Risdiplam

Huntington disease: somatic expansion, pathobiology and therapeutics Jasmine Donaldson、Davina Hensman Moss、Marc Ciosi、Karen Usdin、Gabriel Balmus、Darren G. Monckton、Sarah J. Tabrizi Nature Reviews Neurology｜DOI：10.1038/s41582-025-01159-7 摘要 简单DNA重复序列的扩增可导致人类45种以上的遗传性疾病，其中大多数为神经退行性疾病。亨廷顿病（Huntington disease，HD）是一种致死性的遗传性神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白基因（huntingtin gene，HTT）中的CAG重复序列扩增所致，进而使亨廷顿蛋白中形成具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ）片段。该疾病导致运动、认知及精神功能进行性衰退，其主要原因是纹状体中型棘状神经元的丢失。 长期以来，亨廷顿病一直被认为是突变型亨廷顿蛋白随年龄增长而产生毒性作用的结果。然而，全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）已经发现，多种遗传修饰因子——其中大多数为DNA修复基因——能够显著影响疾病起病及进展。这些发现提示，受累组织中的CAG重复序列体细胞扩增是一个关键病理机制。 这一新兴范式提示，疾病进展并非完全由蛋白质层面的机制驱动，DNA层面的变化同样参与其中；这一机制也存在于其他重复扩增疾病中。从治疗角度看，这一发现带来了新的机会：限制体细胞重复扩增的干预措施可能对多种重复扩增疾病有效；在亨廷顿病中，如果将此类干预与疾病特异性治疗策略（例如降低亨廷顿蛋白水平）联合应用，可能比单独采用任一策略带来更有效且更持久的临床获益。与此同时，这一治疗思路也带来挑战，包括如何确定最佳治疗干预时机，以及在临床试验中，当治疗靶组织为脑时，如何最恰当地证实表型改善。要点（Key points） ·重复扩增疾病是一组疾病，包括亨廷顿病，其病因是重复DNA区域发生扩增。 ·DNA修复基因能够修饰亨廷顿病及其他重复扩增疾病的起病年龄和进展速度，这可能是通过参与扩增重复序列的体细胞扩增而实现的。 ·亨廷顿病患者脑和血液中的体细胞不稳定性与临床结局相关。 ·亨廷顿病的起病受到HTT基因第1外显子中编码谷氨酰胺和脯氨酸的重复序列精确DNA序列结构的影响。 ·靶向MSH3、PMS1和MLH3等驱动体细胞扩增的错配修复蛋白的治疗方法，目前正处于临床前研发阶段；但需要考虑敲低或抑制到何种程度，才能在尽量降低风险的同时获得有意义的临床获益。 ·开发用于测量靶向体细胞不稳定性治疗效果的生物标志物至关重要。引言（Introduction） 亨廷顿病（HD）是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病，临床特征为不自主舞蹈样运动、精神障碍和认知功能下降。HD由亨廷顿蛋白基因（HTT）第1外显子中的CAG三核苷酸重复序列扩增所致，该扩增编码亨廷顿蛋白中异常延长的多聚谷氨酰胺（polyQ）片段。遗传获得的CAG重复次数达到40次或以上时，通常具有完全外显率；等位基因重复次数越多，起病年龄越早。遗传获得36～39次CAG重复的等位基因属于外显率降低范围，只有其中一部分携带者会在其一生中出现HD症状。该突变会造成细胞毒性，最终导致选择性神经元死亡，尤其累及纹状体和大脑皮质，从而产生特征性的运动和认知改变。 HD的典型起病年龄为30～50岁；当遗传获得的等位基因含有超过55次CAG重复时，可出现青少年型HD。欧洲血统人群中HD患病率约为每10,000人1例；亚洲和非洲人群报告的患病率较低。不过，2024年的大规模遗传学分析提示，目前所有人群中记录到的患病率可能均低于真实患病率。 在分子层面，HD是毒性功能获得性疾病的典型代表。扩增的polyQ片段促进异常蛋白质-蛋白质相互作用，诱导HTT聚集体形成，并损害自噬和线粒体功能等细胞过程。然而，目前已经逐渐明确，HD的分子发病机制比单纯的蛋白质毒性功能获得更为复杂。 HD的一个关键特征是体细胞扩增（somatic expansion），即患者脑内的CAG重复序列可在原有长度基础上进一步增加数十次，甚至数百次。这一现象也见于其他重复扩增疾病。早期人脑尸检研究已经显示，CAG重复序列在人体脑内存在体细胞嵌合现象，并呈现脑区特异性分布；不过，当时尚不清楚这一发现的意义。随后，其他研究团队发现，在校正等位基因长度的影响后，皮质中大规模重复扩增发生频率较高的个体，其实际起病年龄比预期更早。 在遗传性HD起病年龄修饰因子的首项全基因组关联研究中，遗传修饰因素的重要性得到了更广泛的认识。该研究由HD遗传修饰因子联盟（Genetic Modifiers of HD，GeM-HD Consortium）开展。GeM-HD发现，起病年龄与DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因变异存在明确关联；其中许多基因此前已被认为是HD小鼠模型中体细胞扩增的驱动因素。这些发现表明，CAG重复序列的体细胞扩增是决定HD起病年龄的关键驱动因素。 HD属于一类由简单序列重复扩增引起的神经系统疾病，这类疾病称为重复扩增疾病（repeat expansion disorders，REDs）。其中包括多种脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxias，SCAs）、脆性X相关疾病（fragile X-related disorders，FXDs）和强直性肌营养不良（myotonic dystrophy，DM）。这些疾病中的许多具有共同特征，例如重复序列不稳定性和共同的细胞功能障碍；这些共同点为理解神经退行性变的趋同机制提供了线索。 在本文中，作者首先概述目前对HD分子发病机制的认识，并探讨遗传关联研究所提供的研究见解。随后，作者深入讨论体细胞不稳定性的基础科学问题，解释驱动这一过程的机制，尤其是滑移链DNA（slipped-strand DNA）的形成，以及参与重复序列扩增的蛋白质相互作用。作者还讨论不同重复扩增疾病可能具有的共同机制。之后，本文回顾目前正在探索的HD治疗方法，重点介绍针对体细胞不稳定性开发的治疗策略，以及这些策略对其他重复扩增疾病可能具有的更广泛治疗意义（框1）。最后，作者讨论体细胞不稳定性的生物标志物，以及如何利用这些标志物评估临床试验中的药物疗效。 框1｜从研究走向现实获益（From research to real-world benefits） 过去十年，对一组统称为重复扩增疾病（REDs）的遗传性疾病病理生理基础的认识不断进步，揭示出一种可能适合进行治疗干预的共同机制。尽管每一种疾病单独来看都较为罕见，但对不同人群开展的全基因组测序显示，REDs作为一个整体，其发生频率比既往认识的更高；其疾病等位基因合计频率约为每283人1例。REDs包括亨廷顿病、多种脊髓小脑性共济失调、弗里德赖希共济失调、脆性X相关疾病及强直性肌营养不良。所有REDs均为进行性、目前无法治愈的脑和肌肉疾病，其病因是重复DNA区域发生扩增；这些疾病会对患者及其家庭造成严重影响，并带来相当大的社会负担。 在易感细胞中，重复DNA还会进一步发生体细胞扩增；这一过程对疾病发病机制具有关键推动作用，其发生速率与疾病进展速度密切相关。体细胞扩增涉及DNA修复蛋白对重复DNA序列中形成的结构进行异常修复，尤其涉及参与DNA错配修复的蛋白。 DNA修复基因的遗传变异可以改善或加重疾病，这些遗传修饰因子因此成为新的治疗靶点。由此，研究者正在探索多种策略，试图靶向遗传修饰因子研究所揭示的DNA修复通路，以减少体细胞不稳定性。针对体细胞扩增的治疗面临一项关键挑战，即确定疾病病程中最适宜的治疗时机。此外，如何在临床试验相对较短的观察时间内，建立能够反映中枢神经系统或外周组织体细胞扩增变化的测量指标，也是推动这些治疗进入临床的重要难题。尽管如此，针对体细胞扩增的治疗研究仍带来令人振奋的前景：如果某种治疗在一种RED（例如亨廷顿病）中证实有效，那么它未来可能用于具有相似发病机制的多种RED。本文综述这一快速发展的领域中的最新研究，并重点介绍正在向临床转化推进的治疗方向。