mRNA-1010

摘要：mRNA疫苗因其高效力、安全性和有效性、快速临床开发能力以及快速、低成本制造潜力，已被证明是传统疫苗的强大替代品。这些疫苗已从单纯的好奇之物发展成为COVID-19大流行疫苗的领跑者。在纳米技术领域为mRNA疫苗开发传递工具的进步具有极高的重要性。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的方方面面。文章描述了mRNA结构、其诱导免疫的药理功能、脂质纳米颗粒（LNPs）、以及mRNA疫苗制造的上游、下游和配方过程。此外，还描述了正在进行临床试验的mRNA疫苗。对未来mRNA疫苗的深入探讨，如其冻干、传递系统、以及LNPs靶向抗原呈递细胞和树突细胞，也进行了总结。 1.引言 疫苗接种是预防传染病传播的最有效手段。疫苗对医疗保健系统经济可行性的影响极大，因为它降低了传染病的治疗成本。此外，疫苗还有助于减少疫情的影响和风险。在COVID-19大流行期间，疫苗在公共卫生和安全以及对经济的延伸效应得到了重申和体现。成功的疫苗接种运动已经根除了天花和脊髓灰质炎等致命传染病，并试图应对COVID-19。世界卫生组织估计，疫苗每年可预防因百日咳、破伤风、流感和麻疹引起的2-3百万人死亡。疫苗已经从利用灭活和减毒病原体发展到包含病原体组分的亚单位，以触发免疫反应。疫苗研究的重要里程碑包括重组病毒载体疫苗、类病毒颗粒疫苗、结合多糖或基于蛋白质的疫苗和类毒素疫苗的开发。然而，最重要的一个里程碑是mRNA疫苗的开发，因为它在COVID-19大流行中的快速开发和批准，以及其mRNA技术在细胞内产生所需的疫苗抗原。 我们目前正处于mRNA疫苗接种时代，因为基础研究早在三十年前就已经奠定。尽管1990年代早期在动物模型中产生有效的体外转录（IVT）mRNA疫苗的表位呈递是有效的，但mRNA疫苗和治疗药物并未得到发展，因为直到19世纪末才得到验证。在过去的十年中，通过（i）引入加帽、尾随、点突变和有效的纯化技术提高其稳定性，（ii）引入脂质纳米颗粒改善mRNA传递，以及（iii）引入修饰核苷酸减少其免疫原性，从而提高整体mRNA质量的关键技术创新和广泛研究，使其作为疫苗得到广泛使用。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有几个重要优势，包括活体和减毒病原体、基于亚单位和基于DNA的疫苗。这些包括（i）安全性，因为mRNA不与宿主DNA整合且不具有传染性；（ii）有效性，因为mRNA结构的修改可以使疫苗更稳定、有效，并减少免疫原性；以及（iii）制造和扩大规模的效率，因为mRNA疫苗在无细胞环境中生产，因此允许快速、可扩展和成本效益高的生产。例如，一个5升的生物反应器可以在单次反应中生产一百万剂mRNA疫苗。此外，mRNA疫苗还可以编码多个抗原，从而加强对一些顽固病原体的免疫反应。 当辉瑞-BioNTech为COVID-19大流行开发并批准mRNA疫苗时，这种疫苗技术的有效性得到了实现。这些疫苗在世界被SARS-CoV-2病毒感染、导致住院和死亡后不到一年的时间里开发出来，创下了记录。Spikevax®（Moderna）和Comirnaty®（辉瑞-BioNTech）的前所未有的开发和对数百万人的广泛接种帮助控制了COVID-19疫情。 这些疫苗的制造商展示的开发、批准和制造能力验证了mRNA平台作为一种安全有效的疫苗接种工具。此外，这也激发了科学界对mRNA作为预防性疫苗工具的极大兴趣。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的基础知识，包括其mRNA结构及其药理效应，mRNA结构的修改，并解释了mRNA疫苗如何在宿主中引发所需的免疫反应。综述还解释了脂质系统的重要性，如脂质纳米颗粒对mRNA疫苗传递的重要性。文章深入探讨了脂质纳米颗粒的结构组成部分和功能。第二代mRNA疫苗的最新发展和当前的临床试验也在本文中详细描述。 2.mRNA疫苗的药理学 2.1.mRNA结构 mRNA分子通过细胞质中的核糖体将DNA遗传序列有效地翻译成所需的蛋白质。非复制型mRNA和自扩增RNA是作为潜在疫苗候选抗原正在研究的两种主要类型的mRNA。传统的非复制型mRNA疫苗编码所需的抗原，用于免疫反应，包含50和30非翻译区（UTRs）和开放阅读框（ORF），也称为编码区和聚（A）尾。自扩增mRNA包含所有这些组分，在其ORF中还包含一个额外的编码区，编码病毒复制机制，这使得细胞内RNA持续扩增，随后抗原表达增强。体外转录（IVT）是一种反应，其中包含感兴趣基因的线性化DNA质粒被转录成mRNA序列。 2.2.5'端帽 mRNA的5'端含有一个7-甲基鸟嘌呤（m7G）基团，紧随其后的是第一个核苷酸的三磷酸基团（m7GpppN）。m7GpppN被称为5'端帽，它是一种保护性结构，可以保护RNA不被外切酶切割，调节前mRNA剪接，并启动mRNA的翻译以及从细胞核到细胞质的mRNA输出。5'端帽对于先天免疫系统识别非自身mRNA或外源性mRNA与自身mRNA或内源性mRNA也至关重要。通过引入许多转录后修饰，可以修改mRNA以提高其效力和稳定性。这些包括在第一个核苷酸（Cap 1, m7GpppN1m）和第二个核苷酸e（Cap 2, m7GpppN1mN2m）的20位的2'-O-甲基化。这些5'端帽结构的修饰不仅增加了mRNA的翻译效率，还阻止了内质网和细胞质受体的激活，包括RIG-I和MDA5，它们是防御病毒mRNA的防御机制。因此，5'端帽结构的2'-O-甲基化是提高和增强转录后mRNA蛋白产量的非常理想的属性，并阻止宿主免疫系统对外源性IVT mRNA的任何不良免疫反应。这个5'端帽可以通过向IVT mRNA反应中添加S-腺苷甲硫氨酸和Cap 0结构来实现，这会产生带有Cap 1结构和S-腺苷-L-同型半胱氨酸的IVT mRNA。Cap 1指的是m7GpppNm，其中Nm代表任何带有2'O甲基化的核苷酸。三核苷酸帽类似物也可以用来在共转录反应中制作Cap 1类似物。Ishikawa等人使用m7GpppAG类似物来加帽IVT mRNA。这些类似物在IVT反应中允许mRNA在5'端带有m7G基团，而没有反向加帽的5'端mRNA产品。使用A、Am、m6A或m6Am等核苷酸进行的进一步修饰，可以进一步改进IVT mRNA的特异性。特别是，m7Gpppm6AmG帽在体外转染实验中实现了最大的荧光素酶表达。Sikorski等人比较了改变第一个转录核苷酸如A、m6A、G、C和U以及是否带有2'-O-甲基化在mRNA IVT反应中的效果。他们观察到，携带A、Am或m6Am作为第一个核苷酸的脂质体介导的mRNA导致了更高的荧光素酶表达，而携带G或Gm的IVT mRNA导致了更低的荧光素酶表达。重要的是，在树突状细胞（DC）线JAWSII中，m6A和m6Am 5'端帽的mRNA翻译导致了8倍的差异。这些发现证明了5'端帽结构对于有效靶向DCs和产生期望的免疫反应的重要性。 2.3.5'和3'非翻译区（UTRs） 尽管UTRs不会被翻译成所需的抗原或蛋白质，但它们参与调节mRNA表达。这些区域位于ORF和5'和3'端之间，在mRNA的上游和下游。这些UTRs包含与mRNA稳定性相关的调控序列，以及mRNA的有效和正确翻译。它们还帮助核糖体识别mRNA，并帮助mRNA的转录后修饰。通过在UTRs中包含顺式调控序列，可以改善mRNA的翻译及其半衰期。此外，包括自然发生的序列，如来自α-和β-球蛋白的序列，已被广泛用于设计mRNA疫苗构建。Zeng等人基于鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量及其（GC）长度设计了新的5'UTR序列，用于mRNA疫苗的开发。 2.4.聚（A）尾 体外转录（IVT）mRNA在其3'端有一个聚腺苷酸部分，被称为聚（A）尾。这个聚腺苷酸尾对于确定mRNA的寿命至关重要。哺乳动物细胞中自然发生的mRNA分子的聚（A）尾长度大约为250个核苷酸（nt），随着mRNA在细胞质中的寿命逐渐缩短。由于尾大小影响mRNA的降解，因此在生产具有更长半衰期的mRNA疫苗和治疗剂中加入聚（A）尾是可取的。向聚（A）尾添加大约100个nt可以产生具有期望延长降解的mRNA。2.5.修饰核苷酸 天然 mRNA 及其他 RNA 分子包含 ATP、CTP、GTP 和 UTP 作为四种基本核苷酸。在 mRNA 分子的转录后修饰过程中，部分核苷酸会发生修饰，如伪尿苷和 5-甲基胞嘧啶。这些修饰核苷酸可以用于 mRNA 的体外转录 (IVT) [21]。尽管未修饰 mRNA 有其自身的优势 ，修饰核苷酸在避免 IVT mRNA 被先天免疫系统识别、从而避免任何不良免疫反应、提高 mRNA 翻译效率至所需抗原方面是有益的 。Andries 等人证明，含有 N(1)-甲基-伪尿苷 (m1) 修饰的 mRNA 在转染到细胞系或小鼠中时，与伪尿苷 (Y) 修饰的 mRNA 平台相比，分别提供了大约 44 倍和 13 倍更高的报告基因表达。作者还证明，(m5C/) m1-修饰的 mRNA 在体外转染时减少了细胞内先天免疫原性。这种修饰导致控制性激活 toll 样受体 3 (TLR3) 并启动下游先天免疫信号传导，这是 mRNA 疫苗的一个理想特性 。图 1 描述了 mRNA 分子的结构组成部分。 图1. mRNA分子结构组成。 2.6.mRNA疫苗对先天和适应性免疫的刺激 包含病原体特异性免疫原（编码病毒蛋白）和佐剂的疫苗可以帮助刺激适应性免疫反应。佐剂旨在刺激先天免疫反应并提供T细胞激活的信号，一个理想的佐剂应在不引起任何系统性炎症的情况下刺激先天免疫反应，因为系统性炎症可能会引起严重的副作用。对于mRNA疫苗而言，mRNA分子本身既作为免疫原也作为佐剂，这是由于mRNA固有的免疫刺激性特性。一旦肌肉内注射mRNA疫苗，就会通过以下途径潜在地激活适应性免疫系统：(i) 肌肉细胞和表皮细胞的转染，(ii) 注射部位的组织驻留免疫细胞如树突状细胞（DC）、巨噬细胞和朗格汉斯细胞的转染，从而启动T细胞和B细胞的启动，以及(iii) 次级淋巴组织如淋巴结（LNs）和脾脏的运输。图2描述了肌肉内注射的mRNA-LNP疫苗的作用模式。宿主细胞通过各种内质网和细胞质固有受体识别单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA），这些受体构成了人类对外源性病毒的先天免疫反应的关键部分。Toll样受体（TLR3和TLR7）在内质网中与外源性ssRNA结合，炎症信号受体包括RIG-I、MDA5、NOD2和PKR在细胞质中与ssRNA和dsRNA结合。这导致细胞激活，并产生I型干扰素和其他多种炎症介质。I型干扰素对细胞翻译有抑制作用，这可能会抑制mRNA疫苗产生的抗原量。目前可用的mRNA疫苗包含纯化的IVT mRNA，其性质为单链，并含有修饰核苷酸。这有助于减少与TLR3和TLR7以及免疫传感器的结合，因此限制了I型干扰素的过度产生及其对mRNA细胞翻译的抑制作用。mRNA疫苗转染组织驻留免疫细胞，包括APCs，如DCs和巨噬细胞。 图2. mRNA脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）的肌肉内注射部位及其作用模式。