Cerivastatin Sodium

Cytiva智荟专线400-810-9118，2号键#智荟锦囊本期快问快答，智荟专线将为大家继续梳理凝胶过滤层析的常见问题。上篇☞ 智荟专线快问快答 | 凝胶过滤层析（上）主要关注凝胶过滤层析的原理、过程、样品准备等通用问题，本篇主要集中在产品使用。Q1新购买的层析柱，拆开包装发现柱顶带了一个像注射器一样的东西，如何取下？Cytiva的高分辨率层析柱，柱子的一端会连有一个Shipping device的小装置，里面存有一定体积的20%乙醇，作用是防止层析柱内的液体挥发导致填料变干，因此在层析柱运输和长期保存的时候均建议将此装置连接到层析柱上1 。取下方法如图1所示:图1：Shipping/Storage device的取下方法如果该装置内的液体蒸发或者操作不当导致液体流出，此时需要补充液体，取下固定栓和顶端扣盖后，按照图2的方法进行液体填充：图2：Shipping/Storage device液体填充方法层析柱短期不使用或者需要运输，此时需要将该装置装回，排除气泡后按图3操作：图3：Shipping/Storage device的安装方法Cytiva柱体积120 mL和320 mL的制备级预装柱和高分辨率的Increase半制备和分析型预装柱，在产品包装内均已标配备了该装置，下方视频展示该装置的液体填充方法以及与Hiload分子筛预装柱的连接方法：如果是您自行装填层析柱，建议单独购置一个该装置（货号：18117643），对柱床进行保护。Q2新购入的分子筛层析柱需要测定柱效吗？为什么我测定出的值比参考值要低？Cytiva的高分辨率分子筛层析柱出厂时均已测定过柱效，均符合COA上的标准。Cytiva Increase 10/300系列产品和HiLoad prep grade系列预装柱的柱效出厂标准如图4所示：图4：部分SEC产品的柱效出厂标准如果您要测定柱效，请完全按照说明书上的试剂和条件进行准备，如果是用ÄKTA系统进行测试，建议运行UNICORN软件中预设的程序（column performance test），程序中均已预设好流速和上样体积等参数。Cytiva预装柱出厂测定使用的是内部死体积非常小的专用设备，如果新柱子您测定出的柱效值偏低，请检查您所用设备的内部体积，例如用ÄKTA avant测定3.2/300柱体积2.4 mL层析柱的柱效，2%的丙酮水溶液上样量10 μL，容易出现柱效测定值偏低的情况，原因是在较大型的层析设备中，微量样品在柱位阀、管路和检测池中发生明显扩散，样品在仪器内部稀释比例过高，导致出峰变宽柱效降低。因此如果使用3.2/300这类小体积层析柱且实验对分辨率要求较高，建议选择内部体积更小的ÄKTA micro层析系统，或者联系Cytiva对ÄKTA pure 25系统进行改造。Q3手里好几根Cytiva分子筛预装柱，如果做150 KD抗体的分离，应该选哪款？Cytiva不同分子筛填料的分离范围不同，分辨率也不同。不同材质的填料之间耐压性也有差异。几款热门凝胶过滤产品的球蛋白分离范围如图5所示：图5：几款热门分子筛产品的球蛋白分离范围对于单体150 KD的抗体分子来说，样品中可能会存在抗体聚集体或者抗体片段，因此要求层析填料对于聚集体、单体，小片段均有分离效果，因此可根据图5的分离范围选择分辨率较高的Superdex 200或者选择分辨率适中的Sephacryl S-200。如果目标蛋白分子量是35 KD，可以选择高分辨率的Superdex 75或者选择分辨率适中的Sephacryl S-100。一般，40 KD以下蛋白建议优先选择Superdex 75，40 KD以上建议优先选择Superdex 200。如果进行核酸片段或者多糖样品的分离，请不要参考球蛋白的分离范围。由于分子形状不同，同一种填料对于核酸、蛋白和多糖的分离范围是有明显差异的。如图6所示，Sephacryl系列部分产品对于多糖和球蛋白的分离范围可能会差一个数量级2。图6：Sephacryl对于不同类型样品的分离范围Q4蛋白样品标记了一个带颜色的基团，发现上样后，样品（带颜色）在柱上的移动过于缓慢，出峰明显延迟，而未标记的蛋白出峰位置是正常的。