HD的发病机制（HD pathogenesis） 尽管HD的遗传学病因已经明确，但其背后的生物学机制复杂且涉及范围广泛。HTT是一种分子量较大（348 kDa）、在全身组织中广泛表达的蛋白质。其N端和C端含有HEAT结构域；HEAT是由Huntingtin（亨廷顿蛋白）、elongation factor 3（延伸因子3）、protein phosphatase 2A（蛋白磷酸酶2A）和yeast kinase TOR1（酵母TOR1激酶）等名称首字母组成的缩写。这些结构域由一个较小且具有柔性的α螺旋桥接结构域连接。HEAT重复蛋白通常充当分子支架，介导参与核转运、微管动力学、囊泡运输和染色质动态变化的蛋白质-蛋白质相互作用。与此相一致，HTT具有庞大的相互作用组，包含350多种结合伙伴，并参与多种过程，包括转录调控、细胞内运输、蛋白质稳态调节和DNA修复。 研究者提出了多种机制，用以解释含有扩增多聚谷氨酰胺结构域的突变型HTT（mutant HTT，mHTT）如何在HD中发挥毒性作用。这些机制包括但不限于：错误折叠蛋白质及神经元内聚集体的积累、蛋白酶体抑制、自噬异常、转录调控失常、核输入和输出受损、轴突运输障碍、兴奋性毒性、神经营养支持丧失、DNA损伤应答失调及DNA损伤增加、突触功能障碍和代谢缺陷（图1）。另有多篇优秀综述对HD下游疾病发病机制进行了更详细的讨论。 mHTT会发生异常的蛋白水解切割，进而形成N端蛋白片段；这些片段能够在神经元中形成聚集体和包涵体。HTT的N端片段还可以由mHTT前体mRNA产生：通过激活内含子1中的隐蔽多聚腺苷酸化位点，生成HTT1a转录本。该转录本包含外显子1及部分内含子1序列，并编码容易发生聚集且致病性较强的HTT1a蛋白。重复序列片段的进行性扩增会增加HTT1a的生成；因此，有研究提出HTT1a可能充当体细胞扩增发挥致病作用的效应分子。CAG重复序列的不稳定性（Instability of the CAG repeat） 扩增的CAG重复序列在代际传递过程中并不稳定（框2），在个体体细胞中同样具有不稳定性。对人类尸检组织的研究早已证实，人体脑内存在CAG重复序列的体细胞嵌合现象，其中纹状体和大脑皮质的不稳定性较高，而小脑中的嵌合程度相对较低。CAG重复序列不稳定性的组织特异性也已在HD小鼠模型中得到描述；在这些模型中，纹状体和肝脏表现出最高的不稳定性，其次为大脑皮质。 HD尸检脑组织显示，与神经退行性变的分布模式相似，重复序列扩增也具有细胞类型特异性：纹状体中的中型棘状神经元（medium spiny neurons，MSNs）和大脑皮质第V层锥体细胞受到的影响更为突出。尤其是间接通路中的MSNs——其功能是抑制运动——较直接通路中的MSNs更早丢失，而且其体细胞扩增速率略高。这些发现支持早期发表的研究结果，并可能有助于解释HD标志性特征之一——不自主运动的出现。星形胶质细胞、少突胶质细胞、多树突胶质细胞和小胶质细胞中的CAG重复序列似乎相对稳定，而这些细胞在HD中通常能够存活。不过也存在一些例外：在HD发病机制中相对未受明显影响的胆碱能中间神经元，也可表现出增加的体细胞扩增。 某些神经元群能够耐受高度扩增的多聚谷氨酰胺片段而不发生退变，这一观察提出了重要问题：选择性神经元耐受性和易损性的机制究竟是什么？这些发现促使研究者进一步思考，体细胞扩增本身是否足以驱动HD中的神经元丢失，以及还有哪些其他因素可能调节细胞易感性。有趣的是，HTT表达水平与细胞类型特异性丢失并不相关；随着CAG重复长度增加，mHTT表达反而下降。其他致病性CAG重复疾病也可表现出类似的细胞类型特异性扩增模式，但发生扩增的细胞并不一定出现神经退行性变。这一观察提示，中型棘状神经元可能具有内在的体细胞扩增易感性，而这种倾向很可能由重要的组织特异性反式作用因子驱动。 皮质中大规模重复扩增发生频率高于平均水平的个体，其起病年龄比预期更早。这一发现似乎与另一观察相呼应：在HD患者之间，遗传获得的CAG重复长度即使只有细微差异，也可能造成起病年龄的较大差异；在模型系统中，较长的重复片段也与更严重的疾病表型相关。过去两年发表的研究结果提示，与非致病性CAG长度相比，含有超过40次CAG重复的细胞会出现转录调控失常，而且这种异常会随着重复序列扩增而加重；然而，单纯的转录改变可能不足以触发细胞死亡。 与其将疾病理解为重复长度依赖性毒性的简单加重，不如考虑现有证据所提示的另一种可能：存在一个关键CAG阈值，超过该阈值后，易损细胞才会出现严重功能障碍。这一假说有助于解释疾病起病的潜伏期，以及较长等位基因在决定起病年龄方面似乎具有完全显性效应的现象；也就是说，它有助于解释为何遗传获得两个突变型HTT基因拷贝的个体，并不会因此出现更早的起病年龄。 尸检脑组织的双重单核RNA测序及HTT CAG重复长度分析提示，只有当纹状体神经元中的CAG重复扩增超过150次时，才会观察到显著的、依赖重复长度的转录调控失常。动物模型数据也支持存在一个位于140～185次CAG重复之间的关键窗口。上述发现提示HD可能遵循两阶段发病模型。第一阶段，超过36次的CAG重复片段使重复序列处于易于进一步扩增的状态，从而可能在疾病相关细胞类型中扩增至致病阈值以上。第二阶段，当重复扩增超过这一阈值后，会产生具有毒性的基因产物，进而驱动神经元功能障碍并最终导致神经退行性变。HD的遗传修饰因子（Genetic modifiers of HD）DNA修复基因（DNA repair genes） 体细胞不稳定性与疾病起病及进展之间的联系，是通过HD遗传修饰因子联盟（GeM-HD）开展的开创性大规模人类遗传学研究逐渐确立的。影响疾病起病年龄的最主要因素是遗传获得的CAG重复次数；在任一给定年龄，起病概率均可由CAG重复长度预测。然而，即使在校正CAG重复大小后，HD起病年龄仍具有可遗传成分，这提示还有其他遗传因素参与HD的发病机制。 图1｜突变型HTT蛋白介导的亨廷顿病发病机制 突变型HTT（mHTT）在第1外显子中含有扩增的CAG重复序列（超过36次CAG），并且这一重复序列可随着时间推移，通过体细胞扩增过程进一步增长。在细胞核内，mHTT被转录为前体mRNA；成熟转录本随后在细胞质中翻译，产生全长mHTT蛋白。全长mHTT经半胱天冬酶和钙蛋白酶蛋白水解切割后形成N端片段；另一方面，mHTT前体mRNA发生可变剪接，则会产生HTT1a。N端片段和HTT1a被转运至细胞核，在那里形成寡聚体和纤维状聚集物。这些聚集物会捕获转录因子，从而导致转录调控失常。 细胞质中的毒性作用包括对分子伴侣、蛋白酶体和自噬过程的抑制，这可能导致异常折叠蛋白及其他细胞成分积聚。皮质-纹状体神经元中的转录调控失常和轴突运输障碍，会导致脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）释放减少，使中型棘状神经元失去神经营养支持。NMDA受体活性改变及谷氨酸摄取增加可导致兴奋性毒性。星形胶质细胞中谷氨酸受体表达减少，可能使突触内谷氨酸水平升高。活化的小胶质细胞会产生更多促炎性细胞因子和趋化因子。多巴胺能信号失衡也被认为会作用于中型棘状神经元，并参与形成亨廷顿病的特征性运动症状。ROS：活性氧。 HD的遗传修饰因子（续）DNA修复基因（续） 这些变异可能对蛋白质活性和功能产生不同影响，从而解释上述差异；目前正在通过功能研究对此进行探索。 在校正CAG重复长度和年龄后，血液中的体细胞扩增增加与更早的起病年龄及更快的HD进展相关。此外，既往与起病和/或疾病进展相关的许多DNA修复基因变异，也与血液中的体细胞CAG扩增相关（图2），进一步建立了疾病表型、体细胞扩增和DNA修复机制之间的联系。不过，这种关联因基因而异：虽然MSH2、MSH6和MLH3被确定为血液体细胞扩增的修饰因子，但它们并未与临床表型建立关联。相反，PMS1、LIG1和POLD1与临床表型相关，却未与血液中的体细胞扩增相关（图2）。 早期针对错配修复（MMR）蛋白的研究显示，MSH2、MSH3、MLH1和MLH3是小鼠体细胞CAG重复扩增所必需的；敲除Msh2也已显示能够改善疾病表型。针对候选修饰基因的研究进一步支持了这些基因位点通过影响HTT体细胞CAG扩增而修饰HD起病和进展的作用。在不同的HD小鼠模型和人源细胞模型中，MSH3、MLH1、MLH3、PMS1以及作用程度较小的POLD1均可促进体细胞扩增。 PMS2表现出复杂且依赖具体情境的作用，这可能受到蛋白质化学计量关系的影响。