AMG-330

【编者荐语】近日，leukemia杂志发表一项基础研究，探索性解释了TP53 缺陷型AML诱导T细胞衔接器（双抗）耐药的机制。研究证实，TP53缺陷型AML细胞能够通过释放以TGF-β1为核心组分的免疫抑制型分泌组，阻滞T细胞细胞周期进程、诱导T细胞早衰，进而削弱BiTE介导的抗肿瘤免疫应答，为TP53突变高危AML的免疫联合治疗提供全新研发靶点。     现译介如下，原文PDF已上传文末小程序，点击免费下载。 双特异性 T 细胞衔接分子（BiTE®）彻底革新了 B 细胞恶性肿瘤的治疗格局，但该类药物在急性髓系白血病（AML）中的临床疗效十分有限。耐药的部分诱因来自急性髓系白血病的遗传异质性，其中以 TP53 基因突变最为突出：初诊患者突变发生率为 10–15%，而治疗相关急性髓系白血病的突变占比最高可达 25%。基于上述背景，本研究提出假说：急性髓系白血病中 TP53 基因异常可从肿瘤细胞固有及外在微环境层面，介导肿瘤对 T 细胞免疫疗法产生耐药。在与经 AMG 330（靶向 CD3×CD33 的双特异性 T 细胞衔接分子）活化的 T 细胞共培养体系中，T 细胞对 TP53 敲除（DEL）原代急性髓系白血病细胞、TP53 敲低（KD）急性髓系白血病细胞系的杀伤活性显著下降。与此同时，若共培养体系内存在 TP53 敲低细胞，T 细胞增殖能力、促炎细胞因子分泌水平均受到抑制。Transwell 小室（Transwell）实验证实，TP53 敲低急性髓系白血病细胞的分泌组是介导免疫抑制的关键因素。蛋白质组学分析结果显示，共培养上清中的转化生长因子 -β1（TGF-β1）是造成 T 细胞功能受抑的关键介质。对与 TP53 敲低细胞共培养后的 T 细胞开展 Bulk RNA 测序发现，T 细胞转录谱向细胞衰老周期表型发生偏移。综上，本研究证实 TP53 缺陷型急性髓系白血病依靠具有免疫抑制作用的分泌组，形成阻碍 T 细胞衔接类免疫药物起效的关键屏障，也提示临床亟需开发新方案以恢复该类患者体内 T 细胞的免疫功能。引言 现阶段靶向药物、表观调控药物的迭代虽推动AML治疗不断进步，但TP53-MUT亚型AML依旧存在巨大临床治疗缺口。TP53突变在初诊AML人群中发生率为10–15%，复发及治疗相关AML患者的突变占比分别上升至25%与30%，依据2022版ELN危险分层标准，此类病例统一划归高危分组，无论治疗强度高低，患者中位OS均低于7个月。临床一线可选方案包含高强度诱导化疗、HMA单药或维奈克拉联合HMA，而VIALE-A临床试验数据证实，维奈克拉联合阿扎胞苷无法为TP53-MUT患者带来显著生存获益，提示该亚型肿瘤对各类传统治疗天然耐药。HSCT作为现阶段唯一具备根治潜力的治疗手段，同样难以改善患者不良预后，既往大型数据库统计结果显示，TP53突变患者移植后2年OS仅19%，累计复发率突破60%，部分高龄或合并基础疾病的患者还会因不符合入组标准失去移植机会。 已有临床前研究证实，TP53缺失能够重塑TME、干扰机体免疫相关信号通路，下调抗原呈递分子表达并改变细胞因子分泌谱，但该类分子变化如何调控T细胞介导的抗白血病免疫，相关机制尚未被完整阐明。伴随双特异性抗体、CAR-T逐步落地AML临床试验，明确TP53基因异常的免疫调控作用，对受试者筛选、联合用药方案优化具备重要临床价值。基于现有研究空白，研究者提出核心研究假说，AML细胞出现TP53基因异常后，能够经由细胞内在、细胞外在两条路径诱导肿瘤对T细胞靶向免疫治疗产生耐药，后续借助AMG 330体外共培养体系、多组学测序技术以及体内动物实验逐层验证假说，并锁定TGF-β1作为分泌组中关键的免疫抑制效应分子。方法 本研究依托多种体外细胞实验技术、Bulk RNA-seq测序平台与体内动物造模技术开展试验，相关实验操作遵循标准化试验规范与伦理准则。