Inotuzumab Ozogamicin

注：文章内容源自书籍Antibody Drug Conjugates-Design, Discovery, and Development第"Bioanalytical Methodologies for Pharmacokinetic Characterization of Antibody Drug Conjugates"章内容的翻译，仅供个人学习用，如有不当敬请原谅。 摘要 ADC的结构由细胞毒性药物与单克隆抗体偶联而成。由于其组成成分复杂，需采用复杂的生物分析策略对ADC的PK特征进行表征。本章探讨了PK表征所需的生物分析检测方法和相关参数，包括利用配体结合法和质谱法对总抗体、总ADC、游离载荷及其代谢物、DAR以及免疫原性进行检测分析。对ADC进行全面分析，需要综合理解抗体的稳定性、连接子化学性质、载荷特征以及潜在的免疫原性。构建完善的生物分析体系对于阐明暴露-反应关系、支持ADC的进一步优化和开发至关重要。总体而言，分析的选择性、灵敏度和创新性是解析ADC复杂处置机制的关键。 目录 引言 ADC为将具有特异性靶点递送功能的治疗性单克隆抗体与具有抗癌活性的高活性细胞毒性载荷协同结合提供了独特可能，近年来其应用还拓展至传染病、免疫科学和神经科学等领域。ADC的独特性质使其成为制药行业中一种极具价值且重要性日益提升的工具，有望增强靶向治疗效果、提高治疗指数并解决耐药性问题。随着ADC在医学领域的应用日趋普及，相关监管思路也不断发展。美国FDA近期发布了《抗体药物偶联物的临床药理学考量》最终指南，其中详细探讨了生物分析方法、给药与暴露-反应关系、内在因素（如器官损伤、药物基因组学）、QTc间期评估、免疫原性以及药物相互作用等内容（FDA，2024）。ADC药物的成功开发需要全面理解靶点生物学、单克隆抗体性质、连接子化学性质和载荷特征，其安全性和有效性取决于对抗体、连接子和毒素各单个组分的优化。同样，构建一套能够成功表征ADC PK特征的完整生物分析体系，也依赖于针对各单个组分的多种检测方法的优化。开发一款具有前景的ADC，需要建立完善的PK/PD研究体系，包括在整个开发过程中开展特征表征，以明确化合物的安全性和有效性。该生物治疗药物的各个组分（单克隆抗体、连接子、毒素）均会影响ADC的整体ADME特征。要全面表征新型ADC的ADME特征，需评估单克隆抗体的处置和清除、载荷的解偶联与释放，以及毒素的代谢和排泄。由于ADC本身存在结构和功能的复杂性，相较于小分子药物或单一治疗性抗体，对其PK特征进行成功表征的难度更大，且需要开发更多的检测方法。为恰当表征ADC及其可能存在的多种分子形态，需要一套独特的生物分析检测方法，包括检测总抗体、总ADC、游离载荷及其代谢物，并在动物试验中评估DAR。通过这些方法获得的综合数据集，能够全面理解ADC的PK、安全性和有效性特征。总抗体（TAb）、ADC（带有至少一个载荷的抗体或抗体片段）、未偶联载荷（游离载荷）或具有药理活性的代谢物检测，是从小分子药物或生物药常规检测方法衍生而来的典型PK检测手段，而DAR评估则是一类新型检测方法，可反映DAR分布特征。根据 FDA的ADC相关指南（FDA，2024），从首次人体试验开始，就需对ADC及其组成成分、具有药理活性的代谢物进行检测，以明确药物的暴露-反应关系。所有生物分析方法均应按照FDA指南（FDA，2018）以及ICH M10《生物分析方法验证》（2022年11月）的规定进行验证和报告。由于DAR检测方法通常仅用于临床前研究中的DAR类型分析，可针对该方法建立符合研究目的的验证标准。此外，还需采用合适的ADA检测方法，评估由单克隆抗体、毒素或连接子引发的ADC潜在免疫原性。本章后续章节将对这五类检测方法分别进行探讨。 总抗体定量检测TAb 抗体具有双价特性，在药物靶点存在的情况下，可以游离、部分结合和完全结合等多种形式存在。游离或部分结合的抗体仍可与靶点结合，而完全结合的抗体则与可溶性药物靶点或ADA完全结合。总抗体指ADC存在的所有形式，包括完全结合的抗体和“游离”抗体（即两个臂或一个臂可与靶点结合的游离和部分结合抗体），且这些形式均可能与载荷偶联或未偶联。明确抗体总形式与游离形式的区别，对于开发合适的检测方法、表征ADC并支持药物开发至关重要。准确了解生物分析检测方法的检测对象，才能对数据进行合理解读，并表征其PK特征。从ADC的生物分析角度来看，总抗体可定义为DAR为0至N的抗靶点抗体。具有特定设计DAR的完全偶联型ADC是理想的药物形式，但实际中，给药制剂中可能存在少量未偶联的“裸”抗体。此外，体内循环中连接子发生裂解，载荷从ADC上脱落，也会产生未偶联抗体。非可裂解连接子可最大程度减少这种情况的发生，因为载荷主要通过抗体的内吞作用和溶酶体降解实现释放，在这种情况下，回到循环中的裸抗体数量应不显著。 完全偶联的ADC是药物的治疗活性形式，也是了解该分子PK特征的核心形式。但裸抗体仍能与靶点结合，并发挥与偶联形式不同的一定治疗作用，如ADCC或CDC。由于裸抗体保留了与靶点结合的能力，其在循环中的存在可能改变PK特征、影响疗效和安全性，还会因与ADC竞争靶点结合而增加数据解读的复杂性。ADC与裸抗体的比例可能随时间发生变化，这一问题值得关注，因此必须同时监测总抗体和ADC的浓度，尤其是在临床前研究和早期临床试验中首次表征ADC性质时。裸抗体的浓度可通过总抗体与ADC的检测浓度差值推算得出。了解ADC的连接子化学性质（可裂解与非可裂解），并在临床前和早期临床试验中密切监测多种ADC形式，能够明确总抗体与ADC的浓度比是否随时间发生显著变化。若两种形式的比例保持恒定，或浓度变化微小，则可为后续开发及后期临床试验中仅监测ADC浓度提供依据。以下章节将探讨常用于检测循环中总抗体水平的配体结合试验（LBA）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法。 配体结合试验 LBA LBA常被用于检测循环中治疗性单克隆抗体的浓度，ADC的总抗体形式检测也不例外。尽管LBA仍广泛应用于总抗体检测，但需注意的是，根据研究项目要求，尤其是最低定量限（LLOQ）的需求，杂化LC-MS可能更为适用，且该方法可同时用于总抗体和总ADC的定量检测，提升检测效率（见“LC-MS/MS”章节）。 总抗体定量检测可采用多种试验形式（见图1）。药物开发的不同阶段可能需要不同的检测方法：在临床前PK/TK研究中，可采用通用检测方法，以能与抗体非可变区结合的抗人抗体同时作为捕获试剂和检测试剂。目前市售有多种亲和纯化的多克隆和单克隆抗体，不会与动物血浆或血清中的内源性免疫球蛋白G发生交叉反应。临床研究中更常用的其他检测形式包括，以抗独特型抗体或靶点蛋白为捕获试剂，以抗独特型抗体为检测试剂（图1a-c）。这些形式可实现更低浓度的最低定量限，因此适用于ADC给药剂量低于TK研究的临床场景。除检测形式外，最常用的检测平台为基于微孔板的比色、化学发光或电化学发光检测平台，以及Gyros检测平台。目前已有大量经同行评审的文献和监管指南，详细阐述了治疗性抗体配体结合试验的开发和验证方法（FDA，2018；ICH，2022；斯莫莱茨等，2005；EMA，2011）。 图1 典型的LBA和ADA检测方法形式。