加细胞表面IL-15Rβ，放大IL-15信号，并增强天然和CAR介导的细胞毒性，为提高细胞因子反应性提供了可操作切入点，无需单纯加大细胞因子剂量。 总体而言，细胞因子中心的工程策略适合采用以调控为导向的框架：优化激活线索，同时调节反向制动机制，以更好维持效力和持久性（图6A）。 重塑NK细胞，使其适应TME。 TME中的营养缺乏、缺氧、酸中毒和乳酸等抑制性代谢物蓄积，会削弱NK细胞效力和持久性。人类NK细胞泛癌单细胞图谱进一步明确，TaNK细胞并非只是数量减少，而是常累积为功能受损状态，并与不良临床结局及免疫治疗耐药相关。TGF-β信号被广泛认为会限制TME中的NK细胞扩增和效应功能。多项研究已尝试从受体层面抑制TGF-β信号，包括工程化UCB-NK细胞表达显性负性TGF-β受体II（dnTGFBR2），以在富含TGF-β的环境中维持杀伤能力。有研究报告，TGFBR2基因编辑异基因NK细胞可预防胶质母细胞瘤干细胞诱导的NK细胞功能障碍，并在高度抑制性的脑肿瘤生态位内改善体内肿瘤控制。近期研究显示，CRISPR介导的SMAD4破坏可使人NK细胞更耐受TGF-β和Activin A抑制，同时保留细胞毒性、细胞因子产生及IL-2或IL-15驱动的增殖。Kumar等进一步将经典TGF-β-SMAD2/3信号与BATF驱动的NK细胞表观遗传重编程和耗竭相关基因程序联系起来，并显示靶向αvβ整合素-TGF-β-SMAD轴或删除BATF可预防或逆转该功能障碍状态。靶向这些下游信号节点的一个主要优点，是可交叉抵御多种相关抑制性配体，这对实体瘤中复杂且相互冗余的抑制网络尤为重要。 HLA-E-NKG2A轴是较为聚焦NK细胞的检查点通路。在多种实体瘤中，高水平HLA-E可结合KLRC1编码的NKG2A，传递抑制信号并破坏免疫突触，限制细胞杀伤。敲除KLRC1可克服HLA-E介导的抑制，改善NK细胞对HLA-E阳性实体瘤的抗肿瘤活性。Sætersmoen及其同事开发了NKG2A/C转换受体，可将其与富含HLA-E的肿瘤结合转化为激活信号，从而抵消NKG2A/HLA-E检查点抑制；这一模块还可与其他工程化特异性组合，并显示出令人鼓舞的安全性信号。在实体瘤中，免疫抑制往往由多种因素共同造成，这种信号重接策略具有潜在价值，因为它将富集于TME中的抑制性配体结合转化为局部受限的激活输入。从概念上看，这与CAR-T细胞中临床验证的转换受体设计相似，例如PD-1/CD28嵌合受体将检查点结合转向共刺激，而非抑制。除受体层面的检查点外，细胞内调控因子也会限制TME中的NK细胞活性（图2）。实体瘤的代谢特征，尤其是乳酸蓄积和细胞外酸中毒，已被证实可抑制NK细胞细胞毒性和细胞因子分泌。GPR132被认为是乳酸相关抑制的检查点样介质；遗传或功能性削弱GPR132可部分恢复NK细胞活性并改善CAR-NK抗肿瘤效力，提示其可作为可工程化的代谢制动因子。与此同时，TIPE2是NK细胞抗肿瘤免疫的细胞内负调控因子；TIPE2缺失可增强小鼠和人NK细胞的效应程序，并提升过继输注NK细胞的治疗表现。总体而言，靶向GPR132和TIPE2体现了内在工程策略，可在代谢抑制性肿瘤环境中增强NK细胞效力和持久性，同时不改变抗原特异性。 无偏功能获得（GOF）筛选已成为发现过表达后可主动增强NK细胞效力基因的有力策略。Yang等开展了一项具有里程碑意义的体内CRISPR激活筛选，在原代人CAR-NK细胞中鉴定出GPCR OR7A10这一重要“增强因子”。过表达OR7A10的CAR-NK细胞增殖和细胞毒性增强，代谢适应能力改善，表现为线粒体质量及耗氧率升高。关键的是，这一工程改造增强了细胞对TME中多种免疫抑制线索的抵抗力，包括TGF-β、腺苷、缺氧和营养缺乏，并转化为实体瘤模型中显著的体内疗效。近期，Kim等鉴定出可感知代谢物的GPCR（如GPR183），其通过感知肿瘤来源的氧固醇，将NK细胞和T细胞引导至实体瘤。异位表达GPR183可增强NK、CAR-NK和CAR-T细胞在异种移植模型中的肿瘤浸润和控制能力，并在免疫功能完整的乳腺癌模型中达到70%的CR率。 低免疫原性工程，促进现货型细胞持久存留。 异基因NK细胞的持久性受宿主免疫排斥限制。生成低免疫原性NK细胞的一种常见方法是破坏经典HLA I类抗原呈递（例如敲除B2M），以减弱宿主异体反应性T细胞识别。然而，HLA I类分子丢失会增加宿主NK细胞通过“缺失自身”机制监视和清除移植物的风险，因此需要组合设计：强制表达HLA-E或HLA-G可恢复对宿主NK细胞的抑制性作用，在逃避宿主T细胞与抵御宿主NK细胞排斥之间取得平衡。主动“免疫防御”工程也被用于保护异基因NK产品免受宿主排斥，使其能够选择性清除已活化的异体反应性淋巴细胞。一种方法是在治疗细胞中加入免疫防御受体，识别4-1BB等活化标志；这些标志会在活化宿主T细胞和NK细胞上短暂上调，因而可定向清除排斥性细胞群，同时保留静息淋巴细胞并延长功能持久性。与这一思路相符，近期研究报告CD70靶向iPSC来源CAR-NK细胞既具有广泛抗肿瘤活性，也可有效清除异体反应性T细胞。理论上，还可评估TNFR超家族中的其他活化标志（如OX40/TNFRSF4）及相关共刺激节点，作为替代或补充性免疫防御靶点，选择性清除排斥性细胞群，支持异基因NK产品长期存留（图6B）。外在TME重塑 TME中的外在屏障常限制NK细胞疗法的效力：不利趋化因子梯度和异常血管限制迁移，致密ECM及基质结构阻碍浸润，而缺氧和腺苷能信号等抑制性可溶性/代谢线索会削弱活化和持久性。除对NK细胞进行内在工程改造外，还可通过不断扩展的药理学和生物学干预手段重塑TME，包括检查点阻断（尤其HLA-E-NKG2A轴）、细胞因子/趋化因子支持、血管正常化、腺苷通路抑制、基质/CAF靶向、ECM调节、微生物组调节，以及将这些线索集中递送至肿瘤部位的局部递送系统（图6C）。 检查点阻断抗体。 NKG2A阻断可增强肿瘤免疫，促进NK细胞和CD8⁺ T细胞效应功能，支持其作为双区室检查点的定位。