细胞实验层面，MV4-11、MOLM-13、OCI-AML3的TP53 KD及对应WT细胞株由合作机构提供，细胞敲低借助慢病毒载体介导shRNA技术完成构建，所有细胞定期开展支原体污染筛查与STR身份鉴定。原代生物样本取自AML确诊患者与健康供者的外周血，利用商品化分离试剂盒完成T细胞提取，全部人体样本采集流程遵从《赫尔辛基宣言》，并获得研究机构伦理审批与受试者书面知情同意。 体外功能实验固定采用1:6的E:T配比，培养体系添加5 ng/ml AMG 330或cTCE，分别在培养第3天、第5天借助流式细胞术检测肿瘤特异性裂解率与T细胞增殖水平，相关指标依照固定公式完成量化计算。Bulk RNA-seq采用prime-seq文库构建方案，测序上机选用Illumina NextSeq2000设备，后续依托fastqc、Star、RSEM、DSeq2等系列生物信息学软件完成原始数据质控、基因表达定量与差异基因筛选，同时结合R语言多款分析工具开展通路富集、可视化绘图工作。 体内动物实验选用NXG小鼠构建白血病移植模型，所有动物实验方案通过德国上巴伐利亚行政区相关监管部门审批，小鼠经尾静脉输注MV4-11 LUC GFP细胞完成造模，造模7天后回输人源T细胞并周期性给予AMG 673或对照制剂，借助IVIS系统动态监测体内肿瘤负荷，试验终点统一取材小鼠外周血、骨髓与脾脏用于离体指标检测。统计学分析借助GraphPad Prism 10软件完成，两组数据对比采用双侧t检验，多组数据采用单因素ANOVA搭配Šidák多重比较检验，p＜0.05作为统计学差异判定标准，ROUT法用于试验离群数据剔除。结果携带TP53敲除的急性髓系白血病原代样本在自体及异体共培养体系中抑制T细胞功能 研究者首先利用患者同源自体共培养体系，探究TP53 DEL原代AML细胞对AMG 330介导免疫杀伤的影响。试验数据显示，相较于TP53 WT组别，TP53 DEL原代AML细胞可明显降低AMG 330带来的肿瘤特异性裂解效率（图1A）。同一培养条件下，TP53 DEL组同步出现T细胞增殖幅度下降、TNF与IFN-γ分泌量减少的变化趋势（图1B、图1C）。为排除患者自体T细胞自身携带TP53变异带来的试验干扰，研究者更换健康供者来源T细胞构建异体共培养模型。异体试验的检测结果与自体培养结果保持一致，TP53 DEL原代肿瘤细胞依旧能够显著抑制健康T细胞的裂解活性、增殖能力以及促炎细胞因子释放（图1D–图1F）。上述两组平行试验共同证明，无论T细胞来源于AML病患或是健康人群，携带TP53敲除的原代AML细胞均可诱发T细胞功能性损伤。 与MV4-11 TP53敲低细胞共培养后，AMG 330介导的细胞毒作用与T细胞功能下降 研究者选用经shRNA稳定构建的MV4-11、MOLM-13、OCI-AML3 TP53 KD细胞及同源WT细胞建立标准化体外模型（附图S2A），三株试验细胞的CD33膜表面表达水平均贴合临床TP53异常AML细胞的表达区间（附图S2B）。健康供者T细胞与各细胞株共培养并补充AMG 330后，MV4-11 TP53 KD组在培养第3天即可观测到抗肿瘤裂解效率显著下降（图2A），培养第5天的复测结果延续相同趋势（附图S2C），MOLM-13、OCI-AML3组别也出现杀伤效率下调的同向变化（附图S2D–E）。TP53 KD共培养环境还会抑制T细胞增殖活性，该现象在MV4-11试验组中表现最为突出（图2B、附图S2C–E）。 基于MV4-11细胞系的突出组间差异，后续试验优先选用该细胞开展细化检测。流式表型结果显示，TP53 KD共培养环境下的T细胞，活化标志物PD-1、GrzB以及耗竭相关分子Lag3的表达水平全部出现下调（图2C）。