Blinatumomab

01 引言 鉴于许多疾病的特征是信号转导不足，将细胞信号转导恢复到正常生理水平或可控地增强细胞信号转导的策略具有广泛治疗应用的潜力。虽然为此目标开发天然配体代表了一种已取得一些成功的合理策略，但许多天然配体由于稳定性、可开发性和多效性活性方面的考虑，无法成为可行的治疗手段。 抗体已成为受体激动作用的一种有前景的治疗策略，这些生物分子通常具有几个有利特性，包括高亲和力、特异性、稳定性、可开发性、长半衰期和多种效应功能的潜力。因此，开发具有激动剂功能的抗体的竞赛已经开始，目前已有多种抗体正在进行激活免疫细胞的临床试验。然而，高效地发现这些抗体仍然是一个关键的生物技术障碍，其难度根据靶点内源性信号转导机制的不同而有很大差异。 迄今为止，许多临床批准的治疗性抗体抑制细胞信号转导，这些拮抗分子的临床转化为了解激动剂抗体的开发提供了一些启示。然而，经验教训表明，许多用于发现和优化拮抗剂的设计原理根本不适用于激动剂，这说明了这些分子固有的独特复杂性及其高效发现的挑战。 在此，我们全面综述了激动剂抗体和其他生物制剂高通量实验与计算发现及优化方面的最新进展(图1)，讨论了使用高通量方法基于亲和力或生物活性筛选先导抗体候选物的实验发现方法，以及用于生成和优化激动剂抗体的计算方法和理性工程学方法。 图1. 发现和优化激动剂抗体的方法概述。 基于亲和力的选择包括首先识别抗原特异性抗体，然后筛选它们的激动剂活性。基于活性的选择在抗体发现过程中直接筛选活性，计算设计方法包括预测具有激动剂活性的先导抗体或具有激动剂活性增加的抗体突变体，合理的分子工程方法包括使用不同的抗体格式、价和Fc工程变体来增加激动剂的活性。 02 基于亲和力筛选激动剂抗体的原理 传统的基于亲和力的筛选方法，即体内(例如，免疫接种和杂交瘤技术)和体外(例如，噬菌体展示和酵母表面展示)方法，已用于发现和优化高亲和力抗体数十年。这些方法在生成激动剂抗体方面显示出可变且难以预测的成功率，这是可以预见的，因为激活细胞受体的抗体最多只代表结合给定靶点受体的分子中的一个子集。 因此，使用这些技术的一个关键挑战是提高其可靠识别激动剂抗体的能力。特别是，在改造、聚焦和偏向性应用传统的基于亲和力的筛选方法以发现通过四种特定作用机制激活细胞信号转导的激动剂抗体方面取得了显著进展：(i)诱导受体聚类；(ii)稳定配体-受体相互作用；(iii)通过结合受体活性位点模拟天然配体；以及(iv)变构结合。 2.1 基于亲和力的筛选：通过受体聚类激活的激动剂 内源性受体信号转导可以为用抗体和其他生物制剂激活受体提供有价值的见解，导致信号转导的有效的受体-受体相互作用可以涉及两个受体(同源或异源二聚体)或三个及以上受体(簇)。天然通过配体诱导同源二聚化进行信号转导的受体(例如，各种酪氨酸激酶受体)理论上非常适合通过IgG抗体进行激动作用，因为其具有相同的价数。双价抗体具有同时、多价地与两个受体分子(每个Fab臂)结合的能力，已经发现了几种通过二聚化激活受体的激动剂抗体。 理论上，需要聚类才能进行信号转导的受体代表着更具挑战性的靶点，但也具有很高的治疗意义价值。此类受体(例如，TNFα家族)在激活免疫细胞对抗癌症方面的应用得到了广泛研究，观察到TNFα家族受体，包括OX40、CD137和CD40，通过同源三聚体聚类和进一步的网络超聚类进行信号转导，这通常由同样组装成三聚体的配体诱导。虽然单独的双价IgG抗体在诱导三个或更多受体组装方面通常不是最优选择，但外部交联确实能够增加活性。重要的是，考虑到体内存在表达FcγR的细胞(例如，效应细胞)，它们有助于抗体Fc介导的交联，并能赋予激动剂活性，这一点具有体内相关性。 通过传统基于亲和力的筛选，已经常规地生成了通过受体聚类起作用的激动剂抗体。然而，人们有极大的兴趣将发现工作聚焦在最有可能产生强效激动剂抗体的靶向表位上，并建立原理以更好地理解信号转导现象。在一项值得注意的最新研究中，研究人员试图系统性地鉴定针对TNFα家族受体OX40的激动剂抗体，并表征激动剂活性与抗体表位之间的潜在关系。通过用小鼠OX40(mOX40)胞外结构域(ECD)免疫接种和杂交瘤技术，以及通过针对mOX40筛选合成噬菌体文库，分别发现了一组小鼠抗体。研究人员根据抗体与OX40的四个不同胞外富含半胱氨酸结构域(CRD)的结合来表征抗体靶向表位：CRD1(膜远端)、CRD2和CRD3(均与配体结合相关)以及CRD4(膜近端；图2a)。接下来，研究人员使用表位分组技术鉴定了一组四个代表性抗体，每个抗体结合一个独特的OX40 CRD(图2a)。研究人员使用这组抗体在多个体外和体内模型中比较激动剂活性，并发现靶向CRD2和CRD4的先导抗体在两种生物模型中[B8R肽免疫模型(图2b)和CT26抗肿瘤功效模型(图2c)]均表现出始终如一的优异体内活性。总而言之，这些结果表明与配体结合位点的相互作用对于OX40激动作用并非必需。 图2. 针对特定OX40受体结构域的抗体可诱导强效激动作用。 (a)靶富含半胱氨酸结构域(CRD)的不同激动剂活性和配体阻断特性的图示。(b)在B8R肽免疫模型中，抗CRD2和CRD4抗体强烈增强CD8+ T效应细胞的活化。(c)靶向CRD2和CRD4的抗体可降低BALB/c小鼠体内肿瘤进展率。 TNFα家族共刺激受体具有显著的结构相似性，问题是表位(CRD)与激动剂活性之间的关系是否可推广到整个受体家族。一项类似的研究评估了相关TNFα家族受体CD40的激动剂活性与表位(CRD结合)之间的关系，基于对一组九种CD40抗体的表征(包括几种临床阶段抗体)，结果表明靶向膜远端CRD1的抗体具有更优的激动剂活性，并且这些抗体不与天然配体CD40L竞争受体结合。因此，尽管TNFα受体家族结构相似，但表位与激动剂活性之间的关系可能具有受体特异性。未来的研究将需要通过测试针对各种TNFα受体的更大规模的结构域特异性激动剂抗体来评估这些结果的普遍性。 通过测试针对各种TNFα受体的更大规模的结构域特异性激动剂抗体来评估这些结果的普遍性。尽管到目前为止讨论的例子说明了诱导同型聚类的激动剂抗体的发现和优化，但也已描述了一些能够通过异型受体聚类发挥激动作用的激动剂抗体。通过针对TNFα家族受体死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)筛选噬菌体展示的抗体样蛋白文库，研究人员发现了一种交叉反应性的DR4和DR5分子治疗剂(替代抗体surrobody)。在体外和体内模型中，这种新发现的替代抗体显示出比针对DR4或DR5的单一特异性单克隆抗体以及这些单克隆抗体的组合更高的效力。从机制上讲，交叉反应性替代抗体可能通过形成同型和异型信号复合物促进增强的受体聚类。总的来说，这项工作展示了异源寡聚聚类增强激动剂活性的潜力，并进一步证明这种聚类可以在不依赖传统双特异性抗体的情况下实现。 2.2基于亲和力的筛选：通过稳定配体-受体相互作用激活的激动剂 使用抗体激活细胞受体的另一个通用方法是稳定配体-受体相互作用，这通常会导致增强的天然配体介导的信号转导。值得注意的是，这种策略本质上不同于直接诱导受体信号转导的传统激动剂，因为它依赖于局部内源性配体水平进行信号激活。