mRNA-LNP疫苗可以转染肌肉细胞以及转染注射部位附近的组织驻留抗原呈递细胞（APCs）。此外，mRNA-LNP疫苗可以流入淋巴结（LNs）并转染驻留于淋巴结的细胞，从而激活T细胞和B细胞。 mRNA疫苗通过转染非免疫细胞产生所需的抗原。然后该抗原在细胞质中的蛋白酶体中被降解，暴露出抗原表位，这些表位与主要组织相容性复合体（MHC）I类形成复合体，呈现给表达CD8+的细胞毒性T细胞。这有助于建立对mRNA表达的抗原的细胞免疫。mRNA疫苗转染肌细胞可以激活骨髓源性DCs，这有助于CD8+ T细胞的启动。mRNA疫苗还通过转染包括DCs和巨噬细胞在内的组织驻留免疫细胞发挥作用。这在注射部位触发局部免疫反应。免疫细胞的mRNA转染可以通过MHC I类途径呈现抗原，导致CD8+ T细胞的成熟。此外，APCs的激活也可以导致MHC II类途径的呈现，导致表达CD4的T辅助细胞的激活。转染局部免疫和非免疫细胞后，一部分注射的mRNA疫苗通过淋巴系统排入淋巴结。淋巴结包含单核细胞和原始T细胞和B细胞。淋巴结APCs的转染可以启动T细胞和B细胞的启动和激活。图3描述了mRNA-LNP疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。 图3. mRNA-LNP疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。(1)体外转录的mRNA被包裹进脂质纳米颗粒（LNP）中。(2)利用LNP表面的特殊脂质，将mRNA-LNP疫苗分子转染进宿主细胞。(3)mRNA-LNP的内吞作用。(4)内吞介导的内化后，mRNA从内涵体逃逸到细胞质中。(5)宿主细胞的核糖体将mRNA翻译成所需的抗原蛋白，这一过程发生在细胞内。(6)抗原蛋白在细胞外释放，或者被蛋白酶体降解，暴露出抗原位点。(7)主要组织相容性复合体I（MHC I）将MHC I表位呈现到细胞膜上进行抗原呈递（APC）。MHC I将表位呈递给CD8+ T细胞。(9)先前释放的外源蛋白可以被降解并通过MHC II表位呈递。细胞外抗原可以被B细胞识别，导致B细胞成熟。 3.mRNA疫苗的药物递送技术 本节可以按小标题划分。它应提供简洁、精确的实验结果描述、它们的解释以及可以得出的实验结论。mRNA疫苗分子体积大（104-106 Da），带负电荷。它们无法通过细胞膜的脂质双层。裸露的mRNA会被血液中的核酸酶破坏和降解。此外，裸露的mRNA也会被组织和血清中的免疫细胞附着和吞噬。将mRNA分子送入细胞的方法包括基因枪、电穿孔和体外转染技术。体内递送mRNA的方法涉及使用脂质或转染剂转染免疫或非免疫细胞。 3.1.脂质纳米颗粒（LNPs） 尽管裸露的mRNA、脂质体和多聚体在人类中显示出临床效果，但LNPs是唯一证明临床效果并获准用于人类的mRNA疫苗药物递送系统。由Moderna和Pfizer/BioNTech开发的针对SARS-CoV-2的COVID-19 mRNA疫苗使用LNPs将mRNA有效载荷送入体内。LNPs目前是非病毒递送载体中用于基因治疗的最前沿。LNPs的临床效果首次得到证明是在LNP-siRNA治疗药物Onpattro®（patisiran）获得美国FDA批准用于遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性。LNP配方是最成功、有效和安全的mRNA疫苗递送方法，用于人类免疫接种。LNPs为mRNA递送到作用部位提供了许多优势，包括配方和规模化生产的便利性、高效的转染能力、低毒性概况、模块化、与不同类型和大小的核酸的兼容性、保护mRNA免受内部降解以及增加mRNA疫苗的半衰期。LNPs通常由四个组分构成：可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。这些脂质包裹mRNA疫苗的有效载荷，并保护核酸核心免受降解。 3.2.阳离子和可电离脂质 阳离子脂质是第一代开发并用于mRNA疫苗递送的脂质。这些脂质含有一个季铵氮原子，赋予它们永久的正电荷。这些脂质的正电荷使它们能够与带负电的mRNA疫苗形成离子相互作用，形成一个名为脂质复合物的脂质复合体。DOTMA及其合成类似物DOTAP是1989年首次用于递送mRNA疫苗的阳离子脂质。包括DOTMA、DOPE和DOGS在内的阳离子脂质自那时以来已被广泛用于mRNA递送，包括商业上可用且成功的Lipofectin。Lipofectin是DOPE和DOTMA的混合物，是最早的LNP配方之一，在体内mRNA转化中证明是成功的。早期的阳离子脂质在体外基因递送方面显示出了希望，但它们在体内效果不佳。早期阳离子脂质的氮头基团的正电荷和不可生物降解性是它们在体外递送和效果不佳的原因。可电离脂质，也称为pH依赖性离子脂质，是第二代阳离子脂质，含有一个伯胺，赋予它们在生理pH或低于生理pH时的正电荷。这些脂质在生理pH的血液中具有中性电荷的特性有助于提高它们的安全性，与第一代阳离子脂质相比。它们还延长了LNPs的循环时间，与由阳离子脂质衍生的LNPs相比。这些是为了克服第一代阳离子脂质的不足和安全性问题，如免疫激活和与血清蛋白的相互作用而开发的。DLin-MC3-DMA是第一个美国FDA批准的离子脂质，用于第一个siRNA药物Onpattro®。DLin-MC3-DMA离子脂质是在对第一个离子脂质DODMA进行一系列修改后合成的。DLinDMA是通过替换DODMA的油酸尾部形成的。与DODMA相比，DLinDMA在体内对呼吸道合胞病毒（RSV）的保护免疫方面表现出优越的能力。DLinDMA进一步优化为DLinKC2-DMA，再进一步为DLin-MC3-DMA，这取决于一系列基于结构-活性关系的研究。DLin-MC3-DMA被认为是第一代可电离脂质。 DLin-MC3-DMA或MC3具有长达72小时的血浆半衰期，增加了siRNA的作用持续时间。后来发现MC3可电离脂质在递送mRNA和siRNA方面都有效。MC3唯一的缺点是其长半衰期（72小时）。这限制了使用MC3的疫苗的长期给药。因此，下一代可电离脂质采用了可生物降解的官能团，这有助于快速清除。引入酯基团有助于增加MC3的生物降解性并增加其系统清除率。酯基团易于安装在脂质中，可生物降解且化学稳定，可被细胞内酯酶轻易裂解。MC3作为开发可生物降解酯基可电离脂质的重要前体和起点。这些包括Moderna的专有脂质、Acuitas的专有脂质等，包括YSK12-C4、CL4H6和L319脂质，被认为是第二代可电离脂质。基于酯的可生物降解可电离脂质在基因递送方面显示出比MC3可电离脂质更高的效力。Moderna的脂质5被发现效力是MC3脂质的三倍，而Acuitas的脂质ACL-0315（用于辉瑞/BioNTech COVID-19疫苗的脂质）在向动物递送荧光素酶mRNA方面的效力是MC3脂质的六倍US10166298B2。 第三代可电离脂质以优化的方式合成，化学合成步骤有限，这增加了可电离脂质的高通量生产。98N12-5是第三代可电离脂质的第一个例子。对98N12-5脂质的修改和改进导致了包括C12-200和C14-113在内的优越类似物的发明。C14-113脂质特别针对心肌，因此可以开辟新的视野，以优化和针对基因疗法以增强心脏功能。Li等人报道TT3是一种有效的脂质，用于递送编码CRISPR/Cas9、因子IX和SARS-CoV-2的各种mRNA分子。除了寻找增强效力外，提高基因递送到特定目标细胞或器官的特异性的兴趣也在进行中。针对疫苗和免疫疗法的免疫细胞以及初级和次级淋巴器官的靶向递送正在迅速进行。一些靶向剂的例子包括含有多环尾部的脂质，包括11-A-M，以及含有环状咪唑头基团的脂质，如93-O17S，专门设计用于靶向T细胞。此外，脂质A18-Iso5-2DC18中的环状胺头基团已被证明可以结合到干扰素基因刺激因子（STING）蛋白。这导致树突状细胞成熟，并通过免疫刺激具有抗肿瘤效果。这对于使用基因疗法的癌症免疫疗法可能是一个有用且理想的特征。利用第三代可电离脂质的基因疗法也显示出对多药耐药细菌感染的希望。环状维生素C衍生的可电离脂质递送抗菌肽和组织蛋白酶B mRNA到巨噬细胞，证明该疗法可以消除多药耐药细菌并保护小鼠免受细菌诱导的败血症。LNPs是最先进的且临床上批准的mRNA递送载体。 3.3.PEG-脂质 在成分中，聚乙二醇（PEG）是一种亲水材料，以其在化妆品、食品和制药行业的广泛应用而闻名。LNPs中的聚乙二醇化脂质组分通常与锚定脂质相连。发现PEG是LNPs配方中的基本化学物质，可以减轻过滤器官对纳米颗粒的摄取，同时改善LNPs在生物流体中的胶体稳定性。因此，LNPs的循环半衰期和体内分布得到增强。通常，PEG脂质在LNPs的脂质成分中占最小摩尔百分比（大约1.5%）。然而，它们在影响关键参数方面发挥着非常关键的作用，如粒径、多分散性指数、聚集减少、颗粒稳定性改善和封装效率。PEG的分子量和锚定脂质的碳链长度可以用来微调循环时间和免疫细胞的摄取，改变效率。此外，LNPs上的PEG-脂质涂层作为立体亲水屏障，防止存储过程中的自组装和聚集。因此，PEG的存在有助于稳定LNP并限制脂质融合来调节大小。PEG的数量与LNP的大小成反比；PEG含量越高，LNP的尺寸越小。通常，PEG的分子量范围在350到3000 Da之间，锚定脂质的碳链在13到18碳之间。许多文献报告指出，PEG的分子量越高和脂质链越长，纳米颗粒的循环时间就越长，免疫细胞的摄取也越少。随着PEG-脂质从LNP表面解离，它减少了LNP的循环时间，并提供了更多的机会将mRNA货物送入目标细胞，这被称为“PEG-困境”。在某些情况下，当PEG-脂质的摩尔百分比保持在1.5%时，体内转染水平被发现与脂质的碳链长度无关。PEG脂质的额外优势在于它们能够将特定配体结合到LNP上，从而有助于靶向药物递送。 3.4.辅助脂质 辅助脂质在LNPs配方中的主要功能在于支持其在储存和体内循环过程中的稳定性。从化学角度来看，这些是甘油酯，并且是非阳离子性的。在各种辅助脂质中，甾醇和磷脂是最广泛使用的。胆固醇是细胞膜中存在的天然成分。它是一个可交换的基团，可以很容易地在LNP中积累。从一系列不同的研究表明，胆固醇可能存在于表面、脂质双层内部，甚至与核心中的离子化脂质共轭。它通常被纳入LNP配方中，通过填补脂质之间的空隙来维持稳定性。需要胆固醇来调节LNP内部脂质双层基质的密度、摄取和流动性。因此，它控制了膜的刚性和完整性，从而通过“凝聚效应”防止任何泄漏。胆固醇的疏水尾部、甾体环的灵活性以及羟基的极性被报道影响LNP递送的效力。胆固醇还有助于通过减少表面结合蛋白来提高LNPs的循环半衰期。此外，它还有助于在LNPs被细胞摄取时与内质网膜融合。它在降低从层状相转变为六角相所需的温度中发挥着至关重要的作用；因此，来自LNP的mRNA货物将被递送到细胞质中。磷脂在LNP配方中的包含可以帮助提高封装效率（与胆固醇一起）并增加细胞递送。通常，LNP中的磷脂数量大大减少，同时增加胆固醇含量以延长循环时间。此外，磷脂的包含促进了LNP的包封效率和转染效力。有报道称，增加磷脂的摩尔百分比有助于加快LNPs递送效力。这些以Zwitter离子形式存在的磷脂被报道在LNP的组装中发挥关键作用，通过稳定阳离子脂质、mRNA货物和周围水分子之间的静电相互作用。然而，磷脂在通过LNP递送mRNA中的实际作用仍然不明确。