图a-c为总抗体LBA分析的潜在策略：a-以抗独特型抗体捕获ADC，再以抗可结晶段检测抗体进行检测；b-以靶点蛋白为捕获试剂捕获ADC，随后以抗可结晶段抗体进行检测；c-以抗独特型抗体/靶点蛋白为捕获试剂捕获ADC，以抗独特型抗体为检测试剂。图d和e分别为采用ELISA和电化学发光试验的抗药物抗体桥接检测常用形式 在研究项目开发早期，需开展额外的验证评估，以确保检测方法确实能检测到目标物质，即所有形式的抗体，且不受其偶联形式或药物抗体比的影响。开发总抗体检测方法的一个关键考量是，确保用于检测总抗体浓度的方法不受ADC偶联状态的影响，即无论ADC偶联的载荷数量为0至N，总抗体检测方法的性能均不受影响。将裸抗体至完全偶联抗体等不同DAR的质控样品，与含完整ADC的参考标准品或给药制剂进行对比，可验证这一特性。与其他监管验证要求一致，对这些亚组质控样品的准确度和精密度设定验收标准，可验证检测方法是否不受DAR的影响。新一代ADC正通过工程化改造实现定点偶联，对于这类ADC，需验证偶联位点是否不会干扰检测方法对抗体的识别。以裸抗体为参考，对比其与单个或多个不同位点偶联抗体的检测方法性能，对于确保所选偶联位点不干扰总抗体检测而言，可能是必要的。解决这些问题的主要障碍在于关键参考试剂的获取，如不同DAR的ADC制剂、抗独特型抗体和靶点抗原，这些试剂是对ADC进行恰当、全面表征的必要条件。 Kadcyla（Trastuzumab emtansine，T-DM1）是一种带有非可裂解硫醚连接子的ADC，已获临床批准用于治疗HER2+乳腺癌患者。研究人员采用LBA，以重组HER2胞外域为捕获试剂、羊抗人F(ab′)2免疫球蛋白G可结晶段为检测试剂，对猴和人血清中的总曲妥珠单抗进行检测。经验证的总抗体检测方法可对所有能与HER2胞外域发生免疫反应的T-DM1 DAR亚型进行定量，包括完全偶联、部分偶联和完全未偶联的T-DM1。此外，Adcetris (Brentuximab vedotin)是获批用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤的ADC，其总抗体检测也依托经验证的ELISA开展。该方法采用桥接法，以抗ID30同时作为捕获试剂和检测试剂，报告的检测范围为12.5~400 ng/mL。 液相色谱-串联质谱试验 LC-MS/MS 大量文献证实，LC-MS/MS可用于治疗性蛋白（包括单克隆抗体）的定量检测。此外，近期有文献报道已开发出可同时检测总抗体和ADC的方法。目前已报道的LC-MS/MS均有一个共同特点，即通过蛋白酶消化，将产生的肽段作为替代标志物进行监测。基于质谱的总抗体分析方法主要包括：1）无需样品富集的直接LC-MS/MS分析；2）利用蛋白沉淀进行样品富集的溶剂介导共沉淀-LC-MS/MS；3）结合LC-MS/MS检测与免疫亲和样品富集的杂化方法。杂化方法近年来备受关注，成为抗体定量检测的潜力方法。免疫亲和富集与LC-MS/MS的高选择性相结合，可有效检测和定量治疗性蛋白。但杂化LC-MS的局限性在于通量相对较低、灵敏度不足，通常比配体结合试验需要更多的样品量。所有基于质谱的方法均包含两个相同的步骤：酶解和LC-MS/MS分析，而后两种方法还会在后续处理和分析前采用富集技术简化样品基质。 样品富集 血浆和血清是总抗体生物分析中常用的两种基质，这类基质成分复杂、不均一，且含有大量高丰度内源性蛋白，给LC-MS/MS检测总抗体带来了巨大挑战。样品富集（如免疫捕获或溶剂介导沉淀）可通过以下方式，解决LC-MS/MS检测抗体的固有难题：（1）对生物基质中的样品进行富集，提高总抗体的质谱信号，以达到所需的检测限；（2）去除高丰度内源性成分，降低质谱检测的背景噪音；（3）提高酶解效率，减少酶解所需的蛋白酶用量。尽管免疫耗竭和过滤等其他方法也已成功用作富集步骤，但应用频率低于免疫捕获和溶剂介导共沉淀法，因此本章不对此进行赘述。在样品提取中采用抗独特型或抗人免疫球蛋白G可结晶段免疫捕获，通常可得到纯度较高的样品，直接用于LC-MS/MS分析。与之相反，蛋白A和蛋白G下拉法的选择性较低，溶剂介导共沉淀或直接酶解法制备的样品纯度较差，背景噪音更高，且存在干扰信号。在这些情况下，若需要更高的检测灵敏度，可能需对肽段进行样品纯化（如固相萃取或肽段免疫捕获）。 免疫亲和捕获 与LBA类似，在采用LC-MS/MS分析检测前，可使用多种试剂从复杂基质中免疫捕获ADC的总抗体，包括蛋白A/蛋白G、抗人免疫球蛋白G可结晶段抗体、靶点抗原和抗独特型抗体（见图2）。从下拉选择性来看，蛋白A/蛋白G通常可与所有哺乳动物的IgG结合（图2a），抗人IgG Fc试剂仅能与人IgG结合（图2b），靶点抗原（图2c）或抗独特型抗体（图2d）可特异性结合ADC抗体部分的互补决定区（游离和部分结合形式），抗药物抗体则与载荷结合（图2e）。对于通用的免疫捕获流程，可采用蛋白A/蛋白G或抗人IgG Fc抗体（优选，因通常不与动物内源性IgG发生交叉反应）进行总抗体的下拉捕获。具体而言，在临床前研究中，若抗独特型试剂尚未研发成功，可开发这类通用方法，且该方法通常可成功应用于不同动物物种的总抗体定量检测。在临床试验中，优选抗独特型免疫捕获法，可特异性下拉目标ADC（游离和部分结合形式）。但临床前和临床试验的方法开发均高度依赖于针对目标ADC总抗体的高质量试剂的获取。 图2 ADC免疫捕获方法。ADC的免疫捕获方法包括多种用于捕获ADC以进行评估的手段。在选择方法时应考虑ADC的特性以及生物分析测量：a）通过蛋白A/G捕获IgG Fc区；b）抗Fc抗体捕获；c）靶点捕获；d）抗独特型捕获；e）抗有效载荷捕获 溶剂介导共沉淀法 作为免疫捕获的替代方法，可使用甲醇或其他有机溶剂使ADC与其他内源性蛋白共同沉淀形成沉淀团，再进行酶解。但该样品富集方法不具备选择性，沉淀中包含大部分内源性蛋白，因此不适用于高灵敏度的总抗体检测，也无法用于检测未结合抗体（无法区分游离总抗体与结合或部分结合的总抗体）。 酶解 目前有多种蛋白酶可用于将蛋白消化为肽段（如胰蛋白酶、精氨酸C蛋白酶、天冬氨酸N蛋白酶、谷氨酸C蛋白酶、赖氨酸C蛋白酶和木瓜蛋白酶），每种蛋白酶具有不同的酶切位点特异性。胰蛋白酶可特异性切割赖氨酸和精氨酸羧基端的肽键（脯氨酸氨基端除外），被广泛用作多种标准蛋白消化方法的首选蛋白酶。此外，赖氨酸和精氨酸在抗体序列中丰度高、分布均匀。在二硫键还原和半胱氨酸烷基化后，胰蛋白酶酶解产生的肽段（7~20个氨基酸）通常适用于LC-MS/MS分析。尽管胰蛋白酶是蛋白酶解的常用且稳定的蛋白酶，但蛋白酶的选择需根据ADC的肽序列单独确定，确保能产生合适的特异性替代肽段用于定量检测。近期研究表明，利用纳米表面和分子取向限制（nSMOL）化学技术，可对ADC的抗原结合片段（FAb）进行选择性酶解，同时最大限度减少其他分析物肽段的干扰。 LC-MS/MS分析 在基于质谱的蛋白生物分析定量领域，通常以代表性（替代）肽段而非完整蛋白作为检测对象，这一方法由灵敏度考量决定，现已成为被广泛接受的策略。在这类检测中，替代肽段的选择需综合考虑氨基酸序列、理化性质和酶解特征，所选肽段应能准确反映样品中目标蛋白的存在和丰度。 可利用计算机酶解工具（如Skyline软件）准确预测特定ADC可能产生的胰蛋白酶（或其他蛋白酶）酶解肽段，通过纯ADC的酶解试验，可确定哪些肽段具备适用于质谱检测的灵敏度和选择性。所选的替代肽段应具备以下特征：（1）由约7~20个氨基酸组成，且不受内源性成分的显著干扰；（2）为目标ADC序列所特有；（3）在从酶解到分析的样品制备过程中保持稳定。