Inotuzumab Ozogamicin

摘要：      抗体-药物偶联物（ADC）包括抗体、接头和药物，它们通过抗体和表面抗原之间的特异性结合将其高效小分子药物引导至靶向肿瘤细胞。应正确设计或选择抗体、接头和药物，以达到所需的疗效，同时最大限度地减少脱靶毒性。由于结构独特而复杂，与产品相关的变化和制造过程会引入固有的异质性。本文主要介绍了ADC历史、临床开发状态、分子设计、制造工艺和质量控制方面的最新关键进展。制造过程，尤其是偶联过程，在其整个生命周期中应仔细开发、表征、验证和控制。质量控制是确保产品质量和患者安全的另一个关键要素。以患者为中心的策略已得到制药行业治疗性蛋白质的广泛认可和采用，并且也已成功应用于ADC，以确保ADC产品在保质期结束前保持其质量。对产品的深入了解和过程知识定义了属性测试策略（ATS）。质量源于设计（QbD）是用于流程和产品开发以及定义整体控制策略的强大方法。最后，我们总结了当前ADC开发面临的挑战，并提供了一些可能有助于给出相关方向并引发更多跨职能研究以克服这些挑战的观点。1.ADC药物概要      第一个ADC药物于2000年获得批准。然而，14种ADC药物中有9种在近 4 年内获得批准。ADC药物开发简史和关键事件       流通的ADC药物通过mAb部分与特定的肿瘤细胞表面抗原结合。结合的ADC药物被内化到内体的肿瘤细胞中。ADC药物从肿瘤细胞中回收或通过接头切割或mAb消化释放药物。释放的药物诱导细胞凋亡或杀死靶向微管或DNA的肿瘤细胞。释放的药物也可能通过渗透邻近细胞来诱导旁观者效应。ADC作用机制图截至2023年1月全球上市的ADC药物2.抗体-药物偶联物的关键要素2.1抗体-药物偶联物的抗原靶标       一个好的ADC抗原靶标具有相似的抗原特性，通常考虑以下方面： （1）抗原靶标的表达和丰度：抗原靶标在肿瘤组织中特异性高表达，在正常健康组织中低表达或无表达。理想的靶抗原应该是非分泌性的，不易从肿瘤细胞表面脱落，并且可溶性形式很少或没有可溶性。确定ADC靶标的抗基因选择性的关键不是肿瘤组织和健康组织中的绝对表达水平，而是表达比。ADC处理后，不应下调靶抗原的表达，以避免靶抗原表达下调介导的ADC耐药。（2）内化特性：抗原靶点内化的速度和水平是重要的参数，直接影响肿瘤细胞对ADC的吸收和释放。同时，非内部化ADC还可以通过有毒小分子的“旁观者效应”发挥治疗作用。（3）抗原共表达和协同效应：ADC可能面临诸如抗原靶点表达低的患者肿瘤，因此对治疗反应小，以及靶向非肿瘤毒性安全问题等问题。双特异性 ADC 结合了双特异性抗体和ADC的优点，为这个问题提供了新的方向。两种抗原靶标的共表达在肿瘤组织中相对常见，但在正常组织中非常罕见。双特异性抗体ADC可以更特异性地靶向肿瘤细胞，理论上可以减少靶向非肿瘤毒性并改善用药窗口 。其次，通过交联促进两种抗原的协同作用，增强内窥镜，通过减少细胞膜上受体蛋白的表达，可以进一步抑制肿瘤细胞生长信号，更有效地杀死肿瘤细胞，同时提高毒素进入肿瘤细胞的效率。2.2抗体-药物偶联物中的抗体       抗体是ADC的重要组成部分，通常考虑以下几个方面： （1）抗体的特异性和亲和力：理想的抗体需要高特异性，但也需要适当的亲和力以增加肿瘤部位的ADC通透性。优化抗原和抗体之间的合理亲和力是平衡ADC在靶细胞中的快速吸收和抗癌效用的关键点。（2）抗体的内化效率：大多数ADC在与靶抗原结合时被抗体介导的内吞有效内化。因此，在抗体选择中，首选具有高效和快速内吞活性的抗体。一些研究正在探索非内化ADC靶向肿瘤细胞微环境结构成分的可能性。这种方法可通过靶向肿瘤基质内高表达的抗原来克服实体瘤穿透障碍 。（3）分子类型和Fc功能：已上市和临床开发的ADC药物中使用最广泛的亚型是IgG1。ADC的Fc有效功能的丧失在某种程度上是有利的。ADC药物与效应细胞的结合可能会减少它们在肿瘤部位的积累，阻碍它们进入细胞，或导致对正常细胞的毒性增加。除了经典的全长单克隆抗体外，ADC的抗体部分还使用双特异性抗体和不同形式的小分子抗体。双特异性ADC提供更高的肿瘤靶向性，两种抗原的协同内吞作用提高了ADC的疗效，同时提高了安全性。为了获得更多的肿瘤渗透性ADC，新型ADC分子的设计策略已经转向不同的小分子抗体形式，包括Fab药物偶联物、scFv药物偶联物和单链抗体（VHH）偶联药物 。这些新型小分子抗体ADC比传统ADC具有更小的分子量和更好的肿瘤渗透性。然而，这些较小的形式可能与较短的半衰期和较快的清除率有关。（4）药物形成和药代动力学特性：抗体与毒性小分子偶联后，由于小分子毒物的强疏水性，ADC分子的特性可能会发生变化，因此抗体分子需要具有较好的药物凝固性。新一代ADC越来越多地使用免疫原性显著降低的全人源化抗体。ADC表现出与抗体相似的药理学特征。因此，理想的抗体选择还应考虑低免疫原性并保持最佳PK特性。2.3抗体-药物偶联物中的接头       ADC中的接头在将抗体连接到有效的小分子中发挥作用，是影响药物的关键元素稳定性、安全性和有效性 。接头需要在循环中保持稳定，并在进入肿瘤细胞后迅速释放负荷 。它主要分为可裂解型和非裂解型。此外，可切割类型进一步分为化学切割型和酶裂型。      不可切割的连接子具有良好的循环稳定性，降低了脱靶毒性，但它们需要进入肿瘤细胞的溶酶体，在那里被蛋白酶降解以释放负载复合物，释放率低。负载复合物通常由氨基酸 - 接头 - 有效载荷组成。它的渗透性很差，因此引发旁观者效应的能力有限。化学裂解接头主要包括酸裂解型和还原型裂解型。化学裂解接头从裂解中迅速释放，但它们在循环中的稳定性差，容易导致脱靶毒性 。酶裂解接头是使用最广泛和研究最广的接头。它们主要包括组织蛋白酶B、β-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶裂解型。在这些类型中，组织蛋白酶B裂解型是最常用的。组织蛋白酶B是一种在各种癌细胞中过表达的溶酶体蛋白酶。此外，它可以优先识别PL、VC、VA和GGFG等特定氨基酸序列，并在这些序列的C端裂解肽键。这种接头既具有良好的循环稳定性，又具有在肿瘤细胞中快速裂解和释放毒素的能力。2.4抗体-药物偶联物中的细胞毒载量       细胞毒载量对ADC的作用至关重要。已知的毒性负荷通常包含微管蛋白抑制剂和DNA抑制剂。通常活性强，水溶性好，稳定性好。