Blinatumomab

摘要:多特异性抗体（MsAbs）作为新一代生物药，能同时识别两个及以上靶点，突破了传统单克隆抗体的 “单一靶向” 局限，为癌症、自身免疫病等难治疾病提供了新解法。本文从基础原理出发，拆解多特异性抗体的 “积木” 组件、组装逻辑、技术突破与临床进展，用通俗语言解读这一前沿生物工程技术如何从实验室走向临床，以及 AI、蛋白设计等技术如何推动其实现 “快速研发、精准可控” 的革命。 一、生物药的进化：从 “单箭穿心” 到 “多靶联动” 你可能对 “单克隆抗体” 并不陌生 —— 这种能精准识别并攻击特定致病靶点的生物药，早已成为抗癌、抗炎的主力军。但随着医学研究深入，科学家发现很多疾病并非单一靶点导致，比如肿瘤细胞会通过多种信号通路逃避免疫系统攻击，单一抗体往往 “力不从心”。 这就催生了生物药的 “升级版”——多特异性抗体（MsAbs）。它就像一个 “靶向多面手”，能同时识别两个或多个不同的靶点（可以是同一蛋白上的不同位点，也可以是完全不同的蛋白），实现 “1+1>2” 的治疗效果。比如，它可以一边绑定肿瘤细胞表面的特异性抗原，一边招募免疫细胞来 “围歼” 肿瘤；也能跨连不同的细胞表面蛋白，调节异常的细胞信号通路（图 1）。 自 19 世纪末现代药物研发起步，从化学合成小分子（如阿司匹林）到 X 射线晶体学解锁蛋白结构，再到重组 DNA、杂交瘤技术催生单克隆抗体，生物药的每一步突破都离不开技术革新。而多特异性抗体的出现，正是基于对免疫机制的深度理解和蛋白工程技术的成熟，目前已有 7 款药物获批上市，另有约 300 款进入临床阶段，成为生物药研发的核心热点。 二、搭建 “超级抗体”：那些关键的 “积木组件” 多特异性抗体的本质，是用不同的 “蛋白积木”（building blocks）组装出的人工分子。这些积木有的来自天然蛋白，有的是人工设计的新型组件，每一种都有独特的优势和用途（图 2）。 1.最常用的积木：Fab 片段 Fab 是免疫球蛋白 G（IgG）的一部分，由重链的 VH/CH1 结构域和轻链的 VL/CL 结构域组成，是目前临床多特异性抗体中最常用的组件 —— 约 58% 的临床候选药都用到了它。 它的优势很明显：结构稳定，表面亲水，适合高浓度配方和皮下注射。但它也有个小麻烦：需要重链和轻链正确配对，一旦组装不当就会产生杂质，科学家们通过 “电荷配对突变”“旋钮 - 孔穴技术” 等方法来解决这个问题。 2.看似完美的 “陷阱”：ScFv 片段 ScFv 是将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）用一段柔性 linker 连接而成的组件，体积只有 Fab 的一半（约 25kDa），且是单条肽链，不用考虑链配对问题，看似是理想的 “积木”。 但它藏着 “隐形缺陷”：缺少恒定区的稳定作用，热稳定性较差，容易聚集，尤其在高浓度下可能影响药效。不过这并不妨碍它的应用 —— 约 36% 的临床候选药仍在使用，比如安进的 blinatumomab 就是由两个 ScFv 串联而成。 3.后起之秀：VHH（纳米抗体） VHH 是骆驼科动物和鲨鱼体内天然存在的 “重链仅抗体” 的抗原结合区，也叫纳米抗体，体积更小（约 12-15kDa），稳定性极强，还能通过吸入给药，是有望替代 ScFv 的新型组件。 它最大的优势是 “简单高效”：无需链配对，亲和力能达到皮摩尔级（和最佳 Fab 相当），且免疫原性低 ——2019 年 FDA 批准的 caplacizumab 就是 VHH 类药物，目前已有约 10% 的临床候选药采用这一组件。 4.多功能核心：Fc 片段 Fc 是抗体的恒定区，看似不是 “靶向” 核心，却是多特异性抗体的 “功能中枢”—— 约 83% 的临床候选药都包含 Fc 片段。 它的作用主要有三个：一是通过 “旋钮 - 孔穴”“电荷配对” 等技术帮助不同组件异源二聚化，实现复杂结构组装；二是结合 FcRn 受体延长抗体在体内的半衰期，减少给药频率；三是通过结合 FcγR 等受体激活免疫效应（如抗体依赖的细胞毒性），或通过突变调控免疫活性（图 3）。 此外，细胞因子（约 14% 临床候选药使用）、微型蛋白（如 DARPin、Anticalin）、从头设计蛋白等也在逐渐成为重要积木，它们能带来新的靶向功能，解决传统抗体难以触及的靶点问题。 三、组装的艺术：如何避免 “积木搭歪”？ 多特异性抗体的组装可不是简单拼接，而是一门精密的工程学。传统的 “单一格式平台”（如 BiTE、CrossMAb）往往只能应对特定靶点，换个靶点就可能 “水土不服”—— 毕竟不同靶点的结合方式、空间结构都不同，需要灵活调整组件的排列、价态和角度。 比如，针对 CD28 靶点的多特异性抗体需要 “单价结合” 才能避免异常激活，而针对 41BB 靶点的则无需此限制；三特异性抗体需要同时识别三个靶点，可能需要 1:1:1、2:1:1 等不同价态组合，仅排列方式就有上百种可能。 