因此，进一步探索磷脂在增强颗粒稳定性和体内递送中的实际作用仍然引人入胜。图4描述了LNPs的组成部分，包括可离子化脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。 图4. 脂质纳米粒的组成部分包括可离子化脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。 3.5.影响mRNA-LNPs的物理化学性质 LNPs具有许多独特的特性，其中大多数是有益的；讽刺的是，一些特性赋予了一些不希望的毒性。因此，非常关键的是要了解影响载mRNA的LNP的物理化学性质。大小和表面积：大小和表面积决定了LNP与生物系统的相互作用过程，以及分布、消除、内化、降解和反应。减小尺寸对应于表面积的增加，从而使其对周围生物环境更具反应性。包括内吞作用和细胞摄取在内的基本生物活动主要依赖于颗粒大小。任何大小依赖的毒性都基于LNPs进入生物系统并修改大分子的能力，从而改变基本的生物功能。在疫苗的情况下，报告了高效率的递送，同时保持约50纳米的颗粒大小，无论其化学组成如何。 电荷：电荷在决定LNPs的生物分布和效力命运中起着主要作用。载体的电荷对于将mRNA疫苗穿过生物膜运输至关重要。因此，带负电的mRNA可以与带正电的阳离子脂质发展出静电相互作用，从而实现高效封装。最终，阳离子脂质体与带负电的细胞表面和内质网膜相互作用以释放mRNA货物。阳离子脂质的pKa（获得正电荷的能力）对递送mRNA货物有显著影响；显然，理解其作用非常重要。尽管如此，围绕基因递送所需的实际pKa仍存在一些不确定性。一些报告指出，通过静脉注射（IV）途径递送LNPs的理想pKa范围在6.2到6.6之间。电荷调节已被有效地研究用于减轻毒性表现，同时改善LNPs中mRNA的递送。 形状和结构：形状和内部结构是直接影响细胞摄取和与生物环境相互作用的关键参数。一些报告提到，与其他形状相比，球形纳米粒的内吞作用相对更容易。或者，非球形纳米粒更倾向于通过毛细血管流动。迄今为止，关于形状和结构的作用机制及其在体内的作用仍然不清楚。由于涉及许多技术挑战，源自形状和结构的实际作用机制仍然广泛未被探索。因此，研究需要加快对它们在变形膜和治疗效果中的活动的理解。 表面组成：LNPs的高效递送和生物分布可能受到递送载体表面组成的影响。众所周知的例子包括通过PEG化将PEG-脂质并入LNPs表面。这种PEG化过程已知可以改变纳米载体的运输轨迹并延长循环半衰期。尽管如此，除了改善生物分布和循环外，PEG化还可能导致LNPs的摄取因空间位阻减少，限制与血浆膜的相互作用。因此，PEG-脂质会从血清中脱离，减少空间位阻，有利于内质网的摄取。 4.mRNA疫苗制造 与传统疫苗相比，mRNA疫苗显示出几个优势，包括它们开发的便捷性、易于扩大规模和快速制造。与其他疫苗类似，mRNA疫苗药物产品在制造过程中经历三个典型步骤：上游生产、下游纯化和最终mRNA药物物质的配方。本节将讨论这些步骤以及每个过程中的较新发展，以简化mRNA疫苗生产。 4.1.上游生产 mRNA疫苗的上游生产包括从含有感兴趣基因的质粒生成mRNA转录本。这个反应称为体外转录反应（IVT）。IVT酶促反应依赖于T7、SP6或T3等RNA聚合酶。RNA聚合酶催化目标mRNA从含有感兴趣基因的线性DNA模板合成。线性DNA模板是通过限制性内切酶酶切含有感兴趣基因的质粒产生的，或者通过PCR扩增感兴趣基因也可以产生mRNA分子。IVT反应的基本酶包括：(i) RNA聚合酶—将DNA转换为RNA，(ii)无机焦磷酸酶（IPP）—增加IVT反应产量，(iii)鸟苷酸转移酶—向mRNA的5'端添加GMP核苷，(iv)Cap 20-O-甲基转移酶（SAM）—这种酶在mRNA的5'帽的20位添加甲基，(v) DNase I—用于从RNA样本中去除污染的基因组DNA和降解IVT反应中的DNA模板的内切酶，以及(vi)聚(A)尾聚合酶和(vii)修饰和未修饰的核苷三磷酸（NTPs）。这些酶促进了含有感兴趣基因的质粒的mRNA转录本的上游开发。加帽酶包括SAM和鸟苷酸转移酶，它们在mRNA的5'端酶促形成5'帽，而聚(A)尾聚合酶尾酶形成聚(A)尾。另一种5'加帽方法是共转录法，其中5'帽事先准备好，然后以非酶促方式添加到mRNA上。这种共转录反应可以使用CleanCap®试剂AG进行。 4.2.下游纯化 mRNA通过上游生产阶段的IVT反应产生；然后通过下游加工的多个纯化步骤进行分离和纯化。IVT反应混合物包含几种杂质，包括残留的NTPs、酶、错误形成的mRNA和DNA质粒模板。基于DNA去除的IVT mRNA实验室规模纯化方法包括DNase酶消化后用氯化锂（LiCl）沉淀。基于实验室的方法不允许完全去除异常mRNA物种，包括dsRNA和截断的RNA片段。去除这些杂质至关重要，以获得纯mRNA产品，该产品展示了其预期的效力和安全概况。低效的纯化技术可能导致mRNA疫苗产品的翻译效率降低和不必要的免疫刺激性概况。例如，当修饰的mRNA在传递给树突状细胞之前通过反相HPLC纯化时，观察到mRNA转染和相关蛋白产量增加了10-1000倍。 色谱法是生物制药工业中广泛接受的常用纯化过程，用于疫苗和生物药物产品的纯化。2004年首次发表的用于大规模核酸纯化的RNA寡核苷酸的程序使用了尺寸排除色谱法（SEC）。SEC有几个优点，包括选择性、可扩展性、多功能性、成本效益和实现高纯度和产量的核酸产品。然而，SEC不能去除具有相同大小的杂质，如dsDNA。与SEC相比，离子对反相色谱法（IEC）已被证明是mRNA疫苗的极好纯化技术。IEC可以轻松分离目标mRNA和IVT反应杂质。这种分离方法依赖于目标mRNA和杂质之间的电荷差异。IEC有几个优点，包括从目标mRNA中分离出更长的RNA转录本，更高的结合能力，成本效益和可扩展性。由于IEC是在变性条件下进行的，该过程变得复杂且温度敏感。 基于亲和的色谱分离是另一种mRNA纯化方法。脱氧胸腺嘧啶（dT）-寡dT是一个捕获mRNA聚（A）尾的序列。含有Oligo dT的色谱珠可以用于下游纯化mRNA疫苗。切向流过滤（TFF）或核心珠过滤可用于去除小尺寸杂质。作为mRNA疫苗的最终抛光步骤，与连接性相互作用介质单体（CIM）柱连接的疏水相互作用色谱（HIC），含有OH或SO3配体，可以极为有益。 4.3.配方mRNA分子带有负电荷，应配制在基于脂质的药物递送系统中，以避免mRNA降解并提高其转染效率和半衰期。LNPs是美国FDA批准的用于递送mRNA疫苗药物物质的最可靠、最可靠的基于脂质的非病毒载体系统。通过在有机相中沉淀溶解的脂质并与水相中的mRNA混合形成mRNA LNPs。有机相中最常用的脂质是可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和PEG脂质。同时，mRNA溶解在柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液中，pH值为4。混合水相和非水相质子化可电离脂质，导致可电离质子化的脂质与阴离子mRNA之间发生静电吸引。这种相互作用同时与其他脂质的疏水相互作用耦合，驱动mRNA-LNPs自发自组装，将mRNA包裹在纳米颗粒的核心内。这个过程也称为微沉淀。LNP形成后，它们被透析以去除非水溶剂，通常是乙醇，并提高溶液pH至生理pH。微流体混合器可以形成小尺寸LNPs，具有低多分散指数和高mRNA包裹效率。微流体混合是实验室规模和GMP水平mRNA LNP配方中最常用的方法。Precision NanoSystems的NanoAssemblr®平台已广泛用于LNP配方开发和在受控环境下的GMP生产。该系统使用错开的鲱鱼骨微混合器（SHM）墨盒结构。SHMs的结构使得两种水相和非水溶剂在微秒内混合。这个时间尺度比脂质聚集所需的时间要小得多；因此，SHMs产生均匀尺寸的小纳米颗粒。NanoAssemblr®设置可以简单调整，以改变水相和非水相的流速和体积，获得所需尺寸和尺寸分布的LNPs。通常使用12-14 mL/min的总流速和3:1的流速体积比，非水相：水相，以产生小的单分散LNPs。尽管SHMs在高效生产LNPs方面具有几个优点，但由于溶剂不兼容性，它们在GMP制造中的实用性受到限制。SHM及其内部部件长期暴露于含有聚二甲基硅氧烷的乙醇可能导致其变形。在连续的GMP生产运行中更换墨盒变得困难。因此，T-混合器用于LNP的放大和制造。它们可以生产与SHM相似的LNPs，可以处理更高的流速和体积（60-80 mL/min），并且与乙醇等有机溶剂兼容。图5解释了mRNA疫苗制造的过程。 图5. mRNA疫苗制造过程的步骤和阶段。mRNA疫苗生产可以分为三个阶段：上游mRNA制造、下游mRNA纯化和mRNA脂质纳米颗粒的配方。mRNA生产可以在一步共转录反应中进行，其中使用加帽试剂，或者在两步反应中进行，其中进行酶促加帽。小规模实验室规模的mRNA纯化过程包括DNase I消化酶，然后是mRNA的LiCl沉淀。大规模的mRNA纯化涉及利用成熟的色谱方法结合切向流过滤（TFF）。最后，mRNA疫苗的配方包括将mRNA水溶液与非水相中的脂质溶液混合。这导致脂质纳米颗粒（LNPs）的自组装，并在LNPs的核心内包裹带负电的mRNA。mRNA与脂质分子在错开的鲱鱼骨微混合器（SHM）中的混合发生在多个周期，这导致最终mRNA-LNP疫苗的形成。 5.mRNA疫苗在临床试验中 任何疫苗候选物在成功的临床前研究之后以及在市场推出之前的关键步骤是临床开发。任何mRNA疫苗的临床开发包括一系列临床试验，以评估其在人类中的安全性、免疫原性和效力。根据患者人群和试验目标，它们被分类为1期、2期、3期和4期。1期研究在一小群人类中进行（理想情况下是一个中心），主要用于确定疫苗的安全性和药代动力学。2期研究是概念验证研究，主要旨在确认1期研究中获得的结果，并在稍多的人类中评估效力。3期研究是确认性研究，多个中心和广泛的人类人群中进行，以确认疫苗候选物的效力和安全性。这些研究通常与活性对照或安慰剂一起进行。4期研究在疫苗候选物获得市场批准后进行，主要旨在确认疫苗的安全性。每个疫苗候选物在商业推出之前应经过所有临床研究的关键临床评估。疫苗的开发需要几年时间才能完成。然而，由于COVID-19大流行，Comirnaty（辉瑞）和Spikevax（Moderna）在不到一年内获得了紧急使用授权（EUA）。目前，有多种mRNA疫苗正在进行临床试验，旨在针对传染病（COVID-19、流感、寨卡病毒、尼帕病毒、呼吸道合胞病毒等）、遗传性疾病和癌症，因为mRNA疫苗能够平衡适应性和先天免疫反应。这些疫苗大多数是基于脂质体的，并且处于1期和2期临床试验中。此外，约60-70%的正在进行的临床研究是使用基于mRNA的COVID-19疫苗进行的。因此，我们在下面的表1中总结了所有正在进行的基于mRNA的疫苗的临床试验（不包括COVID-19疫苗）。如前所述，大多数mRNA疫苗处于临床试验的早期阶段（1期或2期），只有少数基于mRNA的疫苗处于3期开发阶段。下面的部分提供了有关当前处于3期阶段的疫苗的详细信息。 5.1.mRNA-1345 mRNA-1345是Moderna公司针对呼吸道合胞病毒（RSV）感染开发的疫苗候选物，它编码一种称为预融合F糖蛋白的RSV蛋白，从而引发有效的中和抗体反应。