在有效杀伤肿瘤细胞的同时，还应降低对正常细胞的杀伤作用。除了传统的有毒负载外，还有许多创新负载正在开发和应用。微管破坏毒素       微管破坏毒素主要通过与微管蛋白结合来达到破坏细胞有丝分裂的目的，导致微管持续伸长或阻止微管聚合。它们主要包括奥司他汀、美登素类药物和艾日布林。特别是MMAE因其强大的活性和膜通透性而被广泛使用。DNA损伤毒素      DNA损伤毒素主要包括DNA片段化型、DNA烷基化型和拓扑异构酶 I/II抑制因子。DNA 损伤毒素不受细胞周期影响，半衰期短。它们不易积累，具有广泛的抗癌谱和指示。常用的毒素包括PBD、多利卡霉素、阿奇霉素、SN38和DXd，其中拓扑结构酶I抑制剂DXd是临床实践中最有效的毒素。从这种毒素开发的HER2 ADC已成为改变乳腺癌诊断和治疗的划时代产品。创新毒素      除了常规的毒性负荷外，还有各种创新的负荷产生应用，包括TLR7/8 激动剂、STING激动剂、Bcl-xL抑制剂和裂粒体抑制剂。2.5偶联     偶联技术对于ADC的均一性、稳定性和药代动力学至关重要。这些技术分为两大类：非定点偶联和定点偶联 。非定点耦合：赖氨酸偶联和半胱氨酸随机偶联      最早的非定点耦合技术是赖氨酸偶联技术，其偶联选择相对较差，均一性不足，对ADC的PK/PD有影响。该方法用于市售Kadcyla、Mylotarg 和 Besponsa的偶联。半胱氨酸随机偶联将偶联位点减少到8个，从而显着提高了偶联稳定性和均一性。这是目前使用最广泛的共轭结合方法。市售的Polivy、Padcev和Adcetris使用这种方法进行偶联 。一般来说，非定点偶联产物是稳定性差、易聚集、治疗窗相对较窄的混合物。定点偶联：半胱氨酸定点偶联、天然抗体定点偶联和抗体定点工程修饰      定点偶联可实现同质、更稳定的ADC并扩大治疗窗口。定点结合技术可分为以下几类：半胱氨酸的定点结合：（1）饱和结合：第一三共的 Enhertu在饱和结合方法中占据所有结合位点，以实现定点结合。（2） 硫瘤单抗：基因泰克将赫赛汀轻链第110位的缬氨酸突变为半胱氨酸，并特异性地与马来酰亚胺接头反应。Sevie、ImmunoGen、Abbagen、Pfizer和其他公司也有类似的技术。（3）桥接：Abzena/Poly therics开发了一种双苯磺酸接头，可以与两个游离硫醇连接，以获得药物抗体比（DAR）值为4的均质样品，并提高了ADC的稳定性。荣昌的triallytriazine连接剂也具有类似的作用。天然抗体的定点偶联：（1）赖氨酸的定点偶联：在特定的pH条件下，由于位置和微环境的差异，抗体上的赖氨酸与接头的反应速率不同。科伦生物的A166是基于该方法开发的HER2定点偶联ADC。（2）糖基修饰的定点偶联：天然抗体的N297位点有不同类型的糖基修饰。Synaffix的GlycoConnect技术使用甘油苷酶和糖基转移酶修饰，将叠氮化物基团连接到 N-乙酰氨基葡萄糖上。这可以触发与环辛炔的点击化学反应，形成DAR值为2的位点导向偶联ADC。此外，中国科学院上海药物研究所发现，内切糖苷酶Endo-S2可在水解抗体的N297位点的同时，将N-乙酰乳糖胺转移到去糖基化位点。这实现了一步法糖定点偶联 。抗体的定点工程修饰：（1）非天然氨基酸偶联：Ambrx的EuCODE技术允许将对乙酰苯丙氨酸 （pAcF）精确插入抗体中定义的位置，通过肟键进行定点偶联。Sutro Biopharma的Xpress CF技术将对叠氮甲基苯基羊毛氨酸（pAMF）引入抗体中，并通过点击化学反应进行定点偶联。（2）肽酶偶联：为了达到定点偶联的目的，酶识别抗体的特定位置。以下技术具有代表性：NBE Therapeutics的Sortase技术、Redwood Bioscience的SMARTag技术、LegoChem的ConjuAll技术和辉瑞的BTG 技术。3.抗体偶联物的生产         为了建立可靠且可重复的ADC制造工艺，我们根据上市前风险评估的概念，使用实验设计（DoE）进行实验设计。确定对药物质量属性有影响的工艺参数，控制工艺开发和生产过程中的关键工艺参数，确定合理的设计空间，不仅可以确保生产按预期进行，还可以获得质量可控的ADC产品。整个ADC生产过程一般包括单克隆抗体制备（细胞扩增和蛋白表达阶段、蛋白质纯化阶段）、接头和小分子药物制备、偶联和最终产物制备（图3）。基于抗体药物生物大分子的特殊属性，除了抗体的质量属性、工艺特性和过程控制外，还需要关注ADC生产过程中的工厂、设备、设施和污染控制。【ADC工艺开发/生产/风险等内容请参考原文】图3：ADC生产过程的流程图mAb部分是通过典型的单克隆抗体生物制造工艺生产的，包括细胞培养和纯化步骤。抗体中间体（AI）与通过化学合成或生物制造工艺生产的药物偶联。偶联过程是mAb与接头药物（例如半胱氨酸碱基）之间的化学反应或mAb和接头之间的后续反应，然后是与药物的反应（例如赖氨酸定向）。所得 ADC 原料药经过纯化，并在适用的情况下通过无菌灌装和冻干工艺进一步生产成药品。4.抗体-药物偶联物的质量控制      控制策略包括一组基于当前产品和过程理解的计划控制措施，以确保过程性能和产品质量。该规范是整体控制策略的一部分，其定义为测试列表、分析程序的参考和适当的验收标准。选择基本特性是为了确认原料药和药品的全部质量，而不是建立完整的表征。因此，应采用系统性方法来设定适当的规范。为生物治疗产品和杂质设定商业规范的方法已经建立并得到业界的广泛认可。这种方法强调基于产品知识的基于风险的方法，以确保患者的安全性和有效性。已经发布了一种系统方法来识别和评估关键质量属性（CQA）这些CQA包括产品变体、与工艺相关的杂质、强制性CQA、原材料和可浸出化合物。使用代表性材料在抗体、小分子或DS水平表征产品，以获得对产品物理化学和生物特性的深入了解至关重要。色谱和电泳技术、光谱技术和质谱法广泛用于物理化学表征，而结合测定、ELISA和基于细胞的生物分析则广泛用于生物表征。ADC产品的典型CQA如图4所示。CQA的可接受考虑范围基于临床经验，以及来自特定产品临床研究、先验知识、文献和法规的信息，其中考虑了工艺能力和方法可变性。属性测试策略基于过程能力和产品稳定性。这些是确定是否应在过程控制（IPC）、发布或稳定性期间测试CQA以及哪些CQA最适合测试的有益步骤。图4：抗体、小分子、原料药和药品的典型CQA。