此外，NKG2A可保护转移部位免受NK细胞作用，并促进循环相关情境下的免疫逃逸，进一步支持在易转移实体瘤中将NKG2A阻断与过继NK细胞治疗联合应用。TIGIT家族检查点也与实体瘤相关：在神经母细胞瘤中，整合分析鉴定NECTIN2-TIGIT为关键检查点，并显示联合阻断TIGIT和PD-L1可显著抑制体内肿瘤生长，提示TIGIT阻断可能揭示免疫抑制生态位中的NK细胞效应潜力。临床上，靶向NK细胞检查点的单药治疗获益并不一致。例如，KIR阻断剂lirilumab在早期AML试验中未显示有临床意义的效果；NKG2A靶向药物monalizumab在特定疾病和方案中显示出令人鼓舞的活性：与durvalumab联合用于III期非小细胞肺癌的COAST试验改善了结局，但与cetuximab联合治疗复发/转移性头颈部鳞癌的INTERLINK-1试验未改善OS。 细胞因子和趋化因子调节。 NK细胞进入肿瘤部位后可能迅速丧失核心效应功能；IL-15:IL-15Rα复合物可防止这一功能丢失并改善肿瘤控制，使肿瘤内NK细胞群保留较强细胞毒潜能。美国食品药品监督管理局已批准IL-15受体激动剂Anktiva（N-803）与卡介苗（BCG）联合治疗BCG无应答型膀胱癌，显示基于IL-15的免疫活化在人类中具有可行性。趋化因子策略旨在恢复能够募集NK细胞等细胞毒性淋巴细胞的梯度，常借助IFN程序、诱导CCL5/CXCL9/CXCL10，或病毒/溶瘤平台；总体而言，趋化因子不足是实体瘤免疫细胞浸润的已知障碍。 血管正常化。 异常肿瘤内皮和促血管生成信号会阻碍免疫细胞外渗，同时加重缺氧，构成抑制NK细胞浸润和功能的复合屏障。一项与NK细胞机制直接相关的研究显示，在髓系细胞背景下靶向VEGF-A可使血管正常化，增强NK细胞对化疗的反应；这一作用与内皮细胞释放chemerin相关，支持血管重塑可与趋化因子信号耦联并形成利于NK细胞进入的环境。血管正常化还可通过改善药物递送和免疫细胞浸润，与免疫检查点治疗协同。尽管许多研究聚焦T细胞，黏附分子表达、间质压力降低和灌注改善等原理也直接适用于NK细胞归巢。 细胞外基质和基质靶向。 富含胶原的致密ECM既可形成物理屏障，也可作为生化“检查点”；胶原诱导的信号会妨碍NK细胞和T细胞抗肿瘤活性。一项具有临床转化意义的基质靶向研究采用FAP靶向免疫疗法FAP-IL2v；该疗法与曲妥珠单抗联合后提高免疫生物标志物，并显著上调NK细胞标志NCR1，符合基质局部细胞因子递送可增强ADCC相关生物学的预期。 TME代谢重编程。 富含腺苷的TME状态会抑制NK细胞功能，因此双重阻断腺苷轴CD73和A2A受体具有治疗依据，尤其适用于联合免疫治疗。CD39/CD73通路的抗体阻断也已有研究验证，进一步支持这一代谢检查点具备转化可行性。除ATP转化为腺苷外，肿瘤细胞外cGAMP还可被ENPP1和CD73降解为免疫抑制性腺苷，揭示先天免疫感知（cGAS-STING）与代谢抑制之间的直接机制联系；药理学靶向ENPP1、CD73或A2AR可据此实现外在微环境重塑。 微生物组的影响。 新证据将肠道微生物组状态与NK细胞介导的肿瘤免疫联系起来。例如，高盐饮食可重塑肠道菌群并诱导强效肿瘤免疫，其特征包括PD-1下调和IFN-γ增强，并可与低强度抗PD-1治疗协同。共生菌B. uniformis来源的荚膜多糖可活化LAG3-NK轴，抑制结直肠癌并增强免疫治疗效果，提示微生物产物可调节NK细胞活化回路，为患者分层和联合方案设计提供思路。 水凝胶作为TME重塑的局部免疫生态位。 整合原位供氧和局部免疫调节剂储库的区域性水凝胶平台，可增强细胞毒性T细胞和NK细胞活性，体现了材料介导的TME重塑策略。另一项研究采用超软水凝胶实现高负载免疫细胞和精准肿瘤靶向；体内实验显示其降低肿瘤生长，生物发光成像支持肿瘤部位NK细胞活性增强，说明工程材料可作为具有时空控制能力的TME重塑工具。桥接分子：精准募集与靶向结合 NK细胞衔接器（NKCE）是经生物工程设计的“桥接分子”，采用双特异性或多特异性结构，同时结合肿瘤相关抗原和NK细胞激活性受体（最常见为CD16、NKG2D或NKp46），无需对效应细胞进行基因改造即可诱导类似CAR的抗原定向细胞毒作用。这为抗体疗法和细胞免疫建立了可编程桥梁，将NK细胞的先天细胞毒性转化为模块化、外部触发且具有肿瘤特异性的功能。 早期NKCE研发主要利用CD16，因为CD16是人NK细胞主要的激活性Fcγ受体，可将IgG结合转化为ITAM依赖信号并有效执行ADCC。若干同时结合CD16和不同肿瘤相关抗原的双特异性抗体形式，包括靶向CD19、CD20、CD30、CD33、CD133和EpCAM者，均在临床前模型中显示出令人鼓舞的抗肿瘤活性。基于CD16的先天免疫衔接器进入临床的代表是四价CD30×CD16A构建体AFM13；它通过CD16A募集NK细胞，在复发或难治性霍奇金淋巴瘤患者中耐受性尚可且有可测量的疾病控制。随后，设计思路从募集单一受体转向多功能结合，以增强信号稳健性和持久性。三特异性杀伤细胞衔接器（TriKE）通过引入IL-15，改善NK细胞存活、增殖和持久性。近期一项直接比较研究显示，与T细胞相比，NK细胞的肿瘤坏死因子转运和加工能力较低。该研究还通过系统开发和比较分析表明，可通过共同结合多个激活性受体并引入IL-2活性，理性优化NKCE，增强体内效力和持久性，为新一代多功能NKCE设计提供了依据。与这一方向一致，靶向CD123并同时结合NKp46和CD16A的三功能NKCE对原代AML原始细胞具有强效活性，可克服CD64介导的传统ADCC耐药，并仅在存在CD123阳性靶细胞时选择性诱导NK细胞活化；非人灵长类药效学和耐受性数据也支持其开发。当内源性NK细胞适应能力受限时，尤其在晚期恶性肿瘤患者中，将NKCE与外源输入的高功能NK细胞产品联合，可能增强治疗效力并提高反应一致性。一项I期试验将UCB来源NK细胞预先与AFM13复合后输注，随后继续给予AFM13；研究报告未出现CRS、神经毒性或GVHD，同时观察到较高缓解率以及供者NK细胞的可测量迁移和持久性。