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深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769文章来源：尧健生物肠道类器官：肠道类器官（intestinal organoids，IOs）可由细胞因子诱导胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）以及Lgr5阳性ISC（Lgr5+  ISC）分化而来。人类消化道疾病和其他动物不太一样，因此动物模型不能很好重现人类疾病的发展过程。培育出人类的结肠“类器官”，有助于科学家研究肠道营养运输、药物吸收、胃肠道癌症以及多种肠道疾病。2011年Spence等首次利用人PSC和ESC构建人体来源的肠道类器官，Hans Clevers等成功构建出可以长期培养的人源肠道类器官。肠道类器官经过传代培养，可以存活6个月以上，并且可以保持基因型不变。肠道类器官模型的构建是一项技术突破，活体分离的隐窝干细胞在体外培养形成立体的隐窝－绒毛结构，该过程区别于常见的肠上皮细胞体外培养，可更好地用于研究肠道干细胞的功能和肠上皮细胞的稳态。DOI：10.1172/jci.insight.86492肠道类器官模型的应用肠道类器官模型在疾病建模研究中的应用患者衍生的器官类似于组织和肿瘤的生物学特性，能够对人类疾病进行体外建模，Nature Communications发表的研究报告了一项针对患者衍生的结直肠癌类器官的大规模基于图像的表型研究，以了解支配器官形态的潜在因素。来自11位患者的结直肠癌细胞被500多种不同浓度的实验性和临床使用的小分子药物处理，从3700000多张共聚焦显微镜图像中系统地绘制了患者衍生的类器官的形态异质性以及它们对化合物扰动的反应。结果发现，由此产生的类器官表型景观主要由类器官大小、存活率和囊状与实心类器官结构的差异驱动。同时，利用多组学因素分析整合类器官形态、大小、基因表达、体细胞突变和药物活性，研究还确定了这些表型背后的生物程序和调控它们的小分子。DOI：10.1038/s41467-022-30722-9肠道类器官模型在疾病治疗药物开发中的应用肠道类器官疾病模型也可用于研究新药物的功能、药物毒性以及药物的生物利用度和组织反应性。Dekkers等研究了囊性纤维化跨膜传导调节因子膜蛋白对肠道类器官系统中药物VX-770和VX-809系列反应，结果表明这些药物可用于囊性纤维化胃肠道疾病的治疗。DOI：10.1126/scitranslmed.aad8278肠道类器官在药物转运方面的研究小肠是药物吸收的主要部位，具有更强的上皮通透性和更大的表面积。因此，建立一个能够高度模拟小肠生理结构和功能的体外模型，将为药物吸收和排泄的评价提供可靠工具。BCRP作为一种外排转运蛋白，在小肠和结肠的顶端上皮中高度表达，研究结果显示，近、中、远段小肠隐窝和绒毛中BCRPmRNA水平存在差异。因此，在研究BCRP介导的类器官药物转运时，宜选择小肠近端到中段的部位。BCRP的荧光探针底物Hoechst 33342已被用于肠道类器官中药物转运的研究。BCRP抑制剂YHO13177显著降低了肠道类器官中Hoechst 33342的荧光强度，表明肠道类器官是筛选BCRP特异性抑制剂的敏感工具。DOI：10.1080/10717544.2017.1381199肠道类器官在精准医学方面的研究肠类器官培养体系的成功建立，为研究肠道疾病，如囊性纤维化病(cystic fibrosis, CF)、炎症性肠病、肠道损伤再生和肠癌等，带来极大的方便，将会成为个体化医疗(personalized medicine)的有力工具。肠道上皮细胞对各种药物和放疗射线非常敏感, 经常是各种药物副作用的靶点，在临床研究前有必要提前预知各种药物和疗法对肠道上皮细胞的影响，但是由于患者个体差异巨大, 同样的剂量用于不同的患者，产生的副作用完全不能预期。有了个体化的类器官之后，就可以通过类器官对药物和疗法的反应来推断出某个病人对该治疗手段的反应和可能发生的副作用。总结肠道类器官打破了传统动物模型和细胞模型在体外研究中的局限性，再现了干细胞复杂多变的增殖分化、稳态自我更新以及损伤后再生的病理生理过程，打开了新型多细胞互作的仿生微器官研究大门，推动了肠道疾病发病机制、药物靶点和器官再生的研究，显示出巨大的应用前景。而单细胞测序、空间转录组学、小分子标记探针影像等新兴技术的发展将会把肠道类器官的研究推向更深更广的维度。