Inotuzumab

-01- 引言 在抗体药物偶联物这个被誉为“生物导弹”的精密武器中，连接子扮演着至关重要的角色。它如同一条智能锁链，一端锁住精准导航的抗体，另一端连接着威力巨大的“弹头”（细胞毒性药物）。这条锁链的设计精妙与否，直接决定了ADC是成为精准打击肿瘤的利器，还是误伤友军的失控武器。今天，我们就来深入探索这个决定ADC成败的核心组件——连接子。 -02- 一、连接子的核心使命 ADC连接子的设计，本质上是在两个相互矛盾的目标之间寻求一个完美的平衡点。一方面，它必须在血液循环系统中表现出极高的稳定性，像一条坚不可摧的铁链，确保毒性药物在到达肿瘤靶点之前绝不会提前脱落。这是因为，一旦药物在血液中过早释放，就会对正常组织造成严重的脱靶毒性，这与ADC靶向治疗的初衷背道而驰。例如，首个上市的ADC药物Mylotarg，其采用的酸催化降解连接子就无法实现很高的治疗窗，因为化学反应没有绝对的界限，导致在系统中仍会释放出较多的毒素分子。 另一方面，当ADC通过抗体部分成功结合肿瘤细胞表面抗原，并被细胞内吞进入溶酶体后，这条锁链又必须能像被设定好程序的智能锁一样，迅速、高效地断开，释放出活性药物，让其发挥杀伤作用。这个释放过程是ADC发挥药效的关键一步，连接子必须对肿瘤细胞内的特定环境（如特定的酶、酸性pH值或高浓度的还原性物质）高度敏感。 -03- 二、连接子的两大技术阵营 为了实现上述的平衡，科学家们开发出了两大类连接子：可裂解连接子和不可裂解连接子，它们各有其独特的作用机制和优缺点。 可裂解连接子 可裂解连接子是目前应用最广泛的一类，它们能够感知肿瘤细胞内部或肿瘤微环境与正常组织的差异，并据此触发药物释放。常见的可裂解连接子主要分为以下几种： 蛋白酶敏感型连接子：这是目前最成功的策略之一。科学家们发现，肿瘤细胞中的蛋白酶活性显著高于正常组织，其主要作用是降解微环境基质，帮助肿瘤细胞突破组织屏障促进侵袭和转移。基于这一发现，BMS的科学家最早针对溶酶体中高表达的组织蛋白酶B进行了系统研究，并引入了PABC（对氨基苄氧羰基）自降解片段，最终设计出了经典的Val-Cit（缬氨酸-瓜氨酸）二肽连接子。当ADC被内化进入溶酶体后，组织蛋白酶B会识别并切断Val-Cit肽链，随后PABC片段发生自发消除，最终释放出纯净的、不含任何连接子残留的活性药物。这一设计被Seagen公司用于其明星药物Adcetris（brentuximab vedotin），取得了巨大成功，目前已有4款上市ADC使用了vc-PABC-MMAE组合。 酸敏感型（pH敏感型）连接子：这类连接子利用了溶酶体（pH≈4.8）和血液（pH≈7.4）之间的pH差异。它们通常包含一个腙键，在血液的中性环境下非常稳定，但进入溶酶体的酸性环境后，腙键会迅速水解断裂，从而释放药物。Mylotarg和Inotuzumab ozogamicin等ADC就采用了这类连接子。 谷胱甘肽敏感型（还原敏感型）连接子：这类连接子利用了细胞内（胞质）高浓度还原性谷胱甘肽（GSH）与细胞外氧化环境的差异。它们通常包含一个二硫键，在血液中保持稳定，但当进入细胞质后，会被高浓度的GSH还原断裂，释放药物。 2. 不可裂解连接子 不可裂解连接子在肿瘤细胞内不主动断裂，药物需依赖抗体的代谢（如溶酶体降解抗体为氨基酸）才能释放，最终产物是“药物-氨基酸代谢物”复合物。这类连接子的核心优势是循环稳定性极高，但依赖抗体在溶酶体中被完全降解，因此释放效率可能受限于抗体代谢速率。 最常用的不可裂解连接子是硫醚键，通过巯基（-SH）与马来酰亚胺（maleimide）或卤乙酰胺（haloacetamide）基团反应形成。例如：N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC），用于Kadcyla（曲妥珠单抗-emtansine, T-DM1）——首个获批的HER2靶向ADC。 Kadcyla的连接子SMCC将DM1（美登素衍生物）偶联至曲妥珠单抗的赖氨酸残基。由于不可裂解，DM1需等待抗体被溶酶体降解为氨基酸后释放，因此脱靶毒性较低，但疗效依赖于抗体在肿瘤内的充分内化与降解。 -04- 三、连接子对ADC药代动力学与治疗窗口的影响 连接子的选择直接影响ADC的药代动力学（PK）和治疗窗口。通过对比不同连接子的ADC（如同一载荷不同连接子、同抗体不同连接子），我们可以发现一些规律： 1. 不可裂解vs可裂解：耐受性与疗效的权衡 耐受性：对于美登素（maytansinoid）载荷，不可裂解连接子（如Kadcyla的SMCC）在动物模型中表现出更好的血液学耐受性；但对于奥瑞他汀（auristatin）载荷，可裂解连接子（如Adcetris的Val-Cit-PABC）经优化后仍可实现高耐受（如添加非裂解间隔臂可降低毒性）。 疗效：可裂解连接子因释放更直接（无需抗体降解），在部分模型中疗效更优；但不可裂解连接子因脱靶少，在抗原低表达肿瘤中可能更安全。 