这些结果支持将NKCE作为精准募集和靶向结合平台的转化依据（图6D）。先进递送与联合治疗平台 区域递送：绕过解剖屏障。 静脉输注仍是免疫治疗的主要给药途径，但研究者正越来越多地探索其他给药策略。从递送工程角度看，核心目标是使治疗药物在适当时间和部位达到合适浓度，以最大化疗效并限制靶外暴露。区域递送旨在提高病灶局部生物利用度，并减轻解剖和生理屏障。例如，脑肿瘤可采用颅内和/或瘤内给药（包括切除腔内注射），绕过血脑屏障，获得高于全身给药的局部暴露。早期临床评估为颅内递送CAR-NK细胞提供了支持性安全证据，也为合理组合治疗创造了实践机会，例如将局部NK细胞给药与全身免疫检查点抑制和/或局部基因递送联合，以增强TME中的持久性、迁移和免疫刺激性重塑。 体内工程：直接在机体内编程免疫细胞。 体内CAR-T细胞策略将编码CAR的基因或转录本直接递送至体内，使内源性T细胞获得CAR表达，从而绕过体外制备的时间和成本瓶颈。目前主要有两种递送方式：（1）靶向脂质纳米颗粒（LNP）递送CAR mRNA，实现短暂且可调控的表达；（2）工程化病毒平台（如慢病毒载体），旨在提高转导效率并延长表达持久性。两类方法均已进入早期临床评估，支持体内工程模式的转化潜力。 相比之下，体内CAR-NK细胞仍处于较早的开发阶段。近期研究推进了“泛CAR”概念，即通过调节CAR编码RNA的全身递送，使工程化效应细胞群超越T细胞并纳入NK细胞。Wang等设计了环状RNA编码的CAR构建体，并将其装入免疫细胞趋向性LNP；全身给药可在体内生成多谱系CAR效应细胞，包括CAR-T、CAR-NK和CAR巨噬细胞。CAR-NK组分被视为协调先天与适应性效应模块的一部分，有助于肿瘤控制和TME重塑。与此一致，Yin等描述了一种免疫细胞趋向性LNP，可静脉递送CAR编码mRNA，短暂工程化包括NK细胞在内的多种免疫细胞谱系，覆盖脾脏、骨髓和外周血，并产生协同的多谱系抗肿瘤反应，适用于实体瘤研究。除RNA平台外，研究者也开发了用于体内生成CAR-NK细胞的工程化慢病毒载体。Andorko等描述INT2104，这是一种假型化慢病毒载体，带有靶向性减弱的病毒融合蛋白（Gen 2.1 Fusogen）和CD7靶向scFv；全身给药后可定向转导CD7⁺ T细胞和NK细胞。在临床前模型中，单次静脉给药即可生成具有功能的CAR20⁺ T细胞和NK细胞，并在人源化小鼠及食蟹猴中实现强效B细胞清除，支持该平台用于现货型、无需淋巴清除的体内CAR细胞生成。由此，体内CAR-NK生成并非孤立的终点，而是全身RNA递送的可扩展拓展，可增加效应细胞多样性，并通过互补的细胞毒作用和免疫协调机制帮助克服免疫抑制屏障。 新一代联合治疗平台。 联合治疗前沿正从简单共同给药转向理性设计的协同平台，使互补作用机制协同发挥。一项具有范式意义的策略是序贯联合纳米抗体CAR巨噬细胞和CAR-NK细胞；在胰腺癌模型中，该策略显示协同抗肿瘤活性。在这一先天免疫协作环路中，CAR巨噬细胞不仅直接攻击肿瘤，还可分泌CXCL9，在TME内强效募集并活化CAR-NK细胞。这体现了通过工程化多细胞先天免疫模块应对实体瘤的总体趋势。功能基因组学发现的新靶点（包括CRISPR筛选得到的MED12、CCNC和Calhm2等细胞内检查点）可作为药物干预节点。靶向这些通路的小分子抑制剂可全身给药，使肿瘤对NK细胞杀伤更敏感，或增强过继转移CAR-NK细胞的适应能力。类似地，补充NAD⁺前体（如烟酰胺核糖）并联合SIRT3激活剂（如厚朴酚）等代谢干预，可作为辅助疗法，抵消代谢恶劣TME中乳酸诱导的NK细胞功能障碍。这些平台化策略多数仍处于临床前阶段，体现了向整合式、机制驱动的联合设计发展的趋势，或可克服当前CAR-NK疗法面临的免疫抑制性屏障。图6 图6：增强NK细胞免疫治疗的多模式策略；通过协调细胞内在重编程、低免疫原性工程、肿瘤微环境（TME）重塑及NK细胞重定向，多模式策略可增强NK细胞持久性、细胞毒性和抵御免疫逃逸的能力；a 细胞内在工程：通过表达嵌合抗原受体（CAR）、工程化免疫检查点转换受体、细胞因子基因改造（如IL-15融合受体）及破坏细胞内抑制性调控因子，增强NK细胞功能；IL-12/15/18诱导的记忆样NK细胞等细胞因子预处理策略可进一步改善细胞持久性和效应活性；b 低免疫原性策略：通过靶向B2M破坏HLA-I表达、过表达非经典HLA分子HLA-E或HLA-G，以及利用4-1BB或CD70等活化依赖性标志选择性清除同种异体反应性T细胞，减少宿主免疫排斥；c 外在调节：通过检查点阻断、细胞因子递送及IL-15反式呈递模拟物（如Anktiva/N-803）、VEGF靶向血管正常化、腺苷通路等代谢调控、FAP靶向间质细胞清除、微生物组调节，以及水凝胶等生物材料平台，重塑抑制性TME并构建局部免疫支持性生态位；d 多特异性NK细胞衔接器可将NK细胞细胞毒作用重定向至靶细胞；双特异性杀伤细胞衔接器（BiKE）连接NK细胞激活性受体与靶抗原，三特异性杀伤细胞衔接器（TriKE）则加入IL-15等刺激性细胞因子，促进NK细胞扩增和持久性；本图由BioRender.com制作临床格局与未来方向 不断演进的临床格局。 过去十年，NK细胞疗法从实验室走向临床的速度显著加快。对ClinicalTrials.gov数据库截至2025年的综合分析显示，已登记的NK细胞干预试验超过400项，涵盖不同细胞来源、工程策略和疾病适应证。工程化NK细胞包括CAR-NK和TCR-NK细胞，分别涉及133项和4项试验（图7A）。大多数试验处于I期或I/II期早期阶段，共315项（图7B）。疾病适应证包括血液系统恶性肿瘤222项、实体瘤147项、自身免疫病19项，另有病毒感染、阿尔茨海默病和GVHD等研究（图7C）。这一分布凸显NK细胞疗法正拓展至肿瘤学之外。 NK细胞疗法的基础：从早期试验到记忆样平台。 NK细胞疗法的临床开发始于未经修饰、体外扩增的自体或异基因NK细胞。