小分子包括接头、药物或接头-药物复合物（如适用）ADC的CQA4.1药物抗体比（DAR）     DAR对产品安全性、有效性和PK有直接影响。它在DS工艺 中使用适当的分析方法进行控制和测试。应进一步评估DS稳定性、药品（DP）过程和稳定性影响，以确定是否应在这些阶段测试DAR。验收标准在很大程度上依赖于特定于产品的临床经验。目前，包括紫外-可见分光光度法、疏水相互作用色谱法（HIC）、反相色谱法（RPLC）和尺寸排阻色谱-质谱法（SEC-MS）在内的方法通常用于表征制造过程和质量控制中的DAR。紫外-可见分光光度法可以利用Drug-Linker和mAb的不同最大吸收波长来确定DAR，但无法获得DAR分布信息，并且容易受到游离药物的干扰。HIC 可以根据疏水差异分离不同的DAR分子，然后获得分析DAR和DAR 分布。作为一种天然分析方法，HIC常用于Cys偶联的ADC。然而，该方法受到高DAR样品的挑战，并且对DAR6、DAR7和DAR8的分离度很差。RPLC可以在变性下分离不同的DAR分子或相关亚基条件，并且其分辨率通常优于HIC。然而，在RPLC 条件下，Cys偶联的ADC会解离成LC和 HC，因此只能获得LC和HC上的平均DAR和药物分布。当使用非变性分离条件、软电离和高分辨率质谱（HRMS）时，SEC-MS对不同的DAR表现出优异的分辨率，并与大多数ADC兼容。因此，SEC-MS越来越多地用于早期开发和ADC表征。4.2偶联位点分布和非偶联mAb部分      ADC产品具有异质性，并且包含具有不同偶联药物数量和不同偶联位点的分子，这可能会影响安全性和有效性。异质性的程度在很大程度上取决于ADC平台。根据目前的知识，赖氨酸导向、链间导向的半胱氨酸和位点特异性偶联平台按降序排列。偶联位点分布和非偶联的mAb部分连接可与DAR相关，用于产物特征化和通过DAR测试进行受控表征。4.3游离药物      游离药物，也是一种非偶联药物，具有潜在的全身毒性。尽管游离药物可以有多种形式，例如药物或连接药物，但它们通常被集体处理。游离药物的验收标准是根据其毒性设定的，同时考虑到工艺的清除能力。在DS释放期间需要控制游离药物。此外，根据ADC产品在DS存储、DP工艺和 DP存储期间的稳定性，也需要在这些阶段进行测试。4.4残留溶剂      有机溶剂通常用于DS生产中，以溶解疏水性细胞毒素。应根据溶剂的毒性和生产过程的去除能力确定残留溶剂的可接受标准。残留溶剂通常在DS放行时进行测试，其他阶段的测试要求应根据残留溶剂对DS稳定性、DP工艺和 DP稳定性的影响来确定。4.5大小变体     大小变体通常包括片段和聚集体。聚集体通常以可解离和不可解离的形式存在。DP在保质期结束时的验收标准应确保疗效和患者安全，这主要基于产品特定的临床经验。根据工艺和稳定性影响进行逆向计算，为抗体即刻（AI）、DS和DP阶段设置适当的验收标准。低分子量型（LMW） 可以通过肽键或链间切割形成。可以使用相同的策略为聚集体设置适当的 LMW标准，但要特别注意ADC片段可能携带偶联药物并引起脱靶毒性。因此，LWM形式应在安全水平以下进行表征和控制。4.6电荷异构体     电荷异构体常见于抗体和ADC中。修饰，包括脱酰胺、天蕨酸异构化、糖基化和 C端赖氨酸，可导致电荷转移和电荷形式变体。应根据产品特定的临床经验，单独评估和设置适当的验收标准。对于某些ADC，在共轭后测试电荷变化可能具有挑战性，因为共轭可能会导致电荷偏移。在这种情况下，产品知识和过程理解有助于使用适当的分析方法制定适当的控制策略。如果产品在代表性的DS和DP工艺和储存条件下保持稳定，则在AI级别进行测试可能足以控制电荷变体。4.7其他形式的变体       根据产品特性和ADC平台，需要考虑一些变体。这些包括但不限于由氧化引起的变体、序列变体、游离二硫键和硫醚。这些属性可能会影响产品的安全性或有效性，或者可能会影响ADC产品质量。例如，三硫键可能不是mAb的CQA，但由于它对DAR的影响，它对链间半胱氨酸ADC平台至关重要。应根据具体情况评估这些不同的蚂蚁。4.8数量或强度     蛋白质含量通常包含在 DS 和 DP 放行中，以确保产品量正确。4.9效价     效价方法应通过反射动作来定义。对于ADC产品，它们主要用于杀死癌症患者的肿瘤细胞。基于细胞的生物测定法有望用于效价测试。这些 生物检定表示也应该具有稳定性，如方法验证所证明的那样。我们必须考虑方法的可变性，以便设置适当的验收标准。4.10糖基化修饰     众所周知，糖基化模式可能会影响效率、安全性或PK。对于ADC产品，mAb的主要作用是将药物递送至靶细胞，因此糖基化可能不会影响疗效。如果存在可能受糖基化模式影响的继发性作用机制（MOA），例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）或补体依赖性细胞毒性（CDC），则应充分表征ADC产物。在这种情况下，糖基化可以作为CQA进行评估，并包含在 AI IPC或放行测试中，具体取决于工艺能力。4.11接头、药物或接头-药物     小分子药物中间体（包括接头、药物和接头药物）的质量控制与小分子药物活性药物成分（API）的质量控制相似，特别考虑了其对ADC产品的影响。4.12纯度     纯度是典型的CQA。更广泛的验收标准取决于其对ADC产品质量和 DS工艺的影响。如果接头或接头药物被过度添加而对DAR没有影响，并且可以在整个过程中有效地去除，则可以证明验收标准是合理的。4.13可偶联杂质     可偶联杂质具有反应性官能团，因此它们可以与AI反应生成副产物。这种副产品很难去除，因为这些蛋白质材料很难与ADC产品分离。因此，在小分子生产阶段对可偶联杂质进行控制和测试。4.14不可偶联杂质      不可偶联杂质没有官能团，不能与mAb连接。这些杂质被控制在低水平，以最大限度地降低对患者的潜在风险。此类杂质可以在小分子阶段进行控制和测试。4.15其他与工艺相关的杂质      其他工艺杂质可以从各种来源进入最终产品，例如DS工艺中残留的重金属。应单独评估每种杂质以识别CQA。应根据临床经验、先验知识或法规要求将这些杂质控制在安全水平以下。过程能力 是设置测试策略的关键考虑因素。如果该工艺已被证明可以有效去除杂质，则质量控制测试将增加最低价值。4.16表面活性剂含量     通常将表面活性剂添加到配方中以保护产品并提高稳定性。