2. 连接子结构优化：提升治疗窗口的关键 自消除基团：如Val-Cit-PABC的PABC自消除可减少连接子残留，降低非特异性毒性； 电荷修饰：Doronina等发现，在药物与抗体间添加非裂解马来酰亚胺己酰基（MC）间隔臂，利用羧基负电荷阻止连接子-药物跨膜扩散，可将ADC的最大耐受剂量（MTD）提高3倍以上； 亲水性修饰：聚乙二醇（PEG）修饰连接子可增加ADC溶解度，减少网状内皮系统（MPS）清除，延长半衰期。 -05- 四、 新一代连接子技术 随着ADC研究的深入，新一代连接子技术正突破传统限制，解决低抗原表达肿瘤、耐药性、实体瘤渗透等难题： 1. 位点特异性偶联连接子 传统ADC通过随机偶联（赖氨酸/半胱氨酸）导致药物抗体比（DAR）不均一（如Kadcyla的DAR 0-8），影响疗效和安全性。新一代连接子结合位点特异性偶联技术（如HIOMAB、SMARTag、非天然氨基酸插入），实现DAR均一（如DAR=2或4），显著提升稳定性和PK特性。 THIOMAB-trastuzumab-DM1：通过工程化半胱氨酸定点偶联，DAR=2时疗效优于Kadcyla（DAR=3.5），且肝/骨髓毒性更低； SMARTag：利用甲酰甘氨酸（formylglycine）标签与HIPS连接子定点偶联，DAR均一且PK更优（半衰期更长，肿瘤摄取更高）。 2. 高载药量连接子 传统ADC载药量低（通常DAR≤4），限制了对低抗原表达肿瘤的杀伤。Mersana的Fleximer聚合物连接子（聚-1-羟甲基乙烯羟甲基甲醛，PHF）通过柔性聚合物骨架，可将DAR提升至15-20（如trastuzumab-Dolaflexin，DAR=15-20 dolastatin）。该连接子具高亲水性和可降解性，在JIMT-1（HER2低表达乳腺癌）模型中，疗效较Kadcyla高100倍以上。3. 耐药导向连接子 针对肿瘤细胞的药物外排泵（如P-gp、MDR1）和抗原丢失，新一代连接子通过增加亲水性（如PEG4Mal修饰DM1）或非裂解设计（如maleimidocaproyl间隔臂）降低药物外排，恢复耐药模型的疗效。例如，Kovtun等设计的PEG4Mal-DM1连接子，在MDR-1过表达肿瘤中疗效显著优于传统SMCC-DM1。 -06- 结语 从早期的不可裂解连接子（Kadcyla）到可裂解的酶敏感/酸敏感连接子（Adcetris），再到新一代位点特异性、高载药量、耐药导向连接子，连接子的创新始终是ADC发展的核心驱动力。其设计需综合考虑靶向抗原特性、载荷分子属性、肿瘤微环境及患者个体差异，在“稳定”与“释放”、“疗效”与“毒性”间寻求最优解。 未来，随着对肿瘤生物学（如溶酶体酶谱、代谢微环境）和连接子化学（如智能响应材料、动态共价化学）的深入理解，连接子将进一步进化为“可编程开关”，推动ADC从血液瘤向实体瘤、从单一载荷向多模态治疗（如免疫激活+毒素杀伤）跨越，为癌症治疗开启更精准、更安全的新篇章。 参考文献： 1.Antibody-Drug Conjugates Fundamentals, Drug Development, and Clinical Outcomes to Target Cancer (Kenneth J. Olivier Jr., Sara A. Hurvitz (eds.))  公众号已在知识星球建立“小药说药专业学习社群”，各种免疫学、肿瘤学、生物医药相关PPT免费下载，配合视频号短视频直播轻松学习，扫描下方二维码关注加入。

摘要：       随着抗体药物偶联物（ADC）从临床开发阶段进入关键研究阶段，在临床疗效和适当安全性的支持下，开发后期和商业化的工艺和方法成为当务之急。在早期流程的开发过程中，重点是速度、一致性和质量。对于后期开发，需要考虑其他方面，包括工艺稳健性、成本效益、工艺和方法可转移性，以及作为监管备案基础的综合控制策略。 【NO.1】研究背景       抗体药物偶联物（ADC）的后期开发可能由许多因素触发。在常规开发计划中，ADC将经历传统的临床开发阶段，包括1期和2期。随着药物达到概念验证，通常有理由在工艺和方法开发的规划和执行方面进行大量投资，以支持3期/关键研究，然后进行工艺验证、发布和商业化生产。随着2012年突破性疗法认定的推出，在医疗需求未得到满足的疾病领域表现出疗效的早期迹象的ADC有可能直接从1a/1b期进入关键试验。当然，在加速时间表下完成所有必要的开发工作需要在多个功能单元之间进行仔细规划和协调，因为ADC涉及两种原料药中间体（DSI）、接头/有效载荷和单克隆抗体（mAb）、一种原料药 （DS）、ADC和药品（DP）。此外，监管申报需要特别考虑，并且可能涉及多个不同的模块3部分，每个主要中间体一个，一个用于原料药，一个用于药品。无论哪种情况，无论是加速药物开发还是传统药物开发，都期望在监管文件中提交完整的化学、制造和控制（CMC）部分。       