采用表达膜结合IL-21和4-1BBL的K562饲养细胞等扩增技术后，研究者可实现外周血或UCB来源NK细胞的数量级扩增，同时保留细胞毒功能，为标准化现货型异基因NK细胞产品奠定基础。一个重要进展是CIML NK细胞：短期暴露于IL-12/IL-15/IL-18可增强IFN-γ产生、持久性和抗白血病活性，效果优于常规NK细胞。在移植后复发情境中，Bednarski等采用供者来源记忆样NK细胞联合供者淋巴细胞输注治疗儿童和青年AML患者；输注细胞存留超过3个月，8例可评估患者中4例在第28天达到CR，1例患者获得超过2年的持久缓解。Berrien-Elliott等开展II期试验，在单倍型相合造血干细胞移植后向复发/难治性AML患者给予同一供者来源CIML NK细胞和IL-15超激动剂N-803；15例可评估患者中，87%在第+28天达到复合CR，供者来源CIML NK细胞存留超过2个月且效应功能增强。在随机II期研究（NCT02477787）中，Lee等在单倍型相合移植后向高危AML或骨髓增生异常综合征患者输注体外经IL-15和IL-21活化的供者NK细胞，显著降低了30个月疾病进展累积发生率，并伴随记忆样NK细胞和CD8⁺效应记忆T细胞扩增。 CIML NK细胞也已用于实体瘤。Shapiro等报告首项人体I期试验，在复发/难治性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中将CIML NK细胞与N-803联合应用，可伴或不伴CTLA-4抗体ipilimumab。该联合方案安全，10例患者中仅1例出现剂量限制性毒性；但加入ipilimumab后HLA不匹配供者NK细胞排斥加快，提示与CTLA-4阻断联合可能存在局限。 CAR-NK细胞的出现：范式转变。 CAR-NK细胞的出现使临床格局发生最具变革性的转变。Liu等于2020年报告、Marin等于2024年更新的脐带血来源CD19靶向CAR-NK细胞里程碑I/II期试验（NCT03056339），成为关键节点。对于复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者，这种现货型产品治疗第100天ORR为48.6%，1年OS率为68%，并显示出显著良好的安全性。该研究还确定了疗效的重要决定因素：来源于核红细胞（NRBC）含量较低（≤8 × 10⁷）且采集至冻存时间≤24小时的脐带血CAR-NK细胞，与更好的临床结局相关。多组学分析显示，来自这些“优质脐带血”的NK细胞富集效应相关基因，代谢适应能力更强；而来自次优脐带血的细胞则上调炎症、缺氧和细胞应激程序。该研究确立了供者选择和制备参数与基因改造本身同等重要。 此后，CAR-NK临床开发管线迅速扩展。我们团队首先在一项I期试验中证实，采用BaEV慢病毒载体生成的CAR-NK细胞具有安全性和疗效；该试验纳入8例复发/难治性大B细胞淋巴瘤患者，所用CD19特异性CAR-NK含4-1BB共刺激结构域（NCT05472558）。CAR-NK细胞每周给药一次、共三次，耐受性良好，未出现CRS、神经毒性或GVHD。第30天ORR为62.5%，其中50%达到CR，中位PFS为9.5个月。scRNA-seq显示，临床疗效与分化程度较低、增殖及免疫潜能较高的NK4亚群相关；耐药则与耗竭特征和MHC I类基因上调相关，提示可能存在异基因排斥。除CD19外，研究领域正快速拓展至多种抗原。在AML中，CD33靶向CAR-NK细胞正在评估；双靶向策略（如CD33/CLL1、CD33/FLT3）旨在降低抗原逃逸。多发性骨髓瘤（MM）中，研究者正在评估BCMA靶向CAR-NK产品，部分试验采用BCMA/GPRC5D双靶向以扩大肿瘤覆盖范围。Lin等开发了CD70靶向CAR-NK细胞（CAR27/IL-15），将CD70天然受体CD27的胞外结构域与信号内结构域融合，并共表达IL-15。在两组MM患者中，高危疾病类别（如t(4;14)易位、amp1q、del17p）CD70表达升高且与生存不良相关。BCMA丢失后CD70表达仍可保留，支持其用于BCMA靶向治疗后复发患者。临床前研究显示，CAR27/IL-15 NK细胞对CD70⁺ MM细胞具有强效细胞毒性，水平可与CAR-T细胞相当，并在BCMA敲除模型中保持有效。这些发现推动了CD70靶向CAR-NK细胞治疗CD70阳性MM的I/II期临床试验启动（NCT05092451）。 对血液系统恶性肿瘤CAR-NK试验登记情况的分析显示，靶点组合正在扩大：79项明确抗原的试验中，CD19出现于34项，反映出其作为淋巴系肿瘤靶点的重要性；同时，CD33、BCMA、CD70、CD123、NKG2D、CLL1、CD7、CD5、NY-ESO-1、CD22、CD20、CD33/CLL1、CD19/CD70、CD19/CD22及BCMA/GPRC5D等双特异性靶点，显示研究正拓展至髓系恶性肿瘤、T细胞恶性肿瘤和骨髓瘤（图7D）。图7 图7：NK细胞疗法临床试验的全球格局；a NK细胞疗法登记试验数量；b 按临床试验阶段划分的试验分布；c 试验适应证构成，包括血液系统恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫病及其他疾病（如病毒感染、阿尔茨海默病和GVHD）；d 血液系统恶性肿瘤CAR-NK试验中的靶抗原；e 实体瘤工程化NK细胞试验中的靶抗原不断演进的NK细胞平台及其临床转化 上述临床成功和局限不仅验证了NK细胞的治疗潜力，也揭示出需要改进的关键领域，直接推动NK细胞平台演进。2003—2026年的临床经验促使领域从简单的体外扩增转向复杂工程策略，以克服患者治疗过程中已发现的特定障碍。 UCB已成为经临床验证的异基因细胞来源，NCT03056339和NCT05472558等试验显示其可行性和疗效。临床研究也指出仍需优化。制备创新聚焦于增强UCB-NK功能：Gao等开发半开放/半封闭CliniMACS系统，CAR⁺比例达到61.7%–95.1%，纯度超过98%，显示稳健的质量体系能够支持可重复的临床级生产。