科学家们正在探索 “理性设计” 思路：先根据治疗需求（如抗癌、抗炎）确定核心功能，再选择适配的积木组件（考虑稳定性、表达量、兼容性等），最后通过灵活的格式组合优化药效。比如，通过选择 “天然倾向正确配对” 的 Fab 片段，可大幅减少组装杂质；通过修饰蛋白的等电点（pI），能简化后续纯化流程。 此外，组装后的 “药物属性” 也很关键。比如，高浓度下的稳定性、体内半衰期、给药途径（静脉 / 皮下 / 吸入）等，都需要在设计阶段就考虑 —— 毕竟一款药物不仅要能在实验室发挥作用，还要能安全、方便地用于患者。 四、技术革命：AI 如何加速 “超级抗体” 诞生？ 多特异性抗体的研发曾面临一个大难题：组装组合太多、预测难度大，导致研发周期长、成功率低。而人工智能（AI）和机器学习（ML） 的介入，正在改变这一现状。 此前，蛋白结构预测需要数周时间，且准确性有限。而 AlphaFold2、RosettaFold 等 AI 工具能在几分钟到几小时内，精准预测蛋白结构，为组件设计和组装提供了清晰的 “蓝图”。比如，通过 AI 可以设计出稳定性更强的 ScFv，或优化 Fc 片段与受体的结合能力，减少实验试错。 机器学习还能预测抗体的关键属性：比如免疫原性（是否会引发人体免疫反应）、稳定性、体内代谢情况等，帮助科学家在早期筛选出更有潜力的候选药。目前，Generate Biomedicines、安进等企业已开始用 ML 攻克 “不可成药靶点”，大幅缩短研发周期。 不过，AI 也有局限性：目前缺乏专门针对多特异性抗体的大规模数据集，大多依赖单克隆抗体或单个组件的数据。未来，需要系统收集不同格式、不同组件组合的多特异性抗体数据，才能让 AI 真正实现 “精准预测、高效设计”。 五、未来展望：从 “可及” 到 “精准” 多特异性抗体的出现，打破了单克隆抗体的治疗边界，为很多难治疾病带来了新希望 —— 比如治疗血友病的 emicizumab、治疗急性淋巴细胞白血病的 blinatumomab，都已在临床上证明了其价值。 未来，这一领域将朝着三个方向发展：一是组件多样化，开发更多如从头设计蛋白、新型微型蛋白等 “定制化积木”，应对更多复杂靶点；二是格式灵活化，摆脱单一平台限制，根据疾病需求设计专属结构；三是研发高效化，通过 AI + 实验结合，实现 “设计 - 验证 - 优化” 的快速循环。 当然，挑战依然存在：如何进一步降低免疫原性、提高组装成功率、控制生产成本，都是需要持续解决的问题。但随着蛋白工程和 AI 技术的不断进步，多特异性抗体有望成为下一代生物药的核心力量，让 “精准医疗” 真正走进更多患者的生活。 从实验室里的 “积木游戏” 到病床上的治愈希望，多特异性抗体的每一步突破，都是科学与工程的完美结合。而这仅仅是开始 —— 未来，我们或许能看到更多 “超级抗体”，为人类健康筑起更坚固的防线。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

01 摘要 双特异性抗体的研发已引起广泛关注，目前已有多种不同形式的双特异性抗体被报道。其中，特别包含Fc片段的双特异性抗体大多为四价，例如稳定化的IgG-scFv融合抗体或双可变域（dual-variable domain, DVD）IgG抗体。然而，尽管这些抗体形式具有类似IgG的特性且在技术上可开发，但它们在分子大小和空间结构上与传统IgG抗体存在差异。因此，研究人员将大量精力集中在更接近天然IgG分子的双特异性异二聚体IgG抗体上。 在制备双特异性异二聚体IgG抗体时，会遇到固有的链关联问题，不过已有多种方法可解决这一问题。例如，“凸-凹”（knobs-into-holes, KiH）技术结合共同轻链策略，或CrossMab技术，这类技术可强制实现抗体链的正确关联；而另一些方法（如双功能Fab（dual-acting Fab, DAF）IgG抗体）则不依赖异二聚体Fc片段。本文综述了双特异性异二聚体IgG抗体领域的最新研究进展，并重点强调了该领域近期取得的成果。 02 引言 在重组抗体技术领域，双特异性抗体凭借其潜在优势（见表1）引发了广泛关注。从生物制药研发的角度来看，双特异性抗体需与相应的单药疗法及联合疗法形成明显差异。可以预见，在所有需要靶向特定组织、实现广泛中和作用（例如针对HIV等病毒）的应用场景中，双特异性抗体都能发挥独特价值。同样，在介导转运过程（如穿越血脑屏障）或募集效应细胞等场景下，双特异性抗体也是不可或缺的工具。此外，从药代经济学、便利性或更优的临床开发路径等角度考量，选择双特异性抗体往往比选择相应的联合疗法或共制剂更具优势；尤其是在未来治疗方案可能需要同时联合两种以上靶向生物制剂的情况下，这一优势将更为突出。 早期设计和改造双特异性抗体的研究主要集中在不含Fc片段的双特异性抗体形式上，如基于单链抗体片段（scFv）的形式或双抗体（diabody）形式。