如今，大多数药物都是使用质量源于设计（QbD）方法开发的，旨在实现持续工艺验证（CPV）。QbD方法旨在推动对工艺和产品的深入理解。确定影响疗效和安全性的重要质量属性，并通过系统实验确定影响这些属性的工艺参数。一旦工艺在实验室规模上得到优化和建立，就会使用适当合格的缩小模型来确定制造工艺的作范围。这些研究通常涉及实验设计（DOE）和统计分析。在某些情况下，还可以确定所选参数的失效边缘。纯化步骤，例如层析和渗滤通常使用标准生物工艺方法进行优化。       扩大规模和技术转移带来了特殊的挑战和机遇。需要对反应动力学、添加速率和其他参数有透彻的了解，才能正确设计和作大型偶联反应容器。必须进行详细的工艺拟合评估，以确保现有设备满足工艺要求。在将购买新设备的情况下，需要首先决定是使用一次性设备还是专用、可重复使用或多产品设备。对于专用和多产品设备，清洁验证成为一个关键考虑因素。放大、设备变更和潜在的场地变更也需要为放大和优化的工艺建立可比性。随着商业过程的发展，需要制定包括规范在内的综合控制策略，以确保通过适当控制重要过程参数来实现既定的质量属性范围。此外，还需要一种综合的监管策略，将接头、有效载荷、mAb、ADC（DS）和药品的质量属性联系起来。 【NO.2】ADC的后期开发        ADC的后期开发，为关键临床试验、工艺验证、监管批准和商业化材料生产做准备，这带来了不同寻常的挑战组合。这些挑战来自几个来源： • ADC是连接大分子和小分子的多组分偶联物。根据所使用的化学成分，ADC可以是异质的，由一组密切相关的物种组成，或者当使用特定位点的技术时，具有更均匀的，每个mAb的有效载荷数量指定。 • 后期开发工作旨在了解和控制影响连接子载荷分布和ADC的其他重要属性。 • ADC的制造工艺步骤需要将生物制剂的水处理与小分子的溶剂处理相结合。这有时会导致意想不到的结果，尤其是在工艺针对更高浓度和放大进行优化时。 • 在开发和制造过程中，必须在适当的设施中处理剧毒材料。      ADC的生产涉及细胞毒性药物、反应性接头和抗体的组合。该抗体要么通过氨基酸具有内在反应性，要么经过修饰以使其具有反应性。由于抗体的多价性质，异质性可能是开发化学家需要监测的一个重要问题。根据所使用的偶联化学成分，偶联物可能从单一均相产物到相关偶联物的高度异质混合物不等。定义产品的偶联物分布由所选偶联化学决定，并在临床前和早期临床研究中确定。后期开发的挑战是优化商业流程，以保持产品质量属性并确保与早期临床阶段材料的可比性。这要求对工艺参数进行适当优化，以确保工艺始终如一地提供目标质量属性。      对于复杂和异质的ADC，了解工艺参数如何影响单个偶联位点的反应性可能是一个挑战。虽然位点特异性化学反应在很大程度上消除了异质性问题，但内源性半胱氨酸和赖氨酸化学反应导致偶联物对许多位点进行了修饰。工艺中可能包括色谱纯化以减少产品异质性，尽管这些混合物可能难以制备分离。传统的蛋白质纯化主要致力于去除宿主细胞蛋白、核酸、高分子量物质和工艺相关杂质，而小分子纯化则侧重于分离独特的所需物质并去除密切相关的非产物分子。另一方面，ADC纯化可能面临控制目标产物异质性的额外挑战。ADC中的异质性在很大程度上是来自不同药物/抗体比（DAR）的偶联物种的共存。DAR通常是一个关键的质量属性，会影响安全性、有效性和稳定性。因此，色谱的目标是将异质性控制在规定的范围内。另一方面，由于mAb和接头有效载荷都是纯化的中间体，因此上游杂质不存在很大程度，而反应副产物、残留物和降解物则比生物工艺的典型情况更受关注。      了解过程参数对质量属性影响的先决条件是建立对产品质量足够敏感的分析方法。在其他字段中没有直接平行的两个重要属性是共轭位点和DAR。针对不同填料的这些属性的分析将采用不同的形式。除了这些只能在偶联后存在和监测的质量属性之外，蛋白质或接头/有效载荷固有的一些质量属性可能在偶联物中被掩盖。偶联后，脱酰胺或偶联药物杂质等质量属性可能会发生变化，但又无法直接监测，因此需要制定全面的控制策略。控制策略包括了解起始材料的质量属性、偶联条件对原料药质量属性的影响（通过实验室模型系统获得）以及下游工艺中杂质的归宿和清除。成功的控制策略将证明，即使没有特异性释放测定，也能以科学合理的方式实现杂质控制。       开发ADC的最后一个挑战是药物种类的高毒性。ADC中使用的药物的 IC50值（最大抑制浓度的一半）通常在低nM至pM范围内，这种毒性超出了大多数化学家的经验范围。因此，实验室工作需要严格遵守暴露和污染的程序、工程和防护设备控制。这些控制措施也必须在生产领域实施，这一要求需要专门的设施。       本综述将在赖氨酸偶联ADC开发的背景下详细研究这些问题。 1. Inotuzumab Ozogamicin （InO）案例研究       InO是一种抗体-药物偶联物，由与抗生素卡利米星（ozogamicin）共价连接的人源化单克隆抗体（inotuzumab）组成. Inotuzu mAb选择性地结合存在于B淋巴细胞。