已有研究将PMS2描述为体细胞扩增的促进因子，也有研究将其描述为抑制因子；另有一项研究发现，PMS2对体细胞扩增完全没有显著影响。LIG1在复制、重组和DNA损伤修复过程中具有关键作用，主要参与DNA切口的连接，因此理论上可能影响体细胞不稳定性。然而，在HD模型中，无论敲低还是敲除LIG1，均未导致重复序列长度发生变化。这种无效应可能反映了LIG家族其他成员的功能冗余；这一解释得到了LIG1缺失模型中MMR缺陷研究的支持。联合敲低Lig1和Lig3也未影响扩增速率；不过，在HD小鼠模型以及由CGG重复扩增导致的脆性X相关疾病模型中，研究发现Lig4能够发挥抵御扩增的保护作用。值得注意的是，LIG1也在一项关于神经原纤维缠结的GWAS中被确定为相关位点，提示其可能参与HTT聚集过程。 与GWAS所提示的许多其他DNA修复蛋白不同，FAN1并非MMR蛋白；其目前已明确的主要功能是参与DNA链间交联修复。此前FAN1并未被认为参与HD发病机制，但在GWAS中，它却成为一个具有高度显著性的疾病修饰因子。与大多数MMR基因变异相反，导致FAN1表达增加的变异与HD起病年龄延迟相关。外显子组测序发现，FAN1中罕见且具有损害作用的变异聚集于DNA结合结构域和核酸酶结构域，并与起病加快相关。作用最显著、能够延迟起病的HD修饰变异位于FAN1的3′非翻译区，可减少对FAN1 mRNA的微RNA介导的降解。相反，能够加快起病的R507H变异编码了一个精氨酸至组氨酸的氨基酸替换，该替换会损害FAN1与其他分子的相互作用及其对重复序列的处理。自FAN1被确定为疾病修饰因子以来，已有明确证据表明，在多种HD细胞模型和小鼠模型中，FAN1能够抵御重复序列扩增；FAN1过表达则能够减慢体细胞扩增。 GWAS数据中并未发现若干可能重要的DNA维护相关疾病修饰因子。2025年一项体内CRISPR研究显示，靶向Pold1和Pold3对扩增的抑制作用，与靶向Msh2、Msh3、Mlh1和Mlh3相当；而靶向Pold2、Pold4、Pole、Polb、Crebbp、Ercc1、Ercc5、Ercc3、Setd2和Setdb1，则产生中度至轻度的抑制作用。单链RNA结合蛋白RPA及其替代形式alternative RPA在HD患者脑组织中表达上调；现有证据提示，这两种蛋白分别能够减少或增强重复序列扩增。RPA能够增强FAN1核酸酶活性，而alternative RPA没有这种作用，因此RPA可能是FAN1的上游激活因子。部分其他基因未能产生GWAS信号，可能是由于缺乏常见的功能性变异、存在细胞类型特异性的化学计量效应，和/或存在其他作用机制。 尽管不同HD相关表型的关联分析结果均指向DNA修复相关变异，但进一步分析发现，不同HD表型的修饰因子并不完全一致（图2）。这些差异究竟在多大程度上源于研究统计效能不足、未能检测到相关性，目前尚未确定。这些关联信号之间的差异值得关注，也可能具有启发意义：神经系统疾病的症状受到神经功能障碍部位及其发生时间进程的影响。HD以早期纹状体萎缩为典型特征：尸检研究显示，尾状核和壳核发生弥漫性萎缩，且神经退行性变沿尾侧至吻侧、背侧至腹侧以及内侧至外侧的梯度分布，并据此建立了病理分级系统。病理改变并不局限于纹状体；随着疾病进展，丘脑、丘脑底核、白质、大脑皮质和小脑等其他结构也会出现改变。此外，从临床前期向临床显性期转变的过程中，皮质变薄程度会逐渐增加。 一种假说认为，不同组织中疾病修饰变异与HTT在表达水平和化学计量关系上的细微时间及空间差异，会导致神经环路受到不同程度的损伤；这可能是遗传修饰因子对不同临床表型产生差异性影响的基础，但仍需进一步研究。MSN中的MSH3和MSH2水平升高，可能推动这些细胞中观察到的较高不稳定性速率。不过也存在例外，例如深层皮质神经元尽管具有较高的不稳定性速率，其MutSβ绝对水平却相对较低，这进一步强调了细胞环境的重要性。 图2｜对亨廷顿病表型或临床里程碑年龄具有显著影响的候选修饰基因 在HD患者中，通过全基因组关联研究（GWAS）发现，对HD表型或临床里程碑年龄具有显著影响的修饰基因（P≤5×10⁻⁸）。样本量（n）指针对每一种表型开展的最大规模GWAS分析，纳入的变异次要等位基因频率大于1%。基因按照全基因组显著相关表型数量由多到少排列；在此基础上，再按照各表型GWAS平均P值由小到大排列。表型及临床里程碑年龄按照全基因组显著修饰效应由多到少排列；在此基础上，再按照各基因的平均GWAS P值由小到大排列。HTTother指其他HTT变异，与非典型HTT重复序列结构无关。HTTstructures指非典型HTT重复序列结构；非典型HTT重复序列结构对血液体细胞CAG扩增的影响未达到全基因组统计学显著性。ATAD5位点的其他候选基因包括TEFM和ADAP2。SREBF2位点的其他候选基因包括CCDC134、SHISA8、TNFRSF13C、CENPM、SMIM45和SEPTIN3。各修饰位点中，变异与表型关联最显著的−log10（P值）按照图例进行颜色编码；−log10（5×10⁻⁸）=7.3。a：在变异等位基因频率大于0.1%的条件下，HTT等位基因结构及运动症状起病年龄分析的样本量为7,553。b：GeM-HD 2025年研究未报告该项分析。NS：无统计学显著性。 图中纳入的表型及样本量包括：总功能能力评分（11,185例）、总运动评分（11,683例）、运动迟缓（11,704例）、诊断置信度4级（11,408例）、运动症状起病年龄（12,892例）、Stroop单词阅读测试（11,373例）、眼球运动功能（11,308例）、符号数字模式测验（11,324例）、多维度疾病进展（216例）以及血液中的体细胞CAG扩增（3,999例）。非DNA维护相关变异（Non-DNA maintenance variants） 认为遗传修饰因子通过体细胞不稳定性发挥作用，这一观点在直觉上具有吸引力；但同样重要的是，还应考虑那些并未明显涉及DNA修复的GWAS位点，包括TCERG1、RRM2B、CCDC82、SREBF2和MED15。这些基因似乎并不汇聚于单一作用机制。事实上，今年发表的一项体内CRISPR研究显示，Tcerg1或Ccdc82缺失并不会影响重复序列扩增。TCERG1编码一种参与转录延伸、前体mRNA剪接及Cajal小体完整性调节的蛋白；MED15则是Mediator复合物的一个组成部分，该复合物参与RNA聚合酶II依赖性基因的调控性转录。HTT可与核斑相关的RNA结合蛋白发生相互作用，其中包括TCERG1和MED15。关于CCDC82目前所知甚少，不过该基因位点近期已被认为与智力障碍和孤独症谱系障碍相关。 RRM2B是一种高度保守的基因，编码由p53诱导的核糖核苷酸还原酶的小亚基，并且是DNA合成所必需的。有趣的是，在小鼠中敲除Rrm2b可抑制肝脏和纹状体中的重复序列扩增；随后，采用腺相关病毒（AAV）敲低Rrm2b也观察到较轻微的作用。核糖核苷酸还原酶对于生成DNA合成和修复所必需的脱氧核苷三磷酸至关重要，因此RRM2B可能确实通过影响脑内体细胞扩增发挥作用。其他不属于DNA修复机制的修饰因子，可能间接影响体细胞扩增或其细胞自主性效应；也可能通过其他细胞类型影响神经元丢失的非细胞自主性效应。HTT基因结构变异（HTT gene structural variants） CAG重复序列两侧的HTT序列，是调节HD起病年龄的一个关键因素。HTT中编码谷氨酰胺的多态性CAG重复序列后方，紧接着是编码脯氨酸的多态性CCG重复序列，其重复次数为4～13次，常见等位基因分别含有7次和10次CCG重复。大多数与HD相关的HTT CAG重复扩增发生在包含（CCG）7等位基因的单倍型上。然而，CCG重复次数的差异似乎并不与HD起病年龄的差异相关。 在HTT参考序列中，纯编码谷氨酰胺的CAG重复序列与纯编码脯氨酸的CCG重复序列之间，存在一段中间序列，其中包含一个编码谷氨酰胺的CAA CAG序列盒，以及一个编码脯氨酸的CCG CCA序列盒。纯CCG重复序列的下游紧接着还有两个额外的、编码脯氨酸的CCT密码子。这种HTT等位基因结构似乎是全球范围内疾病相关及非疾病相关等位基因中最常见的结构，被称为典型结构或经典结构。尽管在欧洲HD相关等位基因中相对少见，但也观察到上述中间序列存在变异（图3）。编码谷氨酰胺的CAA CAG序列盒可以缺失、存在或发生重复，这使纯CAG重复序列的长度与实际编码的谷氨酰胺片段长度不再一致。 HD的起病年龄和严重程度，最适合由遗传获得的纯CAG重复序列长度预测，而不是由遗传获得的谷氨酰胺编码序列总长度预测。