这种限制可能具有治疗益处，因为它可能规避与配体或其他激动剂全身给药相关的潜在毒性问题，并且在直接激动剂策略不合适的情况下可能特别有吸引力。 对于此类生物制剂的聚焦发现，基于亲和力的筛选通常涉及对结合配体-受体复合物的正选择和针对结合单个组分(例如，单体配体或受体)的负选择。该策略需要目标配体-受体复合物的高纯度，而这可能因此类复合物的低稳定性而变得复杂。为了缓解这些稳定性问题，已使用具有超高亲和力的工程化配体替代天然配体。或者，也使用了分子栓系方法。 在一个值得注意的例子中，发现了针对IL-6:gp80(配体-受体)复合物的抗体片段(骆驼科 VHH纳米抗体)，它们选择性地结合配体-受体复合物界面的一个"连接表位"，这些抗体是通过用通过柔性肽接头与gp80融合的IL-6免疫骆驼而发现的。虽然大多数鉴定出的纳米抗体仅识别IL-6或gp80，但少数稀有克隆选择性地识别融合蛋白。研究人员解析了其中一个稀有克隆与IL-6:gp80复合物的晶体结构，发现该纳米抗体结合一个新形成的表位，该表位几乎均匀地跨越IL-6与gp80的结构域I的连接处。该纳米抗体表现出激动剂活性，增强了IL-6介导的gp80信号转导的强度和持续时间。 有趣的是，类似的发现工作已经产生了通过独特结合模式(即，除了直接结合配体-受体复合物界面之外)起作用的抗体。在一个值得注意的例子中，研究人员鉴定出一种稀有抗体，它能稳定IL-4(配体)与IL-4Ra和γc(两个受体亚基)的三元复合物。观察到该抗体片段在涉及两个受体亚基的表位处相互作用，具体在膜近端"茎"界面，并间接稳定了配体结合。在另一个例子中，鉴定出的抗体片段具有有趣的特异性，包括仅在干扰素(IFN，配体)结合时才结合IFNAR2(受体)的变构、构象选择性抗体，以及预先结合IFNAR2并同样稳定IFN结合的其他抗体，这项研究产生了将IFN信号转导效力提高约100倍的抗体片段。 2.3基于亲和力的筛选：通过模拟天然配体激活的激动剂 虽然许多激动剂抗体被描述为能够替代配体功能，但此处报道的配体模拟物既能重现配体诱导的受体信号激活，又能以与天然配体竞争的方式结合靶点受体(即，抗体表位与配体结合位点重叠)。值得注意的是，已经使用了一些通用策略直接偏向发现针对配体模拟抗体。其中一种创新方法是抗独特型抗体发现，其中根据对其他抗体可变区的亲和力来选择抗体(图3a)。 激动剂、抗独特型抗体的发现通常涉及在两个动物物种中进行连续两次免疫接种，并且需要一个已知的激动剂分子作为初始免疫原和分子发现的支架。从初次免疫中获得的多克隆抗体被分离、处理和纯化以去除Fc区，然后F(ab’)2区被用作第二次免疫的免疫原，得到的抗独特型抗体被分离并筛选其激动剂特性。 这种通用方法已在几项概念验证研究中用于激动剂抗体的发现，例如，研究人员鉴定了一种模拟生长激素的抗体，该抗体激活JAK2/STAT5通路并刺激猪肝细胞分泌胰岛素样生长因子。在另一个例子中，研究人员发现了模拟激素羊催乳素(PRL)结合和激动剂活性的抗独特型抗体(图3)。其中一种抗体被进一步表征，发现其与配体PRL竞争结合靶点受体(图3b)，并诱导细胞反应，类似于PRL，尽管程度较低(图3c)。抗独特型抗体发现已被主要证明可以替代天然肽类激动剂，但也可能是发现配体模拟抗体以替代各种天然配体的有吸引力策略。然而，需要研究来确定该方法的普遍性和典型效率。 配体模拟抗体也已通过更常规的发现活动被发现，在一份报告中，观察到一种值得注意的抗PRL受体抗体与天然配体PRL相比具有独特的生物活性。有趣的是，该抗体通过激活AKT、ERK1/2、STAT1和STAT3诱导选择性的配体模拟活性，但未通过STAT5通路诱导配体样信号转导。进一步表征表明，该抗体部分与PRL竞争，表明其结合的表位部分与正构位点重叠。更一般地说，部分正构结合可能代表了抗体选择性模拟配体诱导信号转导的有利方面的一种通用策略。 图3. 对催乳素受体具有激动剂活性的抗独特型抗体的发现。 (a)发现抗独特型抗体的图解。首先产生针对天然配体PRL的抗体，然后作为第二次免疫的抗原来源。所得抗体通过配体模拟对PRL受体显示激动剂活性(b)。激动剂mAb B-7与天然配体(PRL)竞争结合。(c)单克隆抗体(mAb) B-7在配体应答细胞中激活细胞增殖。 2.4基于亲和力的筛选：通过变构作用激活的激动剂 变构抗体在不同于配体结合位点的位置结合受体，这些抗体更有可能避免与多效性结合相关的保守表位，因此通常具有吸引力。变构激动剂抗体已通过传统方法以及机制聚焦策略被发现，一种通用的机制聚焦方法涉及在饱和浓度的天然配体存在下筛选针对靶点受体的分子文库，从而阻断正构结合位点，并偏向发现结合变构位点的分子。例如，研究人员在饱和水平的胰岛素存在下筛选胰岛素受体(INSR)的结合物，从而发现了一种针对胰岛素受体的变构激动剂。新发现的抗体激活INSR达到胰岛素诱导水平的约20%，并且不抑制胰岛素介导的受体激活。值得注意的是，相对于胰岛素，该抗体仅显示出部分下游信号转导，选择性地通过Akt通路而非Erk通路激活INSR。总的来说，该抗体具有胰岛素样调节糖尿病血糖水平(Akt通路)的能力，而不会重现潜在有害的、胰岛素样诱导的细胞增殖(Erk通路)。 03 基于活性筛选激动剂抗体的原理 虽然基于亲和力的筛选代表了一种经过验证的激动剂发现方法，但其存在固有的局限性。例如，对大量先导候选物生物活性的低通量评估可能是一个费力、低效且限速的步骤。直接针对生物活性高通量筛选抗体文库提供了一种创新方法，可替代或与基于亲和力的筛选串联使用，并且可能在传统方法失败的情况下显示出高效激动剂发现的效用。 与传统发现方法一样，基于功能的筛选需要编码分子治疗剂(基因型)的序列与生物活性(表型)之间的联系。这种基因型-表型联系已经实现，使得单个细胞具有抗体基因并报告活性(自分泌系统)，或者两个细胞紧密相邻，其中一个细胞具有抗体基因，另一个细胞报告活性(旁分泌样系统)。 值得注意的是，使用哺乳动物细胞报告系统直接基于功能筛选文库已在多项概念验证激动剂活动中得到应用，展示了发现系统和生物医学应用的多样性。例如，已成功用于针对特定细胞表面受体靶点以及靶向激动策略。抗体文库已被展示在细胞表面、分泌或在细胞内表达，筛选策略基于报告细胞基因表达(例如，与转录因子激活相关的荧光蛋白)以及表型反应(例如，细胞增殖、迁移和防止细胞死亡)，已使用此方法鉴定出单特异性和双特异性抗体。尽管它们的发现主要是使用体外系统完成的，但也使用了体内系统。相反，这些通用的基于功能的筛选方法也已成功应用于筛选拮抗剂抗体。 典型的自分泌、基于功能的筛选工作流程(使用表面展示抗体变体)涉及多个步骤。首先，将编码抗体库的基因(例如，通过柔性肽接头与单个跨膜结构域融合的抗体基因)克隆到慢病毒转移盒中。接下来，制备慢病毒颗粒并将其用于将抗体基因稳定整合到哺乳动物报告细胞中，通常使每个细胞具有单个抗体基因。慢病毒转导后，报告细胞组成型表达表面展示的抗体，允许抗体与靶点受体相互作用，在有效的情况下，此事件会导致下游信号激活，可以通过可选择的表型分离激活报告细胞的克隆。