这种情况通常是标记后的样品（或标记物本身）和层析填料发生了相互作用，导致样品出峰延迟或者提前。例如FITC标记的抗体分子用Sephadex G-25进行脱盐实验去除游离的小分子FITC，会发现黄色的FITC会明显的吸附在白色填料上。类似地，用Superdex 30 increase分离多肽样品时，由于多肽类的样品可能强亲水或者强疏水，所以建议在样品和缓冲液中添加0.1% TFA（三氟乙酸）或者添加30%乙腈+0.1% TFA，保证样品的有效分离。蛋白质与SEC填料发生相互作用主要依靠静电相互作用和疏水相互作用3。前者涉及填料和蛋白质的带电表面残基。后者可能发生在填料和蛋白质的疏水位点之间。静电相互作用会导致蛋白质洗脱时间发生变化，或者出现吸附和峰拖尾。有两种类型的静电相互作用可能会影响蛋白质在SEC中的保留，即离子吸附和离子排斥。当存在离子吸附时，可能会出现样品回收率低和峰拖尾。而对于离子排斥，由于随之而来的是排斥力，所以容易导致样品提前洗脱。调整离子强度和pH值是减弱静电相互作用的主要方法。为了减少疏水相互作用，可以添加有机试剂，例如乙腈、去污剂或甘油。对于蛋白和多肽类的样品，另一种广泛使用的方法是添加碱性氨基酸-精氨酸，精氨酸既能稳定蛋白质结构，又能防止蛋白质与填料之间的相互作用。Q5运行SEC实验，样品出峰位置正常，但是峰出现了拖尾是什么原因？好的峰通常是左右比较对称的，但是实际实验中有可能出现拖尾或者前伸，如图7所示。图7：拖尾峰和前伸峰出现拖尾峰的主要原因和解决办法如图8所示：图8：峰拖尾的可能原因和解决办法出现前伸峰的主要原因和解决办法如图9所示：图9：峰前伸的可能原因和解决办法Q6Increase 10/300层析柱运行的时候，顶端出现一段 “空” 的水柱，如何处理？对于Increase这种预装柱来说，如果柱头适配器和填料之间出现缝隙，如图10所示：白色柱床和顶端滤膜出现0.5 cm的缝隙。通常原因是柱床发生过超压，导致部分胶粒被压 “瘪” ，这种情况对于胶粒的损伤是不可逆的。出现缝隙后对于柱效的影响较大。图10：Increase预装柱顶端柱床塌陷如果此时层析柱压力正常，建议向下调节层析柱顶端红色适配器，使其紧压胶面，排除空隙体积，调节方法如图11所示：图11：Tricorn柱顶端适配器高度调节方法预装柱顶端适配器长度有限（可继续向下调节的高度小于1 cm），如果旋转到底发现也无法贴近胶面，此时可测量柱床高度，如果柱床高度超过28 cm，可单独购买调节范围相对更长的顶端红色适配器，此时请进行柱效检测，判断是否还能达到分离要求。如果柱床塌陷过多，请直接购买新的分子筛层析柱。Q7运行Increase 10/300 GL的柱子，0.02 mL/min的流速下压力已经达到2Mpa，该如何处理？首先判断超压报警是由什么原因引起的，先把柱子by-pass或者柱子不接入系统，看下系统的运行压力。判断到底是层析系统还是层析柱引起的超压。一旦确认是层析柱的问题，先检查下层析柱顶端柱床是否出现塌陷（如图10所示），如果出现塌陷请先按照图11的方法向下调节柱头压紧胶面。然后请尝试反向冲洗层析柱，如果压力依然很高，建议更换层析柱内的滤膜，滤膜属于消耗品，一旦滤膜出现变色（变绿，变棕黄，变黑），也请及时进行更换。层析柱清洁不到位，或者样品浊度粘度过高，经常会引起滤膜堵塞导致层析柱超压。滤膜的更换方法请扫描下方二维码下载。扫码在线学习带你高效进阶，化身“纯化达人”！《纯化达人成长记：凝胶过滤的几道“弯”》课程概要：1. 凝胶过滤的基本原理2. 不同凝胶过滤产品的特点及应用3. 实验常见问题关于凝胶过滤层析的更多问题欢迎直接拨打Cytiva智荟专线：400-810-9118转2号线咨询。参考资料：1.CY18970-02Feb20-PD. Maintenance and cleaning of size exclusion chromatography columns.2.CY14619-03Sep20-DF. Sephacryl High Resolution resins HiPrep Sephacryl HR columns.3.CY12707-03Dec20-HB. Principles and methods size exclusion chromatography.相关阅读：☞ 智荟锦囊开讲啦 | 关于分子筛层析柱超压☞ 凝胶过滤的几道 “弯”☞ 智荟专线快问快答｜离子交换篇☞ 快问快答 | 关于亲和层析的常见问题（上）☞ 快问快答 | 关于亲和层析的常见问题（下）