事实上，在校正纯CAG长度后，尽管CAA CAG谷氨酰胺编码序列盒的重复会额外编码4个谷氨酰胺，但与该序列盒缺失的等位基因相比，具有该序列盒重复的等位基因仍与起病年龄延迟约9年相关。与此相一致，HTT CAG重复序列的体细胞扩增速率，同样最适合由遗传获得的纯CAG重复序列长度预测，而不是由谷氨酰胺编码序列总长度预测。 考虑到今年发表的数据提示，只有当纹状体神经元中的CAG扩增超过150次时，才会观察到转录调控失常；因此，编码谷氨酰胺的总长度仅相差约两个重复单位，却产生上述影响，或许并不令人意外。 图3｜非典型HTT等位基因结构对HTT体细胞扩增的影响，不能解释其对亨廷顿病临床表型的作用 a：在所有HTT等位基因结构上，HTT CAG重复序列均可发生血液中的体细胞扩增；在CAACAG、CCGCCA以及CAACAGCCGCCA序列盒缺失等位基因上，扩增速率略低。 b：非典型HTT等位基因结构对血液体细胞扩增的影响，与校正年龄和CAG重复长度后其对HD运动症状起病年龄及疾病进展的相对影响并不一致。 c：评估HTT等位基因结构在纯CAG长度之外的额外影响。图中展示了Enroll-HD队列中观察到的最常见HTT等位基因结构（等位基因频率大于2.5×10⁻³）。左侧为纯CAG重复序列，它可能是HTT体细胞重复不稳定性机制的主要底物，也是决定HTT体细胞重复扩增速率和HD病理改变的主要因素。右侧为多态性CCG和CCT重复序列。中间为定义非典型HTT等位基因结构的CAG与CCG重复序列之间的中间序列变异。 纯CAG重复序列：体细胞HTT重复不稳定性机制的主要底物；决定体细胞HTT重复扩增速率；决定HD病理改变。中间序列变异：对HTT体细胞扩增具有较小影响，但对HD严重程度、疾病进展及生物标志物具有较大影响。纯CCG重复序列：对HD起病年龄没有影响。 这些同义序列变异可能通过不依赖重复不稳定性的机制发挥作用，包括：中间序列变异影响HTT转录；影响HTT转录本的折叠、稳定性、剪接或翻译；以及影响RNA毒性。HTT非典型等位基因结构的补充讨论 除编码谷氨酰胺的CAA CAG序列盒缺失、存在或重复外，部分等位基因中的编码脯氨酸的CCG CCA序列盒也可能缺失（图3）。在欧洲人群中，HD相关染色体上该序列盒缺失较为罕见（小于1%）；但在一项南非非洲裔HD队列中，其出现频率与典型等位基因相当。如前所述，编码脯氨酸的CCG重复次数并不影响疾病起病年龄。然而，令人意外的是，在一项南非非洲裔HD队列中，编码脯氨酸的CCG CCA序列盒缺失与临床诊断年龄提前约4年相关。随后，在一个规模较大的欧洲血统HD患者队列中，这一结果得到证实：编码脯氨酸的CCG CCA序列盒缺失与运动症状起病年龄提前约6年相关。此外，编码谷氨酰胺的CAA CAG序列盒和编码脯氨酸的CCG CCA序列盒同时缺失，致病性更强；与纯CAG重复长度相同的典型等位基因相比，其起病年龄提前约10年。这种CAA CAG与CCG CCA双重缺失结构，也与36～39次纯CAG重复、外显率降低范围内等位基因的外显率显著增加相关。 一种颇具吸引力的解释是，中间序列结构的差异通过影响体细胞扩增潜能，进而影响HD起病年龄。除CAA CAG序列盒重复的情况外，大多数非典型结构均与血液DNA中CAG长度非依赖性体细胞扩增速率降低相关。在细胞模型中也观察到CAA CAG序列盒重复的扩增速率降低，这与该序列盒重复能够延迟起病年龄的作用一致。然而，对血液整体DNA的分析并未发现CAA CAG序列盒重复会影响CAG扩增速率（图3a、b）。相反，双重缺失等位基因在细胞模型中，以及HD患者血液和额叶皮质整体DNA分析中，似乎均与较低的体细胞扩增速率相关；这一结果与这些等位基因加速疾病起病的现象相反（图3）。由于中间序列HTT重复结构缺失，导致最易感的纹状体和皮质神经元中体细胞扩增速率增加，这种可能性仍不能排除。 另一种解释目前看来更有可能：中间序列缺失等位基因致病性增加，可能归因于不依赖体细胞扩增的作用机制，包括影响HTT转录、HTT转录本加工（可能包括高度致病性的HTT1a转录本相对生成速率）及其稳定性；也可能影响经典HTT翻译，或重复相关的非AUG介导的CAG/AGC/GCA翻译。鉴于这些非典型结构的影响，即使在校正纯CAG长度后，仍是目前发现的影响最大的遗传修饰因素，因此明确其作用机制仍是重要研究方向。体细胞不稳定性的假定机制（Proposed mechanism of somatic instability） 目前普遍认为，体细胞CAG重复扩增是由对HTT第1外显子CAG重复序列内部所形成DNA结构的错误修复所导致。扩增机制至少包括两个主要环节：第一，DNA损伤结构的形成；第二，对这些结构进行异常修复。 MMR介导重复扩增最可能的底物，是滑移链DNA（slipped-strand DNA）形成的突出环（slip-outs）（图4）。这些结构可由DNA转录、染色质重塑或其他DNA代谢过程形成。转录过程中驱动滑移链DNA形成的因素，可能同时取决于染色质环境，以及转录过程在较长CAG重复序列上的速度减慢。该过程还可能涉及转录依赖性的RNA-DNA杂交体（R-loop）形成；R-loop能够稳定模板链，并促进滑移链DNA形成。 这一通路的第二个环节，是对滑移链DNA结构进行修复（图4A）。在哺乳动物系统中，MutS同源蛋白MSH2、MSH6和MSH3形成异二聚体复合物MutSα（MSH2–MSH6）和MutSβ（MSH2–MSH3），分别识别DNA错配和插入-缺失环。MutSβ参与体细胞扩增，与其倾向于结合长度为2～14个碱基对的插入-缺失环有关；而MutSα主要识别碱基-碱基错配以及1～2个碱基对的插入-缺失环。 在一种模型中，MutSβ通过连续的结合、滑动和解离步骤沿DNA扫描。一旦遇到滑移链DNA，MutSβ便识别并稳定该结构，从而发出启动错配修复的信号（图4B）。MutSβ使DNA发生弯曲，以便招募MutL同源蛋白，包括MutLα（MLH1–PMS2）、MutLβ（MLH1–PMS1）或MutLγ（MLH1–MLH3）。MutLα和MutLγ是潜在的核酸内切酶，具有不同的切割特异性；切割结果可能决定最终发生的是重复扩增还是重复收缩（图4C、D）。 MutLα能够切割已经存在切口的DNA链（即DNA骨架的一条链发生断裂），而不受其自身结合在哪条DNA链上的影响；在不存在预先切口时，它并不表现出链选择性。这提示MutLα既能够切割含有突出环的DNA链，也能够切割不含突出环的DNA链。相比之下，MutLγ切割的是含有突出环DNA链的对侧链。 图4｜重复序列扩增的假定模型 A：当DNA暂时处于未配对状态时，例如在转录过程中，或可能由于染色质重塑所致，链错位可导致互补DNA链上形成滑移链DNA突出环。这些突出环可能包含1～3个CAG·CTG重复单位，即3～9个核苷酸。 B：滑移链DNA突出环优先被MutSβ识别；随后，MutSβ招募MutLα和/或MutLγ，分别对每一个损伤位点进行修复。 C：MutLα能够以依赖PCNA的方式，切割含有突出环的DNA链，或切割突出环对侧的DNA链。Ca：如果MutLα切割含有突出环的DNA链，招募核酸外切酶后将导致该DNA链被切除，并去除突出环。随后以不含突出环的DNA链为模板进行DNA再合成，将导致重复序列收缩。Cb：如果MutLα切割不含突出环的DNA链，核酸外切酶介导的链切除，以及DNA聚合酶δ（Polδ）介导的缺口填补或链置换，将使含有突出环的DNA链成为模板，从而导致重复扩增。 D：当MutLγ被招募至突出环时，它会切割DNA的对侧链。以含有突出环的DNA链为模板进行链切除和DNA再合成，将导致该链发生扩增。PMS1是发生扩增所必需的，尽管MutLβ缺乏核酸内切酶活性，因此其介导体细胞扩增的作用目前尚不清楚。 E：FAN1可能作用于MutLα切割之后，此时扩增中间产物成为FAN1核酸外切酶活性的底物。FAN1是限制扩增速率的因素；因此，即使存在FAN1，重复扩增仍可发生，只是速率降低。 F：FAN1也可能直接与MutSβ竞争结合滑移链DNA突出环；在这种情况下，FAN1会从3′端切割含有突出环的DNA链。FAN1切割之后，负责去除突出环的相关因子目前仍不清楚。 G：通过C～F部分所提出的任一途径，对两个突出环进行修复，最终可能产生净扩增（Ga）、无净变化（Gb）或净收缩（Gc）。体细胞不稳定性机制 MutLα能够切割已经存在切口的DNA链，而不受其自身结合在哪条DNA链上的影响；在不存在预先切口时，它并不表现出链选择性。