从分离的细胞中提取基因组DNA，并将其用作扩增先导抗体基因的模板DNA。回收的基因可以直接评估序列同一性，或通过下一代测序进行探测。最后，以可溶形式生成先导候选物，以进一步审查其生物活性和生物物理性质。 在使用表面展示抗体文库的自分泌系统中，抗体被限制在靠近靶点受体的位置，因此与通常用于筛选可溶性先导物的浓度相比，细胞表面呈现出相对较高的先导抗体有效浓度。因此，这些筛选对抗体亲和力的严格性降低，可能有利于促进识别具有稀有且理想生物学特性的克隆，而这些特性在基于亲和力的筛选中可能会丢失。这可能是有益的，特别是对于靶点未知的筛选应用。然而，当靶点受体已知时，基于亲和力的筛选可以在进化出同时具有理想活性和可溶形式亲和力的抗体方面起到补充作用。例如，最近一项研究展示了使用自分泌报告系统筛选针对酪氨酸激酶受体TrkB的激动剂抗体，在该系统中，膜拴系的抗体激活靶点受体，该研究的目标是发现替代同源配体脑源性神经营养因子(BDNF)的抗体。为了实现分子发现，研究人员使用了两步法，即基于亲和力的筛选，随后是基于活性的筛选。首先，将噬菌体scFv文库(>1010)富集结合人TrkB胞外域的克隆。然后来自基于亲和力筛选的结合克隆被亚克隆到用于哺乳动物表面展示的慢病毒转移质粒中，转导到TrkB模型细胞系中，并进行高通量、基于活性的筛选。令人鼓舞的是，以可溶形式鉴定的一个顶级抗体显示出与天然配体相当的体外TrkB激动剂活性，此例子展示了成功使用基于亲和力的预富集将发现聚焦在具有类药亲和力的激动剂抗体上。 值得注意的是，直接基于功能的筛选可能为分子发现提供固有的优势，并且即使在单独基于亲和力的筛选失败时也可能显示出效用。最近一项重要的研究试图发现针对人apelin受体(APJ)的拮抗剂和激动剂抗体，该受体是A类G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，由于其有限的暴露胞外区，很难产生抗体。为了进行发现，使用了一个现有的纳米抗体文库，该文库是通过用APJ纳米盘免疫骆驼并将分离的库亚克隆到噬菌粒载体中生成的(图4a)。该文库先前曾用于功能性抗体的基于亲和力的筛选活动，其中鉴定了几种拮抗剂抗体。然而，没有发现激动剂抗体，这引发了一个问题：在这个免疫库中是否存在激动剂抗体。 接下来，研究人员试图使用这个相同的免疫来源库，通过噬菌体展示(一轮以富集初始结合物)然后进行哺乳动物报告细胞的高通量、基于功能的筛选来发现功能性抗体(图4a)。对于拮抗剂发现，在存在同源天然配体apelin(80%最大剂量)的情况下筛选无信号转导的克隆；而对于激动剂发现，则在缺乏天然配体的情况下筛选有信号转导的克隆。值得注意的是，如图4b所示，细胞经历了三轮基于活性的分选，分选轮次之间进行培养。然后分选单细胞(每孔一个)，扩增，并评估其拮抗或激动功能(图4c)。通过RT-PCR回收顶级先导序列，进行测序，并以可溶性单域抗体(sdAbs)形式表达。在拮抗剂发现活动中，评估了10个可溶性先导克隆，其中7个的IC50值 <200 nM。对于激动剂发现，10个先导抗体在表面展示形式下评估时，相对于同源配体显示出 >50% 的信号激活。一个激动剂先导物(JN300)以可溶形式进一步表征，观察到其既能结合表达APJ的细胞，又能以80-90 nM的EC50值激动APJ受体(图4d)。 图4.基于自分泌的G蛋白偶联受体(GPCR) apelin受体激动剂纳米体的功能筛选。 (a)首先用APJ纳米片免疫骆驼产生抗体文库。将得到的免疫库克隆到噬菌体展示载体中，并利用噬菌体展示对APJ结合克隆进行预富集。接下来，将该亚库克隆到慢病毒转移质粒中，通过GPI锚定进行哺乳动物细胞展示。(b)亲本GPI锚定文库和第三轮基于活性的分类后的细胞图。产物/底物的高比率表明在APJ β-阻滞蛋白报告细胞中具有激动剂活性。(c)经过三轮分选后，携带纳米体基因的报告细胞每孔被分选为单个细胞，并评估激动剂活性。(d)表现最好的激动剂纳米体(JN300)在可溶性形式下表现出激动剂活性，如PathHunter β-阻滞蛋白试验所示。 总的来说，这项研究提出了几项值得进一步讨论的创新之处。首先，所使用的哺乳动物表面展示方法不同于之前报道的方法，其独特之处在于抗体库成员与衰变加速因子结构域融合，该结构域允许锚定在脂筏的糖基磷脂酰肌醇上，这一点值得注意，因为GPCR通常也与脂筏相关。其次，成功进行轮次间基于活性的筛选(无需亚克隆)对于更快速基于功能的抗体发现具有吸引力。尽管作者确实报告了一些问题，例如由于类似旁分泌的细胞激活导致假阳性增加，研究人员建议将工程化的、可诱导的抗体展示作为潜在的解决方案。第三，这项研究为拮抗剂抗体的发现提供了一个通用蓝图，考虑到拮抗剂抗体与激动剂类似，在给定库中可能代表难以仅基于亲和力选择的稀有序列，这一点值得注意。第四，研究人员展示了使用明确定义的对照进行系统验证(即，表面展示的激动剂和拮抗剂生物制剂)。总的来说，这些原理可以广泛用于基于功能的筛选应用。 基于活性的筛选也已用于发现双特异性激动剂抗体。在一项值得注意的研究中，研究人员试图鉴定针对已知靶点促红细胞生成素受体(EpoR)的激动剂抗体，以替代天然配体促红细胞生成素(EPO)的活性。在对一个初始人抗体文库进行结合EpoR的预筛选并将其亚克隆成分泌型scFv-Fc格式后，研究人员用含有抗体基因的慢病毒感染过度表达EpoR的基于生长优势的报告细胞，感染复数(MOI)为2(每个细胞平均应表达两个scFv库成员)。从扩散限制的甲基纤维素琼脂中回收了几个先导集落，每个集落含有一到四种不同的抗体变体(图5a)。有趣的是，每个细胞感染多个scFv-Fc抗体变体导致了一种称为细胞内组合文库的现象，其中单特异性和双特异性抗体均被分泌。推而广之，生物活性可能来源于单一抗体、抗体组合或双特异性抗体，从而极大地增加了文库多样性。 在这项研究中，单一抗体仅表现出适度的体外生物活性，表现最佳的激动剂达到同源天然配体EPO活性的约60%。研究人员随后检查了约50种抗体基因组合(每个基因对在同一集落内鉴定)的体外生物活性，并观察到大多数混合物(包含单特异性和双特异性抗体)表现出改善的活性。一种显示出协同作用(V-1/V-2)且生物活性与天然配体EPO相当的特定基因组合被进一步评估。为了确定导致观察到的生物活性的分子种类，研究人员制备了所有可能的分子构建体(图5b)。有趣的是，单特异性抗体和单特异性抗体混合物未表现出激动剂活性，而V-1/V-2双特异性抗体显示出与EPO相当的激动剂活性(图5b)。进一步的竞争分析表明，V-2与EPO竞争结合，而V-1结合EpoR的非重叠表位，为观察到的活性提供了潜在的机制见解(图5c)。总的来说，这项工作展示了成功高通量发现一种高效力双表位抗体；需要进一步研究以评估这种通用方法在预期双表位抗体有优势的应用中的效果，例如针对机制上通过更高阶受体聚类信号转导的靶点受体。此外，该策略可能广泛用于双特异性抗体和协同抗体组合的高通量鉴定和评估。 图5.针对促红细胞生成素(EPO)受体(EpoR)的激动剂抗体的自分泌基础功能筛选。 (a)将慢病毒抗体文库转导到细胞增殖依赖于EpoR激活的TF-1细胞中。