冻存造成的损伤仍是一项关键挑战。Berjis等发现，以IL-15和IL-18预处理可挽救NK细胞，使其免于GZMB介导的凋亡，冻存复苏后回收率接近100%，且功能完全恢复。iPSC来源NK细胞代表平台演进的临床化阶段，可进行多重工程改造并同时应对多项障碍。目前，NCT05182073（用于MM的FT576）和NCT04245722（用于B细胞恶性肿瘤的FT596）等试验正在评估iPSC来源CAR-NK产品，其设计包括CAR靶向、高亲和力不可裂解CD16以及IL-15/IL-15受体融合蛋白。先进基因编辑与平台技术的融合，在iPSC来源双靶向CD19/BCMA CAR-NK产品QN-139b中得到鲜明体现。该产品源自克隆化iPSC主细胞库，采用多重改造应对临床观察到的障碍：（1）敲除B2M和CIITA，预防T细胞介导的异基因排斥；（2）敲入HLA-E和HLA-G，提供“别吃我”信号，避免宿主NK细胞清除；（3）引入IL-2受体融合蛋白（IL2RF），实现不依赖细胞因子的持久存留；（4）加入tEGFR安全开关；（5）表达CD19/BCMA双顺反子CAR，全面靶向B细胞。临床前研究证实其功能和基因组稳定性得以保留，且120天内未观察到肿瘤形成。 临床经验与先进基因编辑的融合正推动下一代创新。敲除IL-15信号负调节因子CISH，可增强代谢适应能力和持久性。针对NCT07072234（肾细胞癌）和NCT06930651（髓系恶性肿瘤）评估的TGFBR2敲除，可使NK细胞耐受TGF-β介导的抑制，这是实体瘤TME中已确定的一项主要障碍。敲除靶抗原（如CD7靶向CAR-NK细胞中的CD7）可防止自相残杀，使NK细胞能够有效治疗此前受自相残杀限制的T细胞恶性肿瘤。攻克实体瘤：下一个前沿 CAR-NK细胞已在血液系统恶性肿瘤中取得显著成功，实体瘤仍是严峻挑战。靶点选择必须应对显著的肿瘤异质性。我们的调查发现，实体瘤领域有39项指定靶点的工程化NK细胞试验。常见靶抗原包括NKG2D（8项试验）、TROP2（5项）、ROBO1（3项）、CD70（2项）、5T4（2项）、GD2（2项）、GPC3（2项）、间皮素（2项）、DLL3（2项）和PSMA（2项），另有多个单项靶点试验（如Claudin18.2、Claudin6、AXL、MUC1）（图7E）。在这些配体中，NKG2D配体尤具吸引力，因为它们可利用NK细胞内在的应激感知机制，适用于多种肿瘤类型。近期NKG2D CAR-NK细胞治疗晚期结直肠癌的I期试验和早期转化研究支持这一策略，显示安全性良好并有初步抗肿瘤活性，包括腹水减少、腹膜肿瘤细胞减少，以及1例肝转移患者获得完全代谢缓解。 NK细胞疗法在实体瘤中的效力受到三项主要障碍限制：肿瘤异质性、浸润所需的物理屏障，以及深度免疫抑制性TME。扩大靶点覆盖范围已成为应对抗原逃逸这一关键障碍的重要策略。双靶向CAR以及NKG2D型CAR可识别一组应激配体，而非单一抗原，因此可能通过靶向肿瘤恶性状态的基础通路，减轻针对单一谱系标志导致的抗原逃逸。此外，分泌IL-15或IL-12等细胞因子的“装甲化”CAR-NK细胞可重塑TME，募集并活化内源性免疫细胞，形成更有利的生态环境。除靶点异质性外，实体瘤TME构成重要物理屏障。应对策略包括区域给药，如直接向肿瘤或切除腔注射；相关试验包括NCT03383978（胶质母细胞瘤颅内注射HER2-CAR-NK-92）和NCT06321484（卵巢癌腹腔注射CIML-NK）。区域给药虽可绕过迁移障碍，仍可能无法覆盖播散性转移病灶。全身给药则要求NK细胞表达合适的归巢分子。一种有前景的工程策略是共表达CXCR1、CXCR2或CXCR4等趋化因子受体，增强肿瘤浸润。NCT06478459等将瘤内注射与全身CAR-NK细胞结合的试验，代表一种务实的混合策略。 越来越多证据支持区域性CAR-NK细胞递送的可行性和安全性。Li等报告首项人体I期剂量递增研究，经腹腔输注NKG2D CAR-NK细胞治疗9例既往接受大量治疗、伴腹膜转移的结直肠癌患者（NCT05213195）。该疗法耐受性良好，未发生剂量限制性毒性。3例患者达到疾病稳定（SD），疾病控制率为33.3%。值得注意的是，区域输注还引起全身免疫活化，CD38⁺HLA-DR⁺ CD8⁺ T细胞亚群扩增，具有高克隆性和细胞毒性。机制研究显示，这种“旁观者”T细胞活化由CAR-NK细胞分泌的IL-15和IFN-γ驱动；两者继而刺激单核细胞反式呈递IL-15，可能为PD-1阻断创造治疗窗口。近期，非小细胞肺癌（NSCLC）研究提供了基因改造NK细胞可迁移至实体瘤的重要证据。Villalona-Calero等在I期试验（NCT05334329）中发现，晚期NSCLC患者输注的sIL15_TRACK NK细胞在给药后7天仍可从肺肿瘤活检中检出。6例患者中有3例在第6周达到SD。这些数据首次证明，冻存现货型基因改造NK细胞能够迁移至实体瘤，并在输注后保持功能。 进入肿瘤后，NK细胞会遭遇限制其功能的微环境。增强代谢适应能力的工程策略（如敲除CISH以强烈活化IL-15信号）正用于克服这些障碍。TGF-β是主要免疫抑制分子，可抑制NK细胞效应程序并促进其转化为功能障碍性ILC1样状态。多项临床试验正通过基因工程应对这一问题，例如在CAR-NK细胞中敲除TGFBR2（NCT07072234、NCT06930651）。 Wang等报告的系统性硬化症（SSc）病例中，QN-139b表现出的组织穿透和重塑能力，对实体瘤免疫治疗具有重要启示。该产品可浸润受累皮肤、清除浸润淋巴细胞、逆转纤维化并恢复微血管结构。治疗前皮肤活检的组织病理学分析显示，胶原沉积致密且紊乱，并有明显血管周围炎性浸润；治疗3个月后，胶原沉积和炎性浸润显著减少，纤维化组织中常受损的汗腺结构也出现恢复迹象。该研究凸显工程化NK细胞克服实体瘤屏障的潜力。整合合理的联合治疗策略 CAR-NK疗法的临床转化日益依赖合理设计的联合方案，以克服TME带来的限制。免疫检查点抑制剂是目前研究最广泛的联合药物。