在动物试验中，对ADC的人IgG1或IgG4进行定量时，可将Fc中的通用肽段VVSVLTVLHQDWLNGK作为替代肽段；而在临床试验中，为最大限度减少基质干扰并达到所需的灵敏度，应选择独特型区域的肽段作为替代肽段。大多数先进的三重四极杆质谱仪（如赛默飞世尔7500、赛默飞世尔6500+、热电科技TSQ等）在选择反应监测（SRM）模式下运行，可对替代肽段实现足够的检测灵敏度（ng/mL级别）。通常选择长分析柱（如2.1×100 mm），以最大限度减少内源性成分以及ADC其他肽段可能造成的色谱干扰。在某些情况下，若需要更高的灵敏度，可采用微流或纳流液相色谱技术。 综上，总单克隆抗体定量的典型流程包括样品富集、酶解和LC-MS/MS分析。在各类样品富集方法中，杂化免疫捕获-LC-MS/MS流程的灵敏度通常高于溶剂介导共沉淀法或直接LC-MS/MS法。在临床前研究中，优选抗Fc段下拉结合LC-MS/MS法进行总抗体（结合型、游离型）定量；而在临床试验中，为实现对游离总抗体的高灵敏度检测，优选抗独特型抗体结合LC-MS/MS法。由于蛋白A和蛋白G下拉法、溶剂介导共沉淀法或直接LC-MS/MS法的选择性较低，这些方法在总抗体定量中的应用频率较低，且可能无法达到所开发检测方法所需的灵敏度。 总抗体定量检测小结 LBA用于总抗体定量时，具有灵敏度高、通量高的优势，且仪器成本低，相关验证经验丰富。但该方法依赖关键试剂保证检测特异性，且易受基质干扰和不同DARs结合亲和力差异的影响。另一方面，LC-MS/MS法，尤其是杂化免疫捕获-LC-MS/MS法，具有特异性强（基质效应小）、灵敏度良好、标准曲线范围宽、方法开发周期短等优势。因此，杂化免疫捕获-LC-MS/MS法作为极具潜力的总抗体定量方法，应用率正不断提升。但该方法仪器成本高，且要求操作人员具备丰富的LC-MS/MS操作、技术和方法开发经验。LBA和杂化免疫捕获-LC-MS/MS法均可用于总抗体定量，除非遇到特定的开发问题（如基质效应），否则LBA仍是常规首选方法。总抗体检测方法的开发和验证需遵循传统治疗性蛋白的方法验证要求，同时结合ADC总抗体检测的特定评估需求。无论选择LBA是LC-MS/MS进行开发和验证，均需明确总抗体检测方法的检测对象为ADC的总形式还是游离形式，才能对数据进行合理解读。 建立经验证的总抗体检测方法时，另一项考量是给药后ADC可能引发的免疫原性反应，以及后续可能产生的ADA。这类ADA与循环中的药物结合，形成复合物后，可能阻碍ADC与靶点的结合，或被非靶免疫细胞内吞并导致细胞死亡。因此，在样品分析前的方法验证阶段，需充分评估ADA对总抗体定量的影响，这一内容将在后续章节中探讨。 总偶联药物或ADC定量检测 理想情况下，ADC在体内循环中保持稳定，到达靶点后发生内吞，释放载荷并发挥最大的预期药理作用。除载荷的靶向释放外，非靶向细胞摄取（吞噬作用或胞饮作用）、非特异性结合（Fcγ受体、N-聚糖受体）或循环过程中的其他因素，均可能导致载荷的非靶向释放。循环中高浓度的ADC有利于最大化疗效，而低浓度的循环载荷则有助于减少非肿瘤特异性毒性。因此，总偶联药物的定量检测可准确测定平均DAR浓度。ADC的体内暴露量是建立整体PK/PD相关性的关键PK指标。在目前FDA已批准的ADC中，LBA是ADC定量的主要方法，因为该技术也常规用于总抗体定量。近年来，LC-MS/MS（尤其是杂化LC-MS/MS）凭借其独特的检测选择性，成为ADC定量的主流方法。杂化LC-MS/MS法结合了针对抗体部分的免疫亲和捕获步骤和LC-MS/MS对释放载荷的定量检测优势，具有显著应用价值。本节将对这两种方法分别进行探讨。 配体结合试验 LBA 采用LBA对ADC进行定量时，捕获试剂或检测试剂中需有一种与载荷结合，另一种抗体则与单克隆抗体结合。由于载荷的分子量极小（即使包含连接子，也在1500 Da及以下），制备对载荷具有足够亲和力和特异性的抗体存在较大难度。需将载荷通过与ADC中相同的连接子化学方法偶联至免疫原/佐剂（如钥孔血蓝蛋白），并以此对动物进行免疫，随后收集并纯化动物血清，得到针对载荷的特异性抗体。 影响ADC定量用LBA是否具有DAR敏感性的因素众多。若该分析方法具备DAR敏感性，其检测信号应随载荷数量的增加而增强。因此，当ADC的DAR值极高时，可能产生空间位阻，影响抗载荷抗体的结合。即便对两种不同的ADC采用相同的分析格式，其中一种分析方法也可能最终丧失DAR敏感性。抗载荷抗体的亲和力是另一重要影响因素，只有抗体始终保持结合状态，检测信号才能增强。最后，分析方法的格式也决定了其DAR敏感性：若捕获抗体为抗载荷抗体，检测信号则不会随载荷数量的变化而增强。 具有DAR敏感性的总ADC分析方法 具有DAR敏感性的分析方法通常以重组靶蛋白或针对ADC中单克隆抗体部分的抗体作为捕获试剂。靶蛋白或抗独特型抗体与ADC中单克隆抗体部分之间的亲和力通常较高，足以作为高效、特异的捕获试剂，保证分析方法具备可接受的灵敏度。在药物研发早期，必须验证捕获步骤不会因ADC偶联形式的不同产生的空间位阻而受影响。该分析格式中，检测采用标记的抗载荷抗体。抗载荷抗体与被捕获ADC之间的结合亲和力需足够强，确保结合的抗载荷抗体不会因第二个抗体的结合而发生解离。需明确的是，偶联载荷的数量与分析响应值之间未必存在线性关系，因此在方法开发和验证过程中，需对这一关系进行表征，确保抗细胞毒性抗体与载荷之间的结合效率或结合比例保持一致。已有文献中典型的应用案例为：分别采用人CD22胞外域或山羊抗人IgG抗体（特异性结合Fc段或F(ab′)₂片段）捕获抗CD22-MCC-DM1或MC-MMAF抗体药物偶联物，随后加入生物素化的抗DM1或抗MMAF抗体进行后续检测。 无DAR敏感性的总ADC分析方法 开发无DAR敏感性的分析方法时，可采用抗毒素抗体捕获ADC，检测则使用针对ADC中抗体部分的标记抗体或标记的靶蛋白。以重组靶蛋白或针对单克隆抗体部分的抗体作为检测试剂，会使分析方法丧失DAR敏感性。抗细胞毒素捕获抗体对载荷需具备足够的亲和力，这一点至关重要，因为该相互作用决定了捕获步骤的效率。亲和力较低的抗体对低DAR值ADC的捕获效果，远不如对高DAR值ADC的捕获效果，原因是多个细胞毒性载荷能产生更高的亲合力。在方法开发和验证过程中，需使用特定DAR值的ADC或富集了特定DAR亚型的ADC，对分析方法的DAR敏感性进行评估。该分析格式用于测定偶联抗体的浓度，且严格来说，无法直接测定发挥药效的活性成分（偶联药物）。因为在该分析方式中，单个位点偶联载荷的抗体与多个位点偶联载荷的抗体产生的分析响应值一致。在支持猴和人体研究的曲妥珠单抗-美登素偶联物生物分析中，先采用抗DM1抗体捕获ADC，再加入生物素化的HER2胞外域和链霉亲和素-辣根过氧化物酶进行检测。由于该偶联抗体分析方法对载荷数量不敏感，使用DAR值为3.5的标准品/质量控制品，可对DAR值在2.58至4.10范围内的T-DM1实现准确定量。类似地，采用无DAR敏感性的分析方法定量抗STEAP1抗体药物偶联物时，先以抗毒素单克隆抗体捕获ADC，再以生物素化的抗独特型单克隆抗体进行检测，结果显示对DAR1和DAR6的定量结果显著偏低（回收率分别为11%和64%），而对DAR2和DAR4的定量结果符合要求（回收率分别为102% 和99%）。 