随着抗体工程技术的不断发展，尤其是抗体表达与纯化技术的显著进步，生产含Fc片段双特异性抗体所面临的技术挑战已大幅减少。令人鼓舞的临床数据进一步推动了该领域的研究热度，例如针对上皮细胞黏附分子（EpCAM）/CD3的鼠-大鼠嵌合双特异性抗体卡妥索单抗（catumaxomab，由Trion公司研发）近期已获批上市，以及针对CD19/CD3的scFv类双特异性T细胞衔接器（BiTE）blinatumomab（由安进公司研发）在B系急性淋巴细胞白血病（ALL）研究中展现出的良好临床数据。直至近期，临床试验中的双特异性抗体仍几乎全部属于效应细胞募集型；而首批双靶向非效应细胞募集型双特异性抗体已进入临床试验阶段，例如：（1）MM-111，一种半衰期延长的双特异性人血清白蛋白/人表皮生长因子受体（EGFR-HER3）scFv融合抗体（由Merrimack公司研发）；（2）SAR156597，一种针对IL-4/IL-14的双可变域IgG（DVD-IgG，由赛诺菲公司研发）；（3）CVX-241，一种针对血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-2（Angiopoietin-2）的四价双特异性CovX抗体（由CovX/辉瑞公司研发）。从已发表的文献和专利来看，未来几年内，众多双特异性抗体有望进入临床试验阶段。 在含Fc片段的四价双特异性抗体领域，已有多种抗体形式被报道，例如稳定化的IgG-scFv融合体、双可变域IgG（DVD-IgG）等。尽管这些双特异性抗体形式具有类似IgG的特性，且在技术上具备可开发性，但它们在分子大小和空间结构上与传统IgG抗体存在差异。因此，研发结构尽可能接近天然IgG的双特异性抗体仍是该领域的研究热点。 本文综述了双特异性异二聚体IgG抗体领域的研究现状与近期进展，详细探讨了多种解决该类抗体制备过程中链关联问题的方法，包括可通过结合共同轻链策略生成特定双特异性异二聚体IgG抗体的“凸-凹”（KiH）技术、CrossMab技术，以及不依赖异二聚体Fc片段的替代方法（如双功能Fab（DAF）IgG技术）。 03 链关联问题与四杂交瘤技术 通过还原和选择性重氧化等生化技术，可利用两种不同的Fab₂片段制备双特异性Fab₂片段。同理，以两种IgG抗体为原料，经还原/氧化处理后，借助相应抗原的亲和色谱法，也能生成全长双特异性IgG抗体。然而，这些方法无法大规模生产符合临床试验质量要求的双特异性抗体；因此，理想情况下，目标双特异性异二聚体IgG抗体需在单一细胞系中表达。图1展示了在单一表达细胞系中，由4条抗体重链（2条不同重链）和轻链（2条不同轻链）生成双特异性异二聚体IgG抗体时面临的核心挑战，即所谓的“链关联问题”。在图1A中，各抗体重链与轻链之间的同源二聚化及异源二聚化界面以示意图形式呈现。若抗体左右两臂采用不同的链，会导致多种链组合产物的产生：两条重链可形成四种不同的组合方式，且每种组合又会与轻链随机结合，最终产生2⁴（共16种）可能的链组合，对应10种不同的抗体，其中仅1种是具有功能的目标双特异性抗体。从复杂混合物中分离出这种目标双特异性抗体难度极大，且其理论最高产量仅为12.5%（图1B），这些因素使得在单一细胞系中生产双特异性抗体极具挑战性且经济效益不佳。尽管如此，仍有研究通过该策略成功制备出双特异性抗体：将两种不同特异性的杂交瘤细胞融合，构建“四杂交瘤（quadroma）”细胞系，该细胞系分泌的抗体混合物中即包含目标双特异性抗体。 Lindhofer等人成功克服了从四杂交瘤产生的抗体混合物中分离目标双特异性抗体的难题，所获抗体质量满足上市供应的要求。为此，他们选择从鼠-大鼠嵌合四杂交瘤细胞中表达鼠IgG2a和大鼠IgG2b嵌合抗体（图2A）。尽管鼠源和大鼠源抗体存在较强免疫原性这一主要缺陷，但采用这类抗体具有三项关键技术优势：（1）种内重链-轻链优先配对，减少错配情况；（2）异源重链可高效配对；（3）所选鼠源和大鼠源IgG亚型对蛋白A的亲和力不同，通过蛋白A亲和色谱与离子交换色谱联用，可相对简便地分离出双特异性抗体产物。利用该技术，可制备出识别EpCAM和CD3的双特异性抗体卡妥索单抗（catumaxomab），并完成其临床开发。由于鼠-大鼠嵌合Fc片段保留了效应功能，这类抗体也被称为三功能抗体（trifunctional antibodies）或Triomabs®。2009年，卡妥索单抗在欧盟获批用于恶性腹水的腹腔内治疗，成为首个获批上市的双特异性抗体。然而，由于FcγR共激活会引发严重的输注反应，卡妥索单抗无法通过全身静脉注射给药；此外，鼠-大鼠嵌合抗体的强免疫原性导致无法重复给药，且四杂交瘤技术难以实现大规模生产，所产抗体质量可能无法满足晚期癌症以外其他疾病的治疗需求。综上，四杂交瘤/Triomab技术虽在特定应用场景中具有可行性，但存在诸多缺陷，需通过人源化等先进抗体工程技术进行大幅优化，相关优化方法将在下文阐述。 