表面活性剂含量的验收标准是根据配方开发数据设定的。测试策略取决于制造工艺和储存条件下表面活性剂的稳定性。4.17其他质量属性     还有其他质量属性，如药典要求，包括颜色、透明度、内毒素水平、纯度、可见颗粒、亚可见颗粒、pH、渗透压、可提取体积、固体剂量的填充重量、再溶解时间和冻干的水分。可接受性可以根据药典要求设置，也可以根据配方开发进行设置。现代过程控制可能比最终产品测试更强大。一个示例是在线填充重量，它将提供比最终产品填充重量或可萃取体积测试更强大的过程控制。可浸出物可能来自不同的来源，例如制造过程 或容器密封系统，它们包括有机杂质和元素杂质。这些杂质通常在过程代表性条件或储存条件下进行表征，以证明杂质处于安全水平。ICH指南，如ICH Q3系列，提供了有关安全水平的详细信息。浸出物通常或不一定包含在AI、DS或DP测试中，因为水平通常得到很好的控制。5.结论      ADC生产包括抗体生产、接头和药物化学或生物合成、偶联和药品的最终制剂。与传统的单克隆抗体药物相比，偶联过程存在特殊挑战。偶联过程取决于所选的连接子和药物，以及要偶联的氨基酸。本文说明了已上市ADC药物的常用工艺，但并非全部包括制造工艺。来自开发活动、工艺验证、临床生产、文献和先验知识的理解知识有助于确定关键工艺参数和控制措施。ADC药物的质量控制策略是根据对工艺的理解和产品知识制定的。以患者为中心的方法被广泛用于根据临床经验和法规要求定义产品规格。考虑到工艺能力和产品稳定性，我们可以定义质量控制策略，包括要测试的质量属性、在哪个阶段以及适当的验收标准。因此，定义了一个总体控制策略，以确保制造过程始终如一地提供具有适当安全性和有效性的 ADC产品。      在过去的20年里，ADC的发展是由对替代和有效肿瘤治疗的高度未满足的临床需求推动的。第三代ADC的成功为ADC研究领域提供了更令人鼓舞的前景。全球ADC药物市场具有巨大的增长潜力。目前，全球共有15种ADC获批上市（13项FDA批准、1项中国批准和1项日本批准），还有更多ADC正在临床开发中。ADC的治疗潜力正在通过临床适应症扩大，从血液肿瘤到实体瘤，从单一疗法扩展到联合疗法（如常规化疗、免疫检查点抑制剂、靶向不同抗原的单克隆抗体以及小分子抑制剂）。近年来，寻找新型靶点、选择新型抗体形式、选择合适的有效载荷以及设计具有良好释放机制的连接子，成功开启了ADC药物在肿瘤以外的疾病中的应用，如自身免疫性疾病和感染性疾病 。在其他领域，这些应用也将进一步扩大 ADC 的临床应用。     识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

这篇文章于2017年发表在Organic Process Research & Development。该文章是由辉瑞科学家根据内部案例对ADC药物后期工艺开发策略的总结。摘要：随着抗体药物偶联物（ADC）从临床开发阶段进入关键研究阶段，在临床疗效和适当安全性的支持下，开发后期和商业化的工艺和方法成为当务之急。在早期流程的开发过程中，重点是速度、一致性和质量。对于后期开发，需要考虑其他方面，包括工艺稳健性、成本效益、工艺和方法可转移性，以及作为监管备案基础的综合控制策略。【NO.1】研究背景抗体药物偶联物（ADC）的后期开发可能由许多因素触发。在常规开发计划中，ADC将经历传统的临床开发阶段，包括1期和2期。随着药物达到概念验证，通常有理由在工艺和方法开发的规划和执行方面进行大量投资，以支持3期/关键研究，然后进行工艺验证、发布和商业化生产。随着2012年突破性疗法认定的推出，在医疗需求未得到满足的疾病领域表现出疗效的早期迹象的ADC有可能直接从1a/1b期进入关键试验。当然，在加速时间表下完成所有必要的开发工作需要在多个功能单元之间进行仔细规划和协调，因为ADC涉及两种原料药中间体（DSI）、接头/有效载荷和单克隆抗体（mAb）、一种原料药 （DS）、ADC和药品（DP）。此外，监管申报需要特别考虑，并且可能涉及多个不同的模块3部分，每个主要中间体一个，一个用于原料药，一个用于药品。无论哪种情况，无论是加速药物开发还是传统药物开发，都期望在监管文件中提交完整的化学、制造和控制（CMC）部分。如今，大多数药物都是使用质量源于设计（QbD）方法开发的，旨在实现持续工艺验证（CPV）。QbD方法旨在推动对工艺和产品的深入理解。确定影响疗效和安全性的重要质量属性，并通过系统实验确定影响这些属性的工艺参数。一旦工艺在实验室规模上得到优化和建立，就会使用适当合格的缩小模型来确定制造工艺的作范围。这些研究通常涉及实验设计（DOE）和统计分析。在某些情况下，还可以确定所选参数的失效边缘。纯化步骤，例如层析和渗滤通常使用标准生物工艺方法进行优化。扩大规模和技术转移带来了特殊的挑战和机遇。需要对反应动力学、添加速率和其他参数有透彻的了解，才能正确设计和作大型偶联反应容器。必须进行详细的工艺拟合评估，以确保现有设备满足工艺要求。在将购买新设备的情况下，需要首先决定是使用一次性设备还是专用、可重复使用或多产品设备。对于专用和多产品设备，清洁验证成为一个关键考虑因素。放大、设备变更和潜在的场地变更也需要为放大和优化的工艺建立可比性。随着商业过程的发展，需要制定包括规范在内的综合控制策略，以确保通过适当控制重要过程参数来实现既定的质量属性范围。此外，还需要一种综合的监管策略，将接头、有效载荷、mAb、ADC（DS）和药品的质量属性联系起来。【NO.2】ADC的后期开发 ADC的后期开发，为关键临床试验、工艺验证、监管批准和商业化材料生产做准备，这带来了不同寻常的挑战组合。这些挑战来自几个来源：• ADC是连接大分子和小分子的多组分偶联物。根据所使用的化学成分，ADC可以是异质的，由一组密切相关的物种组成，或者当使用特定位点的技术时，具有更均匀的，每个mAb的有效载荷数量指定。• 后期开发工作旨在了解和控制影响连接子载荷分布和ADC的其他重要属性。• ADC的制造工艺步骤需要将生物制剂的水处理与小分子的溶剂处理相结合。这有时会导致意想不到的结果，尤其是在工艺针对更高浓度和放大进行优化时。• 在开发和制造过程中，必须在适当的设施中处理剧毒材料。ADC的生产涉及细胞毒性药物、反应性接头和抗体的组合。该抗体要么通过氨基酸具有内在反应性，要么经过修饰以使其具有反应性。由于抗体的多价性质，异质性可能是开发化学家需要监测的一个重要问题。