液相色谱-串联质谱法 LC-MS/MS 与用于ADC定量的LBA不同，LC-MS/MS法可直接测定从ADC中裂解的载荷。该方法通常包含三个关键步骤：样品富集、消化和LC-MS/MS分析。 样品富集 与前文所述的总抗体定量用杂交LC-MS/MS类似，样品分析前的富集步骤仍被推荐采用，以降低样品复杂度，消除干扰。ADC富集可使用同类捕获试剂，且在条件允许时应尽量统一，以便在同一项研究中更准确地对比单克隆抗体和ADC的检测数据。需根据研究设计选择样品富集方法：临床前研究采用总ADC富集法，临床试验则采用游离态ADC富集法。尽管ADC的浓度通常在μg/mL及以上，但为确保药物研发各阶段分析方法的选择性和性能，样品富集仍可能是必要步骤。 消化 如前所述，采用LC-MS/MS测定ADC浓度，需检测从抗体上裂解的载荷，这一过程通常通过裂解ADC与载荷之间的连接子实现载荷的释放。早期一代的可裂解型ADC连接子主要包括以下四类： 酸不稳定连接子（腙键）：将血浆或血清的pH值从7.4滴定至4.5，即可释放偶联药物（药物+连接子），用于ADC分析。 二硫键可裂解连接子：通过二硫键还原（如二硫苏糖醇）后进行烷基化（如碘乙酰胺），释放带有巯基的偶联药物，并形成稳定的硫醚键。 肽键可裂解连接子（如缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸）：通过溶酶体蛋白酶消化（如组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶）释放偶联药物。 β-葡萄糖醛酸苷可裂解连接子：通过β-葡萄糖醛酸苷酶水解释放偶联药物。 例如，抗STEAP1抗体药物偶联物（含缬氨酸-瓜氨酸连接子）的定量分析，即采用免疫捕获-酶解-LC-MS/MS完成，因为配体结合分析无法准确测定DAR1的含量。 新一代ADC则设计为非可裂解型连接子，主要包括两种偶联方式： 非位点特异性偶联（如半胱氨酸偶联）：蛋白酶消化后会产生多种偶联药物形式，且消化产物可能含载荷，也可能不含载荷，因此这类非可裂解型ADC并不适合采用LC-MS/MS定量。典型案例为恩美曲妥珠单抗的定量分析，因该药物采用随机巯基非可裂解型偶联方式，故最终选择配体结合分析，而非免疫捕获-消化-LC-MS/MS。 位点特异性偶联：蛋白酶消化后会产生仍与连接子相连的多种载荷形式，以及ADC的多种亚类。尽管在此情况下，采用LC-MS对载荷进行定量极具挑战性，但仍可通过上述分析方法开发出针对ADC亚基的定量方法。 明确这些连接子相关影响因素，凸显了在药物研发早期对ADC连接子的化学性质和稳定性进行全面表征的重要性，唯有如此，才能设计出准确的定量分析方法。 LC-MS/MS分析 经过免疫捕获富集、酶解或化学裂解后，ADC样品提取物中的干扰物质已基本被去除，可直接进行LC-MS/MS检测，无需额外的样品前处理步骤；除非研究要求的分析范围需要进一步的样品制备。由于释放的载荷（作为ADC的替代检测物）的性质与小分子药物极为相似，反相色谱法可实现良好的分离效果。分析中优选稳定同位素标记的ADC作为内标，以追踪从免疫亲和捕获、消化到LC-MS/MS分析全过程中释放的载荷；也可选用稳定同位素标记的药物（或药物+连接子）作为替代内标，但该内标无法追踪免疫捕获富集和消化步骤。采用选择反应监测（SRM）模式的高灵敏度质谱，通常可满足分析方法对灵敏度和选择性的要求。典型应用案例为：采用杂交免疫捕获-LC-MS/MS法，对一项临床试验中的抗STEAP1抗体药物偶联物进行定量分析。 综上，杂交免疫捕获-LC-MS/MS融合了配体结合分析和LC-MS/MS两种正交分析平台的优势，具备独特的分析选择性和灵敏度，可实现总偶联ADC的检测，这是单一分析平台无法实现的。在动物实验中，通常将抗人Fc段抗体或蛋白A/G作为通用的ADC样品富集试剂，用于测定总ADC（结合态和游离态）；而在临床试验中，一般采用抗独特型抗体法，实现对游离态ADC的特异性富集和检测。 总ADC定量分析方法总结 LBA和杂交LC-MS/MS均可用于ADC的定量分析，方法的选择取决于ADC连接子的具体化学性质和分析灵敏度要求。与单克隆抗体的定量分析类似，ADC的LBA具有灵敏度高、样品处理通量高、仪器成本相对较低的优势。但该方法也存在缺陷：由于不同DAR亚型的偶联药物结合能力较低且存在差异，导致分析方法的选择性较差、不同DAR亚型的回收率存在偏差；此外，该方法并非直接测定偶联药物，检测信号与载荷之间的关系复杂。杂交LC-MS/MS法虽仪器成本更高，且仅适用于特定化学性质的ADC连接子，但具备极佳的分析选择性，可直接、灵敏地测定偶联药物，且方法开发周期相对较短。此外，循环中的靶蛋白和配体均会影响两种分析平台的性能，因此在方法开发或验证过程中，必须评估其影响。 DAR分布的测定 ADC治疗药物的稳定性是重中之重，其结构设计的初衷是将强效药物递送至靶组织，同时最大限度降低对正常组织的毒性。ADC需在全身循环中保持稳定，才能成为有开发价值的候选药物，并发挥预期的疗效和安全性。然而，第一代ADC的连接子稳定性较差，易在血液中释放毒性载荷，进而引发毒性反应。尽管新一代ADC采用了非可裂解型或酶可裂解型连接子，试图克服这一缺陷，但在体内，连接子的裂解或其他降解途径仍会导致载荷的流失。循环系统中载荷的大量流失，不仅会降低预期的治疗效果，还会引发对给药后ADC的安全性担忧。明确这些因素，凸显了监测体内DAR值变化、掌握ADC药物稳定性和活性的必要性。 LBA可通过载荷特异性抗体区分ADC和无药抗体，但由于其为间接检测方式，无法识别不同的DAR亚型。高分辨质谱（HRMS）结合先进的解卷积软件，已被证实是研究ADC的DAR分布不可或缺的方法。该LC-MS不仅能区分偶联抗体和无药抗体，还能检测出由生产工艺、体内解偶联或降解产生的多种DAR亚型。通过电喷雾电离（ESI）高分辨质谱，对完整的ADC蛋白或部分酶解产物（如轻链和重链）进行分析，以准确表征ADC分子的DAR分布，这一方法具有极高的应用价值。需注意的是，部分酶解可能导致丢失部分理解DAR值和载荷流失所需的结构信息，不过酶解产生的ADC小分子片段会使DAR值的测定更为简便。采用HRMS平台测定DAR分布，通常包括三个步骤：免疫捕获、去糖基化（针对细胞培养表达的抗体）和高分辨质谱分析。 ADC的免疫捕获 对用于DAR分析的样品进行充分的纯化和富集至关重要，因为常规反相色谱法无法将血浆或血清中大量杂蛋白中的不同DAR亚型有效分离。因此，免疫捕获已成为富集目标ADC、去除内源性蛋白，进而开展DAR测定的标准方法。 与总抗体或偶联药物定量中的免疫捕获类似，多克隆抗人IgG Fc段抗体、靶抗原/抗独特型抗体或抗毒素抗体均可作为捕获试剂，从血浆或血清样品中富集ADC。选择合适的捕获试剂时，需考虑样品类型、药物偶联位点以及试剂的可获得性，从而确定最佳的样品纯化富集方法。 需重点说明的是，抗Fc段抗体捕获法是临床前研究中捕获和测定所有DAR亚型的理想方法，但不适用于人体样品的分析，因为人源化或全人源抗体的ADC与内源性IgG的序列几乎完全一致。该方法可用于多种偶联抗体的结构变体分析，也适用于跨物种分析。这一通用、稳定的捕获方法，已被用于食蟹猴血清中人IgG1单克隆抗体αPCSK9的免疫捕获及后续LC-ESI-MS定量分析。 第二种方法是以靶抗原或抗独特型抗体捕获ADC，用于动物和人体样品中DAR（0至N的游离态或部分结合态）的测定，部分情况下可使用商品化试剂盒。