细胞因子定量结果同步印证功能受损表现，TP53 KD组培养上清内IFN-γ、TNF、IL-2三种关键促炎因子的分泌量显著低于WT对照组（图2D）。研究者额外设置对照试验，排除CD33抗原基线表达差异、肿瘤细胞自身增殖速率不同带来的试验干扰，数据证实两类细胞的CD33表达与体外增殖能力无统计学区别（图2E、图2F）。 该抑制效应不局限于BiTE药物作用体系，在靶向CD33的CAR-T共培养试验中，除OCI-AML3无明显组间差异外，其余TP53 KD肿瘤细胞同样能够抵御CAR-T介导的细胞毒杀伤（附图S3A–C）。进一步T细胞亚群分群试验显示，TP53 KD细胞可同步抑制CD4⁺与CD8⁺两个T细胞亚群的生物学功能，两类细胞的功能抑制效果呈现叠加特征（附图S4A–E）。整套细胞系体外试验完整复刻原代患者样本的试验结论，确定TP53 KD AML细胞能够全方位削弱AMG 330诱导的T细胞抗肿瘤功能。 TP53敲低诱导的代谢重塑改变急性髓系白血病细胞自身适应性，但不影响T细胞存活状态 研究者从膜表面分子表达、细胞代谢重编程、肿瘤细胞转录组变化三个方向，逐层排查TP53 KD介导T细胞功能受损的潜在诱因。首先检测IFN-γ/TNF-α刺激前后MV4-11细胞表面共刺激、共抑制分子表达，CD80、CD86、OX40L、PD-L1在TP53 KD与WT细胞间无表达差异（附图S5A-B），直接排除膜表面分子改变作为免疫抑制的核心诱因。 依托Seahouse能量代谢检测平台开展糖代谢试验，共培养后的TP53 KD AML细胞整体糖酵解活性出现明显上调（图3A），糖酵解最大容量、糖酵解储备、非糖酵解酸化指标同步升高（图3B）。两组细胞的氧化磷酸化水平不存在显著统计学差异（附图S5C-D）。尽管糖代谢重编程能够优化TP53 KD肿瘤细胞的体外生存优势，但单一代谢层面的改变无法完整解释T细胞大范围功能抑制现象。 研究者对共培养结束后的两类MV4-11细胞开展Bulk RNA-seq检测。无偏主成分分析结果显示，TP53 KD与WT细胞的转录谱各自独立聚类，组间转录特征区分明显（图3C）。差异基因筛选数据表明，相较于KD组别，WT细胞共计78个基因上调、116个基因下调（图3D）。TP53 KD细胞内炎症相关细胞因子、免疫趋化因子编码基因大范围下调（图3D–图3F、附图S5E）。转录组数据明确提示，TP53 KD引发的分泌组重塑是调控T细胞活性变化的关键驱动因素。 TP53敲低急性髓系白血病细胞的分泌组损伤T细胞功能 研究者搭建Transwell隔离培养体系，借助物理分隔空间区分细胞直接接触与可溶性分泌物两种作用模式（图4A）。上室放置TP53 KD或WT AML细胞，下室置入T细胞、AMG 330与CD33阳性靶细胞，试验结果显示，上室为TP53 KD细胞时，下室T细胞的肿瘤裂解效率与增殖能力同步下降（图4B、图4C）。研究者收集前期共培养获得的肿瘤细胞条件培养基，单独添加至T细胞-靶细胞共孵育体系，仅TP53 KD来源的上清即可显著抑制T细胞杀伤活性（图4D）。 Olink高通量蛋白芯片针对培养上清开展广谱蛋白筛查，筛选出组间表达存在统计学差异的分泌蛋白，TGF-β1被锁定为TP53 KD组高表达的关键抑制分子（图4E、图4F）。胞内流式染色结果证实，无论基线培养或是和T细胞共培养之后，TP53 KD细胞胞内TGF-β1蛋白表达量更高（图4G）。流式微球阵列的上清定量结果再次验证，TP53 KD共培养体系的上清TGF-β1分泌浓度远高于WT组别（图4H）。 外源添加纯化TGF-β1至WT细胞共培养体系后，原本具备正常杀伤能力的T细胞出现功能衰减，完整复刻TP53 KD带来的耐药表型（图4I）。