这种蛋白负责病毒的进入和细胞间传播，对RSV感染的传播至关重要。这种疫苗是一种基于脂质纳米颗粒的疫苗，包含优化的蛋白质和密码子序列。美国FDA最近为60岁以上的成人授予了mRNA-1345的快速通道审查指定。在mRNA-1345之前为RSV感染开发的几种疫苗在临床试验中失败，原因是免疫反应低。最近，Moderna报告了正在进行的1期研究的中期结果，评估儿童、年轻人、老年人和育龄妇女中mRNA-1345的耐受性、反应原性和免疫原性。结果显示，截至数据截止日期，疫苗在试验的所有剂量水平上都得到了良好的耐受。该研究预计将在2023年完成。正在进行的mRNA-1345疫苗2/3期研究（NCT05127434）在60岁及以上的成人中进行，以评估mRNA-1345疫苗的安全性和耐受性，并证明与安慰剂相比，单剂量mRNA-1345疫苗在预防首次RSV相关下呼吸道感染（RSV-LRTD）方面的效力，从注射后14天至12个月。该研究计划在两个安慰剂对照阶段进行，即2期在400至2000名参与者中进行，3期在超过30000名参与者中进行。研究的主要目标是评估疫苗的安全性和效力。安全终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括mRNA-1345疫苗效力（VE）预防首次RSV-LRTD发作在注射后14天至12个月期间。这项研究于2021年11月开始，预计将于2024年11月完成NCT05127434。 5.2.mRNA-1010 mRNA-1010是Moderna公司开发的四价流感疫苗候选物，它编码世界卫生组织推荐的四种季节性流感病毒的表面蛋白、血凝素（HA）蛋白，包括季节性流感A/H1N1、A/H3N2和流感B/Yamagata-、B/Victoria系。HA被认为是疫苗开发的重要目标，因为它能产生广泛的抗流感保护，并且是当前可用的流感疫苗的主要目标。mRNA-1010的效力已在1期和2期研究中得到评估。2021年12月，Moderna发布了正在进行的1期研究的中期结果，该研究在年轻人和老年人中评估了3种剂量（50微克、100微克和200微克）的mRNA-1010。结果显示，在所有参与者中，所有剂量在接种后29天成功提高了针对所有毒株的血凝抑制试验几何平均滴度，没有显著的安全发现。该公司还确认，正在进行的mRNA-1010的2期研究已达到全额招募，计划在2022年进行中期分析。正在进行的3期活性对照研究（NCT05415462）旨在评估成人≥18岁的mRNA-1010季节性流感疫苗的免疫原性和安全性。活性对照是任何许可的四价灭活季节性流感疫苗。该研究的主要目标是评估mRNA-1010相对于活性对照针对疫苗匹配的流感A和B毒株在第29天的体液免疫原性，并评估mRNA-1010的安全性和反应原性。安全终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括第29天抗血凝素（HA）抗体的几何平均滴度（GMT）和达到血清转换的参与者百分比。这项研究于2022年6月开始，预计将于2023年8月完成NCT05415462。 5.3.mRNA-1647 mRNA-1647是由Moderna公司针对育龄妇女的巨细胞病毒（CMV）感染开发的疫苗候选物。它由六种mRNA组成，这些mRNA编码了CMV表面的两种抗原。其中五种mRNA编码形成膜结合五聚体复合物的亚单位，而第六种编码全长膜结合糖蛋白B（gB）。mRNA-1647疫苗指导人类细胞制造抗原，产生模拟CMV在自然感染期间向免疫系统呈现的功能抗原。迄今为止，mRNA-1647疫苗已在第一阶段和第二阶段研究中进行了评估。这两项研究的中期分析结果积极，导致启动了第三阶段研究以确认mRNA-1647的效力和安全性。这项第三阶段研究（NCT05085366）是一项随机、观察者盲、安慰剂对照的研究，旨在评估16至40岁健康参与者中mRNA-1647疫苗的效力、安全性和免疫原性。研究的主要目标是评估CMV血清阴性女性参与者中mRNA 1647疫苗的效力，以及评估所有参与者中mRNA-1647疫苗的安全性和反应原性。安全性终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括血清免疫球蛋白G（IgG）对mRNA-1647未编码抗原从阴性转为阳性的结果（时间框架：第三剂注射后第197天（28天）至第887天（第三剂注射后24个月）。该研究于2021年10月开始，预计将于2025年7月完成NCT05085366。 5.4.mRNA疫苗的临床安全性 任何疫苗候选物在临床开发计划的早期阶段的主要目的是评估其在人类群体中的安全性。疫苗的安全性在整个临床开发过程中通过主要监测不良事件、死亡、实验室发现等进行评估。只有在安全性概况可接受的情况下，任何疫苗才能获得市场授权/批准。如果在研究期间和临床开发计划中发生任何不良事件，监管机构/机构伦理委员会（IEC）可以停止临床试验。预计与疫苗候选物相关的不良事件应该能够迅速解决/恢复。即使在疫苗获得市场批准后，赞助商也有责任监测其安全性概况。由于核苷的存在，毒性是需要考虑的mRNA疫苗的重要因素之一。文献报道，一些基于核苷的抗癌药物和抗病毒药物的毒性是由于非天然核苷。特别是在针对Crigler–Najjar综合征的疫苗的临床前研究中，观察到的最常见毒性是肝毒性。这可以归因于用于传递的脂质纳米颗粒配方中的任何有毒辅料的存在。在另一项针对狂犬病的mRNA疫苗的研究中，由于mRNA的炎症性质，在临床试验中报告了系统性不良事件。与mRNA疫苗相关的大多数毒性主要是由于用于配方的辅料或其他在配方开发过程中使用的溶剂。通过在安全限制内使用辅料以及遵循减少疫苗中残留有毒成分的过程，可以避免这些毒性。未来，mRNA疫苗预期的毒性包括局部和全身炎症、表达免疫原的生物分布和持续性、自身反应性抗体的刺激，以及任何非天然核苷酸和传递系统组分的潜在毒性效应。此外，这些疫苗还可能引起强烈的I型干扰素反应、水肿（由于细胞外裸露的RNA）、血液凝固和病理性血栓形成。另一方面，全球卫生当局已经批准了几种mRNA疫苗用于人类。所有批准的疫苗在临床试验评估期间都显示出可接受的安全性概况。例如，辉瑞-BioNTech（Comirnaty）和Moderna（Spikevax）的两种COVID-19 mRNA疫苗已经展示了出色的安全性和效力概况。总体而言，目前正在临床开发的几种mRNA疫苗的安全性概况是可以接受的（耐受性良好），迄今为止很少有或没有从临床试验中撤回的。在临床研究期间报告的大多数不良事件包括注射部位反应。所有赞助商都预计在疫苗开发过程中将安全性作为一个重要因素，通过在非临床开发期间进行彻底的毒性测试来考虑。非临床研究的观察结果应在临床试验中予以考虑，并应仔细监测。 6.第二代mRNA疫苗 第二代疫苗是在改进了第一代mRNA疫苗的一些效率低下问题并增强了安全性、效力、储存和处理之后开发的疫苗。这些变化包括使疫苗在室温下稳定，并减少对冷链储存和运输的需求，同时保持相同的效力和安全性。其他变化包括寻找更强大和靶向配体的纳米载体，这些载体可以有更好的安全性和mRNA传递效力概况。此外，正在进行大量研究，探索各种RNA基分子作为疫苗的使用，包括自我放大RNA。本节重点介绍预计将在不久的将来开发的第二代mRNA疫苗。 6.1.冻干mRNA脂质纳米颗粒 通常，mRNA脂质纳米颗粒（LPN）疫苗必须储存在零下温度以保持稳定性和效力。用于储存疫苗的冷链运输限制了低收入和新兴经济国家疫苗的获取。长期稳定性是LNPs开发的一个主要问题，因为在水悬浮液中储存时观察到物理和化学不稳定性。化学降解涉及mRNA分子中键的改变。物理降解包括变性/聚集（失去二级和三级结构）、融合和封装mRNA的泄漏。mRNA的化学降解主要通过水解和氧化发生。LPNs中脂质的降解也导致水解和氧化。水解主要通过磷酸二酯键发生，这是mRNA分子的骨架。另一方面，氧化影响mRNA的核苷和糖基团。氧化导致mRNA链断裂、碱基断裂和二级结构的改变，这可以阻止体内抗原的翻译。此外，LNPs储存期间的脂质结晶和脂质多态转变导致泄漏或药物排斥。储存条件是一个强烈影响mRNA-LNP疫苗稳定性的关键参数。mRNA-LNPs的长期储存尚未完全探索。在长时间储存期间，mRNA-LNPs可能会经历结构变化。因此，了解其在储存期间所施加的变化至关重要，以获得稳定的mRNA-LNP。由于mRNA-LNPs中的降解反应是由水的存在引发的，冻干是一种广泛用于包括mRNA-LNPs在内的纳米颗粒长期储存的干燥技术。在冻干蛋糕或粉末形式下，mRNA-LNP疫苗可以方便地全球运输，而不需要冷冻储存。冻干过程分为三个阶段：冷冻、一次干燥和二次干燥。在冷冻过程中，水被冻结成冰晶，而溶质材料被排除在冷冻浓缩相之外。一次和二次干燥过程都是在真空下进行的。一次干燥步骤在低温下进行，在此阶段通过升华过程去除冻结的水。在二次干燥步骤中，温度升高以通过解吸机制去除任何未冻结的水。冻干过程的细节在其他研究中讨论。由于mRNA-LPN疫苗是由特定类型的脂质在一定浓度下制备的，因此在冻干和随后的储存过程中保持物理化学参数如粒径、多分散性和封装效率非常重要。因此，仔细选择冻干过程参数、缓冲液以及冷冻和冻干保护剂至关重要，以确保稳定效果。在一项研究中，Shirane等人在形成LNPs后冻干了含有乙醇的siRNA-LNP分散液。结果表明，新制备的（传统的）和重新配制的冻干配方之间在体内基因敲低效率方面没有差异，证明了mRNA-LNPs的冻干可行性。在冻干过程的冷冻和干燥步骤中，封装在LNP中的mRNA可能暴露于不同的压力下，这最终影响mRNA-LNP的稳定性。因此，使用冷冻保护剂在配方中非常重要，而LNPs稳定的最优冷冻保护剂取决于材料和配方类型。Zhao等人确定了脂质类纳米颗粒（LLNs）的mRNA的最佳储存条件。LLNs是使用离子化脂质、N1、N3、N5-三（3-（二十二烷氨基）丙基）苯-1,3,5-三羧酰胺衍生物、TT3制备的。筛选和评估了冷冻保护剂（海藻糖、葡萄糖和甘露醇）类型和物理状态条件，如水相、冷冻或冻干，以评估纳米颗粒大小和体外及体内mRNA表达等属性。在水相条件下，LLN mRNA没有保持长期储存稳定性。在最佳浓度下添加冷冻保护剂有助于保持冻干LLNs中mRNA的体外表达效率。然而，在冻干和重悬过程中，LLN-mRNA的纳米结构发生了变化，影响了mRNA-LLNs与血清蛋白的体内相互作用，导致不同的体内效率。在液氮中冷冻mRNA的LLNs，加入5%的蔗糖或海藻糖，被认为是长期储存的最佳选择。 Hong等人开发了一种使用阳离子脂质基传递系统的可冻干SARS-CoV-2疫苗。重新配制的疫苗在小鼠体内诱导针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应，证明了冻干后SARS-CoV-2的免疫原性和中和抗体活性。在冷冻过程中的各种压力可能会影响LPNs的稳定性，包括晶体形成、界面效应、冷冻浓缩、缓冲液pH值变化和相分离。冷冻过程中的晶体形成施加了冰-液界面，这可能导致包括mRNA在内的蛋白质分子胶体结构的吸附和损伤。冷冻增加了剩余液相中溶质材料的浓度，促进了粒子-粒子相互作用，并导致粒子聚集。冷冻浓缩增加了对脂质双层的渗透压，对膜施加物理压力，导致膜破裂。此外，渗透稳定性取决于脂质膜组成，因为溶质选择性渗透。其他研究讨论了冷冻和干燥引起的压力的详细信息。