例如，采用生物素化的配体MUC16富集半胱氨酸工程化的抗MUC16抗体药物偶联物，随后通过LC-MS/MS分析其DAR分布，该免疫捕获方法后续也被用于其他ADC的研究。 第三种方法是采用针对偶联药物的抗毒素抗体捕获ADC，该方法要求制备的抗体靶向ADC的药物部分，而非抗体部分或内源性抗体，适用于动物和人体样品的分析。但抗毒素抗体对不同DAR亚型的结合亲和力存在差异，且无法富集DAR0（无药抗体）。已有研究采用针对ADC中MMAE的抗药物抗体测定DAR值。 无论采用何种免疫捕获方法，要准确测定体内样品的DAR分布，都必须对样品进行纯化和富集。研究人员需注意，上述三种捕获方法对不同DAR形式的结合亲和力可能不同，因此对各DAR亚型分别进行免疫捕获验证，有助于实现所有DAR形式的稳定富集。 捕获后ADC的去糖基化 对于细胞表达系统制备的抗体，从血浆或血清中捕获的ADC需进行去糖基化处理。抗体的Fc段重链上存在两个N-联糖基化位点（每个重链的天冬酰胺297位），且由于聚糖的组合形式多样，糖基化具有高度的异质性。聚糖修饰会导致ADC的质谱图复杂化，进而影响DAR值的准确测定。N-聚糖酶（PNGase F）是去除糖蛋白中N-联寡糖的常用酶，市面上可购得多种去糖基化试剂盒或试剂。将ADC样品与该酶在非变性或变性条件下孵育后，无需额外处理，即可进行HRMS分析。 高分辨质谱分析 HRMS 测定体内样品中ADC的DAR分布，是ADC药物研发的关键环节，可提供连接子体内稳定性、不同DAR亚型的生物转化等重要信息。早期基于质谱的DAR测定方法，采用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI/MS）对ADC样品进行分析。例如，采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），对前列腺特异性膜抗原（PSA）特异性单克隆抗体的多种偶联形式的DAR值进行测定，这些PSA单克隆抗体均偶联了放射性标记的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N'N'',N'''-四乙酸或细胞毒性药物美登素。尽管这些早期的DAR测定方法操作简便，但由于多种同位素亚型的质谱峰重叠，难以区分不同的DAR变体。 目前，高分辨质谱结合电喷雾电离技术（LC-ESI-HRMS）已被广泛用于ADC的DAR分布定量分析。采用正电喷雾电离模式的四极杆-飞行时间质谱（Q-TOF）或赛默飞Q-Exactive等轨道阱质谱，采集包含ADC多种电荷态峰群的总离子流（TIC）图谱，并利用 BioPharmaViewTM（AB Sciex公司）、蛋白质解卷积软件（赛默飞世尔科技公司）等专业软件对全质谱图进行解卷积，得到体内循环ADC的DAR图谱，其中包含多种载荷水平不同的偶联抗体形式。在假设各ADC形式电离效率一致的前提下，可通过对比各DAR亚型解卷积后的峰面积，估算DAR分布。典型应用案例为：采用反相色谱（RP）和体积排阻高效液相色谱结合四极杆-飞行时间质谱，测定重组人C242抗体及其美登素偶联物的DAR分布。 尽管反相液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法已成熟应用于赖氨酸偶联和工程化半胱氨酸偶联ADC的DAR分析，但对于不稳定的ADC（如以链间半胱氨酸还原位点为药物偶联位点、依靠亚基间非共价相互作用维持结构的ADC），采用该方法进行DAR分析仍存在较大挑战，原因是变性后的ADC稳定性较差。针对这类不稳定ADC，目前已采用疏水相互作用色谱-紫外检测法（HIC-UV），或疏水相互作用色谱-紫外检测与体积排阻色谱-质谱联用技术（HIC-UV-SEC-MS）开展DAR分析。近年来，有研究报道采用纳升电喷雾电离质谱平台，对天然或变性状态下的ADC平均DAR值进行测定。离子迁移质谱（IM-MS）与高分辨质谱联用，也被证实是复杂ADC样品DAR测定的有效工具。近期有文献报道了一种“中层”分析方法，利用化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶（IdeS）和二硫苏糖醇还原，将ADC降解为轻链和Fd’片段，再进行DAR分析。 一项针对恩美曲妥珠单抗的猴研究，体现了质谱法在ADC研发早期测定DAR值变化的应用价值。该研究中，采用生物素化的重组HER2胞外域或抗DM1抗体，从血浆中捕获T-DM1；经磁珠上的去糖基化处理并洗脱不同DAR亚型后，通过毛细管反相液相色谱结合四极杆-飞行时间质谱进行DAR测定。研究发现，28天内样品的DAR值呈逐渐降低的趋势，这表明用于制备标准品/质量控制品的新鲜ADC，可能无法完全代表药代动力学后期时间点检测到的分析物。DAR值的下降趋势，反映了药物的解偶联程度以及不同DAR亚型清除率的变化（FDA，2018年）。 DAR分析方法总结 尽管目前的DAR分析方法灵敏度较低，且本质上多为半定量分析，但仍能提供重要的补充信息，为ADC药物研发提供支撑。在药物发现阶段，DAR分布分析可为优化连接子化学性质/稳定性、设计更优质的ADC候选药物及实现其他理想的“成药性”特征提供指导；在药物开发阶段，DAR分布分析有助于建立稳健的定量PK分析方法，实现体内ADC各种形式的准确测定（FDA，2018年）。新一代高分辨质谱的灵敏度和分辨率均得到提升，可更准确、灵敏地实现体内DAR的监测，甚至可用于总抗体/ADC的定量分析。因此，在临床前研究中应开展DAR分析，对于稳定性较差的ADC，该分析尤为必要。 LC-MS/MS测定游离载荷 ADC在体内的分解代谢可发生在抗体部分，也可发生在连接子和偶联药物部分。抗体部分会被分解为完整蛋白（如不同DAR亚型）、蛋白亚基，并最终水解为多肽和氨基酸。目前对抗体分解代谢产物的研究已较为深入，证实其几乎不存在安全性风险。相反，偶联药物产生的游离载荷及其代谢产物（如药物、药物-连接子、药物-连接子-多肽）则需要进行全面评估，以明确其潜在的脱靶毒性效应，为ADC的安全性和有效性研究提供依据。 游离载荷的鉴定通常通过体外研究完成，包括靶蛋白表达细胞系的代谢研究和跨物种的血浆稳定性研究。这些药物研发早期的研究，可帮助鉴定ADC的游离载荷、明确其处置机制，并筛选出合适的临床前研究动物种属。典型案例为恩美曲妥珠单抗的三种游离载荷（MCC-DM1、赖氨酸-MCC-DM1和DM1）的鉴定，对这些游离载荷。 对于体内研究，FDA（2024年）要求对游离载荷及其具有药理活性的代谢产物进行定量分析，该检测通常采用LC-MS/MS法。与LBA（如ELISA）相比，质谱法具有更高的选择性，这一固有优势使其成为血浆、血清、组织等复杂生物基质中小分子游离载荷定量分析的首选方法。但值得注意的是，也有研究报道采用LBA开展此类检测。 定量下限LLOQ的挑战 开发对游离载荷及其药理活性代谢产物具有足够灵敏度的生物分析方法，是一项重大挑战；尤其是在血浆或血清基质中，为降低脱靶毒性，循环中游离载荷及其代谢产物的浓度通常极低。为解决这一问题，FDA建议游离载荷的分析方法应具备高灵敏度，能够检测到循环中极低浓度的游离载荷及其药理活性代谢产物。 所幸的是，游离载荷及其代谢产物通常为单电荷态（特定情况下为双电荷态），这简化了质谱的调谐过程；此外，这些化合物的疏水性高于大多数内源性成分，能在反相液相色谱柱上实现良好保留，便于色谱分离和高效的电喷雾电离。