Wang等开展队列扩展研究，在6例晚期转移性结直肠癌（CRC）患者中评估单用NKG2D CAR-NK细胞或联合抗PD-1抗体的疗效。联合方案耐受性良好，并显示初步临床获益：1例患者达到疾病稳定（SD），2例患者总生存期（OS）超过700天。值得注意的是，联合治疗患者外周血中的CAR转基因拷贝数明显较高，中位峰值为45,593，而单药组为1,001，提示PD-1阻断可能增强CAR-NK细胞在体内的持久性。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，记忆样细胞因子诱导型（CIML）NK细胞联合IL-15超激动剂N-803和ipilimumab具有良好安全性，并伴随早期NK细胞增殖增加；但HLA不匹配NK细胞持久性降低仍是重要限制。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，与单用帕博利珠单抗相比，自体SNK01联合帕博利珠单抗的2年生存率更高（58.3% vs. 16.7%）。放化疗联合方案也显示出临床前景。一项针对晚期胰腺癌一线治疗的首项Ib/II期试验采用异基因NK细胞联合吉西他滨/S-1，报告客观缓解率（ORR）为31.6%、疾病控制率为73.7%；单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定出与治疗反应相关的特定NK细胞和T细胞亚群。在一项针对复发/转移性鼻咽癌的I期试验中，扩增的自体NK细胞联合cetuximab使7例患者中的4例达到SD；接受两次NK细胞输注的3例患者中，疾病进展时间为12–19个月。靶向治疗和新型生物制剂为增强NK细胞活性提供了更多机会。双特异性CD30/CD16抗体AFM13联合细胞因子活化NK细胞，可对CD30⁺恶性肿瘤诱导类似CAR的反应。其他若干I/II期试验已证实安全性，并显示疗效信号：B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者接受异基因MG4101联合利妥昔单抗治疗后，ORR为55.6%，且安全性良好；在急性髓系白血病（AML）中，单倍型相合NK细胞输注后给予重组人IL-15（rhIL-15），与既往基于IL-2的研究相比，NK细胞扩增和缓解率更高，但皮下注射与细胞因子释放综合征（CRS）相关；复发性神经母细胞瘤患者接受抗GD2抗体hu14.18K322A联合化疗、细胞因子和单倍型相合NK细胞治疗后，缓解率为61.5%，其中4例为完全缓解（CR）。联合方案的最佳给药顺序、剂量及联合药物仍在研究中。目前临床数据虽有限但不断累积，仍需开展更大规模的随机试验，以确定这些合理设计的联合方案能否在不同肿瘤类型中带来持久缓解。超越肿瘤：CAR-NK细胞在非恶性疾病中的应用 2024—2025年发表的三项里程碑式临床试验，已明确证实CAR-NK细胞治疗非恶性疾病的潜力。这些研究表明，CAR-NK细胞疗法可使重症自身免疫病患者获得深度且持久的治疗反应；与自体CAR-T细胞疗法相比，其安全性特征更佳，同时具备现货型异基因产品的流程优势。CAR-NK细胞用于自身免疫病治疗还利用了异基因NK细胞短暂的生物学特性，使其能够迅速清除致病细胞群，促进健康免疫系统重建，发挥强效的免疫重置作用。 系统性红斑狼疮。 Gao等的研究是迄今针对CAR-NK细胞治疗系统性红斑狼疮（SLE）开展的规模最大、内容最全面的评估。18例难治性SLE患者在淋巴清除预处理后接受异基因CD19 CAR-NK细胞治疗。所有患者均有活动性疾病（SLEDAI-2K评分≥8），且多种既往治疗均失败，78%的患者既往接受过生物制剂治疗。安全性良好：仅1例患者（6%）发生1级CRS，未见神经毒性、移植物抗宿主病（GVHD）或剂量限制性毒性。相比之下，自体CAR-T治疗的CRS发生率为55.9%，免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）发生率为2.8%。研究未观察到低丙种球蛋白血症；6个月随访期间也未见治疗后重度感染，而自体CD19 CAR-T治疗的重度感染率为7.6%。疗效结果显著。中位随访11个月时，59%的患者达到DORIS缓解，76%达到低疾病活动状态（LLDAS）。所有患者均迅速改善，SLEDAI-2K评分显著下降；在治疗前有蛋白尿的患者中，80%完全缓解。所有患者均停用了免疫抑制剂，并成功减量糖皮质激素。机制研究显示，尽管CAR-NK细胞仅短暂存留（≤14天），89%的患者仍实现深度B细胞清除。重建的B细胞以初始B细胞为主，记忆B细胞和浆母细胞显著减少。B细胞受体（BCR）深度测序显示，71%的患者出现类别转换逆转和多克隆受体库扩增，这是免疫重置的特征。Fu等采用IL-15装甲化CD19 CAR-NK细胞治疗3例患者，得到了相符结果：治疗后B细胞完全清除，随后以初始B细胞为主完成重建；所有患者均达到SRI-4反应，2例患者成功停用糖皮质激素，进一步支持了这一疗法的治疗潜力。 系统性硬化症。 Wang等的研究首次将诱导多能干细胞（iPSC）来源CAR-NK细胞疗法用于自身免疫病。一名36岁患者有20年弥漫性皮肤型系统性硬化症（dsSSc）病史，并伴有间质性肺病和心肌纤维化，接受了CD19/BCMA CAR-NK细胞治疗。治疗后，患者多个器官系统均迅速、协调地改善。采用改良Rodnan皮肤评分（mRSS）评估的皮肤纤维化逐渐消退，超声检查证实皮肤弹性改善。甲襞毛细血管镜检查显示，出血性梗死减少并出现新生血管，提供了血管修复的客观证据。高分辨率CT显示肺部阴影和纤维化改善；心脏MRI显示心肌纤维化接近消退，晚期钆增强比例由1.2%降至0.5%。 免疫监测显示，B细胞被完全清除后以初始B细胞为主重建；至第3个月，转换型记忆B细胞几乎消失。抗Scl-70、抗SSA/Ro52自身抗体显著下降，显著升高的IgE恢复正常，提示浆细胞得到有效清除。单细胞RNA测序（scRNA-seq）证实免疫细胞发生动态变化，符合免疫重置特征。