在一项研究中，Jones等人检查了冷冻干燥对mRNA完整性的影响。在水或10%海藻糖中冷冻干燥的纯化RNA（25 µg/mL），储存在−70◦C、−20◦C、4◦C、37◦C或室温下，在氮气下储存长达10个月，并分析RNA完整性。在水和10%海藻糖中冷冻干燥的RNA的恢复率分别为66%到零。此外，在10%海藻糖中储存的RNA在所有时间点上显示出高一致性的恢复，允许RNA在4◦C下储存长达10个月。这允许即使在发展中国家也能开发RNA疫苗。Muramatsu等人证明，核苷修饰的mRNA-LNPs可以冻干，并且mRNA LNPs的物理化学属性（粒径、封装效率）在室温下12周和至少4◦C下24周储存后没有显著变化。然而，在4◦C和25◦C储存时，冻干的核苷修饰mRNA-LNPs的RNA完整性分别观察到10-15%和30%的下降。此外，在小鼠中进行的体内生物发光成像研究表明，冻干的萤火虫荧光素编码mRNA-LNPs保持了高表达，没有失去高翻译性。在比较小鼠免疫研究中，作者证明了冻干的核苷修饰mRNA LNP流感病毒疫苗在室温储存12周后或至少4◦C储存24周后保留了其效力。水替代假说和玻璃化是冷冻和冻干保护剂（糖）在冻干过程中稳定生物系统的两种机制。作为冻干保护剂的海藻糖被报道在冷冻干燥过程和随后在−80、5、25和40◦C储存期间稳定mRNA-精蛋白复合物配方。在储存期间分析的质量属性，包括外观、RNA完整性、RNA含量、pH值和渗透压，符合质量（稳定和安全）RNA药物所需的稳定性规格（WO2016165831A1）。蔗糖也似乎是稳定SS-可切割的质子激活脂质类材料（ssPalm），LNPs的一个组成部分的合适冷冻保护剂。通常，在冷冻期间，相互混溶性较低的分子导致相分离，颗粒将通过相互碰撞发生聚集/聚并。蔗糖与含有接枝聚乙二醇（PEG）聚合物的LNP表面具有高混溶性。蔗糖与LNP表面PEG层之间的优先相互作用通过表现出冷冻保护属性稳定颗粒。糖与磷脂头基团之间的相互作用降低了干燥状态下脂质膜的熔化温度。糖减少了磷脂的酰基链之间的范德华相互作用，并保持了头基团间距。因此，糖减少了水与磷脂之间的相互作用，然后取代了水。在无水条件下，糖是水的良好替代品。糖与脂质双层表面的脂质之间形成了多个氢键，而没有改变脂质双层结构。糖可以同时与不同的脂质相互作用，与磷脂极性基团（P=O和/或C=O）和脂质胆碱基团的甲基基团相互作用。在玻璃化过程中，糖溶液在冷冻过程中变得冷冻浓缩，在去除水分后形成稳定的玻璃基质，结果在糖的玻璃基质中捕获了冻干蛋糕。具有低流动性和高粘度的玻璃基质保护脂质双层免受冰晶引起的损伤。此外，糖玻璃基质抑制了脂质相变介导的构象变化。渗透和体积效应是玻璃化期间的两个关键属性，通过防止脂质膜在近距离聚集时相邻双层的密切接触，减少机械应力。冻干技术的进展，包括使用SMART冷冻干燥进行压力测量和用于监测关键过程参数的过程分析技术，有助于满足mRNA-LNP疫苗更好的储存要求。 6.2.聚合物纳米载体 通常，与基于脂质的载体类似，mRNA传递的聚合物载体利用静电吸引力（聚合物的正电荷和mRNA的负电荷之间）进行mRNA多聚体的自组装。与基于脂质的系统相比，mRNA多聚体在雾化后恢复结构，因此在探索粘膜疫苗接种方面具有吸引力。mRNA多聚体形成更坚硬的超分子结构，具有高分子量和较慢的聚合物链流动性，这提供了更好的稳定性。Palamà等人通过乳液-扩散-蒸发方法开发了聚（ε-己内酯）纳米颗粒，用于GFP（绿色荧光蛋白）-mRNA的细胞内传递。在颗粒组装之前形成精蛋白-mRNA复合物，以获得更好的稳定性、控制释放和更高的mRNA装载量。具有核壳结构的纳米颗粒有一个被聚（ε-己内酯）层覆盖的mRNA内核，提供了更大的稳定性和隐身属性。作者指出，聚（ε-己内酯）纳米颗粒有可能解决mRNA不稳定问题。mRNA传递的聚合物载体一直在与细胞毒性作斗争，部分原因是聚合物阳离子电荷。用聚乙二醇链修饰阳离子电荷聚合物可以改善体外和体内的货物传递，并减轻细胞毒性。此外，聚合物载体的固有异质性和它们相对较低的基因转移效率限制了聚合物mRNA疫苗的临床转化和大规模生产。由于患者依从性和较少侵入性疫苗接种，基于支架的mRNA疫苗传递已被利用。Yan等人报告了一种用于mRNA疫苗传递的可注射壳聚糖海藻酸盐凝胶支架。通过单链mRNA与脂质体载体纳米颗粒的复合形成脂质复合体复合物。然后，mRNA脂质复合体被装载到冻干的壳聚糖-海藻酸盐支架上，随后进行再水化步骤。此外，确定了凝胶中mRNA释放动力学和凝胶-mRNA的免疫效率。结果表明，基于支架的mRNA疫苗传递可能是传统免疫方法的潜在替代品。聚乙烯亚胺已被广泛用于mRNA疫苗传递。聚乙烯亚胺结构的优化提供了高基因转染效率。聚乙烯亚胺的属性，如在广泛的pH范围内的缓冲能力和在低pH下氨基酸基团的高质子化比率，有助于核酸复合物的形成。尽管效果出色，但聚乙烯亚胺的应用受到其毒性和与带负电荷的血清蛋白的相互作用行为的限制，这会导致蛋白质聚集。将PEG纳入配方中，使用低分子量聚合物形式（约2kDa的聚乙烯亚胺），与环糊精的共轭，以及二硫键连接是一些可以减轻聚乙烯亚胺毒性的策略。 低分子量聚乙烯亚胺（2k）已被用于传递HIV-gag mRNA至树突状细胞和BALB/c小鼠。在体内皮下注射后，形成的mRNA-低分子量聚乙烯亚胺复合物具有诱导抗原特异性免疫反应的潜力。基于2 kDa聚乙烯亚胺的mRNA疫苗通过鼻内给药成功传递了编码HIV gp120抗原的mRNA，并诱导了系统性免疫反应。为了确定聚乙烯亚胺的化学结构对mRNA传递至目标部位（淋巴结）及随后的免疫反应的影响，研究了聚乙烯亚胺化学结构的修饰，包括与几种环糊精复合。Tan等人合成了β-环糊精（β-CD）和支链聚乙烯亚胺（2 kDa）的共轭物，用于mRNA疫苗的传递。形成的复合物有效包裹mRNA，并通过穿过质膜和从内质网逃逸，提供高转染效率。 除了聚乙烯亚胺之外，还研究了其他聚合物载体，如聚（氨基酯）、壳聚糖、聚酰胺胺和聚（2-丙基丙烯酸）。由于其外围的高胺密度，聚（氨基酯）是一种可生物降解的聚合物，通过形成超支化树状球形树状体，有效地形成mRNA复合物。以前已经研究过用于传递核酸（mRNA）的基于壳聚糖（CS）的纳米颗粒。然而，它们有限的从内质网逃逸能力阻碍了mRNA的传递。壳聚糖是一种从甲壳质衍生的生物相容性阳离子生物聚合物，与核酸发生静电相互作用，并且可以进行化学修饰。电荷密度或脱乙酰度、分子量和胺基与磷酸盐比率（N:P）是影响SiRNA-CS基系统转染效率的壳聚糖参数。通过硫酸化透明质酸包覆和添加海藻糖，CS-mRNA纳米颗粒的生物活性提高了4-10倍。尽管壳聚糖纳米颗粒的体外和体内传递效率很高，但与用于传递mRNA的脂质纳米颗粒相比，它们的胶体稳定性和内质网逃逸潜力较低。聚酰胺胺（PAMAM）树状体是高度支化的（甲基丙烯酸和乙二胺，以胺基和羧基末端基团结束）阳离子聚合物，并且是生物相容的，允许与核酸一起包埋。Chahal等人开发了体外转录的传统未修饰mRNA和修饰的PAMAM树状体纳米颗粒（MDNP）用于RNA疫苗传递。修饰的树状体纳米颗粒可以通过在小鼠中提供多种抗原来提供针对包括H1N1流感病毒和埃博拉病毒在内的广泛致命病原体的保护性免疫反应。结果表明，修饰的树状体纳米颗粒通过在小鼠中提供多种抗原，诱导了保护性免疫反应。 聚（ε-己内酯）是一种吸引人的mRNA应用聚合物，已获得食品药品监督管理局（FDA）的批准。由聚（ε-己内酯）组成的纳米颗粒具有低体外和体内毒性、在生物液体中高胶体稳定性、控制封装货物的释放行为，以及通过内吞作用实现的卓越细胞摄取。可生物降解的聚合物，如聚葡糖（一种葡萄糖聚合物）和精胺（一种在所有生物中发生的多胺），已被采用于mRNA疫苗的传递。聚葡糖：精胺共轭物以5:1的电荷比自组装与编码SARS-CoV-2 RBD抗原的mRNA，保护了被包裹的mRNA免受核酸酶的降解，允许在4°C下以冻干形式储存而不失核酸活性，这对于疫苗的储存和运输是一个重要考虑因素。 E. Jeandupeux等人研究了将聚（2-丙基丙烯酸）PPAA，一种在酸性pH下具有膜溶解特性的阴离子聚合物，纳入壳聚糖mRNA纳米颗粒中，以提高生物活性并促进内质网逃逸。三元（CS/mRNA/PPAA）纳米颗粒被评估了粒径、多分散指数、z-电位和体外转染效率。与脂质对照（LipofectamineTM MessengerMaxTM（LP-MM）mRNA脂质纳米颗粒）相比，三元纳米颗粒在pH 6.5时的表达水平为86%，没有显示出任何代谢毒性，而脂质对照的生物活性仅为75%。假设PPAA通过增加内质网释放或减少CS/mRNA复合物稳定性来增强生物活性。 虽然越来越多的研究表明使用各种聚合物载体进行mRNA传递，但值得注意的是，目前还没有全面的比较研究可以指导使用聚合物载体有效传递mRNA疫苗的理想配方。 6.3.佐剂纳入脂质纳米颗粒 为了增强免疫反应，佐剂被纳入疫苗中，通过激活细胞特异性受体，进而促进抗原呈递。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它们与许多限制相关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强大细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的 toll样受体（TLRs）由于其在激活后增强细胞因子产生的能力，成为佐剂开发的主要目标。这反过来又触发了免疫系统，从而增强了疫苗的效力。 肽也被纳入脂质纳米颗粒作为佐剂。Xiang等人合成了靶向淋巴结的melittin-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离melittin相比，α-melittin-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面表现出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-melittin的良好稳定性和缺乏副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结的纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导系统性抗肿瘤反应。在一些研究中，从细菌衍生的单磷酸脂质被纳入作为佐剂。Ravindran等人通过纳入可溶性利什曼抗原（SLA）和佐剂单磷酸脂质-海藻糖二角诺霉素，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。与脂质体佐剂配方在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对Leishmania donovani的保护水平明显更高。即使在接种后四个月，也明显观察到包括IFN-γ和Ig2a抗体诱导在内的细胞免疫反应，这为所开发配方提供长期免疫能力的潜力提供了证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中并增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被命名为病原体相关分子模式（PAMPs）的分子组，可以被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特别识别。