Calicheamicin是一种有效的 enediyne细胞毒性剂，可导致DNA双链断裂，导致细胞死亡。InO与表达CD22的细胞结合，并在内化时释放卡利西霉素，从而引起细胞毒性。它目前处于急性淋巴细胞白血病（ALL）的3期临床试验中。InO被授予该适应症的突破性疗法认定。 图1.inotuzumab ozogamicin（InO）的结构     InO是使用常规赖氨酸偶联法生产的，其中琥珀酰亚胺基活化的 calicheamicin衍生物与inotuzumab上赖氨酸的ε-氨基反应形成共价键。InO的表示如图1所示。大约六个卡利希霉素衍生物分子与每个inotuzumab分子偶联。为InO开发稳健、可扩展和商业化的制造工艺的一个主要挑战是控制产品异质性，以确保与早期临床和毒理学材料的可比性。由于赖氨酸偶联化学的非位点特异性，InO是偶联物的异质混合物，具有不同负载的接头payloard（calicheamicin 衍生物）连接到inotuzumab 上的不同赖氨酸位点。然而，由于开发了优化的工艺条件，InO的药物负荷分布是可控且非常可重复的，并且偶联发生在优选的赖氨酸位点。在 mAb上的80多种赖氨酸中，超过90%的偶联发生在8-10个动力学优选的赖氨酸位点（抗体的每一半有4-5个）。因此，InO具有特征的负载分布和位置异构体分布。       为了确保这种概况在整个后期工艺开发中的一致性，采用了一种系统和基于风险的方法来进行开发研究。首先，筛选InO的质量属性，并确定与偶联物异质性相关的属性。这些与异质性相关的质量属性包括：  • 总载药量  • 药物载量分布  • 未偶联抗体  • 未偶联接头有效载荷  • 偶联赖氨酸的序列位置 图2. iCE的药物负荷分布      图2显示了通过成像毛细管等电聚焦（iCE）的InO药物负载分布示例。由于电荷差异，具有不同DAR的物质在电泳图中的迁移方式不同。       在为上述质量属性和目标规格建立了分析测试方法后，这些质量属性用于测量工艺表征研究中产生的偶联物的异质性。下一步是评估影响这些质量属性的流程步骤。制备InO原料药的过程包括四个主要步骤： （1）inotuzumab与活化的calicheamicin 衍生物的偶联; （2）使用疏水作用色谱（HIC）纯化粗偶联物; （3）使用超滤/渗滤进行缓冲液置换; （4）配制以制备最终配制的原料药。      多学科团队进行了初步风险评估，以确定可能影响InO原料药异质性的工艺参数。这些工艺参数包括： • 偶联反应：偶联pH值、时间、温度、药物起始量、助溶剂和表面活性剂起始量。 • HIC步骤：色谱柱激发、上样和洗脱缓冲液浓度和pH值以及馏分混合。 图3. iCE 的药物载量曲线比较       使用多变量DOE和单变量实验策略的组合来执行过程表征研究，以表征这些过程输入参数与质量属性之间的关系。结果表明，总载药量（DAR）和载药量分布主要受偶联反应中卡利希霉素输入和HIC纯化步骤中馏分混合的控制。对于偶联反应，增加calicheamcin起始量会导致DS具有更高的DAR，并且相应的药物负载分布向更高负载的物质转移，如iCE谱图（图3）和相应的LC-MS（图4）所示。在HIC纯化步骤之后，由于游离卡利霉素和游离抗体在HIC柱上的迁移率不同，因此从偶联物中去除了游离卡利霉素和游离抗体。 图4. 通过 LC-MS 比较药物载样量曲线       然后根据蛋白质浓度、药物载样量和聚集水平的标准合并收集的HIC馏分，进一步细化偶联物载样量及其分布，并确保在进入下一个工艺步骤之前满足所需的偶联物质量属性。然后根据原料药异质性的目标规格确定卡利霉素起始量和HIC馏分混合标准的可接受范围。随着实验结果和进一步的放大经验的获得，重新审视了风险评估并进行了临界性评估。卡利希霉素起始量和HIC馏分混合标准均被指定为关键过程。       后期工艺开发的另一个挑战是将偶联工艺从实验室规模放大到生产规模。与典型的生物过程不同，inotuzumab与活化的calicheamicin衍生物的偶联反应非常迅速。根据反应中剩余的未偶联mAb量判断，浓度为10 mg/mL mAb的偶联反应在2分钟内完成，如图5所示。快速反应动力学要求所有规模的反应混合物充分混合。此外，加成速率和加成方法也是快速动力学反应需要考虑的参数。 图5.未偶联InO的抗体量与反应时间关系       为了确定控制0.1至10L各种规模的反应器系统中混合效率的参数，使用盐加标实验确定了每个反应器的混合时间，其中在添加浓缩物时监测反应器内氯化钠溶液的电导率。混合时间数据表明，在具有可比搅拌设置的每个反应器中实现了一致的混合曲线。因此，实验室规模的反应器（0.1L）被认为是适合的偶联放大模型。此外，计算流体动力学模拟还用于表征各种尺度的混合。       