诱导EpoR信号激活的罕见抗体及其组合导致集落形成。理论上，活性可以由单一抗体、抗体组合、双特异性抗体或它们的组合产生。(b)体外分析表明，活性最高的分子种是双特异性抗体V-1/V-2，而单克隆抗体V1和V2单独或联合均不表现出激动剂活性。(c)作用机制似乎是双特异性抗体V-1/V-2迫使EpoR二聚体形成类似于天然配体(EPO)诱导的构象。 除了针对特定靶点的抗体发现基于功能的筛选之外，几个有趣的例子突出了靶点未知的发现。在一项创新性的演示中，研究人员试图发现能够替代各种Yamanaka转录因子(Sox2、c-Myc、Oct3/4和Lkf4)的抗体。在反式表达这些关键因子(例如，通过慢病毒转导进行基因递送)是细胞重编程以产生诱导多能干细胞(iPSC)的标准方法，而能够替代这些因子的抗体对于推进体外和体内iPSC重编程能力具有重要意义。在这项研究中，研究人员鉴定了一种替代Sox2的抗体，并发现它结合并拮抗脑酸溶性蛋白1(Basp1)，这是一种先前未报道在细胞重编程中发挥作用的蛋白质。在另一项值得注意的研究中，研究人员直接鉴定了促进细胞向大脑迁移的抗体，用于再生医学和神经退行性疾病治疗的应用。总的来说，这些例子和其他例子突出了基于功能的筛选在广泛生物医学应用中的潜力。 3.1基于活性的筛选：基于旁分泌的激动剂发现 旁分泌样系统结合了两种不同的细胞类型，其中一种细胞类型产生抗体或生物制剂，作用于另一种细胞类型以诱导信号转导。虽然基因型和表型包含在两个独立的细胞中，但基因型-表型联系通常可以通过扩散限制环境得以保留。迄今为止，已经设计出的旁分泌样系统要么结合相同物种的细胞，要么结合不同物种的细胞。虽然开发此类系统带来了共培养多种细胞类型固有的挑战和复杂性，但这些系统也提供了与每种细胞类型相关的潜在优势。例如，噬菌体、细菌和酵母等生物体通常用于体外表面展示技术，并且因其大文库容量、易于进行基于亲和力的筛选以及便于迭代分选以富集先导克隆而具有吸引力。哺乳动物细胞系统适用于基于功能的高通量筛选，并且对于在生物相关背景下表达和呈现靶点抗原具有吸引力。 在一个值得注意的例子中，使用基于荧光的显微技术和通过微量移液器进行细胞分离的简单方法筛选了功能性抗体，其通量与荧光激活细胞分选(FACS)相当。在这项研究中，研究人员通过将原代B细胞(来自用DR4和DR5免疫的鸡)和报告细胞共同包封在低熔点琼脂糖微滴(直径约100 μm)中，鉴定出针对DR4和DR5的激动剂抗体。基于报告抗原结合和凋亡反应的荧光模式，从大量原代B细胞中分离出具有功能性抗体的细胞。 也报道了结合多种物种的共培养系统。例如，研究人员试图将传统的噬菌体展示方法与基于功能的筛选相结合，开发一种旁分泌样激动剂筛选系统，其中将产噬菌体的大肠杆菌与哺乳动物报告细胞共同包封在微滴生态系统中。为了建立概念验证，首先在缺乏微滴生态系统的情况下进行了几项研究。研究人员将展示抗TrkB抗体的产噬菌体大肠杆菌与TrkB报告细胞共培养，并证明与用产随机噬菌体的大肠杆菌处理相比，细胞活化显著增加。此外，研究人员证明了大多数哺乳动物细胞在与大肠杆菌共培养24小时后仍然存活。接下来，使用皮升级微滴系统，研究人员观察到细菌产生了足够的噬菌体来诱导报告细胞激活。可能需要进一步研究来开发类似的系统用于基于FACS的筛选，使用在水相中稳定的微滴。 3.2基于活性的筛选：新兴技术 几项研究建立了创新的酵母-哺乳动物共培养系统，可以进一步适应于高通量基于活性的抗体筛选。例如，使用基于亲和力的筛选方法，研究人员将酵母展示的文库与过表达目标受体(即人酸敏感离子通道受体1a)的活哺乳动物细胞一起培养。通过FACS筛选产生的酵母-哺乳动物细胞复合物的抗原结合，从而使得相对于亲本分子具有增强亲和力和效力的拮抗剂抗体得以成熟。基于功能的发现的另一个潜在未开发机会涉及酵母报告细胞。有趣的是，酵母细胞已被改造为通过表达与人类疾病相关的信号通路相连的报告基因来报告受体激活(类似于哺乳动物报告细胞)。 04 激动剂抗体发现与工程的计算工具 无数计算方法已被用于改进抗体发现和工程过程，一项非常适合计算的任务是抗体-抗原界面的突变扫描，可用于识别对结合相互作用重要的关键抗体残基。许多软件套件可以执行此任务，包括Rosetta、FoldX 和 SAAMBE-3D。Rosetta和FoldX使用内置的能量函数来计算突变前后蛋白质组件的能量，以确定此类突变的能量效应。使用这些工具，可以同时突变多个位置。相比之下，SAAMBE-3D是一种机器学习算法，可以快速计算单个氨基酸替换引起的结合能变化。SAAMBE-3D是在SKEMPI 2.0数据库上训练的，该数据库包含成对突变和实验确定的结合ΔG。随着突变数据集的不断增长，机器学习在此类应用中的效用也应随之提高，成为一种强大且准确的方法。这些方法传统上依赖于抗体-抗原复合物的晶体结构，而这些结构可能未知且难以获得。然而，在某些情况下，抗体和抗原各自存在晶体结构，但不存在复合物结构，包括HDOCK、ZDOCK和 RosettaDock 在内的几种对接协议可以从单个结构计算抗体-抗原复合物。在其他情况下，只知道抗原结构，在这种情况下，可以使用计算工具(如Rosetta和 FoldX)创建抗体的同源模型，然后用于对接协议。在这种情况下，拥有实验测量数据来确定哪些残基参与抗原结合有助于评估同源模型和对接程序是否准确反映了结合相互作用。 05 结构引导的激动剂发现 这些计算方法正越来越多地与实验确定的结构信息结合使用，以设计激动剂抗体和其他生物制剂。在一个值得注意的例子中，通过免疫发现的拮抗性sdAb通过基于结构数据的合理突变被转化为激动剂。在这项研究中，研究人员试图开发一种针对A类GPCR APJ的激动剂sdAb，可用于治疗慢性心力衰竭。为实现此目标，研究人员用含有热稳定和构象稳定的APJ的纳米盘免疫骆驼，并使用免疫库的噬菌体展示分离结合APJ的sdAbs。接下来，筛选所得抗体的拮抗剂和激动剂特性。研究人员鉴定了186种独特的sdAbs，它们以皮摩尔到纳摩尔范围的亲和力结合APJ。其中，106种是强效拮抗剂，其余80种是中性结合剂。不幸的是，没有发现激动剂抗体。 为了实现激动剂发现的未完成目标，研究人员接下来试图开发一种理性设计方法，将来自初始活动的一种强效拮抗性sdAb(JN241)转化为激动剂。JN241在所有鉴定出的抗体中具有最长的CDR3，此外，JN241在与配体结合位点重叠的表位处结合APJ。研究人员解析了抗体-APJ复合物的晶体结构，用于识别APJ与JN241之间的关键相互作用。在这些关键位置用丙氨酸取代创建了几个APJ和JN241突变体，测试了JN241与突变APJ的结合以及APJ与突变JN241的结合。重要的是，研究人员发现位于配体结合口袋中的CDR3的丙氨酸突变并未破坏结合相互作用。因此，该区域的突变可用于将此sdAb转化为激动剂。 基于先前涉及强效抗APJ肽激动剂AMG3054的研究，研究人员注意到拮抗剂sdAb JN241缺乏与APJ两个残基的疏水相互作用，而这两个残基已被证明对激活受体很重要。