根据所使用的偶联化学成分，偶联物可能从单一均相产物到相关偶联物的高度异质混合物不等。定义产品的偶联物分布由所选偶联化学决定，并在临床前和早期临床研究中确定。后期开发的挑战是优化商业流程，以保持产品质量属性并确保与早期临床阶段材料的可比性。这要求对工艺参数进行适当优化，以确保工艺始终如一地提供目标质量属性。对于复杂和异质的ADC，了解工艺参数如何影响单个偶联位点的反应性可能是一个挑战。虽然位点特异性化学反应在很大程度上消除了异质性问题，但内源性半胱氨酸和赖氨酸化学反应导致偶联物对许多位点进行了修饰。工艺中可能包括色谱纯化以减少产品异质性，尽管这些混合物可能难以制备分离。传统的蛋白质纯化主要致力于去除宿主细胞蛋白、核酸、高分子量物质和工艺相关杂质，而小分子纯化则侧重于分离独特的所需物质并去除密切相关的非产物分子。另一方面，ADC纯化可能面临控制目标产物异质性的额外挑战。ADC中的异质性在很大程度上是来自不同药物/抗体比（DAR）的偶联物种的共存。DAR通常是一个关键的质量属性，会影响安全性、有效性和稳定性。因此，色谱的目标是将异质性控制在规定的范围内。另一方面，由于mAb和接头有效载荷都是纯化的中间体，因此上游杂质不存在很大程度，而反应副产物、残留物和降解物则比生物工艺的典型情况更受关注。了解过程参数对质量属性影响的先决条件是建立对产品质量足够敏感的分析方法。在其他字段中没有直接平行的两个重要属性是共轭位点和DAR。针对不同填料的这些属性的分析将采用不同的形式。除了这些只能在偶联后存在和监测的质量属性之外，蛋白质或接头/有效载荷固有的一些质量属性可能在偶联物中被掩盖。偶联后，脱酰胺或偶联药物杂质等质量属性可能会发生变化，但又无法直接监测，因此需要制定全面的控制策略。控制策略包括了解起始材料的质量属性、偶联条件对原料药质量属性的影响（通过实验室模型系统获得）以及下游工艺中杂质的归宿和清除。成功的控制策略将证明，即使没有特异性释放测定，也能以科学合理的方式实现杂质控制。开发ADC的最后一个挑战是药物种类的高毒性。ADC中使用的药物的 IC50值（最大抑制浓度的一半）通常在低nM至pM范围内，这种毒性超出了大多数化学家的经验范围。因此，实验室工作需要严格遵守暴露和污染的程序、工程和防护设备控制。这些控制措施也必须在生产领域实施，这一要求需要专门的设施。本综述将在赖氨酸偶联ADC开发的背景下详细研究这些问题。1. Inotuzumab Ozogamicin （InO）案例研究InO是一种抗体-药物偶联物，由与抗生素卡利米星（ozogamicin）共价连接的人源化单克隆抗体（inotuzumab）组成. Inotuzu mAb选择性地结合存在于B淋巴细胞。Calicheamicin是一种有效的 enediyne细胞毒性剂，可导致DNA双链断裂，导致细胞死亡。InO与表达CD22的细胞结合，并在内化时释放卡利西霉素，从而引起细胞毒性。它目前处于急性淋巴细胞白血病（ALL）的3期临床试验中。InO被授予该适应症的突破性疗法认定。图1.inotuzumab ozogamicin（InO）的结构InO是使用常规赖氨酸偶联法生产的，其中琥珀酰亚胺基活化的 calicheamicin衍生物与inotuzumab上赖氨酸的ε-氨基反应形成共价键。InO的表示如图1所示。大约六个卡利希霉素衍生物分子与每个inotuzumab分子偶联。为InO开发稳健、可扩展和商业化的制造工艺的一个主要挑战是控制产品异质性，以确保与早期临床和毒理学材料的可比性。由于赖氨酸偶联化学的非位点特异性，InO是偶联物的异质混合物，具有不同负载的接头payloard（calicheamicin 衍生物）连接到inotuzumab 上的不同赖氨酸位点。然而，由于开发了优化的工艺条件，InO的药物负荷分布是可控且非常可重复的，并且偶联发生在优选的赖氨酸位点。在 mAb上的80多种赖氨酸中，超过90%的偶联发生在8-10个动力学优选的赖氨酸位点（抗体的每一半有4-5个）。因此，InO具有特征的负载分布和位置异构体分布。为了确保这种概况在整个后期工艺开发中的一致性，采用了一种系统和基于风险的方法来进行开发研究。首先，筛选InO的质量属性，并确定与偶联物异质性相关的属性。这些与异质性相关的质量属性包括： • 总载药量 • 药物载量分布 • 未偶联抗体 • 未偶联接头有效载荷 • 偶联赖氨酸的序列位置图2. iCE的药物负荷分布图2显示了通过成像毛细管等电聚焦（iCE）的InO药物负载分布示例。由于电荷差异，具有不同DAR的物质在电泳图中的迁移方式不同。在为上述质量属性和目标规格建立了分析测试方法后，这些质量属性用于测量工艺表征研究中产生的偶联物的异质性。下一步是评估影响这些质量属性的流程步骤。制备InO原料药的过程包括四个主要步骤：（1）inotuzumab与活化的calicheamicin 衍生物的偶联;（2）使用疏水作用色谱（HIC）纯化粗偶联物;（3）使用超滤/渗滤进行缓冲液置换;（4）配制以制备最终配制的原料药。多学科团队进行了初步风险评估，以确定可能影响InO原料药异质性的工艺参数。这些工艺参数包括：• 偶联反应：偶联pH值、时间、温度、药物起始量、助溶剂和表面活性剂起始量。• HIC步骤：色谱柱激发、上样和洗脱缓冲液浓度和pH值以及馏分混合。图3. iCE 的药物载量曲线比较使用多变量DOE和单变量实验策略的组合来执行过程表征研究，以表征这些过程输入参数与质量属性之间的关系。结果表明，总载药量（DAR）和载药量分布主要受偶联反应中卡利希霉素输入和HIC纯化步骤中馏分混合的控制。对于偶联反应，增加calicheamcin起始量会导致DS具有更高的DAR，并且相应的药物负载分布向更高负载的物质转移，如iCE谱图（图3）和相应的LC-MS（图4）所示。在HIC纯化步骤之后，由于游离卡利霉素和游离抗体在HIC柱上的迁移率不同，因此从偶联物中去除了游离卡利霉素和游离抗体。图4. 通过 LC-MS 比较药物载样量曲线然后根据蛋白质浓度、药物载样量和聚集水平的标准合并收集的HIC馏分，进一步细化偶联物载样量及其分布，并确保在进入下一个工艺步骤之前满足所需的偶联物质量属性。然后根据原料药异质性的目标规格确定卡利霉素起始量和HIC馏分混合标准的可接受范围。随着实验结果和进一步的放大经验的获得，重新审视了风险评估并进行了临界性评估。卡利希霉素起始量和HIC馏分混合标准均被指定为关键过程。