接下来，使用实验室规模的反应器进行混合研究，以评估混合条件对偶联物质量属性的影响。混合条件包括搅拌速率、高于或低于表面添加法以及活化的卡利希霉素衍生物溶液的添加时间。实验表明，低搅拌速率和表面以上添加导致混合不良，这从不完全共轭中可以明显看出。另一方面，当 calicheamicin溶液加入表面下时，偶联定义添加速率，在中等规模（1L）下测试混合输入的可接受作范围，以确保工艺一致性和可扩展性。图6中的结果表明，中等规模运行的药物负荷曲线与从早期临床运行制备的参考标准品的载药量曲线相当。该工艺已进一步扩大到商业规模，产量和质量属性的比较表明，已建立的工艺对于商业规模生产是稳健且可扩展的，如图7所示。原则上，剪切依赖性聚集可能会限制高混合速率的使用，尽管在这种情况下没有观察到聚集作为混合的函数。 图6. iCE 的药物载量概况 图7. 不同尺度上的共轭属性比较 2. 技术转移至商业化生产       一旦确定了商业规模的工艺，就开始了该工艺向制造的技术转让。开发和制造团队之间的信息共享和技术讨论贯穿整个开发周期，但在工艺特性研究接近尾声时，技术转移文件才最终确定，为生产做准备。      下面将讨论工艺配合、生产设备和一次性系统、原料药中间体的供应、原材料注意事项以及细胞毒性材料的处理，因为它们与工艺向制造的转移有关。 3. 生产设备和生产工艺        ADC原料药生产的主要制造设备包括反应器和纯化系统。为每个制造过程选择合适的制造设备基于多种因素。本节介绍一次性系统、反应器、色谱分析设备、缓冲液置换设备以及随附的注意事项。 （1）一次性系统       ADC生产可能会大量使用一次性系统。多家供应商提供完全一次性的制造系统，包括色谱橇、色谱柱、切向流过滤橇和膜。一次性生物工艺容器经常用于产品转移、稀释和过滤。除了无需清洁和清洁验证的好处外，一次性系统还减少了工人接触细胞毒性药物的可能性。设计允许完全封闭的模块，使用后不必拆卸。如果一次性系统最大限度地减少了对受污染表面的处理，那么该过程将更加安全。为了通过最少的处理实现安全性改进，应注意确保模块之间的连接在使用期间和使用后无泄漏。 （2）反应器       在InO工艺中，选择玻璃反应器是因为其混合能力和放大性能。使用 ANSYS软件14.0通过计算流体动力学（CFD）仿真对反应器进行表征。CFD结果（图8）显示，在较短的混合时间内实现了充分的混合。这种混合曲线类似于在较小的开发反应器中观察到的混合曲线。此外，CFD仿真还用于评估多种设计，包括（1）单叶轮与双叶轮，（2）叶片角度（45、60 和 90°）和（3）叶片高度。在放大运行之前，进行了盐加标实验、添加速率和各种添加位置实验，以确认CFD模型。这些结果表明，可以在不使用特定反应器填充体积的变化和反应器设计的变化。在inotuzumab ozogamicin的案例中，规模的5倍变化需要评估混合动力学。 图8. 商业规模反应器的CFD模拟       虽然没有在混合性能方面与玻璃或不锈钢反应器相当的一次性反应器，但已经对混合袋和一次性生物反应器进行了评估，并在某些情况下用于生物偶联反应。使用ANSYS软件13.0对一次性生物反应器设计进行CFD仿真。结果表明，容器顶部发生缓慢混合，并形成微涡流（图9）。因此，这个一次性反应器细胞生长所需的设计限制了混合时间，并且可能无法为ADC偶联反应提供足够的混合，特别是对于具有快速动力学的反应。 图9. 一次性生物反应器的CFD模拟 （3）色谱法       疏水作用色谱（HIC）纯化在InO的生产中起着关键作用，可确保满足预定的关键质量属性。疏水层析与反相色谱类似，因为保留性是由疏水性驱动的。然而，疏水层析填料设计为与从强水性缓冲液（高达∼4M，弱溶剂）到水或弱缓冲液（∼20mM，强溶剂）的洗脱系列配合使用，对于蛋白质工作，通常不会扩展到有机溶剂/水混合物。由于与inotuzumab偶联的卡奇霉素赋予偶联物更大的疏水性，因此此步骤可有效去除产品中未偶联的抗体、聚集体、游离药物和赋形剂。由于此步骤包括馏分收集，因此ADC的药物负载也会受到影响，具体取决于馏分的合并方式。       对于InO，每个馏分都经过蛋白质浓度、药物/抗体比率和聚集体测试，并建立了确保仅合并那些产生符合规格的最终产品的馏分的标准。为了建立馏分混合标准，使用小规模模型进行的研究转化为生产规模非常重要。图10显示了典型的实验室规模色谱图。卡奇霉素偶联物的一个有用属性是存在310nm发色团。这导致偶联物在310nm处产生显著信号，而任何残留的未偶联抗体都没有310nm的吸收。粗偶联物与色谱柱初始结合后，用低磷酸盐浓度洗涤洗脱未偶联的抗体，然后用不含磷酸盐的缓冲溶液进行分步洗涤，洗脱产物。晚期洗脱馏分包含更多高度偶联的物质，根据它们对药物/抗体比值的影响，可能包括这些物质。 图10. 