04 强制重链正确异二聚化 为解决链关联问题并强制两条不同重链实现正确关联，20世纪90年代末，基因泰克（Genentech）公司的Carter等人开发了一种巧妙的技术，称为“凸-凹”（knobs-into-holes，KiH）技术。该技术的核心原理是对两条重链CH3结构域（重链间相互作用最集中的区域）的界面进行改造：在其中一条抗体重链的CH3结构域中引入一个 bulky 氨基酸残基（形成“凸起”，类似“钥匙”），在另一条重链的CH3结构域中构建一个可容纳该 bulky 残基的“凹陷”（类似“锁”）。改造后的异二聚体Fc片段还可通过人工二硫键进一步稳定。 在优化异二聚化界面的过程中，研究人员评估了多种合理设计方案，包括空间位阻互补、KiH突变、二硫键引入，以及在CH3结构域两侧引入带相反电荷氨基酸残基形成盐桥等，最终通过噬菌体展示文库筛选实现了界面的优化。向“凸起”重链引入S354C、T366W两个突变，向“凹陷”重链引入Y349C、T366S、L368A、Y407V四个突变（图3A），可使重链正确异二聚化的效率达到97%以上。尽管可能会出现“凹陷-凹陷”同源二聚体，但通常不会形成“凸起-凸起”同源二聚体；不过，要获得均一的双特异性抗体制品，两条重链的表达量需大致相等。因此，通过筛选合适且稳定的表达克隆，可进一步提高制品质量，降低“凹陷-凹陷”二聚体的含量。此外，也可通过选择性纯化工艺或下文所述方法去除“凹陷-凹陷”二聚体。值得注意的是，所有KiH突变均隐藏在CH3结构域内部，不会被免疫系统识别。 与这一观察结果一致，MetMab（一种针对cMet的单臂抗体，在大肠杆菌中表达，携带上述KiH突变）近期已成功完成Ⅱ期临床试验：在cMet高表达患者中展现出良好的疗效信号，且未观察到与传统IgG抗体存在差异的免疫原性。此外，携带KiH突变的抗体在（热）稳定性、Fcγ受体结合能力、效应功能（如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，ADCC）、新生儿Fc受体（FcRn）结合能力及药代动力学（PK）行为等方面均未受影响。 近期还出现了基于带电荷残基离子相互作用（见图3B）或空间位阻互补（见图3C）的类似技术。中外制药（Chugai）的Igawa和Tsunoda，以及安进（Amgen）的Gunasekaran等人选择改造CH3界面的电荷极性：共表达电荷匹配的Fc结构域时，有利的吸引作用会促进异二聚体形成，同时保留疏水核心；而不利的排斥电荷相互作用则会抑制同源二聚体形成。2006年，Igawa和Tsunoda发现，一条链CH3结构域中的3个带负电残基可与另一条链CH3结构域中的3个带正电残基配对，具体的电荷残基对为E356-K439、E357-K370、D399-K409（反之亦然）。在A链中引入至少两个以下突变（E356K、E357K、D399K），同时在B链中引入K370E、K409D、K439E突变（单独引入或与新发现的二硫键联合引入），可在高效促进异二聚体形成的同时抑制同源二聚体形成。由于这项研究发表于日本专利申请文件中，其影响力此前较为有限；直到近期，Gunasekaran等人才基于已解析的晶体结构，阐明了CH3-CH3界面中这些物种保守的相反电荷残基对（E356-K439、E357-K370、D399-K409、K392-D399）的作用机制。其中，K409-D399对的结构保守性最强且处于埋藏状态。随后，研究人员通过突变改变了电荷残基的极性：在A链中将K409突变为D409，在B链中将D399突变为K399。考虑到同源二聚体CH3-CH3结构域的对称性，这种改造会使同源二聚化过程中产生排斥作用，而对异二聚化产生稳定的离子相互作用。 理论上，该方法可抑制两种同源二聚体的形成（图3D）；而在KiH技术中，若“凹陷”链过量表达，仍可能检测到“凹陷-凹陷”二聚体。通过选择合适的突变组合，研究人员最终在A链引入K409D-K392D突变、在B链引入D399K-E356K突变，实现了高比例的异二聚化，且两条链的表达量相近。然而，尽管理论上具有优势，但与结合二硫键稳定的KiH技术相比，利用电荷残基对的方法并未显著提高异二聚体的产量和纯度，还可能导致抗体生产效率大幅下降。显然，将两种技术结合或许能进一步提高异二聚化效率，但从抗体制备产量及减少治疗性抗体中“非人类”突变数量的角度考虑，这种结合可能并非理想选择。 健赞（Xencor）的Moore等人基于结构计算和序列信息，设计了41组突变变体对，并通过筛选确定了异二聚化效率最高的组合。在他们的研究中，A链引入S364H、F405A突变（简称HA突变），B链引入Y349T、T394F突变（简称TF突变）（图3C），异二聚体形成比例可达89%，与未结合二硫键稳定的KiH技术及静电引导技术效果相当。 默克雪兰诺（Merck Serono）的Davis等人则基于“人IgG和IgA的CH3结构域互不结合”这一特性开发了新技术：通过交换结构相关的β-链片段，构建不对称的CH3结构域，并利用该结构域生成异二聚体IgG样抗体。