佐剂通过toll样受体9（TLR-9）信号通路起作用，从初步数据中明显看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮诱导和内质网成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将称为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。阳离子脂质已成为mRNA传递的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易纳入mRNA，以产生具有特征性高封装效率的脂质纳米颗粒。所制定的纳米颗粒成功表达了肿瘤抗原，最终导致刺激免疫反应。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白亚单位疫苗后，其效果得到增强，这归因于T滤泡辅助细胞的诱导和体液反应的激活。发现纳入阳离子脂质组分对于引发免疫反应至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用实现核酸的结合和凝聚，从而促进有效载荷跨越细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，用于传递核酸、mRNA和小干扰RNA。Zhang等人开发了一种具有自我佐剂特性的C1脂质纳米颗粒疫苗，用于传递具有抗肿瘤效果的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共传递促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号传导。此外，体内生物分布研究表明，纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内效果的评估显示淋巴结中CD8+ T细胞的浓度最高，从而证实了纳米疫苗给药后免疫反应的增强。核苷修饰的mRNA在脂质纳米颗粒中的配方已被证明是对抗传染病的有效免疫方式。已确定，在对抗艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相比，要么相同，要么增强，即血清中HIV-1结合抗体的高滴度。发现对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产针对各种感染的单组分或多组分疫苗方面具有很大的潜力。 6.4.靶向抗原呈递细胞 脂质纳米颗粒作为一种载体系统，因其生物相容性、高装载效率和可定制的表面特性等多功能特性，正在成为传递疫苗的极其有效的系统。Moderna（mRNA-1273）和辉瑞-BioNTech开发的两种针对COVID-19的疫苗的成功，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为临床上先进的基因传递系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取最小化。为了通过激活细胞特异性受体来增强免疫反应，进而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它与许多限制相关，例如对某些抗原无效和无法启动强大的细胞免疫反应，这就需要替代品。在抗原呈递细胞上表达的toll样受体（TLRs）由于其在激活后增强细胞因子产生的能力，成为佐剂开发的主要目标。这反过来又触发了免疫系统，从而增强了疫苗的效力。 肽也被纳入脂质纳米颗粒作为佐剂。Xiang等人合成了靶向淋巴结的melittin-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离melittin相比，α-melittin-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面表现出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-melittin的良好稳定性和缺乏副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结的纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导系统性抗肿瘤反应。在一些研究中，从细菌衍生的单磷酸脂质被纳入作为佐剂。Ravindran等人通过纳入可溶性利什曼抗原（SLA）和佐剂单磷酸脂质-海藻糖二角诺霉素，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。与脂质体佐剂配方在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对Leishmania donovani的保护水平明显更高。即使在接种后四个月，也明显观察到包括IFN-γ和Ig2a抗体诱导在内的细胞免疫反应，这为所开发配方提供长期免疫能力的潜力提供了证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被命名为病原体相关分子模式（PAMPs）的分子组，可以被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特别识别。佐剂通过toll样受体9（TLR-9）信号通路起作用，从初步数据中明显看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮诱导和内质网成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将称为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。阳离子脂质已成为mRNA传递的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易纳入mRNA，以产生具有特征性高封装效率的脂质纳米颗粒。所制定的纳米颗粒成功表达了肿瘤抗原，最终导致刺激免疫反应。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白亚单位疫苗后，其效果得到增强，这归因于T滤泡辅助细胞的诱导和体液反应的激活。发现纳入阳离子脂质组分对于引发免疫反应至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 6.5.自扩增mRNA疫苗 脂质纳米颗粒因其生物相容性、高装载效率和可调节的表面特性等多样化特性，正成为疫苗递送领域极其有效的载体系统。Moderna（mRNA-1273）和辉瑞-BioNTech成功开发了两种针对COVID-19的疫苗，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为临床上先进的基因递送系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取不足。为了增强免疫反应，疫苗中加入了佐剂，通过激活细胞特异性受体促进抗原呈递。传统上使用的是不溶性铝盐作为佐剂，但它存在许多限制，例如对某些抗原无效和无法引发强烈的细胞免疫反应，因此需要替代品。表达在抗原呈递细胞上的Toll样受体（TLRs）因其在激活后增强细胞因子产生的能力，成为佐剂开发的主要目标。这反过来触发免疫系统，增强疫苗的效力。生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用实现核酸的结合和凝聚，从而促进有效载荷穿过细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，旨在递送核酸、mRNA和小干扰RNA。张等人开发了一种具有自佐剂特性的C1脂质纳米疫苗，用于递送具有抗肿瘤效力的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共递送促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号传导。此外，体内生物分布研究表明纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内效力评估显示淋巴结中CD8+ T细胞浓度最高，从而证实了纳米疫苗给药后免疫反应的增强。将核苷修饰的mRNA配方在脂质纳米颗粒中已被证明是对抗传染病的有效免疫方式。已确定，在对抗艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相同或更强，即血清HIV-1结合抗体滴度更高。发现对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产单一或多组分疫苗对抗各种感染方面具有很大的潜力。 7.mRNA疫苗的不足 7.1.抗体反应的持续时间 mRNA疫苗产生的抗原被APCs摄取并运输到淋巴结。在这里，B细胞、APC和滤泡辅助T细胞（TFH细胞）之间的相互作用促进了生发中心的形成。然后B细胞在生发中心增殖并分化和突变，产生针对病原体的高亲和力中和抗体。这一级联的生化免疫反应对于持久的抗体至关重要，对应于对抗传染病的长期作用。几种有前景的mRNA疫苗正在开发中，它们积极针对APCs。针对APC细胞特异性配体、单克隆抗体（mAbs）和肽的LNPs是正在探索的一些策略，以增加mRNA疫苗产生的免疫反应。此外，通过延长抗原mRNA的翻译来改变mRNA疫苗的药代动力学特性，现已成为增强抗体反应的有希望的工具。mRNA疫苗在针对HIV-1、SARS-CoV-2、寨卡病毒和流感病毒的临床前研究中引发了强大的生发中心免疫原性反应和TFH细胞诱导。尽管这些结果是有希望的，但抗体反应的持续时间是一个复杂的现象，会因抗原而有很大差异。此外，评估mRNA疫苗的免疫反应持续时间需要更长期的数据才能全面了解。 7.2.安全性 总体而言，目前的mRNA疫苗在临床试验和批准后的实际人群中显示出有希望的安全性。这些疫苗在临床试验中只有轻微或中度的不良事件。然而，也有一些零星的安全事件需要进一步优化mRNA疫苗及其所有成分。例如，CureVac基于精蛋白的狂犬病疫苗CV7201，在78%的参与者中引起不良反应。这导致CureVac采用LNPs作为他们下一个狂犬病候选疫苗CV7202的主要和首选递送工具。与大多数药物一样，对mRNA疫苗的不良反应通常随着剂量的增加而增加和升级。例如，在Moderna的流感H10N8疫苗的I期试验中，从400 µg开始观察到不良事件。因此，他们继续使用高达100 µg的较低剂量。在CV7202的I期试验中，5 µg剂量具有高反应原性；因此，1 µg是给予受试者的最高剂量。在每百万COVID-19疫苗接种中，轻度过敏性反应为4.7例，其中Moderna疫苗为每百万2.5例，辉瑞-BioNTech疫苗为每百万2.2例。这比传统疫苗通常看到的要高得多。科学家提出，这种过敏反应可以归因于患者对LNPs中使用的聚乙二醇化脂质的预先存在的抗体。