基于这些特性，小分子生物分析中常用的样品前处理方法均可用于游离载荷及其药理活性代谢产物的定量分析，且通常能达到预期的灵敏度。已有研究报道，即使采用简单的蛋白沉淀法，结合赛默飞7500、赛默飞6500+等现代LC-MS/MS平台，也能实现足够的检测灵敏度，定量下限可低至0.1 ng/mL。对于定量下限要求更高的检测，可采用液-液萃取或固相萃取法，具体将在下文中阐述。 样品前处理的注意事项 根据连接子的结构和化学性质，样品储存和处理过程中可能需要添加稳定剂（如蛋白酶抑制剂），以防止载荷的释放。这是因为游离载荷的本底浓度极低，即使少量载荷从ADC中释放，也会对定量结果产生显著影响。 根据研究的特定要求（如低剂量临床研究）或ADC的特性，游离载荷及其代谢产物的检测可能需要更复杂的样品前处理和液相色谱分离方法。与蛋白沉淀法相比，当需要更高的灵敏度和选择性时，液-液萃取法（LLE）和固相萃取法（SPE）能更高效地对样品进行净化和富集。已有研究报道，新型液相亲和表面分析技术和微毛细管液相色谱技术可实现大鼠肝脏和肿瘤组织样品中溶菌酶-丝裂霉素C-美登素醇1（lys-MMC-DM1）游离载荷的高灵敏度定量检测。 除了检测血浆或血清中循环的游离载荷及其代谢产物浓度外，研究表明，对靶组织样品中的相关物质进行鉴定和定量分析，能够为药效评估提供重要信息。在样品前处理阶段，通常先将组织样品在空白血浆中匀浆，再采用小分子药物常规的样品前处理流程进行后续操作。 游离载荷及其代谢产物分析总结 尽管游离载荷及其代谢产物的检测分析，只是ADC全面表征所需的众多检测项目之一，但该检测在评估ADC的毒性方面发挥着关键作用，在药物研发过程中需予以重点考量。如前所述，维持体内循环中游离载荷及其代谢产物的低水平，有助于降低ADC相关的全身毒性。因此，必须采用高灵敏度的LC-MS分析方法，对这类物质进行有效监测。 免疫原性分析 免疫原性是指ADC等生物治疗药物诱导机体产生免疫应答的能力。治疗性蛋白引发的免疫应答，其临床后果轻重不一，从无明显临床意义到危及生命均有可能。与其他生物治疗药物类似，ADA引发的免疫应答，还可能影响药物的PK、PD特征，以及药物的安全性和有效性。FDA发布的《抗体药物偶联物的临床药理学考量行业指南》（2024年）详细规定了ADC免疫原性的评估方法，该指南参考了《治疗性蛋白产品的免疫原性评估》（2014年8月）和《治疗性蛋白产品的免疫原性检测-抗药物抗体检测方法的开发与验证》（2019年1月），并指出，对ADC各组成部分的免疫应答进行检测是具有实际意义的。当前的行业指南要求，需建立合适的ADC免疫原性评估方法，其中包括用于检测抗药物抗体的高灵敏度验证方法。Myler等人（2022年）针对免疫原性评估的方法验证和结果报告，提出了适用于全行业的建议。此外，FDA还建议实施风险评估策略，以识别并降低治疗性蛋白用药后可能出现的免疫应答相关潜在风险（FDA，2019年；Mora和Richards，2023年；EMA，2017年）。在建立基于风险的评估体系和开发免疫原性检测方法时，核心目标是检测机体对治疗性蛋白是否产生免疫应答，并明确该应答的临床影响。这需要采用多阶段的检测方法，包括通过筛选试验识别ADA阳性样品/患者、通过竞争试验确认ADA的存在及特异性，以及通过功能试验评估ADA的中和能力（FDA，2019年；EMA，2017年）。因此，对ADC免疫原性的综合评估，需结合免疫学、药代动力学、药效学数据，以及临床疗效和安全性数据进行分析。Hock等人（2015年）制定了针对ADC的免疫原性监测策略指南，并详细阐述了如何开展驱动该策略的风险评估（详见：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4287284/）。 免疫原性与临界值 免疫原性检测为定性分析，需采用统计学方法确定临界值（CP），以此判断样品检测结果是否为阳性。临界值是免疫原性检测中的应答阈值，样品应答值达到或超过该阈值则判定为阳性，低于该阈值则为阴性。设定合适的临界值，是开发能准确报告ADA阳性发生率检测方法的关键，且免疫原性评估的每个阶段检测（如筛选临界值、确认临界值、滴度临界值等）都需单独设定临界值。临界值不仅是生物分析试验中判定阳性/阴性的标准，也是实现不同试验批次数据归一化处理的手段。临界值的计算并非简单的操作，需要借助统计分析工具，并采用未接受过该药物治疗的受试者样品进行检测，以获得可靠的临界值，同时合理考虑试验的变异性。当前的指南建议，至少选取50份样品，在至少3个不同试验日进行检测，以获取足够的数据分析信息，开展规范的统计学分析。根据研究需求，针对特定疾病的生物基质，也需完成上述检测，因为不同患者群体的基质成分可能会影响检测信号，进而改变临界值（FDA，2019年）。已有多篇文献详细探讨了在符合监管要求的前提下，选择合适统计方法及计算临界值的重要性（FDA，2019年；EMA，2017年……），本章不再对临界值的统计学计算进行详细论述。 筛选、确认与滴度检测 检测和表征ADC诱导产生的ADA，所采用的多阶段检测策略与其他治疗性抗体一致。首先开展筛选试验，该试验需能检测出低亲和力和高亲和力的ADA。由于筛选阶段设定的临界值允许5%的假阳性率，因此所有ADA筛选阳性的样品，都需要通过确认试验进一步验证。通常，确认试验会在检测体系中加入ADC药物，通过观察信号抑制情况，确认ADA是否与该治疗性蛋白发生特异性结合。一旦证实ADA与ADC存在特异性结合，需开展滴度检测，以明确机体对该偶联药物产生免疫应答的强度。用于ADC免疫原性评估的筛选、确认和滴度检测方法，其开发与验证需遵循适用于其他治疗性蛋白的标准监管要求（FDA，2019年；Myler等人，2022年；EMA，2017年）。通过多阶段的免疫原性检测，能有效降低假阳性结果的出现概率，确保最终判定的阳性结果，并非由检测试剂与基质成分的非特异性结合造成。 筛选试验 筛选试验也被称为结合抗体试验，用于检测与治疗性蛋白产品（本文中为ADC）结合的抗体。由于阳性对照试剂并非参考标准品，且每位患者产生的免疫应答存在差异，筛选试验通常被视为半定量试验。适用于检测抗药物抗体与治疗性蛋白或ADC之间特异性的试验方法，主要包括直接/间接ELISA、桥联ELISA和电化学发光ECL检测法。图1d、e展示了桥联试验的典型模式。虽然应用相对较少，但已有研究报道，放射免疫沉淀试验（RIPA）和表面等离子体共振（SPR）技术也可用于帕尼单抗的免疫原性检测。临床验证试验的要求与临床前试验存在差异：在药物研发早期，研究中会纳入多种不同的ADC变体（DAR、连接子化学结构或载荷不同），并在不同物种中开展试验。为简化研发早期的ADA分析工作，已有研究提出了通用检测方法，该方法能节省方法开发时间，且在检测试剂有限时具备灵活性。有研究报道，可采用鼠抗人Fc段或Fab段抗体进行捕获，以针对试验物种（小鼠或猴）的抗IgG抗体作为检测抗体，实现对ADA的检测。在部分情况下，该通用检测方法的性能与药物特异性桥联试验相当甚至更优，不仅对药物的耐受性更强，且具备足够的检测灵敏度。但通用检测方法也存在局限性，无法对ADA在治疗性蛋白上的结合位点进行结构域定位，且通常具有同型特异性。 为提高ADA检测方法对药物的耐受性，研究人员开发了酸解离、酸解离结合固相萃取（SPEAD）等样品前处理方法。