他们将这类双特异性抗体命名为“链交换工程域抗体”（strand-exchange engineered domain antibodies，SEEDbodies；图2E），并证实其保留了天然Fc片段的特性；若其中一条链轻微过量表达，几乎可仅产生异二聚体制品。该技术可应用于多种IgG样抗体形式，研究人员已针对西妥昔单抗（cetuximab，商品名Erbitux®）的亲本抗体C225（一种抗表皮生长因子受体嵌合抗体，已完成临床开发）的衍生物展开了详细评估。 此外，zymeworks公司也针对“通过改造Fc界面区域生成双特异性抗体”这一方向展开了研究，并开发了名为Azymetric™的建模平台，用于生成异二聚体IgG1抗体，但目前该平台的具体细节尚未公开。 20世纪90年代初，已有研究报道利用亮氨酸拉链制备双特异性抗体，但这类构建体不含Fc片段。直到近期，基因泰克（Genentech）的Christensen、Wranik等人对该技术进行了改进：通过在抗体重链C端融合异二聚化卷曲螺旋区域，实现了异二聚体双特异性抗体的特异性生成（图2F）。该异二聚化元件可在抗体分泌过程中，或在抗体纯化过程中通过弗林蛋白酶（furin）等蛋白酶进行蛋白水解切割去除。 表2总结了用于强制重链正确关联的主要技术方法。 05 强制轻链正确关联 尽管上述方法已解决重链随机关联的问题，但确保并强制轻链正确关联同样至关重要。否则，即便采用“凸-凹”（KiH）技术，轻链仍会随机配对，导致产物中混有非目标抗体与目标双特异性抗体（图1C）。近年来，重链正确关联的研究已取得显著进展，但轻链正确关联的技术突破滞后，这在一定程度上制约了双特异性异二聚体IgG抗体领域的发展。从结构角度来看，双特异性抗体中异二聚体VL-CL/VH-CH1界面的改造需比同源二聚体CH3/CH3相互作用的改造涉及更多界面修饰，技术难度更大（图1A）。 通常，抗体的特异性由重链中的互补决定区（CDR）调控，尤其是重链CDR3；因此，解决链关联问题最直接的思路是采用共同轻链策略（图2C）。该策略需通过噬菌体展示技术或免疫共同轻链转基因动物，筛选出可与两种不同重链配对、且分别识别对应抗原的共同轻链。近期已有研究报道了应用共同轻链策略制备双特异性抗体的典型案例：基因泰克（Genentech）的Jackman等人将共同轻链与在大肠杆菌中分别表达半抗体的技术结合，构建出可交联FcεRI与抑制性受体FcγRIIb的双特异性抗体，从而抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和力IgE受体FcεRI的活性。该抗体有望用于哮喘及其他过敏性疾病的治疗。 尽管共同轻链策略原理简单，但目前已报道的应用案例较少，且尚无基于该策略的抗体进入临床阶段。这可能是因为该策略无法直接利用已验证的现有抗体，而需重新筛选适配共同轻链的新型抗体对；同时，由于采用共同轻链会降低天然抗体的多样性，目前尚不确定该策略是否适用于任意抗原对的双特异性抗体制备。 因此，开发可将现有抗体通用转化为轻链正确关联的双特异性异二聚体IgG抗体的新技术，仍具有重要意义。与CH3结构域KiH技术类似，研究人员也在探索通过改造轻链-重链异二聚体相互作用，最终实现全双特异性IgG的制备。Zhu等人在双抗体（diabody）变体的两个VL/VH界面引入空间互补突变及二硫键：在抗p185HER2抗体的VL/VH界面引入VL Y87A:F98M和VH V37F:L45W突变后，所获得的异二聚体双抗体产量超90%，且总产量与亲和力均与亲本双抗体相当。 中外制药（Chugai）的研究人员也采用了类似思路：通过在VH-VL界面引入突变（主要是将VH的Q39和VL的Q38突变为带电荷残基），促进轻链正确关联，从而构建双特异性双抗体。尽管这些方法能在双抗体系统中实现重链-轻链的正确配对，但尚不清楚其能否完全消除或充分抑制错配，以满足双特异性异二聚体IgG抗体制备的要求。 我们（罗氏公司）近期开发了CrossMab技术，该技术与KiH技术结合，可解决双特异性异二聚体IgG抗体中轻链正确配对的问题（图2D），并能以通用方式利用现有抗体制备双特异性抗体。在该技术体系中，目标双特异性抗体的其中一条臂保持不变，另一条臂则通过重链与轻链Fab结构域（VH-VL或CH1-CL）的域交换进行改造（图4）。改造后，新形成的“交叉”轻链不再与双特异性抗体另一条臂的重链Fab区域发生关联，从而通过这种最小化的域结构调整，实现轻链的正确关联。 早期理论预测显示，CrossMabFab和CrossMabVH-VL可能产生特定副产物，而CrossMabCH1-CL无理论副产物。实际瞬转表达结果也证实：CrossMabFab会产生无功能的重链二聚体及非功能性Fab片段；CrossMabVH-VL会形成类似Bence-Jones蛋白的副产物；而CrossMabCH1-CL的副产物谱最优，纯度最高。 