这提示MutLα既能够切割含有突出环的DNA链，也能够切割不含突出环的DNA链。相比之下，MutLγ切割的是含有突出环DNA链的对侧链。 如果含有突出环的DNA链被切割，随后招募核酸外切酶并切除该链，将去除突出环；以不含突出环的DNA链为模板重新合成DNA，则会造成重复序列收缩。相反，如果被切割的是不含突出环的DNA链，随后发生链切除和缺口填补，含有突出环的DNA链便可能被用作模板，最终形成重复序列扩增。 体细胞不稳定性的假定机制（续） 如果含有突出环的DNA链被切割，随后由EXO1介导的链切除会去除该突出环；与突出环相对的另一条DNA链则作为DNA合成的模板，最终导致重复序列收缩。相反，如果被切除的是不含突出环的DNA链，那么含有突出环的DNA链就会被用作模板；因此，重新合成DNA时会将突出环所含序列纳入，进而发生重复扩增。这可能解释了为什么MLH3是重复扩增所绝对必需的。 PMS2是MutLα复合物的组成部分，但它似乎只在部分细胞类型中介导重复扩增。结合扩增底物的特点，一种可能是：当MutLα切割不含突出环的DNA链时，它促进重复扩增；而当其切割含有突出环的DNA链时，则发挥抑制扩增的作用。尽管这一假说尚不能解释在某些系统中MutLα为何是扩增所绝对必需的，且仍需进一步研究以阐明其在重复扩增动态过程中的作用，但扩增偏向性提示MutLγ可能是发挥主要作用的复合物。MutLβ在重复扩增中的作用则不太明确。MutLβ缺乏核酸内切酶活性，因此该复合物可能参与稳定重复序列处的修复机器。 当DNA链发生错位时，需要考虑的一个重要问题是：滑移链结构可能同时在DNA的两条链上形成。分别处理两个突出环，最终可能造成净扩增，也可能造成净收缩。例如，如果PMS2切割滑移链突出环，而MLH3切割不含突出环的DNA链，则重复长度可能不发生变化。如果两个滑移链结构彼此距离较近，且各自的切除区域发生重叠，那么无论切割哪一条链，最终都可能不改变重复长度，因为用于模板的DNA链长度并未发生差异。这或许可以解释为什么随着重复序列变长，扩增速率会增加：对于较短的致病性重复长度（40～50次CAG重复），链错位可能导致两个突出环的切除区域相互重叠，使一条链上的突出环被纳入，而另一条链上的突出环同时被去除，最终不产生重复长度的净变化。 在HD小鼠模型中，Exo1缺失似乎没有产生明显影响；而在脆性X相关疾病模型中，Exo1缺失反而增加了重复扩增。这提示切口的后续处理可能通过一种不依赖EXO1的机制完成。该切口可能成为DNA聚合酶δ（Polδ）的底物；Polδ具有链置换合成能力。EXO1具有保护作用这一事实，并不排除它参与该过程，也不能排除其他核酸外切酶的参与。 FAN1如何抑制体细胞扩增（见“DNA修复基因”一节），目前尚不完全清楚；但FAN1与MLH1的相互作用，以及FAN1自身的核酸酶活性，可能均参与其中。尽管FAN1–MLH1相互作用的功能尚不明确，但在存在扩增重复序列的情况下，这种相互作用似乎能够减少体细胞扩增。MLH1和FAN1双敲除所产生的重复序列稳定化效应，与单独丢失MLH1时相同，这提示FAN1能够抑制MMR因子的促扩增作用。尽管这并不能证明二者属于同一条通路，但FAN1可能位于MSH3介导的MutL招募过程下游。FAN1具有5′瓣状结构核酸内切酶活性和5′至3′核酸外切酶活性；因此，MutL在含有突出环的DNA链上进行切割后，会形成5′瓣状中间结构，该结构可能由FAN1处理，最终去除突出环并导致重复收缩（图4E）。 FAN1也可能独立于MutS和MutL发挥作用（图4F）。与MutSα或MutSβ类似，FAN1是一种具有结构特异性的核酸酶，对滑移链底物具有较高亲和力。体外实验显示，FAN1能够与MutSβ竞争结合滑移链DNA；在生理盐浓度下，FAN1能够以依赖PCNA和RFC的方式，切割并去除含有突出环的短CAG重复DNA链。FAN1在体内是否能够结合并去除滑移链结构，以及这一过程是否还需要其他因子，目前仍不清楚。如果这一机制确实存在，理论上可以预期，MMR缺陷细胞系会表现出明显的重复收缩倾向。MutS或MutL敲除研究确实观察到收缩倾向，但在MMR功能完整的模型中，收缩速率似乎并不等于扩增速率，这提示还存在其他参与因素。 MutL各组成成分显然参与了这一修复过程，但它们各自的具体作用尚未完全阐明。未来研究需要进一步明确PMS1、FAN1和EXO1在修复过程中的确切作用，并确定是否还有其他尚未识别的参与因子。 最后，其他DNA修复途径中的相关因子也可能影响体细胞不稳定性，例如参与转录偶联核苷酸切除修复、氧化应激或碱基切除修复（base-excision repair，BER）的基因。有人提出，BER可能是体细胞扩增的上游介导机制；在HD小鼠模型中，BER蛋白NEIL1和OGG1曾被报道可促进重复扩增。与此相关的发现还包括：线粒体靶向活性氧清除剂XJB-5-131能够减少氧化损伤，并表现出抑制体细胞扩增的作用；而过氧化氢处理则可能促进扩增。然而，近期一项小鼠肝脏CRISPR敲除筛选未能重复证实OGG1的遗传效应。此外，在针对临床表型或血液体细胞扩增的人类GWAS中，也未发现OGG1信号。进一步而言，在严格控制条件下开展的、使用不稳定CAG·CTG重复序列的细胞系研究发现，过氧化氢暴露或多种抗氧化剂处理均不会影响重复扩增速率。综合这些数据，氧化应激可能参与体细胞扩增，但并非体细胞扩增发生所必需的条件。与其他重复扩增疾病的相关性（Relevance to other repeat expansion disorders） 与HD一样，目前大多数其他重复扩增疾病（REDs）也缺乏有效治疗方法或治愈手段。与HD类似，其中一些REDs在受累基因的编码序列中含有CAG重复片段，导致生成含有较长多聚谷氨酰胺片段的毒性蛋白。这类疾病包括多种脊髓小脑性共济失调，例如SCA1、SCA3和SCA7。然而，许多其他REDs涉及的重复序列，在长度、碱基组成以及其位于受累基因中的位置方面均存在差异。因此，这些疾病会产生多种不同的下游后果，其中大多数目前尚未得到充分理解。 尽管不同REDs中重复扩增的下游后果可能有所不同，但越来越多的证据提示，这些疾病具有共同的扩增机制。大多数重复序列表现出相似的体细胞扩增动态，这被认为反映了小幅扩增事件发生频率较高。研究还观察到，发生扩增的细胞类型具有一定相似性；在已经开展研究的疾病中，扩增过程共同依赖转录，而不依赖DNA复制。也许最有说服力的是，在HD中与体细胞扩增变异及起病年龄相关的一些DNA修复基因单核苷酸多态性（SNP），在其他具有不同重复序列、且重复序列位于不同基因区域的REDs中，也与体细胞不稳定性和/或起病年龄的变异相关。这些相关疾病包括由外显子CAG重复引起的多种脊髓小脑性共济失调、1型强直性肌营养不良（DM1）、脆性X相关疾病（FXDs）、Fuchs角膜内皮营养不良3型，以及由TAF1基因第32内含子中的CCCTCT重复引起的X连锁肌张力障碍-帕金森综合征。 不同REDs的患者来源细胞模型，以及部分疾病的小鼠模型，均显示出相同基因突变可产生相似影响。尽管不同模型之间也存在差异，但现有证据提示，这些差异可能反映修饰因子作用程度上的细微差别，而非完全不同的机制。例如，在DM1转基因小鼠模型中，MSH6对代际重复扩增没有显著影响；而在DM1敲入小鼠模型中，MSH6则能够抑制体细胞扩增。然而，在脆性X相关疾病小鼠模型，以及由一名弗里德赖希共济失调患者来源诱导多能干细胞（iPSCs）构建的模型中，MSH6却促进重复扩增。含有MSH6的MutS复合物MutSα已被证实能够结合由CAG、CTG、CGG和CCG重复序列形成的发夹结构。MutSα还可能促进MutSβ与重复序列结合，而MutSβ在大多数模型系统中是重复扩增所必需的。研究还观察到，MutSα对MutSβ与小型插入-缺失错配底物结合具有类似的促进作用；这类底物是MutSβ在经典MMR过程中的识别对象。因此，MSH6可能发挥辅助作用，只有在其他因素成为限速步骤时，这种作用才会显现。 PMS2是另一个在不同疾病或疾病模型中对重复扩增产生不同影响的因子：它可能完全没有影响，也可能促进扩增。例如，在DM1小鼠模型中，PMS2缺失可使扩增减少50%；在脆性X相关疾病小鼠胚胎干细胞模型中，PMS2缺失则可使所有扩增完全消失。在另一种CAG重复疾病——谷氨酰胺酶缺乏症的患者来源iPSC模型中，也观察到扩增完全消失。研究发现，在HD和脆性X相关疾病小鼠的不同组织中，PMS2可根据基因剂量不同而抑制或促进扩增；这一现象可能与其切割偏好有关，也可能解释上述不同研究结果。 