后期工艺开发的另一个挑战是将偶联工艺从实验室规模放大到生产规模。与典型的生物过程不同，inotuzumab与活化的calicheamicin衍生物的偶联反应非常迅速。根据反应中剩余的未偶联mAb量判断，浓度为10 mg/mL mAb的偶联反应在2分钟内完成，如图5所示。快速反应动力学要求所有规模的反应混合物充分混合。此外，加成速率和加成方法也是快速动力学反应需要考虑的参数。图5.未偶联InO的抗体量与反应时间关系为了确定控制0.1至10L各种规模的反应器系统中混合效率的参数，使用盐加标实验确定了每个反应器的混合时间，其中在添加浓缩物时监测反应器内氯化钠溶液的电导率。混合时间数据表明，在具有可比搅拌设置的每个反应器中实现了一致的混合曲线。因此，实验室规模的反应器（0.1L）被认为是适合的偶联放大模型。此外，计算流体动力学模拟还用于表征各种尺度的混合。接下来，使用实验室规模的反应器进行混合研究，以评估混合条件对偶联物质量属性的影响。混合条件包括搅拌速率、高于或低于表面添加法以及活化的卡利希霉素衍生物溶液的添加时间。实验表明，低搅拌速率和表面以上添加导致混合不良，这从不完全共轭中可以明显看出。另一方面，当 calicheamicin溶液加入表面下时，偶联定义添加速率，在中等规模（1L）下测试混合输入的可接受作范围，以确保工艺一致性和可扩展性。图6中的结果表明，中等规模运行的药物负荷曲线与从早期临床运行制备的参考标准品的载药量曲线相当。该工艺已进一步扩大到商业规模，产量和质量属性的比较表明，已建立的工艺对于商业规模生产是稳健且可扩展的，如图7所示。原则上，剪切依赖性聚集可能会限制高混合速率的使用，尽管在这种情况下没有观察到聚集作为混合的函数。图6. iCE 的药物载量概况图7. 不同尺度上的共轭属性比较2. 技术转移至商业化生产一旦确定了商业规模的工艺，就开始了该工艺向制造的技术转让。开发和制造团队之间的信息共享和技术讨论贯穿整个开发周期，但在工艺特性研究接近尾声时，技术转移文件才最终确定，为生产做准备。下面将讨论工艺配合、生产设备和一次性系统、原料药中间体的供应、原材料注意事项以及细胞毒性材料的处理，因为它们与工艺向制造的转移有关。3. 生产设备和生产工艺ADC原料药生产的主要制造设备包括反应器和纯化系统。为每个制造过程选择合适的制造设备基于多种因素。本节介绍一次性系统、反应器、色谱分析设备、缓冲液置换设备以及随附的注意事项。（1）一次性系统ADC生产可能会大量使用一次性系统。多家供应商提供完全一次性的制造系统，包括色谱橇、色谱柱、切向流过滤橇和膜。一次性生物工艺容器经常用于产品转移、稀释和过滤。除了无需清洁和清洁验证的好处外，一次性系统还减少了工人接触细胞毒性药物的可能性。设计允许完全封闭的模块，使用后不必拆卸。如果一次性系统最大限度地减少了对受污染表面的处理，那么该过程将更加安全。为了通过最少的处理实现安全性改进，应注意确保模块之间的连接在使用期间和使用后无泄漏。（2）反应器在InO工艺中，选择玻璃反应器是因为其混合能力和放大性能。使用 ANSYS软件14.0通过计算流体动力学（CFD）仿真对反应器进行表征。CFD结果（图8）显示，在较短的混合时间内实现了充分的混合。这种混合曲线类似于在较小的开发反应器中观察到的混合曲线。此外，CFD仿真还用于评估多种设计，包括（1）单叶轮与双叶轮，（2）叶片角度（45、60 和 90°）和（3）叶片高度。在放大运行之前，进行了盐加标实验、添加速率和各种添加位置实验，以确认CFD模型。这些结果表明，可以在不使用特定反应器填充体积的变化和反应器设计的变化。在inotuzumab ozogamicin的案例中，规模的5倍变化需要评估混合动力学。图8. 商业规模反应器的CFD模拟虽然没有在混合性能方面与玻璃或不锈钢反应器相当的一次性反应器，但已经对混合袋和一次性生物反应器进行了评估，并在某些情况下用于生物偶联反应。使用ANSYS软件13.0对一次性生物反应器设计进行CFD仿真。结果表明，容器顶部发生缓慢混合，并形成微涡流（图9）。因此，这个一次性反应器细胞生长所需的设计限制了混合时间，并且可能无法为ADC偶联反应提供足够的混合，特别是对于具有快速动力学的反应。图9. 一次性生物反应器的CFD模拟（3）色谱法疏水作用色谱（HIC）纯化在InO的生产中起着关键作用，可确保满足预定的关键质量属性。疏水层析与反相色谱类似，因为保留性是由疏水性驱动的。然而，疏水层析填料设计为与从强水性缓冲液（高达∼4M，弱溶剂）到水或弱缓冲液（∼20mM，强溶剂）的洗脱系列配合使用，对于蛋白质工作，通常不会扩展到有机溶剂/水混合物。由于与inotuzumab偶联的卡奇霉素赋予偶联物更大的疏水性，因此此步骤可有效去除产品中未偶联的抗体、聚集体、游离药物和赋形剂。由于此步骤包括馏分收集，因此ADC的药物负载也会受到影响，具体取决于馏分的合并方式。对于InO，每个馏分都经过蛋白质浓度、药物/抗体比率和聚集体测试，并建立了确保仅合并那些产生符合规格的最终产品的馏分的标准。为了建立馏分混合标准，使用小规模模型进行的研究转化为生产规模非常重要。图10显示了典型的实验室规模色谱图。卡奇霉素偶联物的一个有用属性是存在310nm发色团。这导致偶联物在310nm处产生显著信号，而任何残留的未偶联抗体都没有310nm的吸收。粗偶联物与色谱柱初始结合后，用低磷酸盐浓度洗涤洗脱未偶联的抗体，然后用不含磷酸盐的缓冲溶液进行分步洗涤，洗脱产物。晚期洗脱馏分包含更多高度偶联的物质，根据它们对药物/抗体比值的影响，可能包括这些物质。图10. 实验室规模的HIC色谱图通过保持色谱柱高度恒定并增加与反应量成比例的横截面积，同时保持恒定的线速度，将色谱柱放大至生产规模。色谱步骤中的所有其他作和缓冲液保持不变。根据UV痕量规模、产量和产品质量属性之间的可比性，色谱步骤被证明是可扩展且稳定的。（4）原料药的最终超滤/渗滤和过滤超滤/渗滤（UF/DF）步骤的主要目的是调整浓度并用原料药缓冲液替换色谱缓冲液。UF/DF系统利用压力迫使小分子缓冲液组分和水通过半透膜，以浓缩溶液（工艺的UF相）并以恒定体积交换产品（DF相）。InO UF/DF工艺使用不锈钢撬块；然而，Recreserved容器是一种一次性袋系统，旨在在此过程中提供充分的混合。在生产秤袋上进行染料混合研究，以确认在此过程中没有未混合的区域。此外，染料实验用于确定回流和产液管线的最佳位置，因为回流和产水流用于增强混合。