组织病理学和空间蛋白质组学分析确认了组织水平的重塑，表现为炎症消退和修复通路激活。 自身免疫病领域的更广泛意义。 这三项研究共同表明，CAR-NK细胞疗法可使重症自身免疫病患者实现免疫重置。与依赖长期持久性的CAR-T细胞不同，CAR-NK细胞通过强效但短暂的细胞毒作用产生疗效，随后由再生性淋巴生成过程重建多克隆且自身耐受的初始B细胞受体库。这一机制具有多项潜在优势：（1）无需维持长期B细胞缺失，可降低感染风险；（2）保留先天免疫功能，NK细胞仍具有功能性病原体识别受体，如NKG2D和CD16，可维持抗病毒防御；（3）避免长期清除B细胞，保护性抗体反应得以维持，IgG水平保持在>5 g/L，抗CMV/EBV IgG滴度稳定；（4）细胞短暂存留可降低迟发毒性风险，例如长期血细胞减少或继发性恶性肿瘤。异基因CAR-NK细胞的现货型特征，有助于克服自体CAR-T细胞治疗成本高、制备延迟和生产失败等普及障碍。其安全性良好，在22例患者中仅发生1例1级CRS（发生率4.5%）；这对伴有器官功能障碍的自身免疫病患者尤其重要。 感染性疾病。 在HIV感染中，靶向gp120的CAR-NK细胞在临床前模型中显示出前景，即使存在病毒逃逸突变，也能识别并清除HIV感染细胞。治疗面临的挑战是如何接触潜伏病毒库：这些病毒转录沉默，免疫效应细胞无法识别。将CAR-NK细胞与潜伏逆转剂联合，可能形成“激活并清除”策略，以清除病毒库。在COVID-19方面，NCT04324996等试验评估了NKG2D-ACE2 CAR-NK细胞，同时靶向病毒刺突蛋白及感染细胞上的应激配体；随着疫情迅速演变和疫苗出现，研究重点已转向其他方向。 纤维化与衰老。 CAR-NK细胞应用的一个前沿方向是年龄相关疾病和纤维化。近年来，靶向细胞衰老和纤维化的衰老细胞清除型CAR-T疗法取得进展，为该领域开发CAR-NK疗法提供了概念基础。研究发现，尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）在衰老细胞上广泛上调，因而成为衰老细胞清除疗法的潜在细胞表面靶点。早期研究显示，靶向uPAR的CAR-T细胞具有强效衰老细胞清除活性，且未引起严重CRS；在化学诱导的肝纤维化和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型中，该疗法可清除衰老细胞、逆转肝纤维化，并改善年龄相关代谢紊乱和身体功能。后续研究证实，在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）中，uPAR表达于衰老的肝星状细胞，其表达随疾病进展而变化。近期，mRNA-LNP技术进展使体内生成uPAR CAR-T细胞成为可能；心磷脂模拟脂质纳米颗粒可缓解uPAR相关肝纤维化和类风湿关节炎（RA），同时简化制备并实现短暂表达。由于衰老细胞通过上调NKG2D配体（NKG2DL）逃避免疫系统内源性NK细胞清除，研究者开发了NKG2D-CAR-T细胞，并在自然衰老小鼠和非人灵长类动物中验证其疗效，未见严重不良反应。这些CAR-T细胞减轻了多种衰老相关病理改变，并改善辐射处理小鼠和自然衰老小鼠的身体机能。在CAR-T研究成果基础上，CAR-NK细胞具有衰老细胞清除应用的独特优势。经大量CAR-T研究验证的uPAR和NKG2DL等共同靶点，可能适用于CAR-NK设计。NKG2D型CAR-NK细胞尤其具有吸引力：它们利用NK细胞对压力配体的内在识别能力，可能兼具短暂存留、较低细胞因子毒性以及CAR依赖和非依赖性细胞毒作用，从而为老年人群提供潜在更安全的衰老细胞清除策略。 不过，衰老细胞具有显著异质性，难以找到普遍共享的表面抗原，因此有必要探索GPNMB和CD153等替代靶点；它们在疫苗策略中分别显示出清除衰老血管内皮细胞和衰老T细胞的潜力。尽管CAR-NK衰老细胞清除疗法仍处于临床前阶段，对衰老相关疾病的认识正在迅速加深，研究范围从纤维化延伸至神经退行性疾病，为未来临床转化提供了有力的概念基础。在此背景下，CAR-NK细胞有望成为更安全、用途更广的衰老细胞清除药物；这一设想仍需进一步研究。未来方向：临床视角 优化剂量与给药方案。 NK细胞疗法的最佳剂量、给药方案和治疗周期数尚未明确。Gao等的研究显示，输注间隔可由每7天一次调整为每3天一次，且不影响安全性；这提高了治疗可及性，并可能增强疗效。Wang等的研究显示，单个治疗周期（10天内输注4次）可使一名系统性硬化症患者获得至少持续6个月的治疗反应。对于实体瘤，分次给药或重复治疗可能尤其有价值，因为持续存在的NK细胞有助于克服TME的物理屏障和免疫抑制作用。仍需针对不同适应证开展系统剂量探索研究，以确立循证给药指南。 优化淋巴清除预处理。 氟达拉滨/环磷酰胺预处理仍限制NK细胞疗法的广泛应用，对伴自身免疫病或实体瘤的老年及体弱患者尤为突出。当前预处理方案可为过继输入的细胞提供增殖空间，并清除免疫抑制细胞群，但也带来骨髓抑制和感染风险。新兴低免疫原性工程策略有望降低预处理强度：通过被动免疫逃逸和主动清除机制，使异基因NK细胞抵抗宿主免疫排斥。工程化细胞可逃避T细胞识别，同时避免因“缺失自身”而遭宿主NK细胞清除，并可选择性清除活化的同种异体反应性淋巴细胞；这些策略有望在减少对强效淋巴清除依赖的同时，延长异基因NK细胞存留时间。仍需前瞻性试验确定这些策略能否在降低毒性的情况下达到非劣效疗效。 明确最佳持久性。 NK细胞持久性与治疗效果的关系取决于具体情境。在血液系统恶性肿瘤中，缓解患者的NK细胞长期存留（最长可达12个月）与持久缓解相关。在自身免疫病中，短暂存留（≤14天）已足以实现深度B细胞清除和持久免疫重置。这表明，持久性并非越长越好，最佳存留时间因适应证而异。对于实体瘤，NK细胞需要发挥作用的时长仍不明确，可能取决于肿瘤类型、疾病负荷和TME特征。 识别预测性生物标志物。 随着NK细胞疗法进入更早治疗线次，患者选择将至关重要。