点击 蓝字 关注我们 Abiosciences 2025年3月26日，百奥智汇创始人、科学顾问，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民课题组联合国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院、同济大学附属上海市肺科医院、广东省人民医院、郑州大学第一附属医院、昌平实验室、重庆医科大学、深圳市人民医院、中国科学技术大学等合作团队，在国际期刊Cell上以Resource形式在线发表了题为“A single-cell atlas reveals immune heterogeneity in anti-PD-1-treated non-small cell lung cancer” 的研究论文。 非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer）在所有癌症类型中具有较高的发病率与致死率，主要包含肺鳞癌（Lung squamous carcinoma）与肺腺癌（Lung adenocarcinoma）等亚型。对相对早期的非小细胞肺癌，临床实践中通常采用手术切除肿瘤的方式进行治疗，但手术过程通常不能识别肿瘤发展过程中产生的微转移（Micro-metastasis），部分患者在接受手术后仍然会出现疾病的复发（Disease recurrence）。新辅助治疗指手术前的药物治疗，2024年以来，以CheckMate-816为代表的一系列临床研究证实了新辅助anti-PD-1免疫治疗联合化疗在非小细胞肺癌中的优异疗效。约60%的患者在接受上述治疗后达到主要病理学缓解（Major pathological response, MPR），其中大部分患者同时达到完全缓解，首次展现了将局部进展期非小细胞肺癌治愈的可能，为患者带来了极大的希望。 尽管如此，非小细胞肺癌的新辅助免疫治疗仍存在两大未被满足的临床需求：（1）约40%的患者响应性较低，且耐药机制尚不明确。（2）约20%的患者在上述治疗后复发，且目前缺乏精准识别高复发风险患者的生物学标记物。2025年3月26日，北京大学张泽民课题组联合此次研究的合作团队，在Cell期刊上发表了题为“A single-cell atlas reveals immune heterogeneity in anti-PD-1-treated non-small cell lung cancer”的研究论文，使用scRNA/TCR-seq系统解析了非小细胞肺癌患者在新辅助治疗后的免疫微环境异质性，初步识别了non-MPR患者的耐药机制，并开发了精准预测患者复发风险的生物学标志物，对非小细胞肺癌的临床实践具有重要的指导价值。 图1 研究方案及主要发现 该研究依据每例患者肿瘤中不同免疫细胞亚型的相对丰度对患者进行聚类，识别了新辅助免疫治疗后的5类免疫微环境亚型（TIME-subtypes），包含富集FGFBP2+ NK细胞的高响应性亚型（TIME-NK）、富集B细胞与三级淋巴结构的高响应性亚型（TIME-BE）、富集效应T细胞的高响应性亚型（TIME-Teff）、富集Treg与终末耗竭T细胞的低响应性亚型（TIME-Treg）及富集髓系细胞的低响应性亚型（TIME-Mye）。值得注意的是，non-MPR患者中有近半数表现为TIME-Treg亚型，提示了Treg富集与低缓解率的相关性。 值得注意的是，该研究注意到FGFBP2+ NK细胞不仅在接受免疫治疗联合化疗的响应者中富集，还在仅接受新辅助化疗的响应者中富集。此外，FGFBP2+ NK样T细胞表现为高度克隆扩增的状态，且不表达PDCD1基因，提示了FGFBP2+ NK细胞可能通过不同于经典CD8+ T细胞的方式对肿瘤进行杀伤。