UF/DF作是直接从使用相同膜材料的实验室规模模型进行缩放的。在每个工艺步骤后进行正常流动过滤，以降低颗粒物的水平。Vmax和Pmax研究在小规模下进行，以确定每个工艺步骤在生产规模上所需的过滤面积。在放大运行期间确定过滤面积的确认。由于这种过滤是在从一个一次性生物工艺容器（BPC）转移到另一个一次性BPC的过程中进行的，因此使用了一次性蠕动泵系统。4. 原料药中间体的供应对于ADC，有两种原料药中间体（DSI）：单克隆抗体（mAb），这是一种生物制剂，而接头/有效载荷，通常是一种小分子。对于ADC生产来说，这两种截然不同的中间体的供应规划至关重要，每种中间体都有其自身的挑战。制药行业mAb的生产已有30年的历史，可以追溯到1986年批准第一个获批的单克隆抗体OKT。从那时起，mAb的生产工艺得到了改进和优化，并且对这些工艺有深入的了解。然而，用作DSI的mAb在运往 ADC的过程中的重要属性可能与mAb作为原料药时的不同。此类属性的一个示例是aggregates级别;mAb DSI的阈值可能是可接受的，因为ADC工艺可以进一步去除聚集体。必须针对每个ADC评估mAb所需的属性。以DSI 形式生产的mAb的另一个区别是生产规模。ADC是强效药物，通常以低于治疗性抗体的剂量给药。因此，mAb DSI可能需要比治疗性mAb更小的设施和作规模，或者活动时间可能明显更短。目前开发的大多数ADC的接头/有效载荷（L/P）是半合成或全合成小分子，因此具有与生物不同的监管要求。此外，相对于许多药物，有效载荷通常是一个复杂的分子，并且具有相应的具有挑战性的制造工艺。最后，L/P 通常包含细胞毒性药物，需要特殊的设施和处理。制造商必须能够处理高效活性药物成分（API）。对于InO，活化的卡利霉素衍生物L/P是在专为专用设施设计的设施中制造的卡奇霉素（calicheamicin）的发酵、分离和合成修饰（参见下面的“细胞毒性材料的处理”）。图11显示了活性加利希霉素衍生物的生产步骤。图11.活化的卡利希霉素衍生物的制造步骤活化的卡利霉素衍生物通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化。RP HPLC可高效分离产物与杂质，并与在线分析相结合，以提高馏分纯度。因此，该纯化步骤可以严格控制DSI中的杂质。尽管活化的卡利霉素衍生物中的活化酯在RP-HPLC的水/有机条件下易水解，但水解可以通过 HPLC流动相pH值进行控制，因此可以最大限度地减少水解。残留溶剂通过沉淀和真空干燥步骤进行控制。RP-HPLC序列后进行沉淀/干燥，为ADC偶联工艺提供了具有适当低杂质和残留溶剂含量的DSI。设定适合偶联过程的L/P规格是L/P过程和分析控制策略开发的一个重要方面。一旦起草了规格，就可以开发L/P工艺以满足这些规格并实现成功的偶联工艺。与小分子工艺类似，L/P的强度对于确保准确充注偶联物至关重要，因此必须达到适当的杂质和残留溶剂水平。对于L/P来说，可偶联和不可偶联杂质的水平也很重要。应尽量减少可偶联杂质，因为这些化合物可以与抗体偶联并成为DS的一部分。对于活化的卡利希霉素衍生物过程，卡利希米星同系物的活化酯由N-乙酰卡利霉素中的低水平杂质形成；这种可偶联杂质通过RP-HPLC纯化清除。非偶联杂质必须通过ADC工艺去除，并适当敏感地测定。5. 开发和验证策略mAb和L/P的工艺开发可以与ADC原料药的偶联工艺开发同时进行。这种并行开发工作必须得到适当的管理，并受最终目标的约束。开发团队之间的沟通至关重要，因为mAb和L/P的属性会直接影响偶联过程。理想情况下，L/P、mAb和ADC工艺的开发和放大是有序和定时的，这样所有三个工艺的开发几乎可以同时进行。图12概述了L/P、mAb 和ADC的开发时间和步骤。这种方法代表了风险最低的最保守的方法。应该注意的是，提供代表商业流程的L/P以验证ADC流程可能就足够了。因此，L/P工艺的验证时间可以移出，使其与ADC工艺验证同时发生或之后进行。这种方法成功的前提条件是必须证明来自最终商业流程的材料与用于ADC验证的材料之间的等效性。遵循小分子范式将允许L/P流程的验证与BLA的提交同时进行。最近的文件在很大程度上包括BLA中的流程验证包。多组分验证的另一个复杂性是抗体或L/P可能没有足够的稳定性来支持整个验证计划的风险。此外，虽然组分的质量属性的维护将在各自的稳定性程序中得到证明，但控制策略必须确保组分质量属性在原料药和药品的整个生命周期内保持不变。对于InO，用于工艺验证（即申报前验证）的生物制剂方法也应用于L/P工艺，既使L/P的验证策略与mAb和ADC的验证策略保持一致，又促进了图12所示的所需流程。图12. 接头/有效载荷、mAb和原料药工艺开发、评估和验证示意图（1）批次量大小批次量大小和稳定性是DSI供应的基本工艺考虑因素。ADC偶联工艺规模由预计的商业需求决定，对于ADC，该规模通常需要低于相应DSI工艺生产数量的DSI数量。为了优化资源和时间，可能需要更大规模地运行DSI进程，以便为多个DS批次准备DSI的供应。mAb和L/P生产的规模将取决于可用的工艺、设备和生产设施，但规模也将取决于ADC批次大小和DSI的长期稳定性。对于InO的生产，mAb工艺的典型产率为三个ADC批次提供了足够的材料，而L/P工艺的典型产量足以为五个ADC批次提供足够的材料。mAb和L/P均可稳定数年，预计每年的ADC批次数将在DSI到期前消耗掉这两种DSI。（2）原材料对于生物制剂工艺，通常在整个过程中监测内毒素和生物负荷水平，并在开发过程中确定原材料的适当限量。可以进行内毒素和生物负荷测试的原材料示例包括缓冲液、赋形剂、层析填料、过滤器和加工容器。必须控制原材料中重金属的含量，以免将这些潜在有毒杂质引入原料药和药品中。重金属可能来自多种材料，因此仔细评估过程中的所有材料非常重要。必须了解和控制过程中使用的容器、袋子和管道的可萃取物和可浸出物。通过产品接触和了解潜在杂质，可以引入各种杂质，其来源将改善对过程的理解和控制。用于L/P溶解的乙醇的含水量是受L/P控制的原材料属性的一个示例。如图11所示，活化的卡奇霉素衍生物含有一种活化的酯，用于与mAb上的赖氨酸残基反应。这些活化酯易水解，因此，乙醇中水的规格设定为≤0.2%。在偶联之前，将活化的卡利霉素衍生物溶解在乙醇中，并将该溶液加注到偶联反应中。