为反向验证TGF-β1的核心作用，研究者构建携带DNR的基因修饰T细胞，该类改造T细胞能够阻断胞内TGF-β下游信号传导。试验结果显示，DNR修饰可大幅逆转TP53 KD细胞带来的免疫抑制，T细胞增殖与肿瘤杀伤能力得到有效恢复（图4J、图4K）。多组正反验证试验共同确认，TP53 KD AML细胞依靠高分泌TGF-β1的可溶性分泌组实现T细胞功能抑制。 与TP53敲低白血病细胞共培养后，T细胞周期相关基因转录水平下调 为阐明TGF-β1造成T细胞功能受损的分子机制，研究者分别收集与TP53 KD、WT细胞共培养4天的T细胞样本开展Bulk RNA-seq。差异基因统计结果显示，和KD肿瘤细胞共培养后的T细胞出现87个基因上调、102个基因下调（图5A）。通路富集分析提示，E2F靶基因、G2M检查点、纺锤体合成等参与细胞周期正向调控的相关通路基因集中下调（图5C）。分层聚类热图中，绿色方框标注的周期相关基因在TP53 KD共培养来源的T细胞中整体表达受抑（图5B、附图S7）。 基于转录组分析获得的周期阻滞假说，研究者采用Ki-67联合7-AAD双染流式方案检测T细胞周期分布（图5D）。周期检测数据直观体现分组差异，和TP53 KD细胞共培养的T细胞大量停滞在静息G0衰老期，WT共培养环境下的T细胞大多停留于G1期并顺利进入分裂进程。转录组与流式周期检测结果相互佐证，TP53 KD AML细胞的分泌组能够通过抑制周期相关基因转录，诱导T细胞早衰、丧失增殖与细胞毒能力。 在NSG小鼠体内模型中，AMG 673对TP53敲低白血病细胞的裂解能力下降 研究者依托NSG免疫缺陷小鼠构建体内成瘤模型，整体动物试验流程遵照既定方案开展（图6A）。小鼠经尾静脉注射荧光标记MV4-11细胞完成造模，造模第7天回输健康人源T细胞，并按照分组规律每周注射AMG 673、cTCE或PBS。活体生物发光成像数据显示，AMG 673干预可显著抑制肿瘤进展，但同等药物剂量下，TP53 WT小鼠的肿瘤控制效果优于TP53 KD小鼠（图6B）。造模第19天的外周血标本检测结果与活体成像趋势保持一致，TP53 KD组小鼠外周血CD33⁺白血病细胞数量显著偏高（图6C）。 因cTCE处理的TP53 KD小鼠肿瘤负荷超标，全部试验动物统一在造模第23天终止试验并解剖取材。离体脏器定量结果显示，经过AMG 673治疗后，TP53 KD小鼠骨髓、脾脏、外周血内部的CD33⁺肿瘤细胞计数显著高于WT对照组（图6D–图6F）。体内动物试验从活体水平验证体外试验结论，TP53基因缺失能够削弱长效BiTE药物AMG 673介导的体内抗肿瘤免疫，诱导AML产生药物耐受。 讨论 BiTE、CAR-T等T细胞靶向免疫制剂已在B系血液恶性肿瘤中收获可观临床疗效，但同类药物的治疗优势无法平移至AML临床治疗场景。现有临床数据统一证实，无论高强度化疗、HMA联合维奈克拉或是HSCT，TP53-MUT AML患者的整体预后全面劣于WT患者，该临床现状凸显TP53基因状态在AML耐药发生进程中的关键地位。本研究借助AMG 330体外体系证实，TP53异常AML细胞可通过旁分泌作用抑制自体、异体来源T细胞的裂解、增殖与促炎因子分泌，该抑制现象同时存在于BiTE与CAR-T两类免疫药物体系中，和既往相关体外试验结论形成相互印证。 研究者通过多组对照试验，先后排除靶抗原CD33、细胞表面共刺激/抑制分子表达异常作为耐药诱因，也证实单纯由TP53缺失带来的肿瘤细胞糖代谢重塑，无法单独造成T细胞大范围功能损伤。现有一项围绕flotetuzumab的临床研究曾提出，TP53-MUT AML样本会出现中性粒细胞趋化相关基因上调，该结论与本研究TP53 KD细胞趋化因子基因普遍下调的试验结果存在差异，这种文献分歧进一步推动研究聚焦肿瘤分泌组的免疫抑制效应。