他们假设，在CDR3尖端附近替换或插入芳香族残基(酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸)可能导致形成必需的疏水相互作用，从而将拮抗剂转化为激动剂(图6a)。在三种插入突变体中，酪氨酸插入导致了激动作用，EC50值在36-47 nM(图6b, c)。重要的是，这个例子突显了相反地抑制生物信号转导的拮抗分子在适当背景下对激动剂发现的价值，为发现提供了新途径。 计算方法也可广泛用于调整生物制剂的特异性和安全性，在一个例子中，研究人员通过计算设计了IL-2细胞因子模拟蛋白，与天然细胞因子相比，通过减少多特异性性改善了安全性。推而广之，计算方法对于降低临床上受限的激动剂治疗剂的毒性可能也具有价值。 图6. 通过合理设计将拮抗纳米抗体转化为激动纳米抗体。 (a)将酪氨酸插入野生型纳米抗体的CDR3的尖端，导致自然配体和受体之间也发生新的接触。体外分析表明，这种插入将野生型拮抗剂转化为完全激动剂，因为激动剂表现出较差的受体抑制(b)和强的受体激活(c)。 06 激动剂Fc工程 除了优化抗体可变区的亲和力和生物活性外，Fc工程是改进激动剂治疗剂的另一个重要途径。抗体的Fc区，包含CH2和CH3结构域，有可能通过Fc介导的交联、工程化的Fc-Fc相互作用以及同种型特异性构象改变体内细胞信号转导。据报道，一种增强激动剂活性的工程策略是控制Fc与Fc受体(Fc Rs)的相互作用。有六种人Fc Rs(即，Fc RI、Fc RIIA、Fc RIIB、Fc RIIIC、Fc RIIIA和Fc RIIIB)，每种对不同人IgG亚类抗体具有独特的亲和力和特异性。有几项重要研究强调了Fc-Fc R相互作用对激动剂活性的影响，例如通过引入Fc突变来增强对Fc RIIB的亲和力，同时减少或消除对其他Fc Rs的亲和力。在一项研究中，研究人员在CD40激动剂IgG1抗体的CH2结构域中引入突变，以寻找具有改善的Fc RIIB结合的Fc变体。研究人员发现了几个突变，这些突变增加了对Fc RIIB的结合亲和力，同时降低了对Fc RIIA的亲和力。有趣的是，其中一个Fc突变体显示对Fc RIIB的结合增加了96倍，导致体外激动剂活性相对于野生型提高了25倍。此外，体内抗肿瘤研究表明，相对于对照抗体，Fc突变体显著改善了抗肿瘤反应。类似地，针对其他免疫受体(如CD137)的激动剂抗体也报道了因增强对Fc RIIB受体的亲和力而改善激动剂活性的情况。一种潜在的机制解释是与这些受体相关的不同内化途径，因为Fc RIIA通常在Fc结合后被降解，而Fc RIIB通常被回收，从而实现更高程度的聚类。总的来说，这些结果证明了优化Fc-受体结合亲和力和选择性作为改善激动剂抗体活性方法的重要性。 尽管工程化Fc-Fc R相互作用是优化激动剂抗体的重要方法，但该方法依赖于效应细胞上Fc Rs的最佳表达，据报道，Fc Rs的表达在表达Fc R的细胞间差异显著，并且在体内难以预测。克服此限制的一种创新策略是以不依赖于Fc R的方式交联抗体，工程化Fc-Fc相互作用已成为实现此目标的创新策略。在一项重要的研究中，研究人员证明，Fc突变T437R和K248E仅在抗体与OX40结合时促进抗体Fc区的六聚化，从而促进抗体结合受体的聚类。晶体结构显示，这些突变在Fc区靠近时促进了稳定的相互作用。使用体外报告分析，Fc突变体显示出与天然配体相比，不依赖于Fc R的激动剂活性提高了30%。 抗体同种型也被观察到由于分子构象和几何形状而影响激动剂活性。一项研究评估了IgG亚类对CD40抗体激动剂活性的影响，与IgG1相比，IgG2同种型抗体在Fc RIIB敲除小鼠中诱导显著改善的T细胞激活，并以不依赖于Fc R的方式诱导激动剂活性。从机制上讲，研究人员确定CH1和铰链区在观察到的改善活性中起重要作用。例如，研究人员观察到，与其他IgG2同种型相比，IgG2的h2B同种型更有效地引发细胞信号转导。该同种型涉及重新排列两个铰链二硫键以与CL和CH1形成新的二硫键，使抗体采取更紧凑的构象，从而使Fab臂位于靠近铰链区的位置。这种紧凑的构象使得靶点受体能够紧密堆积，在通过受体介导的聚类进行信号转导的背景下可能具有吸引力。同样，另一份报告也证明了IgG2抗体的h2B同种型在针对免疫受体CD200R时具有改善生物活性的独特能力。总的来说，这些研究增加了不断增长的证据，支持通过Fc工程和优化来改善激动剂活性。 07 激动剂价数和特异性工程 通过理性分子工程优化价数和特异性已成为增强激动剂活性和改善安全性的另一条有前景的途径，对于通过受体聚类起作用的抗体尤其相关。最近一项研究评估了增加价数和靶向多个表位在增强不依赖于Fc交联的OX40激动作用方面的潜力，研究人员系统地评估了包含一种类型抗体结合域(单表位)或两种针对非重叠表位的不同抗体结合域(双表位)的双价和四价抗体的活性。四价抗体以多种分子形式构建，包括双可变结构域格式(DVD)。对于单表位构建体，四价抗体与双价对照相比，显示出改善的不依赖于Fc交联的生物活性。此外，相对于该组中的所有构建体，四价双表位变体在体外T细胞模型中显示出更优的活性(图7c)。重要的是，四价DVD抗体在小鼠模型中显示出与IgG对照相似的体内药代动力学特征。此外，四价双表位抗体在观察T细胞依赖性免疫反应的标准模型中显示出更优的药效学特征(图7d)。有趣的是，即使在该体内模型中缺乏对FcγRs的亲和力，四价双表位抗体也能达到最大激动作用。 为了更好地理解四价双表位抗体激动OX40受体的现象，研究人员解析了OX40:Fab1:Fab2三元复合物的晶体结构(图7a)。这些结构数据表明，当以四价、双表位DVD格式使用时，Fab1和Fab2无法结合单个OX40受体分子。这种格式的几何限制偏向于结合两个OX40受体，一个受体由Fab臂1结合，另一个由Fab臂2结合，从而有利于更高阶OX40受体复合物的组装(图7b)。此外，研究人员使用尺寸排阻色谱法评估了在不同分子构建体存在或不存在OX40受体胞外域的情况下的受体交联程度。有趣的是，双表位四价抗体与OX40 ECD共同孵育产生了最大的抗体-受体复合物。相对于双价单表位抗体，四价单表位抗体的受体复合也有所改善，尽管程度较轻。从机制上讲，理论上，只要受体结合偏向于结合多个OX40受体，双表位结合就能实现广泛的链状受体交联(图7b)。 双表位靶向和高阶价数最近应用于另一个值得注意的例子，进一步突显了这一新兴理性方法的实用性。研究人员探索了一种DR5激动剂治疗方法，包含两种结合非重叠表位的DR5抗体的等摩尔混合物。每种抗体包含一个Fc突变，该突变被观察到在结合细胞表面靶点DR5时诱导IgG六聚化，观察到激动作用不依赖于FcγR介导的抗体交联。此外，在体外和体内模型中，双表位治疗相对于具有相同Fc突变的单表位对照治疗显示出更优的激动反应。进一步分析揭示，异源六聚体组装诱导了完全的DR5激动作用，这与同源六聚体分子种类的混合物不同。基于在多种癌症模型中获得的令人鼓舞的体外和体内临床前结果，该治疗正在针对实体恶性肿瘤进行一项积极的临床试验(GEN1029)。 双特异性工程也被应用于改善药物安全性和有效性。