一个尚未解决的重要问题是：其他多态性CAG位点的重复长度，是否能够以反式作用方式修饰其他重复扩增疾病的起病年龄。候选基因研究提示，其他导致多聚谷氨酰胺重复疾病的致病基因中的CAG重复变异，可能影响多种脊髓小脑性共济失调的起病年龄。相反，另一项研究发现，正常ATXN3基因中的CAG重复长度——当该重复扩增时可导致SCA3——可能修饰HD起病年龄。然而，规模更大的分析未能重复这一发现；该研究未发现ATXN3 CAG重复长度与HD起病年龄之间存在关联，也不支持其他致病性CAG重复扩增基因中的变异能够修饰HD。 不同REDs中存在广泛的下游效应，这给治疗研发带来了挑战；部分疾病相对罕见，又进一步增加了研发难度。然而，鉴于目前存在重复扩增机制共同性的证据，能够减少HD体细胞扩增的治疗方法，也可能用于治疗这一疾病类别中的其他疾病，至少可能适用于并非先天性或极早起病的疾病。DNA修复靶向治疗的机会与注意事项（Opportunities and considerations of targeting DNA repair）现有治疗策略概述及治疗时机（Overview of current therapeutics and when to treat） 目前提出的HD两阶段发病机制，对应两种不同的治疗策略：一种是阻止CAG重复序列发生体细胞扩增，另一种是降低致病性多聚谷氨酰胺重复序列产生的毒性。直到过去几年，研究关注更多集中于后一种策略，即通过反义寡核苷酸（ASOs）、RNA干扰以及HTT剪接调节等方法，降低突变型HTT的mRNA和/或蛋白水平。研究者还探索了多种治疗途径，以处理HD下游病理后果，包括使用NMDA受体拮抗剂靶向兴奋性毒性，以及干预多巴胺能失衡、线粒体功能障碍和神经炎症；这些内容已在Tabrizi等和Jiang等近期发表的综述中讨论。携带HD致病突变的个体在其一生中可能需要使用多种药物，以针对不同的HD相关机制。事实上，一种具有潜在强大作用的策略，是同时在重复序列和其产生的蛋白质毒性两个层面进行干预；例如，在小鼠中同时使用小干扰RNA（siRNA）敲低MSH3和HTT，已经显示出这种双靶向策略的可行性。 确定最佳治疗干预时机是一项关键目标；不同治疗策略的最佳治疗时间可能并不相同。直到近几年，早期干预的机会仍受到生物标志物不足的限制，因为研究者需要能够在运动症状出现或明显神经退行性变发生之前追踪疾病进展的指标。2020年，对HD青年成人研究（HD-Young Adult Study，HD-YAS）队列开展的横断面分析发现，在预计运动症状起病前数十年，临床前期携带者已经出现亚临床改变；这些改变早于认知或神经精神功能下降。这一研究为在临床前期疾病阶段评估药物提供了参数。 在HD-YAS队列的纵向研究中，研究者发现，在最早期的疾病阶段，即HD综合分期系统（HD Integrated Staging System，HD-ISS）0期和1期，血液中已经存在体细胞CAG重复扩增；此时患者尚未出现认知、神经精神或功能方面的改变。体细胞扩增的变化与随后脑萎缩速率，以及神经元-轴突损伤和纹状体损伤标志物呈正相关。体细胞扩增在脑内并非同步发生；当扩增超过转录调控失常阈值时，会导致神经元不同步死亡。这些数据提示，在疾病极早期抑制体细胞扩增，可能防止更多神经元跨越神经元毒性阈值，从而避免神经退行性变和功能下降。降低HTT水平（HTT lowering） 首个进入临床试验的HTT降低治疗药物是tominersen，这是一种靶向HTT的反义寡核苷酸（ASO）。tominersen试验首次证明，治疗药物能够降低脑脊液（CSF）中的突变型HTT（mHTT）水平。然而，遗憾的是，由于临床结局恶化，该试验被终止。阴性结果可能是多种因素共同作用的结果，包括ASO给药剂量较高、受试者处于较晚的疾病阶段，以及可能同时降低了野生型HTT水平。当前正在开展Ⅱ期临床试验，评估较低剂量tominersen在前驱期和早期显性HD受试者中的疗效；该试验有望帮助研究者理解HTT降低治疗的作用，以及何时进行治疗最为合适。其他处于临床试验阶段的HTT靶向治疗还包括小分子HTT剪接调节剂branaplam和PTC518，二者分别由Novartis和PTC Therapeutics开发。 过去几年的数据提示，HTT1a可能是致病性基因产物；因此，如果HTT降低治疗不能降低具有毒性的HTT1a水平，其疗效可能受到限制。目前处于临床试验阶段的HTT1a靶向策略包括Alnylam公司的siRNA药物ALN-HTT02，以及uniQure公司的病毒基因治疗AMT-130。 尽管野生型HTT对于神经发育至关重要，并参与多种关键细胞功能，但在成年人体内长期抑制野生型HTT的影响尚不清楚。临床前数据提示，野生型HTT可能具有神经保护作用；因此，等位基因选择性治疗旨在降低mHTT，同时保留正常HTT的功能。多家公司正在开发等位基因选择性ASO，以靶向与扩增HTT CAG重复片段处于连锁不平衡状态的单核苷酸变异（SNVs）。迄今考虑的SNV仅能使欧洲血统HD人群中约40%的患者实现等位基因选择性治疗，这意味着等位基因选择性ASO不可能成为适用于所有患者的通用治疗方案。对于非白人群体而言，由于SNP频率存在差异，这些治疗能否有效推广尤其值得关注。靶向体细胞扩增（Targeting somatic expansion） 过去10年中，靶向HD体细胞扩增的治疗策略逐渐成为具有吸引力的研究方向。事实上，在肿瘤学领域，许多被认为是基因组不稳定性驱动因素的DNA损伤修复蛋白，已经作为潜在可成药靶点接受研究。MSH2、MLH1和PMS2不太可能成为理想的治疗靶点，因为这些蛋白功能丧失与胃肠道癌症和中枢神经系统癌症风险显著增加相关。相比之下，MSH3、PMS1和MLH3对功能丧失变异的耐受性相对较好，与恶性肿瘤的关联也较弱。 考虑到MSH3和PMS1具有较低的癌症风险，与HD起病及进展相关，并且已被证实能够影响体细胞扩增，因此二者似乎是更有利的治疗靶点。目前，研究者正集中力量开发能够进入中枢神经系统的MSH3和PMS1靶向分子。 MSH3是一种高度动态的蛋白质，为小分子抑制提供了多种可能途径。第一种途径是阻止MSH3、进而阻止MutSβ与滑移链DNA结构结合。目前已经发现一种化合物，其通过与MSH3的DNA结合结构域发生共价结合，阻止MSH3与DNA结合。尽管该化合物尚不能被视为临床候选药物，但这一策略值得进一步开发和测试。第二种途径是抑制MSH3的ATP酶活性；这一功能对于体细胞扩增至关重要。目前正在开发针对MutSβ ATP酶功能的变构和正构小分子抑制剂。第三种途径是抑制MutSβ与MutL同源蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。MSH3与MLH1之间已知的结合位点可能有助于开发破坏这一相互作用的化合物；但由于MSH2同样能够与MLH1结合，因此蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂能够实现多大程度的相互作用削弱，目前尚不清楚。第四种途径是靶向MSH3的激活因子，例如组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）；研究已显示，抑制HDAC3能够减少体细胞不稳定性。最后，也可能是最直接的选择，是降低中枢神经系统中的MSH3水平。研究者已经分别使用二价siRNA和ASO，成功降低HD小鼠以及HD患者来源细胞中的MSH3水平，且未观察到微卫星不稳定性、肿瘤发生或转录调控失常的迹象。 在HD小鼠中，敲除PMS1能够显著减少体细胞扩增、逆转转录调控失常，并减少mHTT核内包涵体。PMS1含有一个可由药物诱导的假外显子；当该假外显子被纳入转录本时，会引入终止密码子，进而通过无义介导的mRNA降解途径降低PMS1表达。在外源表达含115次CAG重复的HTT第1外显子构建体的视网膜色素上皮细胞中，这一过程能够减慢CAG重复扩增。能够稳定RNA与剪接体或RNA结合蛋白相互作用的小分子，是一种具有吸引力的治疗选择；目前已有多种策略正在开发PMS1剪接调节剂。然而，必须注意避免非预期的脱靶效应；目前已有的部分药物，例如branaplam和risdiplam，便存在此类问题。 MLH3对于哺乳动物减数分裂至关重要，但在错配修复中通常被认为是一种辅助因子。Mlh3缺失与小鼠肿瘤易感性增加相关；然而，与MSH2、MSH6、MLH1和PMS2不同，MLH3在人类中并非已知的结直肠癌易感基因。