设计CrossMab序列时，需确保域交换后的Fab结构域（CrossFab）稳定性不受影响且三维结构正常。实验结果显示，单特异性CrossMab的稳定性与表达量均与亲本未修饰IgG抗体相当。同时，不同连接子的测试结果表明，连接子不会影响抗体的表达效率、结合能力及稳定性；回溯分析还预测，所选连接子不含T细胞新表位，因此CrossMab技术预计无免疫原性风险。 利用该技术，研究人员基于贝伐珠单抗（bevacizumab）与Ang-2选择性抗体LC06这两种现有抗体，构建了三种针对血管生成素-2（Ang-2）和血管内皮生长因子-A（VEGF-A）的双特异性CrossMab变体，旨在同时阻断Ang-2与VEGF-A这两种血管生成因子。表面等离子体共振（SPR）与细胞实验结果显示，所有三种Ang-2/VEGF CrossMab的两条不同臂均保留了对VEGF-A和Ang-2的抗原结合亲和力，且在干扰相应受体相互作用、抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖及Ang-2诱导的Tie2磷酸化方面，效果与亲本抗体相当。 基于更优的理论与实际副产物谱，研究人员选择Ang-2/VEGF CrossMabCH1-CL进行后续实验。在Colo205皮下移植瘤模型中，该分子展现出强效的肿瘤生长抑制活性与抗血管生成作用，疗效优于贝伐珠单抗单药治疗；在VEGF诱导的角膜囊袋模型中，Ang-2/VEGF CrossMabCH1-CL可完全阻断血管生成，且疗效同样优于贝伐珠单抗。此外，该分子保留了对FcγRIIIa和FcRn的结合亲和力，在小鼠与食蟹猴体内的药代动力学（PK）特性与标准IgG1抗体相当。 CrossMab技术可在瞬转HEK293细胞与稳定中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达系统中应用；但为获得极低KiH或CrossMab相关副产物的优质制品，筛选能稳定且均衡表达四条抗体重链与轻链的CHO细胞克隆至关重要。因此，在克隆筛选阶段需通过夹心ELISA、反相高效液相色谱（RP-HPLC）或毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）等方法进行早期产物评估。通过该流程，研究人员成功获得了Ang-2/VEGF CrossMabCH1-CL表达量达数克/升的CHO细胞克隆，表达量与标准IgG工艺相当，且后续可通过成熟的下游纯化（DSP）工艺进行纯化与制剂。同时，该分子的热稳定性与长期稳定性均与亲本抗体相当；此外，对分离的CrossFab进行X射线晶体学分析，结果证实其结构符合分子建模预测，且处于传统IgG抗体Fab片段的构象空间范围内。 综上，域交换（即CrossMab）技术与带稳定二硫键的KiH技术结合，可在生产规模上解决双特异性抗体中轻链正确组装的难题。CrossMab技术的优势在于，其可近乎通用地应用于现有抗体对，无需改变抗体基本结构，也无需筛选共同轻链——贝伐珠单抗与LC06构建Ang-2/VEGF CrossMab的案例便证明了这一点。此外，域交换原理不仅限于1+1形式的双特异性抗体，还可应用于需要轻链正确关联的其他形式（如四价IgG-Fab融合体）。 06 无需强制重链异二聚化的双特异性异二聚体IgG抗体 在前一节中，我们总结了通过系统性改造两条重链CH3结构域界面，以促进重链异二聚化的各类方法。此外，通过蛋白质工程改造（不直接影响重链二聚化本身，而是依托成熟的纯化技术），也能实现目标异二聚体产物的富集。 与Triomab技术（利用鼠源和大鼠源IgG亚型对蛋白A的亲和力差异分离目标异二聚体）类似，可将IgG3中已知的、能破坏蛋白A结合能力的氨基酸残基插入其中一条IgG1的CH3结构域，使该重链失去与蛋白A结合的能力。由此产生的双特异性抗体会形成三类产物：含两条可结合蛋白A重链的抗体、含一条可结合蛋白A重链的抗体（即目标异二聚体）、不含可结合蛋白A重链的抗体，后续可通过色谱法将这三类产物分离。再生元（Regeneron）的Davis等人便采用了这些已知突变，并结合共同轻链策略，成功制备出双特异性异二聚体抗体（图5A）。 中外制药（Chugai）的Igawa和Tsunoda也采用了类似思路：通过改造抗体重链可变区的氨基酸残基，使两种抗体的重链产生等电点差异，进而利用离子交换色谱分离目标双特异性抗体。 双特异性抗体的体外组装制备 近期，基因泰克（Genentech）的Jackman等人报道了一种近乎通用的替代方法——将KiH技术与半抗体分别表达相结合。具体而言，将携带“凸起”或“凹陷”突变的两条重链，分别与其对应的轻链配对形成半抗体，并在不同的大肠杆菌培养体系中表达、分离。随后，从大肠杆菌周质中提取半抗体，通过体外组装使两条半抗体形成双特异性抗体（图2B）。该方法通过避免在单一细胞系中共表达四条不同的抗体重链与轻链，在半抗体表达阶段即可实现轻链的正确关联，无需借助域交换或其他策略；而后续重链的正确异二聚化，则通过体外KiH技术实现。 