当ADC等治疗性蛋白在全身循环中处于高浓度时，需采用这类前处理方法。值得注意的是，在进行上述任一前处理操作前，必须充分了解ADC的性质和连接子的化学结构；样品前处理中使用的酸，需在与标记ADC孵育前充分中和，以保证关键检测试剂的完整性。 确认试验 确认试验是对ADA筛选阳性的样品开展的后续验证试验，目的是验证ADA与该生物治疗药物结合的特异性，降低筛选试验中假阳性结果的比例。确认试验的方法形式多样，包括免疫沉淀法和耗竭法，最常用的形式是加入过量未标记药物进行竞争性抑制。样品中ADA产生的特异性信号，会因外源性药物的加入而被抑制-外源性药物会与检测体系中的标记药物竞争结合ADA（直接试验中的捕获标记药物，或桥联试验中的捕获和检测标记药物），而非特异性信号则不会受到抑制。竞争性抑制的程度，通过对比加药样品与未加药样品的检测信号，计算加药后的信号抑制率来确定。建议基于筛选试验方法开发确认试验，以提高两种试验灵敏度的一致性，同时便于验证假阳性结果。与筛选试验类似，判定疑似阳性样品为ADA阳性，也需要设定确认临界值，样品应答值超过该阈值则判定为确认阳性。 与筛选试验相同，当ADC等治疗性药物在循环中处于高浓度时，确认试验也需进行酸解离前处理。该步骤的优势（提高药物耐受性）和潜在问题（可能导致ADC从抗体上解离），与筛选试验中的酸解离步骤一致。对于竞争性抑制试验，建议在样品中和后、捕获前加入外源性药物，为外源性药物与ADA的结合创造条件。 滴度试验 滴度试验用于对样品中的ADA进行进一步表征，检测机体产生ADA应答的强度。该检测具有重要意义，因为相较于ADA的阳性发生率，ADA应答的强度可能对药物的药代动力学、药效学、安全性和/或有效性产生更大影响。滴度试验是一种半定量方法，用于测定确认阳性样品中ADA的相对水平。通常采用与筛选试验相同的方法开展滴度检测，且临界值设定为允许0.1%的假阳性率（FDA，2019年）；也有研究提出了其他统计方法，仅根据阴性对照的检测值及其变异性设定临界值。这种方法的优势在于，可在不同疾病人群中使用相同的临界值，且无需制备特定患者的样品池进行样品稀释。 滴度值的常用报告方式为：样品检测信号高于试验临界值的最高稀释倍数的倒数；也可通过剂量-反应曲线的线性部分，将稀释倍数外推至临界值，以此计算滴度值。报告滴度值时，所有样品稀释步骤（包括酸解离和基质必需稀释MRD）均需纳入计算（FDA，2019年）。检测滴度值并分析其变化趋势，有助于了解药物的免疫原性，为研发中药物的生物分析数据补充依据。例如，滴度值在临床研究中具有重要应用价值：对比患者用药后与用药前的ADA滴度，可判断患者出现的是治疗诱导的ADA产生、治疗增强的ADA产生（用药前已存在ADA，用药后滴度升高），还是短暂的ADA应答（用药后未持续存在）。近期有研究提出，可采用信噪比替代滴度值，报告ADA应答的强度。在撰写本章时，建议药物研发方在采用该方法前，先征求药品监管机构的意见。 中和抗体分析 中和抗体（NAbs）是指能够干扰治疗性蛋白与其靶点相互作用的抗体。ADA可通过多种方式抑制ADC的活性：干扰ADC与靶点结合的ADA，通常具有中和作用；但最终ADC的活性受抑制程度（完全抑制或部分抑制），取决于药物、药物靶点和中和抗体的浓度。例如，体内存在中和抗体时，ADC仍可能发挥治疗效果。对于依赖诱导细胞受体交联、激活效应功能（如CDC或ADCC）的ADC，即使抗体不直接阻碍ADC与靶点的结合，也可能干扰ADC的功能，降低其疗效。 开发可靠的中和抗体检测方法，对全面分析ADC诱导的ADA应答所产生的临床影响至关重要（FDA，2019年；吴等人，2016年）。药品监管机构的指南文件（FDA，2019年；EMA，2017年）对中和抗体检测方法的开发与验证提出了总体建议，近期发布的一份白皮书则为该方法的验证试验和结果报告策略提供了明确指导。FDA 2019年发布的指南指出，细胞水平试验和无细胞试验均为可用于检测中和抗体活性的方法。尽管细胞水平中和试验的操作较为复杂，但因该试验能模拟生理体系，表征ADA的中和能力，成为首选方法。若治疗性药物的作用机制为阻断可溶性配体的结合，采用无细胞试验是合适的；若尝试开发细胞水平试验但未取得成功，药物研发方可论证采用无细胞试验的合理性。 细胞水平试验分为直接试验和间接试验两种形式。当生物治疗药物通过结合细胞表面的特异性配体受体、直接刺激细胞产生应答时，采用直接试验：体系中存在中和抗体时，细胞的应答会减弱或消失。间接试验适用于此类药物：药物（通常为单克隆抗体融合蛋白或可溶性受体）通过阻断配体与细胞表面特异性受体的结合发挥作用，其预期效果为细胞应答减弱或消失。当体系中存在中和抗体时，中和抗体会与药物结合，阻止药物与细胞受体结合，进而使配体能够与靶受体结合并触发特定的细胞应答。无论是直接试验还是间接试验，在方法开发前都需要进行充分的设计和规划，以确保选择合适的稳定细胞系，确定有效的生物学检测指标，同时保证试验达到可接受的灵敏度。 若ADC的作用机制为抑制性，或无法开发出满足特异性和灵敏度要求的细胞水平中和试验，可采用无细胞试验对中和抗体进行表征。无细胞试验通常通过竞争性配体结合或酶活性检测，评估中和抗体的活性。竞争性配体结合试验的设计原理为：药物靶点与中和抗体竞争结合药物，当体系中存在中和抗体时，药物与靶点的结合会受到抑制。与细胞水平试验相比，无细胞试验的建立更简便，且灵敏度更高、准确性更好，对基质效应的耐受性也更强。 通常，药物研发的后期阶段（Ⅲ期临床试验）前，不强制要求开展中和抗体试验；但如果ADC被判定为高免疫原性风险药物，需在关键临床试验前考虑建立中和抗体检测方法，必要时开展相关试验。总体而言，中和抗体试验对评估ADA的临床影响具有重要意义。选择合适的中和抗体试验形式，需遵循监管要求，并综合考虑三个核心因素：ADC的作用机制、试验的预期要求以及药物的免疫原性风险。 免疫原性分析总结 与所有生物治疗蛋白一样，由于ADA可能影响药物的疗效和安全性，ADC的免疫原性评估始终是药物研发项目中的关键环节。建议开展免疫原性风险评估，为生物分析策略的制定提供依据。实施风险评估策略，不仅意味着开发ADA检测方法，还需要综合考虑诸多因素，包括但不限于药物的作用机制、临界值确定的统计学分析、关键检测试剂的制备，以及相关疾病状态等。从开发高灵敏度方法检测并确认ADA与生物治疗药物的特异性结合，到检测免疫应答的强度，再到识别降低药物PK暴露量的中和抗体，全面了解ADC的免疫原性，有助于为药物研发的生物分析资料提供支撑。由于ADC具有多结构域的特点，这类新型药物被认为比传统单克隆抗体治疗药物具有更高的免疫应答诱导风险；但实际上，ADA的阳性发生率也与药物的作用机制相关。例如，靶向抗原呈递细胞的ADC，其ADA阳性发生率可能低于单独的单克隆抗体；而增强自然杀伤细胞（NK）效应功能的ADC，其ADA阳性发生率可能高于单独的单克隆抗体。针对传统生物治疗药物的现行监管指南，为药物研发早期制定保守的免疫原性评估策略提供了框架；随着研发推进至后期阶段，对ADC的了解不断深入，可逐步降低免疫原性风险评估的保守程度。图1d、e展示了用于抗药物抗体检测的常见桥联试验模式。 生物分析方法学在研究支持中的应用 ADC由抗体和细胞毒性载荷两部分组成，对其进行全面的PK表征，相比小分子药物或传统治疗性蛋白的生物分析，难度更高、复杂性更强。