肿瘤内在标志物（抗原表达密度、突变特征、MHC I类状态）、免疫相关标志物（基线NK细胞功能、Treg和MDSC水平、炎症细胞因子）以及产品特异性标志物（供者特征、制备参数、CAR-NK细胞亚群）均可用于患者筛选和治疗个体化。Marin等提出的“优质脐带血”标准，包括低核红细胞（NRBC）含量和较短的采集至冻存时间，是将产品特征与临床结局关联起来的重要进展。Lei等鉴定的NK4亚群也表明，NK细胞分化状态会影响治疗效果。对这些及其他生物标志物进行前瞻性验证，是实现精准细胞疗法潜力的关键。 拓展肿瘤学之外的应用。 CAR-NK细胞在自身免疫病中的突出疗效，包括在SLE中实现免疫重置、在系统性硬化症（SSc）中促进组织重塑，为其拓展至肿瘤学之外的应用打开了空间。特发性肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化等纤维化疾病，阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病，以及由细胞衰老驱动的年龄相关疾病，均是新兴研究方向。靶向uPAR或NKG2D配体的“衰老细胞清除型”CAR-NK细胞，可能针对衰老的基础生物学机制，清除导致多个器官系统炎症和功能障碍的衰老细胞。尽管这些应用仍处于临床前阶段，却展示了NK细胞平台的广泛适用性及其应对多种人类疾病的潜力。结语 NK细胞从最初被发现的“杀伤性淋巴细胞”发展为免疫治疗的重要支柱，体现了转化免疫学的发展历程。过去50余年间，人们对NK细胞的认识从简单的先天免疫效应细胞，逐步扩展至复杂、多样且具有可塑性的淋巴细胞：NK细胞连接先天免疫与适应性免疫，参与组织稳态调控，并监视多种细胞应激。如今，该领域正处于转折点，研究重点开始从理解NK细胞生物学转向系统性地重编程NK细胞以实现治疗获益。 本综述提出的核心范式是系统层面的工程化。下一代NK细胞疗法不会仅由单一基因改造定义，而将通过协同优化多个相互关联的网络实现：增强激活信号、解除细胞内抑制机制、重编程代谢以耐受不利环境，并赋予细胞“隐形”特征以逃避宿主排斥。这种控制论视角将NK细胞视为整合系统，而非彼此独立的靶点集合，代表着相较于过去十年还原论策略的一项根本转变。 有几项相互汇聚的主题值得关注。 第一，NK细胞的表观遗传和转录图谱已成为其生理适应和病理功能障碍的重要决定因素。TaNK具有不同的转录特征，慢性刺激会造成持久的表观遗传损伤；这些发现提示，工程策略需要预防或逆转此类功能异常。靶向BATF、SMAD4或CREM等主调控因子，可能比针对单个表面检查点带来更广泛且持久的获益。 第二，TME构成多重屏障，需要相应的综合应对策略。代谢压力，包括乳酸积聚、葡萄糖缺乏和腺苷信号，可显著损害NK细胞功能；这些认识拓展了干预方向，包括靶向GPR132和补充NAD⁺前体。新兴的“代谢检查点”抑制剂可补充传统免疫检查点阻断（ICB），为恢复TME中NK细胞的适应能力提供另一类策略。 第三，NK细胞疗法向肿瘤学以外拓展可能是最具变革性的前沿。CD19 CAR-NK细胞在SLE和SSc中的突出疗效表明，免疫重置原则可广泛适用于自身免疫病，即短暂清除淋巴细胞群后，再通过再生过程恢复多克隆免疫细胞。异基因CAR-NK细胞具有良好的安全性、不发生GVHD以及现货型可及性，有望成为RA至多发性硬化症等疾病的变革性疗法。该策略进一步扩展至纤维化疾病和年龄相关病理状态，靶向uPAR或NKG2DL清除衰老细胞，可进一步拓宽治疗前景。 第四，发现平台与工程工具的融合正以前所未有的速度推动创新。针对原代人NK细胞开展的全基因组CRISPR筛选，已发现MED12、CCNC和ARIH2等新调控因子；调节这些因子可在具有临床相关性的条件下增强效力。将这些发现应用于多重基因编辑的iPSC来源NK细胞产品，构成从实验室发现走向临床应用的合理路径。随着人工智能开始参与蛋白质设计和CAR结构设计，迭代速度还将加快。展望未来，仍有若干挑战。实体瘤TME仍可抵抗最先进的工程策略，需要将增强迁移、代谢韧性和免疫抑制耐受结合起来。NK细胞的最佳存留时间因适应证而异，在血液系统恶性肿瘤中可达数月，在自身免疫病中仅需数日；如何实现这种情境依赖的持久性调控仍待解决。整合安全开关、逻辑门控回路和多抗原靶向，对平衡效力与精准性至关重要。 更核心的问题是细胞状态：哪一类NK细胞亚群——NK1、NK2、NK3或工程化杂合亚群——最适合不同治疗用途？如何避免NK细胞转变为ILC1样或促血管生成表型，从而偏离治疗目标？未来需要将单细胞多组学与功能研究持续整合，并根据临床试验反馈迭代推进。展望未来十年，发展方向已逐渐清晰：设计、构建和应用高精度工程化NK细胞的工具已触手可及；其在血液系统恶性肿瘤中的临床验证已经建立，在自身免疫病中的概念验证具有变革意义，实体瘤领域也正积极推进。取得成功需要基础免疫学家、合成生物学家和临床研究者持续合作，并将NK细胞视为复杂且适应性强的系统，而非简单效应细胞。NK细胞从实验室走向临床并继续发展的历程仍在延续。 声明：尽管本公众号译者对本文进行了二轮审校，以尽力确保内容的准确和完整，但仍然可能存在翻译或理解的不当，请读者以原文为准。如有翻译不当处，您可在公众号对话框中发送反馈，译者会尽快校对并予以回复。尽管竭力避免，但论文翻译可能引入生成式AI的幻觉问题，指导临床实践的内容须以原文为准。 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Next-generation natural killer cell therapy: bench to bedside and beyond. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2026;11:451. https://doi.org/10.1038/s41392-026-02911-1 文献原文：Next-generation natural killer cell therapy bench to bedside and beyond.pdf