实验室规模的HIC色谱图       通过保持色谱柱高度恒定并增加与反应量成比例的横截面积，同时保持恒定的线速度，将色谱柱放大至生产规模。色谱步骤中的所有其他作和缓冲液保持不变。根据UV痕量规模、产量和产品质量属性之间的可比性，色谱步骤被证明是可扩展且稳定的。 （4）原料药的最终超滤/渗滤和过滤       超滤/渗滤（UF/DF）步骤的主要目的是调整浓度并用原料药缓冲液替换色谱缓冲液。UF/DF系统利用压力迫使小分子缓冲液组分和水通过半透膜，以浓缩溶液（工艺的UF相）并以恒定体积交换产品（DF相）。InO UF/DF工艺使用不锈钢撬块；然而，Recreserved容器是一种一次性袋系统，旨在在此过程中提供充分的混合。在生产秤袋上进行染料混合研究，以确认在此过程中没有未混合的区域。此外，染料实验用于确定回流和产液管线的最佳位置，因为回流和产水流用于增强混合。UF/DF作是直接从使用相同膜材料的实验室规模模型进行缩放的。       在每个工艺步骤后进行正常流动过滤，以降低颗粒物的水平。Vmax和Pmax研究在小规模下进行，以确定每个工艺步骤在生产规模上所需的过滤面积。在放大运行期间确定过滤面积的确认。由于这种过滤是在从一个一次性生物工艺容器（BPC）转移到另一个一次性BPC的过程中进行的，因此使用了一次性蠕动泵系统。 4. 原料药中间体的供应       对于ADC，有两种原料药中间体（DSI）：单克隆抗体（mAb），这是一种生物制剂，而接头/有效载荷，通常是一种小分子。对于ADC生产来说，这两种截然不同的中间体的供应规划至关重要，每种中间体都有其自身的挑战。制药行业mAb的生产已有30年的历史，可以追溯到1986年批准第一个获批的单克隆抗体OKT。从那时起，mAb的生产工艺得到了改进和优化，并且对这些工艺有深入的了解。然而，用作DSI的mAb在运往 ADC的过程中的重要属性可能与mAb作为原料药时的不同。此类属性的一个示例是aggregates级别;mAb DSI的阈值可能是可接受的，因为ADC工艺可以进一步去除聚集体。必须针对每个ADC评估mAb所需的属性。以DSI 形式生产的mAb的另一个区别是生产规模。ADC是强效药物，通常以低于治疗性抗体的剂量给药。因此，mAb DSI可能需要比治疗性mAb更小的设施和作规模，或者活动时间可能明显更短。       目前开发的大多数ADC的接头/有效载荷（L/P）是半合成或全合成小分子，因此具有与生物不同的监管要求。此外，相对于许多药物，有效载荷通常是一个复杂的分子，并且具有相应的具有挑战性的制造工艺。最后，L/P 通常包含细胞毒性药物，需要特殊的设施和处理。制造商必须能够处理高效活性药物成分（API）。       对于InO，活化的卡利霉素衍生物L/P是在专为专用设施设计的设施中制造的卡奇霉素（calicheamicin）的发酵、分离和合成修饰（参见下面的“细胞毒性材料的处理”）。图11显示了活性加利希霉素衍生物的生产步骤。 图11.活化的卡利希霉素衍生物的制造步骤       活化的卡利霉素衍生物通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化。RP HPLC可高效分离产物与杂质，并与在线分析相结合，以提高馏分纯度。因此，该纯化步骤可以严格控制DSI中的杂质。尽管活化的卡利霉素衍生物中的活化酯在RP-HPLC的水/有机条件下易水解，但水解可以通过 HPLC流动相pH值进行控制，因此可以最大限度地减少水解。残留溶剂通过沉淀和真空干燥步骤进行控制。RP-HPLC序列后进行沉淀/干燥，为ADC偶联工艺提供了具有适当低杂质和残留溶剂含量的DSI。       设定适合偶联过程的L/P规格是L/P过程和分析控制策略开发的一个重要方面。一旦起草了规格，就可以开发L/P工艺以满足这些规格并实现成功的偶联工艺。与小分子工艺类似，L/P的强度对于确保准确充注偶联物至关重要，因此必须达到适当的杂质和残留溶剂水平。对于L/P来说，可偶联和不可偶联杂质的水平也很重要。应尽量减少可偶联杂质，因为这些化合物可以与抗体偶联并成为DS的一部分。对于活化的卡利希霉素衍生物过程，卡利希米星同系物的活化酯由N-乙酰卡利霉素中的低水平杂质形成；这种可偶联杂质通过RP-HPLC纯化清除。非偶联杂质必须通过ADC工艺去除，并适当敏感地测定。 5. 开发和验证策略       mAb和L/P的工艺开发可以与ADC原料药的偶联工艺开发同时进行。这种并行开发工作必须得到适当的管理，并受最终目标的约束。开发团队之间的沟通至关重要，因为mAb和L/P的属性会直接影响偶联过程。理想情况下，L/P、mAb和ADC工艺的开发和放大是有序和定时的，这样所有三个工艺的开发几乎可以同时进行。图12概述了L/P、mAb 和ADC的开发时间和步骤。这种方法代表了风险最低的最保守的方法。应该注意的是，提供代表商业流程的L/P以验证ADC流程可能就足够了。因此，L/P工艺的验证时间可以移出，使其与ADC工艺验证同时发生或之后进行。