这些抗体可以在体内形成，以响应许多消费品中的聚乙二醇，如牙膏和洗发水。尽管聚乙二醇是安全的，但据传它以T细胞独立的方式在一部分人口中激活体液免疫。它通过直接交联B细胞受体并引入IgM产生来实现这一点。据报道，40%的人群中存在抗聚乙二醇抗体，这可能会加速和增加过敏反应的风险，并阻碍疫苗效力。CDC建议不要给有对辉瑞-BioNTech或Moderna疫苗过敏反应史的人接种mRNA疫苗。由于mRNA疫苗配方的一些成分可能会引起一部分人口中的过敏反应，因此应该重新设计配方成分，以增强安全性。 7.3.孕产妇/新生儿疫苗接种 怀孕期间和婴儿新生儿阶段的免疫系统是高度动态和不断发展的，这可能会增加一个人对传染病的易感性。寨卡病毒可以感染发育中的胎儿的皮层神经元和胶质细胞，导致细胞死亡、神经炎症和胎儿严重的先天性畸形。巨细胞病毒感染可能导致大约1%的妊娠并发症，导致先天性残疾，以及婴儿的神经损伤。也有报道称SARS-CoV-2病毒在子宫内的传播极为罕见。其对孕产妇和新生儿健康的影响正在调查中。为了解决这些不足，孕产妇疫苗接种已成为提高孕产妇健康和减少新生儿发病率负担的工具。孕产妇IgG抗体可以通过与新生儿结晶可片段（Fc）受体结合并进入胎儿循环来轻易穿过胎盘屏障。这保护胎儿免受病原体和其他传染病的侵害。几项临床前研究表明，孕产妇接种mRNA-LNPs预防了寨卡病毒传播给怀孕小鼠的胎儿，A组和B组链球菌，并保护了小鼠新生儿免受疱疹病毒的侵害。 7.4.老年人疫苗接种 预计到2050年，全球60岁以上人口比例将从12%翻倍至22%。这一人群非常需要疫苗，因为许多传染病对老年人的影响格外严重。例如，70-90%的流感相关死亡发生在65岁以上的人群中，COVID-19在65岁以上患者中的致命性比年轻患者高65倍。老年人群体通过疫苗接种获得免疫更加困难，因为年龄对先天和适应性免疫系统产生不利影响。感染后产生的适应性免疫反应通常不足，除了细胞因子信号传导受损外，还有生理和细胞变化受损。这些变化包括较少的初始B细胞和T细胞、T细胞凋亡的易感性增加、T细胞受体多样性减少，以及在细胞毒性CD8+ T细胞上关键受体如CD28的表达减少。mRNA疫苗可能是增强老年人免疫力的解决方案。这些疫苗可能对所有年龄组，特别是老年人提供强大的效力，如辉瑞-BioNTech疫苗候选物BNT162b2的III期临床试验所见。该疫苗在所有按年龄明确定义的治疗组中激发了超过93%的效力。同样，Moderna疫苗mRNA-1273也非常有效，在65岁以上的志愿者中显示了86.4%的效力，相比之下，18-65岁年龄组的效力为95.6%。设计高效的药物递送系统对于提高老年人的疫苗效力至关重要。mRNA递送工具充当佐剂，通过增强APCs对注射部位的招募来放大疫苗反应。例如，诺华的油包水乳液MF59，已被用作mRNA递送工具，并可用作佐剂。MF59放大了流感疫苗的免疫反应，并且已获准用于老年人。在老年人群体中，用MF59佐剂的流感疫苗增强了血清转换和血清保护率，与非佐剂疫苗相比。 7.5.疫苗接受度 只有当疫苗被接种，并且人们对疫苗有满意的接受度和对疫苗效力的信念时，疫苗才有效。然而，由错误信息引发的公众怀疑威胁到群体免疫的实现和维持，并将最脆弱的人群，如老年人和儿童，置于风险之中。疫苗覆盖率和接种率的下降可能导致本已根除的危及生命的疾病的重新出现。例如，麻疹在2000年已在美国完全根除，但由于疫苗接受度差，2019年感染了超过1200人。对于COVID-19，由于信息量大和意识广泛，全球疫苗接受率在55%到90%之间。美国目前的接受率在56-75%之间，可能不足以维持对SARS-CoV-2的群体免疫阈值。此外，在美国，mRNA疫苗试验的高效力率提高了公众对mRNA疫苗的信心。 7.6.疫苗获取 负担得起且容易获取疫苗是在实现对传染病普遍保护方面的最大挑战，特别是在低收入国家。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷储要求，这种获取进一步受到限制。在2014-2016年致命的西非埃博拉病毒爆发期间，需要-80°C储存的疫苗通过便携式和可重复使用的Arktek冷冻箱在刚果民主共和国供应，允许向40万人接种疫苗。这种冷储技术能够在流行病期间迅速部署数百万剂疫苗。然而，在像COVID-19这样不断演变的大流行中为数十亿人接种疫苗需要热稳定的疫苗。两种SARS-CoV-2疫苗候选物在室温下的临床前研究中报告为热稳定。如果这些热稳定的mRNA疫苗候选物在临床试验中显示出有希望的结果，它们可以极大地简化全球对mRNA疫苗的获取。设计负担得起、稳定且有效的热稳定mRNA疫苗是当务之急。 8.结论 几十年来在mRNA设计及其递送技术的发展和研究，使mRNA疫苗成为对抗大流行和现有传染病的惊人工具。首批两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗以意想不到的速度开发出来。这些疫苗超出了预期，为mRNA疫苗的未来奠定了坚实的基础和基本工作。从众多mRNA疫苗的临床试验中可以看出，这些疫苗可以与常规疫苗平台并驾齐驱甚至取代它。mRNA技术有潜力开发出针对持久和具有挑战性的病原体的更有效疫苗，并在不久的将来治疗各种癌症。然而，需要在mRNA递送技术上取得进展，以实现更有效、更安全、无需冷链的mRNA疫苗，有能力为全球数十亿人口接种疫苗。需要进一步研究mRNA疫苗如何影响先天免疫反应。批准的mRNA疫苗的大量积极安全性和效力数据，加上经过验证的监管批准路径，为科学界带来了希望，即mRNA治疗确实有巨大的潜力改变现代生物治疗方法，用于疫苗接种、蛋白质替代疗法和癌症免疫疗法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:核酸技术彻底改变了疫苗开发，使得RNA和DNA疫苗的设计和生产能够快速进行，以预防和治疗疾病。针对COVID-19的mRNA和质粒DNA疫苗的成功部署进一步验证了这项技术。目前，由于其更高的有效性，mRNA平台占据主导地位，而DNA平台正在快速进化，因为它拥有独特的优势，有可能克服与mRNA平台相关的问题。为了帮助理解这两种疫苗平台的最新表现，并认识到它们在未来的临床潜力，本综述比较了文献中目前已知的mRNA和DNA疫苗的优势和缺点，包括开发时间线、财务成本、分发便利性、有效性、安全性和产品的监管批准。此外，综述还讨论了正在进行的临床试验、改进策略，以及RNA和DNA平台的替代疫苗设计。 1.引言 核酸疫苗因其在临床试验中对多种疾病（包括癌症和SARS-CoV2等病毒感染）的治疗或预防显示出有希望的结果，最近受到了极大关注。与传统的基于蛋白质或病毒的疫苗相比，核酸疫苗拥有众多优势，这些优势已经并将继续使它们成为疾病控制和治疗最有希望的平台。与基于蛋白质和病毒的疫苗生产所需的在孵化鸡蛋或培养细胞中的漫长过程不同，核酸疫苗的开发和制造简单快捷，并且可以迅速扩大生产规模，特别是在应对新兴大流行病时。核酸疫苗的生产过程中不包含传染性病原体，这也消除了不完全灭活病毒或纯化的问题，并确保了它们在人类中的安全性。此外，核酸疫苗的基因序列可以轻松修改以针对特定病原体和疾病，使它们能够适应新兴传染病和快速演变的病原体，或者适应癌症等异质性疾病中的个性化疫苗。除了安全性和生产便利性，核酸疫苗能够通过MHC I类和II类分子呈现抗原，并诱导宿主免疫系统的细胞和体液反应，而蛋白质疫苗在诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应方面效率较低，激活这些细胞需要MHC I分子呈现抗原。同样重要的是，核酸疫苗避免了当前基于鸡蛋的疫苗中病毒适应在鸡蛋中复制的问题，这可能导致关键抗原位点的变化，干扰保护性免疫反应。核酸疫苗的另一个优势是，与基于蛋白质或病毒的传统疫苗相比，它们在最终溶液产品中的添加剂更少。传统疫苗的溶液通常含有MF59、铝盐和CpG等佐剂。Saponin作为佐剂被添加到Novavax（一种针对COVID-19的蛋白质亚单位疫苗）的溶液中。Thimerosal有时被用作传统疫苗的防腐剂，以防止细菌或真菌污染。尽管没有证据表明疫苗中使用Thimerosal是有害的，但公众担心Thimerosal可能导致儿童自闭症等神经系统疾病。相比之下，Moderna或Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗的溶液中不包含额外的佐剂或防腐剂。用于mRNA传递的脂质纳米颗粒（LNPs）也作为疫苗佐剂。此外，疫苗溶液通常含有稳定剂。明胶是病毒疫苗溶液中常用的稳定剂（例如，Flumist®用于流感，M-M-R® II用于麻疹、腮腺炎和风疹，Varivax®用于水痘）以保护病毒在制造和运输过程中免受冻干或解冻的损害。接种疫苗的患者血液中可能产生抗明胶抗体，这可能导致严重的过敏反应。Polysorbate 80是另一种用于基于蛋白质和病毒的疫苗（例如，HPV疫苗、Novavax和J&J/Janssen COVID-19疫苗）溶液中的稳定剂，也可能在一些患者中引起过敏反应。相比之下，Moderna和Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗使用蔗糖作为mRNA疫苗溶液中的稳定剂，没有数据显示蔗糖的存在与任何疫苗相关的不良反应有关。然而，需要注意的是，mRNA疫苗含有聚乙二醇（PEG）在脂质纳米颗粒中用于稳定脂质结构，这被认为是引起mRNA疫苗在临床上观察到的严重过敏反应的潜在因素之一。为了解决这个问题，已经开发了新的聚合物，如聚（寡（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯）（POEGMA）作为PEG的替代品，可能稳定LNPs并减少免疫原性（见第2.4.2节）。 目前，两种主要类型的核酸疫苗在研究实验室和临床上越来越受到关注，分别是DNA疫苗和RNA疫苗，它们分别以DNA和mRNA作为主要疫苗成分。RNA和DNA疫苗都通过使用宿主自身的蛋白质合成机制来产生“抗原”，这些抗原是病毒或致病细胞表面可以被宿主免疫系统识别并触发免疫原特异性免疫反应的免疫原性蛋白。这个过程模仿了自然感染而不引起疾病，允许身体以受控的方式发展免疫力。DNA疫苗通常通过将编码抗原的基因片段克隆到一个圆形载体中（如质粒和微环DNA）来创建，这些载体可以在哺乳动物细胞中高效表达，并通过肌肉内和皮内注射等途径将修饰后的DNA构建物传递给宿主。宿主细胞，例如肌肉内传递中的肌细胞，将摄取DNA，读取其序列中的遗传信息，并合成编码的抗原（图1）。RNA疫苗可以通过mRNA和其他RNA载体（如自复制RNA和环状RNA（见第3.3节））来创建。在这种情况下，RNA而不是DNA负责携带生产抗原所需的遗传信息。在抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞（DC）和巨噬细胞的帮助下，产生的抗原被宿主免疫系统识别为外来物，并将对其产生免疫反应。对于抗病毒疫苗，将产生能够识别和中和病毒的抗体。对于所有疫苗，T细胞也被激活以帮助破坏感染的细胞或带有目标抗原的细胞。 RNA和DNA疫苗都需要被传递到细胞中以表达抗原。单独的裸DNA已在许多临床试验中作为疫苗使用，并被证明是有用的，尽管需要进一步提高裸DNA疫苗的传递效率和因此的免疫原性，以扩大其应用。