肺类器官：肺是由一个高度分支的管道系统组成的复杂器官，能够参与各种重要的生理过程，包括气体交换和免疫防御，同时肺也是病毒、细菌等病原体感染和损伤的重要靶器官。类器官可用于模拟人体器官发育和各种疾病的病理变化，而肺类器官的兴起对研究肺部疾病有着很重要的意义。肺类器官的研发历程1987年，Jennings等首次培养出可在体外维持原始细胞特性的Ⅱ型肺泡上皮细胞。1991年，Kopf-Maier等首次利用肺癌细胞构建类似于原始组织的类器官结构。2013年，Barkauskas等发现AT2细胞是成人肺中的干细胞，并将AT2细胞接种至3D共培养系统，最终培养出具有肺成纤维细胞的“肺泡球”结构。2017年，Tan等首次以成人来源的细胞培养类器官，结果证明，将成人的支气管上皮细胞、肺成纤维细胞和肺微血管内皮细胞放置在恰当的三维组织培养环境中，细胞将迅速自排列成为离散的上皮和内皮结构，且在结构与功能上具有稳定性。肺类器官的构建目前，肺类器官的构建主要来源于成熟肺组织分离的上皮干/祖细胞和人类多能干细胞。前者包括基底祖细胞、Club 细胞和 AT2 细胞，后者包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）。其中，以ESCs和iPSCs为主的人类多能干细胞最常被用于体外研究人的肺部生理学和病理学。肺类器官的应用疾病研究当前已经利用肺类器官对多种肺部相关疾病开展了研究。肺癌作为一种高死亡率的疾病，需要一种体外模型进行相关研究。研究人员通过诱导小鼠和人多能干细胞源性肺上皮细胞建立了体外类器官,以模拟早期肺腺癌。通过实验发现，表达致癌KRAS的AT2细胞中成熟谱系识别的基因的表达水平减少，这表明了在揭示致癌KRAS表达的早期后果方面, 类器官具有实用性。DOI: 10.1016/j.stem.2020.07.022.在肺部疾病中, SARS-CoV-2引起的肺部感染是目前被全球广泛关注的一类疾病。肺类器官，特别是肺泡II型细胞，表达ACE2, 对SARS-CoV-2具有易感性。TIWARI等利用培养的肺类器官来研究病毒如何与各种器官系统相互作用。通过实验发现肺类器官能够在细胞膜上表达ACE2和TMPRSS2，而它们能够与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合, 继而引起感染。DOI: 10.1016/j.stemcr.2021.02.005.药物筛选早期的类器官模型需要大量的起始细胞，不适于高通量筛选，且经常会呈现出较低的体外活力。随着多能干、祖细胞分离技术的发展，目前研究人员能够研发出重复性高、寿命长的类器官。肺类器官拥有模拟人类肺部的生理条件，且具有与人体器官相似的细胞组成和功能结构。因此肺类器官为药物筛选提供了更加便捷的筛选平台。HAN等利用培养好的类器官模拟COVID-19肺部感染中的炎症变化，通过RNA-seq证实了病毒感染，随后对几种抑制SARS-CoV-2的药物进行了高通量筛选, 并确定了包括伊马替尼在内的几种抑制剂。这表明，经过SARS-CoV-2感染的hPSC-LOs（人类多能干细胞肺器官模型）可作为高通量筛选模型,为新冠肺炎候选治疗药物的快速、高效筛选提供了可能的途径。DOI: 10.1038/s41586-020-2901-9.毒理评价类器官与微流控细胞芯片的结合也是一种新趋势，它不仅拥有器官特定功能，能够模拟器官的生长发育过程，还能精准调控发育过程中的信号分子，做到了实时检测。ZHANG等人设计了一种3D人肺芯片模型，并应用该芯片模型评估纳米毒性，研究纳米颗粒暴露引起的细胞反应。通过对不同类型的纳米颗粒进行测试，证明了3D人肺芯片模型可作为毒理评价可靠的实验平台。未来类器官与微流控芯片的结合为研究有毒污染物、环境污染物以及化学污染物的影响提供了一个高效的体外模型。DOI: 10.1039/c8tx00156a.总结肺类器官在当前研究中展现出极大优势：打破传统细胞和动物模型在研究中的局限性，规避了临床研究中存在的伦理问题，是替代传统研究模型的更优选择；包含肺器官内的多种细胞类型，与源器官高度相似，且拥有遗传稳定性，这些特性均提示其巨大的研究应用前景。然而，其应用仍存在一定局限性：与传统动物模型相比，肺类器官缺乏细胞多样性、功能性的血管系统、神经系统及免疫系统。