最近一项研究通过共同靶向β-Klotho将受体激动作用聚焦于靶向脂肪组织，从而改善了抗成纤维细胞生长因子受体1激动剂抗体的安全性。同样，另一项研究表明，通过双特异性工程结合表皮生长因子受体以实现肿瘤定位，降低了CD137激动剂的肝毒性。一项有趣的研究报道了一种四价双特异性抗体，同时靶向CD137和OX40，该双特异性四价分子相对于CD137单克隆抗体对照减少了肝脏T细胞浸润。值得注意的是，尽管每个抗体分子对每个靶点只有两个结合域，该抗体也表现出不依赖于FcγR的T细胞激活，这种激活依赖于共同靶点的结合。需要进一步研究来阐明这种四价双特异性分子T细胞激活的潜在机制。 除了理性工程方法外，天然抗体格式也赋予了两个以上结合位点的价数，可能对受体聚类介导的受体激动作用具有吸引力。例如，IgM抗体(十价到十二价)是B细胞在初始抗原反应期间自然产生的。尽管与IgG抗体相比，IgM同种型抗体在临床应用方面探索较少，但IgM可能在需要强烈亲和作用的各种生物医学应用中发挥作用。最近一项研究报告了IgM激动剂抗体通过分子靶向受体酪氨酸激酶Tie2和DR4治疗眼部疾病的开发进展。 图7. 四价双表位靶向OX40可改善FcγR非依赖性受体的激动作用。 (a) OX40:Fab1:Fab2三联配合物[摘自蛋白质数据库(PDB)： 60GX]说明了Fab1和Fab2与OX40受体上独特的、不重叠的表位结合。(b)四价双表位抗体被提出在独特的表位上结合两个OX40分子，并促进雏菊链状的高阶受体聚类。(c)在没有FcγR交联或CD28共刺激的情况下，CD4+ T细胞的体外激活表现出四价双表位抗体的优越激动作用。(d)在人OX40敲入小鼠的KLH免疫中，CD4+效应记忆T细胞的体内激活显示，四价的、不依赖于FcγR介导的聚类的双表位分子具有优越的激动作用。 08 可开发性 将激动剂抗体转化到临床是具有挑战性的，既面临一般抗体可开发性的障碍，也面临激动剂特有的障碍。生物物理性质、可生产性、安全性和有效性都是预测和确定激动剂先导候选物从发现到临床进展可能性的重要考虑因素。已使用多种方法进行早期抗体可开发性评估，包括确定抗体自身相互作用、交叉相互作用、表达滴度和稳定性的实验技术，以及基于抗体序列和结构预测生物物理性质的计算方法。激动剂抗体还需要在给药和给药方面进行独特的考虑，以证明体内安全性和有效性，并避免与靶上和脱靶结合相关的不良反应。先前在临床上追求天然配体和配体-Fc融合蛋白治疗应用的研究可为此提供见解，天然配体诱导的细胞信号转导受到严格调控且通常短暂，而天然配体本身通常稳定性低且降解迅速。成功地将抗体应用为激动剂治疗剂需要仔细优化给药和给药方案，以在时间和空间上有效控制信号转导。 虽然工程化的双特异性和多价抗体已成为具有增强功能和改善安全性和有效性的下一代激动剂的有前景的格式，但这些复杂格式也需要专门的可开发性考虑。对于生产来说，重要的是使用标准生物技术平台以高产率和纯度高效生产抗体。早期生产双特异性抗体的努力因重链和轻链错误配对导致产物难以分离且不均一而受挫，重要的是，这些重链和轻链配对问题已基本得到解决，从而能够轻松生产纯的、均一的目标双特异性抗体产品。对于工程化的多价抗体，也有多种分子格式可供选择，具有良好的可生产性，包括四价和六价格式。除了生产考虑因素外，多层方法可以通过首先基于每个组成抗体结构域评估可开发性，然后评估工程化分子的可开发性来改进早期可开发性评估。令人鼓舞的是，已有几种双特异性抗体获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，包括blinatumomab(Amgen)、emicizumab(Genentech)和amivantamab(Jannsen)。此列表显著包括具有激动剂功能的双特异性抗体，例如FDA批准的双特异性T细胞衔接器(blinatumomab)，它能同时结合恶性B细胞上的CD19并激活T细胞上的CD3。总的来说，已经建立了重要的基础工作来促进激动剂治疗剂的开发。在早期和准确评估先导候选物可开发性方面的持续进展对于改善激动剂生物制剂的可靠临床转化以及避免临床试验中代价高昂的失败至关重要。 09 未来方向 几种第一代激动剂抗体在临床开发中遇到了挑战，包括毒性、脱靶效应和缺乏有效性，最终阻碍了它们的临床应用。考虑到激动剂在临床上的未来，新一波激动剂治疗剂可能包括绕过通常IgG格式的分子，以提高活性和安全性，特别是如果能解决由于分子复杂性带来的固有可开发性挑战。 对于未来的激动剂发现，能够高通量、基于功能地筛选适合以多种抗体分子格式(具有不同价数和特异性)呈现的可溶格式激动剂抗体的策略将具有吸引力。在这方面，旨在利用综合优势并规避弱点的新型混合平台代表了一个有前景的未来方向，以改进激动剂发现。提高激动剂发现的总体可靠性也将是一个巨大的进步，未来的活动需要有效的降低发现风险的策略。一个关键的风险因素是抗体分子格式，包括筛选格式(例如，表面展示抗体)与药物格式(例如，可溶性IgG)，未来需要考虑的第二个关键风险因素是抗原(实验用与生理状态)。更具体地说，筛选结合简化版本抗原的先导分子可能缺乏或显示出与生理状态下抗原结合的受损。 另一个重要的未来方向是建立稳健的、机制聚焦的发现策略和原理，这可能包括基于受体类别(例如，离子通道偶联、G蛋白偶联、酶联受体或其子集)或类似地基于内源性受体信号转导机制(例如，二聚化、高阶寡聚化和构象变化)的基于功能的筛选，机制聚焦的发现策略有望针对众多尚未成功靶向的靶点受体开发激动剂。 基于亲和力、基于活性和结构引导的方法已经使得发现了许多激动剂抗体和生物制剂，分子工程也在优化激动剂功能方面发挥了关键作用，弥补了双价IgG单克隆抗体在充分重现许多天然配体活性方面的固有局限性。此外，内源性配体-受体相互作用为受体信号转导提供了宝贵的蓝图，值得充分考虑以指导激动剂发现。总的来说，激动剂抗体通过激活细胞过程治疗多种病理状况具有巨大潜力。然而，在这些生物分子能够广泛临床应用之前，还需要持续的研究、开发和创新。竞赛正在进行中，以建立高效可靠地识别具有类药安全性和有效性的稀有激动剂抗体的通用策略。 参考文献 Agonist antibody discovery: experimental, computational, and rational engineering approaches. Drug Discov Today. 2022, 27(1): 31–48. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2021.09.008 免责声明：推文基于已公开的资料信息撰写，仅用于知识分享和传递，任何情况下本文的信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。