体外实验观察到NK细胞能够杀伤化疗处理后进入压力状态的恶性肿瘤细胞系，提示了FGFBP2+ NK细胞在化疗响应中的功能。传统观点认为，化疗主要通过肿瘤死亡与抗原释放促进免疫治疗疗效的提高，该研究观察到化疗也可激活一部分NK细胞对肿瘤进行直接杀伤。 图2 非小细胞肺癌新辅助免疫治疗后的免疫微环境异质性示意图 该研究还对T细胞进行了T细胞受体（T cell receptor，TCR）克隆扩增方面的深度分析，识别了两类具有潜在不同耐药机制的non-MPR患者。近年来的一系列研究提示，Tex-relevant克隆型（耗竭T细胞相关克隆型）与CCR8+ Treg克隆型可分别近似指代肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞与肿瘤抗原特异性Treg。该研究深度分析了上述克隆型的数目与扩增强度在MPR与non-MPR患者中的差异，识别了两类non-MPR患者：Treg-hi non-MPR患者同时具有较高数目的Tex-relevant克隆型与CCR8+ Treg克隆型，提示治疗响应性低与高度免疫激活伴随的免疫抑制具有相关性；Treg-low non-MPR患者表现为相反的特征，其Tex-relevant克隆型数目较少、扩增程度较低，提示该类型患者的免疫激活不足。因此本研究识别了non-MPR患者的耐药机制异质性，能够指导患者的后续精准治疗。 此外，该研究观察到耗竭T细胞前体（Texp）的丰度能够较好地预测患者手术后的复发风险，且该指标的预测能力显著高于传统的病理学缓解率指标。该发现有助于在手术时刻识别高复发风险患者，指导患者的后续辅助治疗。 综上所述，本研究系统性的阐释了非小细胞肺癌患者在新辅助免疫治疗联合化疗后的免疫微环境异质性，识别了患者在耐药机制方面的潜在差异，并开发了预测患者复发风险的新型生物学标志物，具有一定的基础研究与临床转化价值。 北京大学BIOPIC/重庆医科大学张泽民院士、中国医学科学院肿瘤医院高树庚教授、同济大学附属上海市肺科医院陈昶教授、广东省人民医院钟文昭教授、郑州大学第一附属医院张毅教授、昌平实验室/重庆医科大学程斯进研究员、北京大学BIOPIC朱琳楠副研究员、深圳市人民医院邹畅教授、同济大学附属上海市肺科医院佘云浪副研究员、中国科学技术大学田志刚院士为该论文的共同通讯作者；博士研究生刘泽道、杨震林医师、吴俊琪医师、博士研究生张文杰、博士研究生孙雨萱、张潮医师、白广宇医师和杨黎教授为共同第一作者。该研究得到昌平实验室、国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持和资助。 论文链接： https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00291-0 张泽民，百奥智汇创始人、科学顾问，北京大学生物医学前沿创新中心主任，北京大学生命科学学院终身讲席教授，北大-清华生命科学联合中心高级研究员，长江学者，中国科学院院士。张泽民博士的学术经历包括南开大学、CUSBEA项目（中美生物化学联合招生项目）、美国宾夕法尼亚州立大学和加州大学旧金山分校。在 2014 年加入北大以前就任基因泰克/ 罗氏公司（Genentech/Roche）16余年，负责生物信息学和癌症基因组学研究，挖掘抗癌靶点。张泽民课题组致力于用前沿的生物信息和基因组学来解决癌症生物学中的核心问题，专注于研究肿瘤微环境的底层特征，发现了肿瘤在微环境水平的异质性和潜在规律，推进其在药物疗效预测和靶点发现中的应用。张泽民课题组的研究成果曾获得北京市自然科学一等奖、中国生命科学十大进展、中国生物信息十大进展（多次）。他也是多个国际顶尖杂志的编委，包括Cell, Cancer Cell, Cancer Discovery和Cell Research。 张泽民课题组目前主要的研究方向包括：（1）研究肿瘤微环境特别是肿瘤浸润免疫细胞的精确组成、相互作用以及功能状态，并鉴定影响这些细胞功能的调控基因；（2）研究肿瘤微环境的异质性、及其对癌症病人治疗的影响；（3）开发原创的生物信息学工具和数据库，来进行大数据的整合、分析和可视化。 本文来源：北京大学生物医学前沿创新中心 END 百奥智汇媒体矩阵