这种方法成功的前提条件是必须证明来自最终商业流程的材料与用于ADC验证的材料之间的等效性。遵循小分子范式将允许L/P流程的验证与BLA的提交同时进行。最近的文件在很大程度上包括BLA中的流程验证包。       多组分验证的另一个复杂性是抗体或L/P可能没有足够的稳定性来支持整个验证计划的风险。此外，虽然组分的质量属性的维护将在各自的稳定性程序中得到证明，但控制策略必须确保组分质量属性在原料药和药品的整个生命周期内保持不变。对于InO，用于工艺验证（即申报前验证）的生物制剂方法也应用于L/P工艺，既使L/P的验证策略与mAb和ADC的验证策略保持一致，又促进了图12所示的所需流程。 图12. 接头/有效载荷、mAb和原料药工艺开发、评估和验证示意图 （1）批次量大小      批次量大小和稳定性是DSI供应的基本工艺考虑因素。ADC偶联工艺规模由预计的商业需求决定，对于ADC，该规模通常需要低于相应DSI工艺生产数量的DSI数量。为了优化资源和时间，可能需要更大规模地运行DSI进程，以便为多个DS批次准备DSI的供应。mAb和L/P生产的规模将取决于可用的工艺、设备和生产设施，但规模也将取决于ADC批次大小和DSI的长期稳定性。       对于InO的生产，mAb工艺的典型产率为三个ADC批次提供了足够的材料，而L/P工艺的典型产量足以为五个ADC批次提供足够的材料。mAb和L/P均可稳定数年，预计每年的ADC批次数将在DSI到期前消耗掉这两种DSI。 （2）原材料      对于生物制剂工艺，通常在整个过程中监测内毒素和生物负荷水平，并在开发过程中确定原材料的适当限量。可以进行内毒素和生物负荷测试的原材料示例包括缓冲液、赋形剂、层析填料、过滤器和加工容器。       必须控制原材料中重金属的含量，以免将这些潜在有毒杂质引入原料药和药品中。重金属可能来自多种材料，因此仔细评估过程中的所有材料非常重要。必须了解和控制过程中使用的容器、袋子和管道的可萃取物和可浸出物。通过产品接触和了解潜在杂质，可以引入各种杂质，其来源将改善对过程的理解和控制。用于L/P溶解的乙醇的含水量是受L/P控制的原材料属性的一个示例。如图11所示，活化的卡奇霉素衍生物含有一种活化的酯，用于与mAb上的赖氨酸残基反应。这些活化酯易水解，因此，乙醇中水的规格设定为≤0.2%。在偶联之前，将活化的卡利霉素衍生物溶解在乙醇中，并将该溶液加注到偶联反应中。活化酯的水解对偶联反应有害，因为L/P一旦水解就不会发生反应。为了最大限度地减少水解，用于溶解的乙醇中的水受到原材料规格的严格控制。      对于开发团队来说，评估每种原材料的所需属性并相应地设定规格非常重要。在开发阶段生效的药典规范可能合适，也可能不合适。但是，由于药典规格可能会发生变化，因此使用工艺要求来确定原材料规格。 （3）细胞毒性材料的处理       正确处理细胞毒性物质对于操作者的安全至关重要。必须制定标准作程序 （SOP）来接收、运输、处理和储存细胞毒性化合物。必须提供合格的设备来处理和储存细胞毒性化合物，例如用于称量和制备溶液的隔离器/手套箱。适当的个人防护装备（PPE）是必不可少的，并且制造工厂的每个区域对PPE的要求可能不同。处理和储存细胞毒性化合物的区域可能需要限制进入，并且必须张贴并维护适当的标志，以提醒所有进入这些区域的人员。活化的卡利希霉素衍生物是在专为生产、处理和储存卡利希霉素产品而设计的专用设施中制造的。发酵和γ卡利霉素分离作在封闭系统中进行，材料之间无需操作员接触即可转移。制造活化的卡利希霉素衍生物的所有合成步骤都在大型隔离器（手套箱）内进行，其构造既可以隔离作员与加利希霉素的接触，又可以方便地进行作。       最后，原料药生产，其中活化的卡利希霉素衍生物与抗体偶联，ADC的纯化在专用套件中进行，便于将L/P溶液安全地装入偶联反应中，并通过纯化和UF/DF操作处理ADC。然后将原料药冷冻并储存，直到发展为药品。对于InO工艺，药品与卡利希霉素和原料药在同一设施中的单独套件中生产。这种安排允许从原材料到密封小瓶的整个过程在同一栋建筑内进行，并有助于确保正确处理和控制细胞毒性材料。 6. 后期开发的分析挑战      在ADC开发后期会进行多种分析活动，其中可能包括以下内容：  • 确定质量属性的关键性; • 开发和验证所有用于关键质量属性放行的检测方法; • 为现有产品和工艺的重要属性开发额外的表征方法; • 过程表征的分析测试支持; • 标准物质的建立和表征; • 临床材料的释放和稳定性测试; • 针对潜在工艺和制造地点变化的可比性研究; • 开发/验证关键工艺步骤的过程中分析; • 分析测试支持用于工艺验证的残余间隙; • 确定分析控制策略。       此外，对于ADC，需要对DSI（mAb和L/P）以及ADC原料药和药品进行类似的分析活动。在本节中，讨论将集中在后期偶联工艺支持的分析策略和挑战上。