MLH3的核酸内切酶活性是HD、脆性X相关疾病和弗里德赖希共济失调模型中CAG、CGG和GAA重复扩增的关键驱动因素。MLH3主要表达为两种异构体，其中一种缺乏核酸内切酶结构域。因此，利用剪接转换寡核苷酸（splice-switching oligonucleotides）优先促进缺乏核酸酶活性的异构体表达，是一种可能减缓重复扩增疾病中重复扩增的治疗靶点。 研究显示，提高FAN1水平能够减慢体细胞扩增。目前尚不清楚FAN1上调能够被机体耐受到何种程度，不过人类遗传学数据提示，人群中的FAN1水平本身存在一定变异。提高FAN1水平的两种潜在方法包括：使用剪接转换寡核苷酸增加FAN1转录本水平；以及使用靶向去泛素化酶的嵌合分子，阻止FAN1降解。这两种方法均应进一步探索，以确定能否在中枢神经系统中实现可控的FAN1水平升高。在将FAN1视为理想治疗靶点之前，还需要开展大量研究，以明确产生有利表型改变所需的FAN1活性水平，并评估潜在的肿瘤发生风险。 大量数据支持降低不同MMR蛋白水平能够减少重复序列不稳定性，但要获得临床获益，体细胞不稳定性究竟需要降低到何种程度，仍是一个尚未解决的问题。研究显示，将MSH3降低约50%——理论上这一水平可能在临床上实现——能够显著减慢HD细胞和小鼠模型中的体细胞不稳定性速率。然而，PMS1可能需要降低到低于临床治疗可行范围的水平，才能产生相应作用。已知的重复扩增调节因子是否具有叠加效应，目前尚不清楚；但联合靶向多个扩增驱动因子，可能产生协同治疗获益。 鉴于HD起病年龄由未中断的CAG重复长度决定，而非由多聚谷氨酰胺长度决定，因此可以设想，通过将CAG转换为CAA，在不改变多聚谷氨酰胺长度或最终HTT蛋白的情况下，缩短连续未中断的CAG重复片段，从而延迟疾病起病。研究者已在HD和弗里德赖希共济失调小鼠模型中，分别使用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，在CAG和GAA重复序列中引入中断。引入中断能够缩短连续未中断CAG重复片段的长度，并显著减少HD和弗里德赖希共济失调小鼠中枢神经系统内的体细胞扩增。这些数据证明了基因组编辑策略的潜在应用价值；然而，其转化为临床治疗仍面临重大挑战，尤其是如何安全、有效地将编辑工具递送至人脑。体细胞扩增的生物标志物（Biomarkers of somatic expansion） 药物研发过程中的一个关键环节，是在体内从分子层面确认药物是否作用于预定靶点。对于抑制体细胞扩增的治疗而言，靶点结合在RNA和/或蛋白产物层面的表现，取决于具体靶点及治疗作用机制。然而，所有这类治疗最终都应通过体细胞扩增这一共同环节发挥作用。因此，在体内确认治疗对体细胞扩增的影响，通常是决定一项研究能否从Ⅰ/Ⅱ期试验进入Ⅲ期试验的重要依据。评估体细胞扩增速率变化最直观的方法，是在基线时测定体细胞扩增程度，并将治疗组随时间发生的相对增加与安慰剂对照组进行比较。理想情况下，应当能够直接测量关键靶神经元中的重复长度变化；但由于无法对神经元进行活检，这一目标难以实现。 一种可能用于测量神经元体细胞扩增速率的方法，是从脑脊液中采集游离DNA或细胞外囊泡DNA。然而，对HD患者尸检后脑脊液DNA进行初步整体分析发现，脑脊液中的DNA并未富集来自具有大规模体细胞扩增细胞的DNA。另一种方法是评估易于获取的外周组织中的体细胞扩增变化；不过，这一策略最适合用于经外周给药的小分子药物。最明显的外周组织是血液，因为血液本就是临床诊疗、自然病程研究和临床试验中常规采集的样本。支持血液作为有用检测组织的证据包括：血液DNA数据已被用于描述体细胞扩增动态，并明确证实扩增具有年龄依赖性和CAG长度依赖性。此外，现有大量重复长度分布数据和储存的血液DNA样本，使研究者能够利用治疗前自然病程数据，针对个体水平评估药物靶点结合情况。 尽管血液体细胞扩增是一个具有吸引力的生物标志物，但血细胞中累积的扩增程度相对有限；在临床试验较短的观察期内，能否检测到纵向变化仍有待确定。为此，一项研究使用片段长度分析，成功检测到血液DNA中体细胞扩增程度在7～12年期间发生的变化。并不令人意外的是，遗传获得的等位基因越大，血液DNA中的体细胞扩增速率越高：遗传获得50次重复的个体，其扩增速率超过遗传获得40次重复个体的5倍。由于绝对变化幅度更大，遗传获得的CAG重复次数越多，随时间检测变化的统计效能也越高。尽管遗传获得较大等位基因的个体相对较少，但Ⅱ期临床试验队列可以考虑根据遗传获得的CAG重复长度进行选择和/或分层。 尽管如此，近期一项研究使用高灵敏度超深度MiSeq测序，在一个包含54名个体的小样本队列中，检测到了约4年期间血液HTT体细胞扩增的高度显著增加；该队列所包含的遗传获得CAG重复长度范围，能够代表成年HD人群。未来仍需开展观察时间更短的纵向研究，以进一步完善统计效能计算，并全面评估血液体细胞扩增作为临床试验生物标志物的潜力。 其他外周组织中的体细胞扩增速率可能高于血液，因此有望提高纵向变化的检测效能。一项针对8名HD患者尸检组织的小型研究发现，肝脏中的扩增速率高于血液、肾脏、心脏、肺和骨骼肌。然而，肝脏活检具有较强侵入性，在临床试验中其操作风险是否可以接受，仍有待确定。其他更容易获取的外周DNA来源，例如皮肤、口腔黏膜上皮、尿液和粪便，其相对扩增速率目前仍有待确定。值得注意的是，在SCA3患者的口腔拭子DNA中观察到了ATXN3 CAG重复扩增。此外，在相应小鼠模型的粪便中，SCA1、SCA2和脆性X综合征的重复扩增程度较高。最后，精子中存在较高水平的重复长度变异，这种变异可能在生殖细胞分化过程中迅速发生；如果这一发现得到证实，那么通过治疗抑制精子中的重复变异，可能在数周内检测到药物靶点结合情况。 总体而言，针对抑制体细胞扩增治疗的潜在生物标志物开发已经取得相当进展。然而，仍需进一步优化检测方法，以便在临床试验较短的时间范围内检测变化，并确定试验队列达到统计学效能所需的样本量。术语表（Glossary） 术语 定义 遗传修饰因子（Genetic modifiers） 本身并不直接导致疾病，但能够改变致病突变表型表达的遗传变异。 全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS） 一种扫描全基因组、寻找与某种性状或疾病相关的常见遗传变异的方法。 HTT1a 一种具有致病性的HTT mRNA蛋白异构体，由HTT基因内含子1中的隐蔽多聚腺苷酸化位点被利用后产生；HTT1a转录本包含外显子1及一小段内含子1序列。 代际不稳定性（Intergenerational instability） 重复DNA序列（例如CAG重复）在亲代传递给子代的过程中发生长度变化。 错配修复（Mismatch repair，MMR） 一种DNA修复途径，用于纠正碱基错配和插入-缺失环；这些结构可在依赖或不依赖DNA复制的情况下形成。 MutL 一种位于MutS下游发挥作用的异二聚体，协调DNA切除及修复步骤；真核生物中的复合物包括MutLα（MLH1–PMS2）、MutLβ（MLH1–PMS1）和MutLγ（MLH1–MLH3）。 MutS 一种能够识别DNA碱基-碱基错配及小型插入-缺失环的异二聚体；真核生物中的MutS异二聚体包括MutSα（MSH2–MSH6）和MutSβ（MSH2–MSH3）。 重复扩增疾病（Repeat expansion disorders，REDs） 一类神经系统疾病，其病因是特定基因内部的重复DNA序列异常延长。 滑移链DNA（Slipped-strand DNA） 一种DNA二级结构；在复制、修复、转录或染色质重塑过程中，重复序列发生错位，从而形成滑移链结构；这类结构常见于微卫星或三核苷酸重复区域。 体细胞扩增（Somatic expansion） 个体一生中，非生殖系（体细胞）内DNA重复序列逐渐增长的过程。结论（Conclusions） 自HD致病突变被发现以来，已经过去30多年；但在此期间，我们逐渐认识到，HD并不是一种简单的孟德尔遗传病。HTT本身参与多种基本细胞过程，这使得研究者难以完全阐明其作用机制。遗传修饰因子的发现——这些因子能够影响疾病起病和进展——为治疗干预提供了有前景的新途径，并且可能与直接靶向HTT的治疗策略联合应用。 已有数据表明，在疾病起病前许多年，体细胞扩增就与HD患者的脑萎缩及疾病进展评分相关；这提示，尽早对体细胞扩增进行治疗性干预可能是有益的。当前仍面临若干重要问题，包括如何在体内有效证明治疗对体细胞扩增速率的影响，尤其是考虑到血液等容易获取的组织中体细胞不稳定性水平较低。只有当我们在临床上通过药物干预抑制体细胞扩增后，才有可能真正理解体细胞重复扩增相对于其他疾病驱动因素所作出的贡献。 目前是HD治疗研发令人振奋的时期，许多药物发现项目正致力于寻找能够减缓或阻止这一毁灭性疾病进展的治疗方法。