活化酯的水解对偶联反应有害，因为L/P一旦水解就不会发生反应。为了最大限度地减少水解，用于溶解的乙醇中的水受到原材料规格的严格控制。对于开发团队来说，评估每种原材料的所需属性并相应地设定规格非常重要。在开发阶段生效的药典规范可能合适，也可能不合适。但是，由于药典规格可能会发生变化，因此使用工艺要求来确定原材料规格。（3）细胞毒性材料的处理正确处理细胞毒性物质对于操作者的安全至关重要。必须制定标准作程序 （SOP）来接收、运输、处理和储存细胞毒性化合物。必须提供合格的设备来处理和储存细胞毒性化合物，例如用于称量和制备溶液的隔离器/手套箱。适当的个人防护装备（PPE）是必不可少的，并且制造工厂的每个区域对PPE的要求可能不同。处理和储存细胞毒性化合物的区域可能需要限制进入，并且必须张贴并维护适当的标志，以提醒所有进入这些区域的人员。活化的卡利希霉素衍生物是在专为生产、处理和储存卡利希霉素产品而设计的专用设施中制造的。发酵和γ卡利霉素分离作在封闭系统中进行，材料之间无需操作员接触即可转移。制造活化的卡利希霉素衍生物的所有合成步骤都在大型隔离器（手套箱）内进行，其构造既可以隔离作员与加利希霉素的接触，又可以方便地进行作。最后，原料药生产，其中活化的卡利希霉素衍生物与抗体偶联，ADC的纯化在专用套件中进行，便于将L/P溶液安全地装入偶联反应中，并通过纯化和UF/DF操作处理ADC。然后将原料药冷冻并储存，直到发展为药品。对于InO工艺，药品与卡利希霉素和原料药在同一设施中的单独套件中生产。这种安排允许从原材料到密封小瓶的整个过程在同一栋建筑内进行，并有助于确保正确处理和控制细胞毒性材料。6. 后期开发的分析挑战在ADC开发后期会进行多种分析活动，其中可能包括以下内容： • 确定质量属性的关键性;• 开发和验证所有用于关键质量属性放行的检测方法;• 为现有产品和工艺的重要属性开发额外的表征方法;• 过程表征的分析测试支持;• 标准物质的建立和表征;• 临床材料的释放和稳定性测试;• 针对潜在工艺和制造地点变化的可比性研究;• 开发/验证关键工艺步骤的过程中分析;• 分析测试支持用于工艺验证的残余间隙;• 确定分析控制策略。此外，对于ADC，需要对DSI（mAb和L/P）以及ADC原料药和药品进行类似的分析活动。在本节中，讨论将集中在后期偶联工艺支持的分析策略和挑战上。ADC后期工艺开发的分析支持有几个考虑因素。一个考虑因素是，需要尽早建立确定对过程和产品理解都很重要的属性的方法。可能需要进一步评估早期开发的方法，以确保支持后期开发的适用性和稳健性。可能需要其他方法和控制来支持对过程/产品的理解增强。典型ADC的潜在质量属性可能包括大小异质性（如聚集和碎裂）、电荷异构体、药物抗体比（DAR）、蛋白质浓度和偶联药物浓度、药物负载分布、偶联位点和占位点（对于赖氨酸ADC）以及残留药物相关物种。对于InO，由于它是基于卡利希霉素的ADC，因此在样品储存、制备和分析过程中需要采取特殊预防措施，以防止由于存在酸不稳定接头和加利希霉素的潜在光敏性而导致药物意外降解。另一个考虑因素是评估偶联对mAb中可能影响抗原结合的关键质量属性的影响。如果在发生抗原-抗体结合的CDR区域存在潜在的脱酰胺“热点”，则需要开发一种测量mAb/ADC中脱酰胺的方法，以监测偶联和纯化过程对这一特定质量属性的影响。在InO的情况下，确定偶联和纯化过程对脱酰胺没有显著影响，因此控制策略反映了脱酰胺是在mAb DSI阶段控制的，而不是在ADC上。过程支持经常遇到的挑战之一是，用于最终原料药检测的方法可能不适用于过程样品检测，因为由于样品基质不同且存在多种组分，过程中样品通常更复杂。例如，对于共轭反应混合物中的DAR测定，释放UV方法不适用，因为反应混合物中的游离药物会干扰共轭药物浓度的测定。这可能导致对DAR的高估。要么需要开发不同的方法，要么使用一种减去游离药物的修改方法。在其他情况下，需要评估基质干扰。通常需要进行加标/回收率研究，以确保该方法适合作为定量分析。对于对初始样品缓冲液条件敏感的方法，例如iCE、离子交换HPLC和HIC，可能需要调整样品前处理程序，以确保该方法仍然能够分离和准确定量目标物质。在InO案例中，iCE方法涉及稀释原始样品以将盐浓度降低到可以容忍的水平。过程支持的另一种常见策略是使用不同于放行方法的分析方法，但通过桥接研究确保等效性。对于InO过程表征研究，使用ELISA分析法测定最终原料药和药品中的残留药物。然而，ELISA分析存在一些局限性：与典型的LC方法相比，分析的可变性更大、程序繁琐以及关键试剂的维护。对于过程表征研究，开发了一种RP-HPLC分析来确定残留药物，而不是 ELISA分析。在HPLC定量限（LOQ）水平进行加标/回收，以证明相似的分析性能并桥接两种方法。可能需要其他方法来测量其他质量属性，这些属性在工艺开发的早期阶段尚未确定。对于InO，在开发的早期阶段没有药物负荷曲线的测定。因此，对于过程表征研究，同时使用iCE方法和 HIC方法来监测药物负载曲线。此外，肽图分析用于监测偶联位点。值得注意的另一点是，并非每个过程或过程表征样品都需要测试所有属性。特别是对于工艺参数范围不是很宽的工艺表征研究，通常不进行生物检测（包括细胞毒性），因为这些结果由于检测的可变性而可能没有意义。为了支持工艺验证，所有关键的过程中分析都需要进行验证。此外，还需要开发合适的方法，以证明所有相关工艺杂质的清除率，例如残留L/P、工艺缓冲液和残留有机溶剂。这项工作通常与工艺验证一起执行，使用从工艺的不同阶段生成的材料，以显示每个阶段的间隙。由于在存在大量蛋白质偶联物的情况下需要非常低的分析LOQ，因此某些工艺杂质方法可能具有挑战性。通常，需要不同的分析技术来定量残留杂质。例如，对于ADC中的残留溶剂，通常需要使用带有顶空进样器和FID检测器的GC方法进行定量。对于某些过程杂质，通常使用除UV以外的检测器（如 ELSD、MS）。【NO.3】总结 这些活动有助于将InO项目成功推进到后期开发。其中的关键是制定控制策略，该策略侧重于控制从原材料到药品的质量属性，注意单元操作的适当扩展，通过应用适当的分析工具对产品进行详细了解，以及研究工艺参数对质量属性的影响。此外，规划处理细胞毒性材料的复杂供应链和设施要求也至关重要。这种ADC特别复杂，但所使用的方法普遍适用。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。