该方法存在一个明显局限：由于半抗体在大肠杆菌中表达，最终产物缺乏糖基化修饰。因此，对于需要抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）等效应功能的IgG1抗体，该方法无法完全通用。此外，并非所有抗体都适用于大肠杆菌表达系统。尽管如此，Yu等人仍利用该方法设计出一种双特异性抗体：该抗体以低亲和力结合转铁蛋白受体（TfR），以高亲和力结合β-分泌酶（BACE1）。研究表明，这种TfR/BACE1双特异性抗体能增强血脑屏障穿透能力，并在小鼠脑内富集。 在另一项配套研究中，Atwal等人发现，抗BACE1抗体治疗能持续减少外周和中枢神经系统中的β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块。这使得TfR/BACE1双特异性抗体成为改善阿尔茨海默病治疗中抗体脑摄取效率的潜在候选药物——而这是传统单特异性BACE1抗体无法实现的。 另一种制备双特异性异二聚体抗体的技术，基于IgG4在体内外均会发生“Fab臂交换”的特性。免疫球蛋白的两条臂通过CH3结构域间的疏水作用、静电作用以及铰链区的两个二硫键连接。与IgG1相比，IgG4的CH3结构域间亲和力更低；因此，将两种不同的IgG4抗体混合后进行还原-再氧化处理，会导致半抗体分离并重新组合，最终形成的混合物中，包含两种原始同源二聚体抗体（各占25%）和一种异二聚体双特异性抗体（占50%）。在此过程中，中间产物半抗体由一条重链与其正确配对的轻链组成，不会出现轻链错配问题。 基因麦布（Genmab）的Schuurman及其团队将IgG4的这一特性应用于IgG1型双特异性抗体的构建：通过在两条重链的CH3结构域各引入一个点突变，在体外实验中（以两种单独制备并纯化的单特异性抗体为原料），使反应平衡向目标异二聚体（即Duobody）方向偏移（图5B）。 类似地，瑞纳（Rinat）/辉瑞（Pfizer）的Strop及其团队通过改造人源IgG1和IgG2抗体的铰链区与CH3结构域（引入K409R和L368E突变），使两种抗体在适宜的氧化还原条件下混合后，能高效形成全长双特异性抗体。具体而言，他们先表达两种不同的抗体（例如分别靶向CD20和CD3的抗体）：其中一种抗体引入L368E突变，并根据抗体亚型在铰链区引入相应突变（IgG1为221E、228E；IgG2为223E、225E、228E，简称“EEE”突变）；另一种抗体引入K409R突变，并在铰链区引入互补的精氨酸突变（IgG1为221R、228R；IgG2为223R、225R、228R，简称“RRR”突变）（图5C）。随后，将两种抗体纯化，按等摩尔比例混合，并加入温和的还原剂进行反应。后续实验证实，该方法制备的双特异性抗体具有与天然IgG相当的稳定性，对Fcγ受体（FcγR）和新生儿Fc受体（FcRn）的亲和力未受影响，药代动力学（PK）特性也保持正常；同时，在体外实验中展现出预期的细胞毒性，在体内实验中能有效清除B细胞。 泛特异性抗体与双功能Fab（DAF）IgG抗体 “双特异性”“多特异性”或“泛特异性”抗体，指能特异性识别多种靶标且无非特异性结合的单克隆抗体（图5D）。事实上，与单克隆抗体“高特异性、高选择性”的传统认知不同，在炎症性疾病领域，天然蛋白（如病毒趋化因子抑制剂vCCI、天花病毒细胞因子反应调节剂CrmD）已被证实具有“多靶点结合、广谱特异性且高亲和力”的特性。诺华免疫（Novimmune）的M. Kosco-Vilbois、N. Fischer等人基于这一发现，开发出所谓的“泛特异性抗体”——这类抗体可识别并抑制多种炎症介质，用于解决生物系统中的功能冗余问题。研究团队通过大规模噬菌体展示筛选与亲和力成熟实验，成功筛选出能同时识别并抑制CXCR3配体CXCL9与CXCL10（且不干扰CXCL11）的抗体。表位映射实验证实，这种泛特异性是通过“结构模拟”机制实现的。 在此背景下，需明确区分三类抗体：（1）识别蛋白家族（如HER家族、血管生成素家族）中“保守共有序列”或“相同结构表位”的抗体（结构一致性介导的多特异性）；（2）识别两种不同序列（如趋化因子受体配体）但构象相似靶标的抗体（结构模拟介导的多特异性）；（3）通过互补决定区（CDR）的不同区域，以不同结合构象和取向识别两种完全不同表位的抗体。基因泰克（Genentech）的Bostrom、Fuh等人开发的抗体便属于第三类，这类具有双特异性的抗体被称为“双功能Fab（DAF）IgG抗体”或“二合一抗体”。 DAF技术的核心思路是：以“主要通过重链CDR结合抗原”的抗体为起始材料。这类抗体可通过“针对抗原A筛选重链CDR受限文库”获得；第二步，在重链恒定的前提下，通过轻链洗牌（light chain shuffling）从上述候选抗体中筛选出“既能结合抗原B、又保留对抗原A结合亲和力”的抗体；最后，对获得的候选抗体进行多轮亲和力成熟，直至满足性能要求。 