医保限定速查丁苯酞:软胶囊 72 小时,注射液 48 小时 数据更新：2026 年 10 月 10 日（获批信息、医保与价格按当月核实） 开这个药之前，先看三行： 谁该看：神经内科开丁苯酞的医生，尤其是管卒中患者出院续贯的 看完能判断什么：这位患者该用软胶囊还是注射液、发病时间还够不够、能吃几天 最容易踩的坑：门诊续贯最常见的场景：急性期住院用过注射液，出院回门诊开软胶囊，首诊时间早超 72 小时——落在支付范围外 声明：本文为个人学习整理，政策学习，不涉及任何用药及诊疗建议。医保支付以2026年执行的《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录（2025年）》及当地医保部门执行口径为准；用法用量以最新版说明书为准。 本篇栏目一览 01 两套说明书 · 一个写死时间窗，一个没写02 目录原文照录 · 乙 358／35903 出入在哪里 · 软胶囊多三道要件04 剂型对照表 · 时间窗差 24 小时05 病历与医嘱清单 · 6 个要素06 规格与协议期 · 3.24 元 vs 102.16 元07 小结 · 五句话 原研与同类品种（认准通用名与剂型） 原研／国内：石药集团恩必普药业；软胶囊国药准字 H20050299、丁苯酞氯化钠注射液国药准字 H20100041属化学药品（消旋正丁基苯酞），非中成药；临床常与复方丹参注射液联合使用以所用批次的说明书为准 01两套说明书 软胶囊说明书适应症：「轻、中度急性缺血性脑卒中」。用法：空腹口服，一次两粒(0.2g)，一日三次，十天为一疗程。说明书里另有一段容易被忽略的文字——「根据现有临床研究的用药方法，本品可与复方丹参注射液联合使用」；注意事项中则写明「吞咽功能障碍者，不宜服用」。餐后服用会影响吸收，因此说明书建议餐前服。 丁苯酞氯化钠注射液说明书把用法用得很细：「本品应在发病后48小时内开始给药。静脉滴注，每日2次，每次25mg(100ml)，每次滴注时间不少于50分钟，两次用药时间间隔不少于6小时，疗程14天。」紧接着还有两句：「PVC输液器对丁苯酞有明显的吸附作用，故输注本品时仅允许使用PE输液器」，以及「本品在发病48小时后开始给药的疗效、安全性尚无研究数据」。 两个剂型的说明书不是一个写法：一个只说清病与用法，另一个把时间窗、疗程、甚至输液器材质都写死了。这直接决定了后面备注栏能贴多紧。 02目录原文照录 《药品目录（2025年）》协议期谈判药品（ybml2025.txt L7367–L7379） 乙 358 丁苯酞软胶囊　3.24元(0.1g/粒)　限新发的急性缺血性脑卒中患者在发作72小时内开始使用，支付不超过20天。（2025年1月1日至2026年12月31日）乙 359 丁苯酞氯化钠注射液　102.16元(100ml:丁苯酞25mg与氯化钠0.9g/支)　限新发的急性缺血性脑卒中患者在发作48小时内开始使用，支付不超过14天。（2025年1月1日至2026年12月31日） 03出入在哪里 注射液一侧：说明书与备注栏几乎重合。说明书 48 小时／14 天，备注栏也是 48 小时／14 天，只多出「新发的」三个字。按说明书用药，报销条件自动满足——这一侧的风险不在天数，而在「新发」的认定：病程里要有本次发病的时间与影像证据，旧病灶或陈旧性改变不能算。 软胶囊一侧：备注栏比说明书多三道要件。说明书写的是「轻、中度急性缺血性脑卒中」，既没有时间窗，也没有支付天数上限；备注栏把它收窄成「新发的＋72 小时内开始＋支付不超过 20 天」。门诊随访的卒中患者，发病超过 72 小时再开软胶囊，就落在支付范围外——这是神经内科门诊最常见的场景：患者急性期住院用过静脉制剂，出院后回到门诊续贯口服，首诊时间早已超过 72 小时。 两个剂型之间还有一个临床上的两难：软胶囊说明书写明「吞咽功能障碍者，不宜服用」，而吞咽障碍恰恰是卒中急性期最常见的问题。这类患者只能选注射液，可注射液的时间窗更紧（48 小时）。实际动作是：先看发病时间够不够，再决定用哪个剂型，而不是先定剂型再补病历。 04剂型对照表  + repr(FIG2) +  05病历与医嘱清单 · 诊断写明「新发的急性缺血性脑卒中」，并把发病时间写到小时——这是时间窗的唯一判据· 首次给药时间与医嘱起止日期：软胶囊 ≤72 小时起始、累计不超过 20 天；注射液 ≤48 小时起始、累计不超过 14 天· 影像证据：头颅 CT/MRI 排除出血、明确新发缺血灶；「新发」要有影像支撑，不能只凭病程描述· 严重程度：软胶囊限「轻、中度」，病历需有神经功能缺损评分（如 NIHSS）支撑分级结论· 输注器具：注射液仅允许使用 PE 输液器，医嘱与护理记录同步写明，避免核查时器具与药品对不上· 吞咽功能评估：考虑口服或改针剂时，把评估方法与结论写进病程（软胶囊说明书明确吞咽障碍者不宜服用） 06规格与协议期 条目 支付标准 / 协议期 丁苯酞软胶囊（乙 358） 3.24元(0.1g/粒)；协议期 2025-01-01 至 2026-12-31 丁苯酞氯化钠注射液（乙 359） 102.16元(100ml:丁苯酞25mg与氯化钠0.9g/支)；协议期同上 批准文号 软胶囊 H20050299；氯化钠注射液 H20100041（石药集团恩必普药业） 注：两个条目的协议期都在 2026 年 12 月 31 日到期，续约结果以国家医保局公布为准；具体结算价格以医院进价与当地平台为准。 07小结 · 先看发病时间，再看剂型：72 小时／20 天是软胶囊，48 小时／14 天是注射液· 注射液按说明书用即可，重点是「新发的」要有影像与病程支撑· 软胶囊是门诊续贯治疗最容易被卡的一环，超 72 小时起始的那部分自费· 吞咽障碍患者不宜口服软胶囊，改剂型前把评估结论写进病程· PE 输液器这一条写在医嘱里，省掉一次解释 ◆ ◆ ◆ 欢迎参与 · 临床上拿不准的限定，写进留言，我核实原文后做成专题 · 文中如有错漏，或你所在地区执行口径不同，直接指出；核实后我更正，并署名致谢 创作不易，点赞鼓励 整理不易，如觉得实用，欢迎转发给科室同事。 往期速查 · 神经·精神·儿科 点标题直达原文，同领域往期一篇不漏： · 医保限定速查｜依达拉奉注射液：说明书写着脑梗死，医保只报ALS · 医保限定速查｜美金刚：一个药四条目录身份，报销闸门各不相同 · 医保限定速查｜多奈哌齐：口崩片多一句限定，病历要接得住 · 医保限定速查｜水合氯醛：剂型一换，抗惊厥就不报了 · 医保限定速查｜氨己烯酸：备注栏五个字，就是全部报销范围 · 医保限定速查｜孟鲁司特:四个剂型两种待遇 · 医保限定速查｜生长激素:报销卡在三条限定 · 医保限定速查｜右哌甲酯:ADHD新药报销边界 · 医保限定速查｜帕利哌酮:三档长效针报销规则 · 医保限定速查｜利司扑兰:口服治SMA报销差异 · 医保限定速查｜诺西那生钠:SMA首年6针怎么报 · 国产RSV单抗双雄：新多妥+英沐乐同日获批 · 克莱罗伟单抗：RSV预防四强格局固定剂量选手 以上均为已发表原文；本篇归入「神经·精神·儿科」领域。 开药前先翻合集：限制怎么定、病历怎么写。 全部类目目录 · 六大合集　号内搜索药品，如没有可后台留言 ① 肿瘤 · 单抗与靶向 上单抗或靶向药前先查：认哪个瘤种、几线、要不要检测报告；「说明书写了、医保不报」的组合专门标出。 ② 自免 · 风湿与皮肤 开生物制剂前查两步：结核/乙肝筛查做了没、达标后拿什么续方；长程管理的病历要求也在这。 ③ 神经 · 精神 · 儿科 有时间窗、疗程上限、年龄与量表门槛的药：溶栓窗口、基因报告、儿童适用年龄，开方前填对字段。 ④ 心血管 · 代谢 · 消化 开 SGLT-2、他汀、GLP-1 前查：适应症全称怎么写、LVEF 与 eGFR 算不算，写错就全额自费。 ⑤ 感染 · 眼科 · 其他 限定只有几个字的药（「限二线」「限干眼症」）：诊断栏写什么才报、一线药要先留什么记录。 ⑥ 医保政策与案例解读 别人被罚的案子就是提醒：罚了多少、依据哪条、病历少写哪一项——一篇篇拆给你看，照着自查。 三种进入方式：① 下拉到本文最底部，点微信自带的「合集」卡片（本篇所属合集）② 进公众号主页 →「合集」标签，按领域挑选③ 点本篇「阅读原文」＝ 聚合目录页，全部篇目可搜索