这本书就像一本“抗癌药物说明书大全”。它不介绍单一药物，而是把抗癌药按它们攻击的“靶点”（通常是癌细胞上特有的、控制其生长的蛋白质）来分类。每一章都深入讲解一个热门靶点：这个靶点是干什么的？为什么攻击它能治癌？针对它已经有哪些上市药物？这些药物在动物实验（非临床）和病人身上（临床）分别有哪些常见的副作用和毒性风险？最后，还会分析这些副作用背后的原因，并对未来研发方向提出建议。全书顶层设计（为什么这样写？） 1.以“靶点”为核心组织全书：这是最根本的逻辑。现代肿瘤治疗已进入“精准医疗”时代，药物是按作用靶点来分类和研发的。以靶点为纲，能最科学、最系统地组织海量药物信息。 2.聚焦“安全性”这一共同痛点：无论药物机制如何，其非临床和临床毒性是研发者、监管者和临床医生共同面临的挑战。本书将“毒性研究”作为贯穿各章的暗线，直击行业核心需求。 3.遵循“研发与认知的时间线”：章节顺序大致按首个代表药物获批的时间排列（如BCR-ABL抑制剂伊马替尼最早，故排第2章）。这体现了肿瘤靶向治疗的发展历史，让读者对领域演进有直观感受。单章固定结构（每一章如何展开？） 这是全书逻辑最精妙和实用的部分，每一章都像一份标准化的“靶点尽职调查报告”，严格遵循以下五步： 靶点机制篇（What & Why） 1.逻辑：先定义靶点（是什么蛋白/基因），解释其在正常生理中的作用。 2.然后转折：阐述该靶点在肿瘤发生中如何“变坏”（如突变、扩增、融合、过表达），及其促癌的具体信号通路。 3.目的：建立“抑制该靶点=治疗相关肿瘤”的理论基础。回答了“打这个靶点为什么能治癌”。 药物发展篇（How） 1.逻辑：基于上述理论，介绍已上市的、针对该靶点的具体武器。 2.内容：列出药物（小分子/抗体/ADC等），简述其研发历程、特点（如第几代、选择性高低）和主要适应症。 3.目的：将理论转化为具体实践。回答了“用什么打这个靶点”。 安全性数据篇（Evidence） 1.逻辑：这是本书的精华所在，提供客观数据层。 2.结构：平行对比“非临床”（动物毒理实验）和**“临床”**（人体试验及上市后）的安全性数据。 3.内容：详细列举各代表药物在两类研究中观察到的不良反应谱、发生率、严重程度。 4.目的：提供事实依据。回答了“这些药物在动物和人身上分别表现出哪些毒性”。 毒性综合分析篇（Analysis & Insight） 1.逻辑：这是对数据层的深度解读和升华。 2.第一步：关联分析：对比非临床与临床数据，看动物实验能否预测人体毒性？哪些能？哪些不能？这是转化毒理学的核心。 3.第二步：机制解析：深入探讨毒性产生的根本原因。是靶点本身在正常组织也有重要功能导致的“靶上毒性”（如EGFR抑制剂引起皮疹）？还是药物脱靶效应？或是代谢产物所致？ 4.目的：超越现象，探寻本质。回答了“这些毒性为什么会产生”以及“动物实验的指导意义有多大”。 总结展望篇（So What & What‘s Next） 1.逻辑：基于以上所有分析，得出结论并展望未来。 2.内容：总结该类靶点药物的整体优劣、当前面临的挑战（如耐药、毒性限制）。提出研发建议，例如：开发选择性更高的下一代药物、探索联合疗法、拓展新适应症、加强毒性监测与管理等。 3.目的：指向应用与未来。回答了“我们学到了什么”以及“下一步该往哪里走”。贯穿全书的暗线逻辑 1.“机制-药物-毒性”三位一体：每一章都不断强化这三者间的内在联系。理解了靶点机制，就能理解药物设计思路，也能预判或解释其毒性特征。 2.“非临床-临床”转化视角：全书不断引导读者思考两者间的关联与鸿沟，这是新药研发中风险评估的关键思维。 3.“问题导向”与“解决方案”：每一章都始于一个科学问题（如何攻击此靶点），呈现现有方案（已上市药物），分析方案带来的新问题（毒性），再尝试提出优化方案（未来展望）。 全书的逻辑是一个高度结构化、层层深入的分析框架： 从【肿瘤生物学基础】出发，到【药物研发实践】，再聚焦于【安全性评估】这一关键环节，通过【数据对比与机制深挖】形成深刻洞察，最终服务于【优化未来治疗策略】的终极目标。 这种逻辑使其不仅是一本“资料汇编”，更是一本传授如何系统化思考靶向药物研发与安全性问题的“方法论”指南。 靶点/主题 靶点机制 代表药物与关键对比 主要毒性/安全性问题 毒性解析与挑战 总结与展望 BCR-ABL “基因错配的致癌引擎”。 【一代】伊马替尼：开创者，但易耐药。【二代】尼洛替尼/达沙替尼/Bosutinib：更强效，克服大部分一代耐药，但不能克服T315I突变。【三代】Ponatinib/Asciminib：能克服T315I。Ponatinib心血管毒性显著；Asciminib作用机制全新（变构抑制剂），毒性谱可能不同。  心血管、肝、胰、骨髓抑制、水肿。 毒性部分源于脱靶。核心挑战是耐药，尤其是“守门员”T315I突变。 从一代到三代，是应对耐药的经典战役。未来需平衡疗效与长期心血管等毒性。 BTK “B细胞的信号开关”。 【一代】伊布替尼：首创，但选择性低，脱靶多。【二代】阿可替尼/泽布替尼：设计上对BTK选择性更高，旨在减少脱靶毒性（如出血、房颤）。 出血、房颤、感染、腹泻。 一代的出血/房颤主要源于脱靶抑制了其他激酶（如ITK、TEC）。二代旨在更“精准”。 研发方向明确：在保持疗效的同时，通过提高选择性来改善安全性。 EGFR “细胞表面的生长天线”。 【一代】吉非替尼/厄洛替尼：针对常见敏感突变。【二代】阿法替尼：不可逆结合，更强效，但腹泻等毒性也更重。【三代】奥希替尼：能克服T790M耐药突变，且入脑能力强，对脑转移效果好；皮疹/腹泻毒性相对一代更轻。 皮疹、腹泻、间质性肺病。 皮疹/腹泻是“在靶毒性”，与疗效正相关。不同代药物对野生型EGFR的抑制强度不同，影响毒性谱。 从对抗常见突变到攻克耐药突变，并优化毒性管理和脑转移疗效。 HER2 “另一个生长天线”。 【单抗】曲妥珠单抗/帕妥珠单抗：作用于细胞外，常联用。心脏毒性需关注。【小分子TKI】拉帕替尼/奈拉替尼：作用于细胞内，腹泻更突出。【ADC】恩美曲妥珠单抗(T-DM1)/德曲妥珠单抗(T-DXd)：“生物导弹”。T-DXd疗效更强，但间质性肺病风险高于T-DM1。 心脏毒性（单抗）、腹泻（TKI）、间质性肺病（ADC）。 作用部位不同，毒性机制不同。ADC的毒性与其携带的化疗药（载荷）和连接子稳定性高度相关。  从阻断信号到精准递送细胞毒药物，ADC疗效实现飞跃。载荷和连接子技术是优化安全性的关键。 MET “肝细胞生长因子的接收器”。 Tepotinib, Capmatinib, 赛沃替尼：均为高选择性MET抑制剂，疗效相似。在毒性谱上略有差异，如Capmatinib胰腺炎风险需关注，赛沃替尼肝毒性警告。  外周水肿、肝损伤、恶心呕吐、间质性肺病。 水肿原因复杂，可能共通。药物代谢和脱靶谱的细微差别导致毒性侧重点不同。 药物同质化较高，疗效明确。临床选择可能更基于具体的毒性谱和管理经验。 ALK “肺癌中的‘钻石突变’驱动基因”。 【一代】克唑替尼：疗效好但入脑差，易耐药。【二代】阿来替尼/色瑞替尼/布格替尼：入脑强，克服大部分一代耐药。阿来替尼肝毒性相对小，色瑞替尼胃肠道反应需管理。【三代】劳拉替尼：能克服二代耐药（如G1202R），但高脂血症、中枢神经影响（认知、情绪）是其特色毒性。 视觉障碍、肝损伤、胃肠道反应、高脂血症（三代）。 不同药物对ALK激酶域的结合模式不同，影响其耐药谱和毒性谱。劳拉替尼的CNS毒性与其高入脑性相关。  药物迭代完美演绎了“克服耐药+解决脑转移”的路径。