经Transwell试验与蛋白组学筛选后，TGF-β1被确定为分泌组内核心效应分子，既往大量研究已明确TGF-β1具备多重免疫抑制作用，既可以重塑TME助力肿瘤免疫逃逸，也能直接抑制IL-2合成、阻滞初始T细胞分化增殖，本研究中TP53 KD组IL-2分泌显著下降的试验数据，恰好匹配TGF-β1的经典作用通路。 目前靶向TGF-β通路的干预策略分为两大研发方向，一类通过中和抗体、配体陷阱直接结合游离TGF-β1，另一类依靠受体基因修饰阻断T细胞内部信号传导，Fresolimumab、DNR修饰T细胞均是两类方向下已被临床前或早期临床数据证实有效的候选方案。本研究的DNR体外回补试验再次确认，阻断T细胞内TGF-β信号可以有效逆转TP53缺陷带来的免疫抑制。Bulk RNA-seq的T细胞转录数据进一步阐明机制，TP53 KD细胞释放的TGF-β1能够驱动T细胞转录组向衰老表型偏移，促使T细胞提前发生周期阻滞。该机制猜想还得到TCGA数据库临床样本分析数据的佐证，既往研究发现flotetuzumab干预后，TP53-MUT AML病例富集T细胞衰老相关特征基因。 综合全部试验数据，该研究明确一项全新AML固有耐药机制，TP53缺陷型AML依靠以TGF-β1为主导组分的抑制性分泌组，诱导T细胞周期停滞与细胞早衰，最终削弱T细胞衔接类免疫药物的临床作用效果。该耐药通路区别于既往报道的肿瘤细胞膜表面分子异常相关耐药模式。研究同样指出，后续还需要针对不同TP53热点突变亚型开展分层探究，而探明TP53缺失上调TGF-β1分泌的上游调控通路，能够为高危TP53突变AML的免疫联合新药研发提供精准靶点，助力提升该难治亚型肿瘤的免疫治疗有效率。 声明：尽管本公众号译者对本文进行了二轮审校，以尽力确保内容的准确和完整，但仍然可能存在翻译或理解的不当，请读者以原文为准。如有翻译不当处，您可在公众号对话框中发送反馈，译者会尽快校对并予以回复。尽管竭力避免，但论文翻译可能引入生成式AI的幻觉问题，指导临床实践的内容须以原文为准。 预打样（Proof）稿件内容说明：部分论文在推送发布时，期刊尚在校稿，所提供的原文为非正式版本。可能存在排版、表述等问题，需以正式版为准。如果在您阅读本文时正式版已发表（至少在本推送发布后3个月以后），您可以在评论区留言，编者将更换PDF源。 文献：Winter, L., Pawlowsky, L., Muth, A., Neumann, A. S., White, K., Kazerani, M., Nixdorf, D., Brauchle, B., Rohrbacher, L., Hänel, G., Petrera, A., Briem, E., Hoffmann, G. V., Janert, T., Carlini, E., Gottschlich, A., Spiekermann, K., Straub, T., Kischel, R., Kobold, S., … Subklewe, M. (2026). TP53 deficiency in AML induces resistance to T-cell engagers through an immunosuppressive secretome. Leukemia, 10.1038/s41375-026-02991-6. Advance online publication. https://doi.org/10.1038/s41375-026-02991-6 文献原文（直接点击右侧下载）：TP53 deficiency in AML induces resistance to T-cell engagers through an immunosuppressive secretome.pdf