Bostrom等人最初以曲妥珠单抗（trastuzumab）为骨架，验证了DAF技术的可行性——成功构建出能同时结合HER2与VEGF-A的DAF抗体。目前，针对EGFR/HER3的DAF IgG1抗体MEHD7945A已进入Ⅰ期临床试验。研究团队已解析出这两种DAF抗体的Fab片段分别与对应抗原结合的复合物结构，清晰展示了DAF IgG抗体的CDR如何同时容纳两种完全不同抗原的结合位点（图6）。 与其他双特异性抗体形式不同，DAF技术在实现双特异性的同时，保留了传统IgG抗体的所有典型优势（如低免疫原性风险）。但DAF抗体的存在与否，高度依赖于“目标抗体与两种抗原形成复合物的结构特性”——可能无法筛选出同时满足“靶标结合、表位识别、信号抑制”等所有需求的理想双特异性候选分子，其通用适用性仍需更多实验验证。 此外，由于DAF抗体的每条臂都可能随机结合两种抗原中的任意一种，理论上存在五种结合模式（不结合任何抗原、结合两个A抗原、结合一个A抗原与一个B抗原、结合两个B抗原、不结合任何抗原）。与其他双特异性抗体形式相比，这种随机性会直接影响“低亲和力靶标”的有效抗体剂量，导致DAF抗体的药代动力学（PD）行为更为复杂。 因此，在选择DAF抗体还是传统双特异性抗体作为治疗方案时，需结合具体治疗场景综合判断。例如，由于“单价或双价抗原结合的不确定性”，无法采用DAF形式构建EpCAM/CD3或CD19/CD3双特异性抗体——这类抗体极可能导致CD3交联，进而引发非特异性T细胞活化。基于这些结构与治疗层面的局限性，双功能Fab抗体虽为双特异性抗体工具箱增添了新选择，但并非所有双特异性需求的“万能解决方案”。 07 双特异性四价IgG融合体/缀合物 尽管本文综述的核心是双特异性异二聚体抗体，但此处仍将介绍两种基于通用IgG格式的双特异性抗体技术。 第一种是Fc抗原结合（Fcab）技术：该技术利用IgG抗体CH3结构域中的三个环状区域构建类抗体文库，在保留免疫球蛋白折叠（Ig-fold）整体结构完整性的同时，模拟IgG可变区中互补决定区（CDR）的抗原结合功能——每个CH3结构域可结合一个抗原，从而使抗体具备双价结合能力。Rücker等人通过酵母展示技术，成功筛选出能结合HER2的Fcab，且这类Fcab仍保留常规Fc结构域的所有特性。将Fcab整合到常规IgG格式中，即可获得双特异性抗体，这类抗体被称为Mab2（图5E）。 第二种是由CovX研究公司的Doppalpaudi等人开发的CovX体技术：该技术以具有催化活性的通用IgG抗体为骨架，通过噬菌体展示筛选获得多种结合肽，并将其缀合到IgG骨架上。其中，骨架抗体可催化醛缩酶反应，使每条Fab臂疏水口袋中的重链赖氨酸（具有亲核性）发生共价修饰，从而实现结合肽与IgG的连接。尽管CovX体的药代动力学（PK）特性与常规IgG抗体存在差异（例如，一种抗Ang-2的CovX体β半衰期为72-110小时），但该技术能显著改善肽类分子的药代动力学性能。显然，该技术可用于缀合单价或双特异性结合肽，进而开发多种CovX体——例如CVX-241：通过双特异性结合肽实现对Ang-2和VEGF-A的同时结合，最终形成双特异性“四价”肽-抗体融合体（图5F）。需特别说明的是，尽管CovX体属于双特异性分子，但其本质是单特异性IgG与肽段的缀合物，与本文前述其他双特异性抗体格式存在系统性差异。CVX-241已进入Ⅰ期临床试验，但近期因分子半衰期短于预期（推测与稳定性不足有关）或嵌入肽段潜在免疫原性问题，该临床试验已终止。 08 展望 近年来，抗体工程领域取得了显著进展。这一进步得益于抗体筛选技术（如噬菌体展示、核糖体展示）的革新、快速测序、克隆与基因合成方法的应用、更高效的瞬时及稳定表达系统，以及先进的纯化与分析技术。这些努力催生出大量已发表和已申请专利的双特异性抗体格式（见图2和图5），充分体现了重组抗体高度的模块化特性。即便对于该领域的资深研究者而言，众多新颖且巧妙的技术方案（或尚未探索的思路）也令人惊叹。 值得注意的是，这些研究成果大多由生物制药公司的科研人员完成，未来若能在学术领域进一步应用这些技术，或将带来更多突破。然而，双特异性抗体格式的多样性（无论是二价还是四价）也引发了一系列问题：理想的双特异性抗体应具备哪些特征？这些双特异性抗体及其格式在临床试验中会如何体现差异化优势与疗效？未来是否会出现一种主流格式，还是在数年之后，临床试验（乃至最终上市产品）中仍会并存20种不同的双特异性抗体制备平台？ 我们认为，双特异性异二聚体IgG抗体在未来数年仍将占据重要地位，因为其模拟了天然二价IgG抗体的进化设计，且具备功能性Fc片段。尽管如此，针对特定应用场景，仍需开发具有传统IgG格式无法覆盖的额外功能的定制化双特异性抗体。显然，双特异性抗体已具备进入更多临床试验的条件，并有望在未来5-10年内推动医学科学的进步。