为明确ADC的PK特征及潜在的暴露-效应关系，生物分析通常需要采用多维度的分析方法，至少检测总抗体、总ADC、游离药物的含量，并开展ADA检测。与小分子药物相比，抗体的半衰期更长，因此ADC的PK特征主要由其抗体部分决定；但ADC的其他固有结构，如连接子的化学性质（稳定性、极性）和载荷类型，也会影响其PK特征，甚至可能诱发有害的免疫应答。除了这些影响生物分析和数据解读的内在因素外，靶标介导的药物处置（库耗效应）、靶点更新速率、新生儿Fc受体（FcRn）依赖的循环利用以及Fc段的效应功能等，也会影响抗体的清除，进而改变ADC的PK特征。ADC的总抗体检测，可提供与抗体相关的PK参数；总偶联药物检测，能反映抗体的偶联状态。总抗体或总ADC的循环浓度通常会随时间下降，而若总ADC的浓度下降速率显著快于总抗体，则表明ADC发生了解偶联（载荷脱落），并产生了低DAR值的产物（如DARₙ₋₁至DAR₀）。这些解偶联产物的生物治疗效果，通常低于目标ADC产物。相反，若体内循环的游离载荷水平较低，且总抗体与总ADC的PK特征相似，则表明ADC的连接子在体内具有较好的稳定性。检测DAR有助于阐明DAR分布与平均DAR值之间的关系。图3展示了总抗体、总ADC和游离载荷的典型浓度-时间曲线。 图3 ADC的典型浓度-时间曲线。该浓度-时间曲线展示了ADC的三种组分：红线代表游离/未偶联药物；绿线代表总抗体；蓝线代表偶联药物或偶联抗体 开展一系列相关检测（包括DAR分布、总抗体、总ADC、游离载荷检测及免疫原性评估），对于全面表征ADC的生物分析特征至关重要，尤其是在临床前研究阶段-此时对药物的体内行为了解较少。在研发早期明确抗体、连接子和载荷的固有性质，有助于为ADC研发项目从早期推进至后期临床试验，制定相应的生物分析策略。由于ADC的人源抗体通常与猴的靶蛋白存在交叉反应，在食蟹猴中开展ADC候选药物的临床前毒理学和毒代动力学评价，是至关重要的研究环节，能为了解人体中靶标或非靶标介导的药物清除机制提供重要信息。这些检测方法也可经适配后用于临床试验，以评估药物的最大耐受剂量、确定治疗窗，并分析PK的变异性及PK/PD关系。在对不同物种、不同研究中的ADC PK和PK/PD数据进行直接对比时，需充分考虑所用分析方法、试验形式和参考物质的差异。尽管每种ADC检测方法都面临各自的挑战，但对所有相关的ADC PK数据进行整合分析，是全面了解ADC特性的关键。 以Kadcyla（T-DM1）为例，该ADC由曲妥珠单抗（人源化IgG1型抗HER2单克隆抗体）通过稳定的硫醚连接子与DM1载荷共价结合而成。在食蟹猴和人体中，总曲妥珠单抗与偶联曲妥珠单抗的浓度-时间曲线趋势相似；而两者的浓度差异，表明DM1在体内会从曲妥珠单抗上缓慢解偶联，释放出低水平的游离载荷，这一结果与DAR分布的正交检测数据一致。尽管存在时间依赖性的解偶联，偶联形式的T-DM1仍被选为测定该ADC PK参数的生物分析相关物质。在人体中，其分布容积为3.3 L，清除率为0.7 L/天，半衰期为4.5天。采用电化学发光ECL/ELISA桥联试验和结构域特异性竞争试验，对Kadcyla的免疫原性进行了评估。多项研究显示，该药物的ADA阳性发生率较低（约4%~6%），目前尚无法确定ADA对其PK、安全性和有效性的影响。但在一项纳入466例患者的临床研究中，24例患者检测出ADA阳性，其中13例为中和抗体阳性，这一结果再次表明，建立全面的生物分析体系对ADC进行表征具有必要性。Adcetris（brentuximab vedotin）是另一款ADC，由嵌合IgG1型抗CD30抗体与MMAE载荷通过蛋白酶可裂解连接子连接而成。该蛋白酶可裂解连接子的稳定性较好，使药物具有理想的PK特征，且载荷的解偶联主要发生在溶酶体中。由于总抗体与偶联MMAE的浓度具有良好的相关性，偶联MMAE被选为PK评估的主要分析物，其在人体中的分布容积为8.2 L，清除率为1.7 L/天，半衰期为4~6天。Adcetris在临床应用中出现了输注相关反应，研究人员采用结构域特异性ECL对其免疫原性进行了监测。在霍奇金淋巴瘤（cHL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）患者中，约7%的患者（156例中11例）检测出持续性抗Adcetris抗体，30%的患者（156例中47例）检测出短暂性抗Adcetris抗体。在这58例ADA阳性患者中，36例（62%）为中和抗体阳性。所有检测出持续性或短暂性ADA的患者，其ADA均靶向ADC的抗体部分，这一结果凸显了开发能区分ADA结合位点的检测方法的重要性。Mylotarg是另一款含可裂解连接子的ADC，由人源化IgG4型抗CD33抗原单克隆抗体，与刺孢霉素衍生物（N-乙酰-γ-刺孢霉素1,2-二甲基肼二氯化物）通过酸不稳定的可裂解连接子连接而成。由于该连接子的稳定性较差，Mylotarg的PK特征不如Kadcyla和Adcetris理想，其在人体中的分布容积为10~18 L，清除率为6.4 L/天，半衰期为3天。Mylotarg的获批过程值得深入探讨。该药物于1991年研发成功，2000年通过FDA的加速审批程序首次获批上市。获批后第一年，FDA便要求为其添加黑框警告，提示该药物在未进行骨髓移植的患者中，会增加静脉闭塞性疾病（VOD）的发生风险。后续研究发现，即使患者接受了骨髓移植，使用该药物后静脉闭塞性疾病的发生率仍有所升高。2010年，应FDA要求，Mylotarg撤市。2017年，辉瑞公司基于急性髓系白血病（AML）的ALFA-0701研究数据及既往试验的荟萃分析结果，重新向美国和欧盟药品监管机构提交了该药物的上市申请，并于2018年在欧盟和美国再次获批。Mylotarg成为ADC药物研发的典型案例，凸显了建立全面的ADC生物分析数据体系的必要性。 结论 ADC兼具细胞毒性和抗体靶向特异性，是靶向肿瘤治疗领域的重大突破，目前已有超过11款ADC（如Kadcyla，Adcetris，Besponsa和Mylotarg等）获得药品监管机构批准，用于治疗多种肿瘤疾病。与小分子药物或传统治疗性蛋白的检测方法开发相比，ADC的结构复杂性使其生物分析面临独特的挑战。为全面表征每款ADC的PK特征并建立PK-PD关系，需建立五种核心的生物分析方法：总抗体检测、总ADC检测、游离载荷及其代谢产物检测、DAR分布检测和免疫原性评估。若参考标准品无法完全模拟体内存在的ADC形式，在方法开发和验证过程中，需开展额外的评估，以准确测定药物浓度，了解其体内PK特征。除了小分子药物和生物治疗药物的常规检测方法外，还需要开发专用检测方法，以明确ADC在体内的代谢过程，助力其PK-PD表征。例如，总ADC的检测方法，需要整合免疫捕获、酶解和LC-MS/MS分析等多种实验流程和技术手段。此外，DAR分布检测，需要借助高分辨率质谱仪，对ADC的完整形式进行分析。在开发ADC生物分析方案时，这些是需要考虑的重要方面。 未来几年，随着目前处于不同临床试验阶段的ADC超过100种，预计监管批准的数量将大幅增加。随着新一代ADC选择新的抗体和抗体靶点、创新的偶联化学以及独特的有效载荷，这一极具前景的领域将呈现出全新的面貌。此外，随着我们对ADC作用机制的理解不断加深，将有助于提高其特异性和安全性，从而拓展到更多的疾病状态和患者群体。LBA和基于质谱的方法之间的持续协同作用，将推动更强大的生物分析策略的发展，以更好地追踪体内各种ADC形式。