管理好各代特色毒性是实现长期治疗的关键。 FLT3 “急性髓系白血病的常见坏开关”。 【一代多激酶】米哚妥林：与化疗联用于一线，靶点多，毒性杂。【二代高选择】吉瑞替尼/Quizartinib：单药用于复发难治，对FLT3选择性更高。Quizartinib因心脏QT间期延长风险曾受关注。 骨髓抑制、心脏毒性（QT延长）、肝毒性。 选择性提高旨在减少脱靶毒性。但骨髓抑制作为“在靶毒性”仍不可避免。 从联合化疗到单药靶向，提高了复发难治患者的疗效。心脏安全是选择性抑制剂需持续关注的方面。 BRAF/MEK “生长信号通路上的关键齿轮与下属”。 【BRAF单药】维莫非尼等：疗效好但很快耐药，且皮肤毒性（增生、新发鳞癌）突出。【BRAF+MEK联合】：成为标准。疗效更强，耐药延迟，且MEK抑制剂能减轻BRAF单药引起的皮肤增生毒性。但联合带来了MEK的毒性（如视网膜病变、心肌病）。 皮肤问题（BRAF单药）、视网膜/心脏问题（MEK）、关节痛、发热。 联合疗法通过上下游双重阻断提高疗效，并利用MEK抑制来抵消BRAF单药的“矛盾激活”副作用，是毒性管理的巧妙设计。 从单药到联合，是靶向治疗中“协同增效、副作用相抵”的典范。需监测眼部和新发的心脏毒性。 CDK4/6 “细胞周期的油门”。 哌柏西利、瑞波西利、阿贝西利：疗效相当。关键区别在毒性谱：- 哌柏西利：骨髓抑制（中性粒细胞减少）最突出。- 瑞波西利：肝毒性风险需监测。- 阿贝西利：腹泻发生率更高，但骨髓抑制相对较轻；还有独特的静脉血栓风险。 骨髓抑制、腹泻、肝损伤、静脉血栓。 虽然靶点相同，但药物化学结构、对CDK4和CDK6的选择性比例不同，导致毒性侧重点显著差异。 三种药物提供了“疗效相似，毒性谱不同”的选择，可根据患者基础情况（如骨髓功能、肠道状况）进行个体化选择。 IDH1/2 “代谢酶变坏”。 【IDH1】艾伏尼布/Olutasidenib：【IDH2】Enasidenib：对比：均需警惕分化综合征。Enasidenib的肝毒性和QT延长风险在早期数据中更受关注。  分化综合征、肝毒性、QT延长、胃肠道反应。 分化综合征是共通的“在靶毒性”，与迫使癌细胞分化有关。不同药物因代谢和脱靶差异，其他毒性风险不同。 开启了肿瘤代谢疗法的新篇章。分化综合征的管理是临床必修课。 CD19 “B细胞的身份证”。 【裸抗】伊奈利珠单抗/Tafasitamab：主要通过免疫机制（ADCC/CDC）杀伤细胞。【ADC】Loncastuximab tesirine：携带PBD毒素，杀伤力更强。骨髓抑制和全身毒性（如水肿、乏力）更显著。 B细胞耗竭/感染、骨髓抑制、输液反应。 作用机制强度不同：ADC因携带强效细胞毒药物，对靶细胞的杀伤更直接、强烈，因此血液等毒性也更重。 提供了从免疫杀伤到直接毒杀的不同武器。ADC为耐药患者提供了新选择，但需更强的支持治疗。 CD20 “另一个B细胞身份证”。 【Ⅰ型】利妥昔单抗/奥妥珠单抗：与CD20结合后，抗原不易内化，更擅长激活补体（CDC）。【Ⅱ型】奥法妥木单抗：结合表位不同，抗原易内化，更擅长诱导直接凋亡和ADCC，CDC作用弱。对比：疗效相似。奥法妥木单抗皮下注射更方便，输液反应更少。奥妥珠单抗人源化程度更高，理论上免疫原性更低。 输液反应、感染、PML。 与靶点结合的特性（Ⅰ型 vs Ⅱ型）决定了其杀伤机制的优势，也影响了临床使用体验（如输液反应）。 在经典靶点上进行工程化优化（人源化、给药途径、作用机制微调），以改善安全性和便利性。 CD3 “T细胞的‘启动按钮’”。 【BiTE双抗】贝林妥欧单抗：半衰期极短（~2小时），需连续静脉输注。【全长双抗】Teclistamab等：具有Fc段，半衰期长（~1周），可皮下或间隔给药。对比：贝林妥欧因持续输注，CRS发生较早且需住院管理；全长双抗给药方便，但CRS可能发生在后续周期。两者神经毒性风险类似。 CRS、神经毒性、感染、血细胞减少。 药代动力学（半衰期、给药方式）直接影响毒性（尤其是CRS）的发生模式和管理策略。 从持续输注到间隔给药，是双抗技术的重要进步，提高了治疗便利性，但毒性本质仍需严密监控。 PD-1/PD-L1 & CTLA-4 “免疫系统的刹车”。 【PD-1抑制剂】帕博利珠单抗/纳武利尤单抗：作用机制相似，适应症和临床数据各有侧重。【PD-L1抑制剂】阿替利珠单抗/度伐利尤单抗：理论上可能保留PD-L2/PD-1通路对部分免疫组织的保护作用，但临床毒性谱与PD-1抑制剂高度相似。【CTLA-4抑制剂】伊匹木单抗：毒性更强（尤其结肠炎、垂体炎），常与PD-1抑制剂联用，但需更低剂量。  免疫相关不良反应（irAE）。 CTLA-4和PD-1在免疫激活的不同阶段起作用，抑制CTLA-4在更上游，可能引发更强烈、更早的免疫激活和毒性。PD-1/PD-L1抑制剂毒性谱总体相似。 PD-1/PD-L1抑制剂已成为基石。联合CTLA-4抑制剂能增效但显著增毒，需精细管理。未来是寻找更佳联合伙伴或双特异性抗体。 CD19 CAR-T “给T细胞装上‘GPS导航导弹’”。 Kymriah, Yescarta, Tecartus, Breyanzi：均为靶向CD19的自体CAR-T。对比：在构造上（共刺激域：4-1BB vs CD28）、适应症（白血病 vs 淋巴瘤）、生产流程上有所不同。这导致CRS/神经毒性的发生率和严重程度、起效速度、持久性存在差异。例如，含CD28共刺激域的产品可能起效更快、CRS更猛；含4-1BB域的则可能持久性更好。  CRS、神经毒性、长期B细胞缺乏。 CAR的结构设计（尤其是共刺激域）直接决定了T细胞的活化强度、扩增水平和存续时间，从而深刻影响疗效和毒性特征。 是定制化活细胞药物。不同产品为不同疾病和患者状况提供了选择。优化CAR结构以平衡疗效/毒性、开发通用型CAR-T是未来方向。总结：同靶点药物对比的核心逻辑 通过上述对比，我们可以清晰地看到药物研发中的几个核心权衡与迭代方向： 1.疗效 vs 耐药：一代药有效但易耐药→ 二代/三代药旨在克服耐药（如BCR-ABL、EGFR、ALK抑制剂）。 2.疗效 vs 选择性：一代药多靶点（强效但毒性杂）→ 二代药提高选择性（减毒保效，如BTK抑制剂）。 3.疗效 vs 毒性管理： 1.机制优化：BRAF+MEK联用，用MEK抵消BRAF的皮肤毒性。 2.毒性谱差异化：同靶点药物（如CDK4/6抑制剂）通过结构调整，产生不同的主要毒性，便于临床个体化选择。 3.给药方式优化：从静脉输注到皮下注射（如CD20抗体），改善患者体验和安全性。 4.作用机制升级：从单纯“阻断信号”（单抗/TKI）到“精准递送毒药”（ADC），再到“调动免疫大军”（双抗/CAR-T），疗效不断增强，但毒性性质和强度也发生根本变化。 5.药代动力学优化：半衰期从短到长（如CD3双抗），给药从繁到简，提高了治疗便利性和患者生活质量。 这本书的价值在于，它不仅列出了这些药物，更通过并排对比其机制、疗效数据和毒性谱，揭示了药物研发背后“针对问题、不断优化”的动态过程，以及临床决策中“权衡利弊、个体化选择”的科学依据。