为减少肺类器官的弊端，共培养、基因编辑、类器官芯片等新兴技术已被应用于类器官的研究中：如通过类器官与免疫细胞的体外共培养来提高类器官的复杂性；结合3D打印和类器官芯片开发与人类系统的生理和病理更加相似的平台；应用单细胞测序技术在高分辨率下对病毒-宿主相互作用进行深入研究；以及应用基因组测序和基因编辑来探索病毒感染期间的基因型-表型相关性。随着肺类器官及相关技术的不断优化，相信不久的将来，其可在相关研究中发挥出更大潜能。脑类器官：脑类器官（Brain organoids）是诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell,iPSCs）在模拟大脑发育环境的培养液中分化产生的类似人脑的三维组织。脑类器官的功能主要是通过神经元的电化学信号传导来实现的，不同的脑类器官在结构上和功能上有所差异，但它们共同协同工作，确保人体正常运转。脑类器官可以用来研究发育、疾病或药物效果，为研究和理解大脑功能及神经疾病的发生提供了前所未有的机遇。DOI: 10.1038/s41418-020-0566-4脑类器官的发现人脑类器官的培育，最早是2008年来自日本的科学家Yoshiki Sasai团队发现来源于干细胞自发组织的神经球中，可以产生皮层样结构，并包含有皮层祖细胞和功能神经元。到2013年，Lancaster研究团队利用matrigel来模拟发育中大脑周围的组织，并使用旋转生物反应器来帮助营养的吸收和氧气的扩散，同时在这样持续的3D悬浮培养中添加用于神经发育的生长因子，获得了更复杂的细胞组成和结构。这也是第一次正式提出3D人脑类器官的概念。脑类器官的应用脑类器官作为一种新兴的体外培养技术，不仅可以在体外重现大脑早期发育过程，用于研究不同脑区或脑与其他组织间的相互作用，还可以帮助我们了解脑发育和谱系演化过程，探索人脑进化及其特有的调控机制，开展神经系统疾病的建模和体外药物筛选。疾病建模研究人员使用源自原发性小头畸形患者的hiPSCs生成了脑类器官，该患者携带小头畸形基因CDK5RAP2截短突变。与对照组相比，从这些细胞生长的脑类器官明显小于同基因对照，并且在较年轻的发育阶段含有更多神经元，表明神经发生过早。研究发现，CDK5RAP2功能的丧失导致祖细胞分裂模式过早从对称分裂转变为不对称分裂，导致神经发生过早，干细胞库耗尽，最终导致小头表型。这项研究首次展示了大脑类器官的疾病建模能力。DOI: 10.1038/nature12517药物筛选阿尔茨海默病（AD）是一种多因素疾病，由于其复杂的发病机理，开发治疗AD的有效药物一直很困难。研究人员使用来自11位患者的iPSC培养的1300个脑类器官建立了高通量筛选系统，通过测试部分FDA批准的可通过血脑屏障的药物来寻找可以治疗AD的有效药物。研究人员发现所有候选药物在减少Aβ或tau沉积以及增强或维持神经元细胞活力方面都在一定程度上有效。结果表明研究人员通过整合人类iCOs（人iPSC衍生的脑类器官）的数学建模和病理性状，成功验证了基于网络的药物筛选平台。DOI: 10.1038/s41467-020-20440-5探索人类大脑发育调节机制研究人员通过对不同分化时间点的视网膜发育及视网膜类器官进行scRNA-seq，揭示了控制人类视网膜发育的转录网络，鉴定出了视网膜祖细胞及七种主要视网膜细胞类型的特征, 确定了人类和小鼠视网膜发育过程中基因表达的物种特异性模式，并发现ATOH7在晚期视网膜形成过程中促进光感受器细胞分化的作用。以上研究说明，脑类器官与scRNA-seq技术的融合，可用于解析不同物种发育路径和差异，发现人类特有基因和细胞类型，探索大脑发育调控机制。DOI: 10.1016/j.devcel.2020.04.009总结虽然脑类器官可模拟大脑发育的细胞、分子及功能特征,受限于长期健康培养的技术难度,目前体外构建的脑类器官在有限的培养时间内,主要仍仅能表征胚胎脑的特征。对于具备更复杂、成熟神经网络的脑类器官构建，目前仍需进一步探索。其中，功能性血管化脑类器官的构建，有望为促进脑类器官长期发育提供支撑。总之，脑类器官的构建和应用仍将是未来生命科学的重要科学问题。随着各领域技术的发展，脑类器官会更接近人类大脑，会在疾病模拟、药物筛选、基因治疗等方面发挥更为重要的作用。参考文献：1.Uchida H, Machida M, Miura T, Kawasaki T, Okazaki T, Sasaki K, Sakamoto S, Ohuchi N, Kasahara M, Umezawa A, Akutsu H. 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