ADC后期工艺开发的分析支持有几个考虑因素。一个考虑因素是，需要尽早建立确定对过程和产品理解都很重要的属性的方法。      可能需要进一步评估早期开发的方法，以确保支持后期开发的适用性和稳健性。可能需要其他方法和控制来支持对过程/产品的理解增强。典型ADC的潜在质量属性可能包括大小异质性（如聚集和碎裂）、电荷异构体、药物抗体比（DAR）、蛋白质浓度和偶联药物浓度、药物负载分布、偶联位点和占位点（对于赖氨酸ADC）以及残留药物相关物种。对于InO，由于它是基于卡利希霉素的ADC，因此在样品储存、制备和分析过程中需要采取特殊预防措施，以防止由于存在酸不稳定接头和加利希霉素的潜在光敏性而导致药物意外降解。       另一个考虑因素是评估偶联对mAb中可能影响抗原结合的关键质量属性的影响。如果在发生抗原-抗体结合的CDR区域存在潜在的脱酰胺“热点”，则需要开发一种测量mAb/ADC中脱酰胺的方法，以监测偶联和纯化过程对这一特定质量属性的影响。在InO的情况下，确定偶联和纯化过程对脱酰胺没有显著影响，因此控制策略反映了脱酰胺是在mAb DSI阶段控制的，而不是在ADC上。       过程支持经常遇到的挑战之一是，用于最终原料药检测的方法可能不适用于过程样品检测，因为由于样品基质不同且存在多种组分，过程中样品通常更复杂。例如，对于共轭反应混合物中的DAR测定，释放UV方法不适用，因为反应混合物中的游离药物会干扰共轭药物浓度的测定。这可能导致对DAR的高估。要么需要开发不同的方法，要么使用一种减去游离药物的修改方法。在其他情况下，需要评估基质干扰。通常需要进行加标/回收率研究，以确保该方法适合作为定量分析。对于对初始样品缓冲液条件敏感的方法，例如iCE、离子交换HPLC和HIC，可能需要调整样品前处理程序，以确保该方法仍然能够分离和准确定量目标物质。在InO案例中，iCE方法涉及稀释原始样品以将盐浓度降低到可以容忍的水平。       过程支持的另一种常见策略是使用不同于放行方法的分析方法，但通过桥接研究确保等效性。对于InO过程表征研究，使用ELISA分析法测定最终原料药和药品中的残留药物。然而，ELISA分析存在一些局限性：与典型的LC方法相比，分析的可变性更大、程序繁琐以及关键试剂的维护。对于过程表征研究，开发了一种RP-HPLC分析来确定残留药物，而不是 ELISA分析。在HPLC定量限（LOQ）水平进行加标/回收，以证明相似的分析性能并桥接两种方法。可能需要其他方法来测量其他质量属性，这些属性在工艺开发的早期阶段尚未确定。对于InO，在开发的早期阶段没有药物负荷曲线的测定。因此，对于过程表征研究，同时使用iCE方法和 HIC方法来监测药物负载曲线。此外，肽图分析用于监测偶联位点。值得注意的另一点是，并非每个过程或过程表征样品都需要测试所有属性。特别是对于工艺参数范围不是很宽的工艺表征研究，通常不进行生物检测（包括细胞毒性），因为这些结果由于检测的可变性而可能没有意义。       为了支持工艺验证，所有关键的过程中分析都需要进行验证。此外，还需要开发合适的方法，以证明所有相关工艺杂质的清除率，例如残留L/P、工艺缓冲液和残留有机溶剂。这项工作通常与工艺验证一起执行，使用从工艺的不同阶段生成的材料，以显示每个阶段的间隙。由于在存在大量蛋白质偶联物的情况下需要非常低的分析LOQ，因此某些工艺杂质方法可能具有挑战性。通常，需要不同的分析技术来定量残留杂质。例如，对于ADC中的残留溶剂，通常需要使用带有顶空进样器和FID检测器的GC方法进行定量。对于某些过程杂质，通常使用除UV以外的检测器（如 ELSD、MS）。 【NO.3】总结        这些活动有助于将InO项目成功推进到后期开发。其中的关键是制定控制策略，该策略侧重于控制从原材料到药品的质量属性，注意单元操作的适当扩展，通过应用适当的分析工具对产品进行详细了解，以及研究工艺参数对质量属性的影响。       此外，规划处理细胞毒性材料的复杂供应链和设施要求也至关重要。这种ADC特别复杂，但所使用的方法普遍适用。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归 原作者所有，如有侵权，可联系删除。 近期会议推荐 点击热门课题 （点击会议名称查看文件） 【11月20-22日】青岛 2025 生物制造中试平台建设与运营管理及发酵中试放大关键技术专题研讨班 线上直播【11月29-30日线上】2025 版《中国药典》抗体药物偶联物（ADC）质量标准深度解读 北京大学继续教育学院开课啦【营养健康指导证书】 【国际营养师.公共营养师证书办理】就业前景好！国际营养师·公共营养师岗位能力培训报名来啦！特别是这些人记得看！ 关注公众号 加微信了解更多内容  感谢帮忙转发 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