与通常直接注射到宿主中的DNA疫苗不同，RNA疫苗（例如mRNA）通常被包裹在脂质纳米颗粒（LNPs）中，这有助于保护RNA并促进其进入细胞和内质网逃逸。这些LNPs通常是免疫原性的，并表现出对RNA疫苗的重要佐剂作用。在被注射部位附近的细胞摄取后，RNA从LNPs中释放出来，进入细胞的细胞质中进行后续的翻译和呈递过程，这些过程与DNA疫苗相似（图1）。 图1. mRNA和DNA疫苗的作用途径。（1）mRNA和DNA疫苗可以通过肌肉注射或其他方法给药，之后疫苗将被宿主的体细胞内化（2）。mRNA和DNA疫苗编码抗原的遗传信息，并依赖宿主自身的蛋白质合成机制来产生抗原。mRNA需要在进入宿主细胞后从其递送载体中释放出来，例如LNP，然后直接翻译成蛋白质抗原。质粒DNA疫苗需要被运送到细胞核中，DNA中的遗传信息才能被读取并转录成mRNA。之后，mRNA从细胞核中出来并翻译成编码的蛋白质抗原。（3）合成的抗原被转移到抗原呈递细胞（APCs）中，这些细胞迁移到次级淋巴器官，通过MHC分子与T细胞受体（TCR）之间的相互作用以及共刺激分子之间的相互作用（例如APC表面的CD86和T细胞上的CD28等受体）来（4）激活T细胞。激活的CD4+ T细胞分泌促炎细胞因子以激活负责（5）建立针对抗原的体液免疫反应的B细胞。 RNA和DNA疫苗平台在包括寨卡病毒、流感、狂犬病等疾病的临床前和临床研究中都显示出了有希望的结果。正在进行的DNA和RNA疫苗的大量临床试验强调了它们在未来医学中的重要角色。然而，这两种疫苗平台也有限制，这些限制目前阻碍了它们充分发挥潜力，并在临床试验中造成了许多失败。由于这两种疫苗在疫苗接种中相对较新，缺乏来自已完成的后期临床试验的足够支持数据，而且目前可用的长期安全性和有效性数据非常有限，因此很难判断哪一种在临床使用中具有更大的潜力。此外，这两种方法都在不断地被开发和优化，这增加了未来DNA和RNA疫苗之间胜者的不确定性。 迄今为止，大多数数据都是通过质粒DNA和基于mRNA的疫苗产生的。因此，本综述聚焦于讨论和比较当前质粒DNA和mRNA疫苗的成就和正在进行的发展，尽管也提到了其他平台。目的是提供洞见，了解它们在预防和治疗疾病方面可能产生重大影响的潜力。 2.mRNA和DNA疫苗的优势和考虑因素 mRNA疫苗高效、安全且多功能。最近，由于在COVID-19大流行期间成功应用于减少可能导致患者住院或死亡的严重病例，它们成为了热门话题。这一成功也减弱了对DNA疫苗的热情。 尽管目前产生的热情较少，DNA疫苗有一些独特的优势，可能克服mRNA疫苗的局限性。它们在热稳定性上更强，保质期更长。因此，它们不需要冷链基础设施进行运输和储存，这降低了疫苗分发的成本，并允许在基础设施有限的地区获得疫苗。此外，DNA疫苗可以在细胞中提供比mRNA更持久的基因表达，这可能会延长对抗原的免疫反应。DNA疫苗更便宜且更容易扩大生产规模。此外，裸DNA疫苗可以直接交付，而不需要与生物材料（如LNPs）包装，这与mRNA疫苗相比进一步简化和降低了设计和制造过程的成本。没有包装材料中的炎症因子，DNA疫苗更安全，因为它们会引起较少的不良副作用。 此外，最近一项关于COVID-19疫苗的临床前研究表明，DNA和mRNA平台之间存在不同的免疫反应。DNA疫苗触发了更强的T细胞反应，而mRNA引发了更强的体液反应，这表明每个平台可能特别适合针对特定疾病。为了深入理解两种疫苗接种方法，我们从几个不同的方面系统比较了mRNA和DNA疫苗的优势和劣势：开发时间线和财务成本、储存和运输要求、剂量和保护效力、监管批准以及安全性和副作用。 2.1.开发时间线和财务成本 与mRNA和DNA疫苗的设计和生产相关的时间和财务成本取决于各种因素，如病原体类型、监管要求和全球需求。这两种疫苗平台有很多共同点。与传统的基于蛋白质和病毒的疫苗相比，它们的生产相对较快，因为它们的生产不需要使用受精鸡蛋或培养细胞。mRNA和DNA疫苗都需要一个类似的初始步骤，即确定正在开发的疫苗的抗原的基因序列（图2）。对于DNA疫苗，基因序列将被克隆到DNA载体中，如质粒DNA，并伴有选定的启动子和增强子以实现优化的转录。DNA载体首先在细菌中扩增，然后从细菌培养中收获。分离和纯化后，它们被重新溶解在水溶液中，准备用于给药。 图2. mRNA和DNA疫苗的生产。（左）生产mRNA-LNP疫苗的一种常见方法。（1）将目标抗原的遗传序列插入到一个环形DNA载体中。（2）然后在细菌中扩增环形DNA并分离出来。（3）线性化环形DNA模板后，遗传序列被（4）体外的噬菌体聚合酶转录成mRNA，并且（5）通过高性能液相色谱（HPLC）纯化mRNA转录本。（6）mRNA与脂质在微流体混合器中迅速混合，导致mRNA被脂质瞬间包裹并沉淀为自组装的纳米颗粒（mRNA-LNPs）。（7）通过透析或过滤纯化mRNA-LNP溶液，以去除非水溶剂和未包裹的mRNA。（8）纯化的mRNA疫苗产品在无菌瓶中包装，供使用前准备。（右）生产DNA疫苗的一种方法。（1）将目标抗原的遗传序列插入到质粒DNA载体中。（2）然后在细菌中扩增质粒DNA并分离出来。（3）通过HPLC纯化质粒DNA后，（4）得到的DNA疫苗产品在无菌瓶中包装，供使用前准备。 mRNA疫苗的设计需要相同的初始步骤，即基因序列鉴定。但是，mRNA疫苗的生产涉及更多的步骤，因为它依赖于双链线性DNA作为模板，如线性化的质粒DNA，其本身可以作为DNA疫苗。模板包含感兴趣的序列和通常来源于T3、T7或SP6噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶启动子。mRNA是通过体外转录（IVT）从模板产生的。通过在DNA模板的3′端包含或在IVT后通过酶反应，将聚(A)尾添加到mRNA转录本。由于mRNA分子不稳定，并且在宿主内给药后高度易受核酸酶降解，裸mRNA很少用作疫苗。相反，mRNA被包裹在纳米颗粒（NPs）中，如LNPs，以稳定mRNA，保护其免受降解，并促进其进入细胞。用于mRNA疫苗的LNPs，如针对COVID-19大流行的Comirnaty（辉瑞-BioNTech）和Spikevax（Moderna），通常包含4种不同类型的脂质：可电离阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。脂质与纯化的mRNA在微流体混合器中迅速混合，形成mRNA-LNP复合物。经过透析或过滤以去除未复合的成分后，mRNA-LNP重新分散在通常含有磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或Tris（三甲胺）（pH 7-8）的盐溶液中。NPs的设计和筛选是耗时的，因为已经开发了成千上万的NPs用于不同的目的，选择最佳的一种用于特定的mRNA疫苗取决于目标组织/器官和细胞类型、mRNA大小和序列、期望的佐剂作用以及可接受的炎症水平。通过传统实验筛选NP库是识别特定设置中最佳配方的常见方式，但可能成本高昂且耗时。随着机器学习和计算方法的最新进展，这一问题可以得到缓解，这些进展有潜力显著加快这一过程并降低成本。 除了NPs的设计和筛选，通常用于LNPs的材料，如可电离脂质，可能很昂贵。Moderna mRNA疫苗的脂质成本为每剂2.85美元。从2020年7月到2022年7月，美国政府花费了253亿美元购买辉瑞和Moderna COVID-19疫苗，平均每剂20.69美元。没有政府支持，美国那些无保险和保险不足的个人可能面临财务障碍。生活在低收入和中等收入国家的人的成本障碍将更高。mRNA疫苗的成本效益因此仍然是一个问题，需要解决。 由于不需要LNPs，DNA疫苗的开发和生产成本明显低于mRNA疫苗，但由于与临床前和临床试验以及政府法规相关的成本，仍然不特别便宜。在印度获批紧急使用的COVID-19 DNA疫苗ZyCov-D的报告价格为每剂3.57美元。 随着越来越多的mRNA和DNA疫苗进入临床试验和公共使用，预计它们的价格将下降，但也应该考虑大幅降低设计、制造和原材料成本的策略，特别是对于mRNA-LNP疫苗。 2.2.运输和储存要求 为了防止mRNA和LNPs的结构变化，mRNA疫苗必须在（超）低温下长期储存和运输。目前Moderna和辉瑞的COVID-19 mRNA疫苗分别需要在-15至-25°C和-60至-90°C之间冷冻储存。对于短期储存，Moderna mRNA COVID-19疫苗在室温下稳定长达12小时，在2-8°C下稳定长达30天；辉瑞-BioNTech mRNA COVID-19疫苗在室温下稳定长达2小时，在2-8°C下稳定长达5天。两种疫苗的温度要求差异的确切原因尚待确定。此外，已经表明，在25°C下储存7天的mRNA LNPs导致转基因表达比在-30°C下储存的减少90%以上。 关于mRNA疫苗在延长储存期间的稳定性以及LNPs中mRNA封装对疫苗稳定性的影响，公开可用的数据很少。保持mRNA疫苗在（超）低温下增加了储存和运输的成本，并限制了mRNA疫苗在全球所有地区或国家的可获得性。这可能导致疫苗获取的不平等，导致疫苗接种率和医疗结果的不均衡。解决这个问题的一个潜在解决方案是对mRNA-LNPs进行冻干，因为Muramatsu等人已经证明冻干的mRNA-LNPs可以在室温下保持物理化学稳定性长达12周，在4°C下超过24周，而不损害它们在小鼠中的免疫原性。Popowski等人也表明，冻干的mRNA疫苗干粉在室温下稳定一个月。在含有蔗糖的溶液中储存mRNA-LNP产品也可以提高其稳定性。为确保有效的全球分发，疫苗应具有足够长的保质期，理想情况下在冰箱可达到的温度（2-8°C）或以上。在这方面，DNA疫苗比mRNA疫苗更好，因为DNA的卓越热稳定性允许它们在4°C甚至环境温度下运输和储存，使它们成为控制资源有限的发展中国家和农村地区传染病传播最有希望的候选疫苗。例如，在印度获得紧急使用授权的COVID-19 DNA疫苗ZyCoV-D，可以在2-8°C下储存，并且在至少三个月内稳定在25°C，保留美国食品药品监督管理局（FDA）要求的所有规格。乙型肝炎的重组DNA疫苗（Engerix-B）可以在45°C下储存一周或在37°C下储存一个月。涉及138名健康成年人的临床研究结果表明，与在4°C的正常储存条件相比，这两种储存方式都没有改变疫苗诱导的保护性抗体滴度。DNA疫苗的显著热稳定性使得运输和储存变得容易，减轻了与冷链要求相关的挑战，并最小化了因冷链中断而导致的疫苗浪费风险。 2.3.剂量和保护效力 当前的DNA疫苗在临床试验中比mRNA疫苗具有更低的效力，并且需要更高的剂量来产生有效的免疫反应。对于初次接种COVID-19疫苗（附录表1），辉瑞的mRNA疫苗以两剂，每剂30微克的形式给予，Moderna mRNA疫苗包含两剂100微克的剂量；相比之下，ZyCoV-D被批准为三剂方案，每剂含有2毫克质粒DNA，分别是辉瑞和Moderna疫苗mRNA剂量的100倍和30倍。据报道，ZyCoV-D的两剂方案，每剂3毫克，在临床试验中产生了相当的保护，但低于6毫克的总剂量仍需验证有效的疫苗接种。 最初的单价Moderna和辉瑞mRNA疫苗在2020年的3期临床试验中对COVID-19的效力相似（附录表1），Moderna疫苗在预防COVID-19疾病方面的有效性为94.1%，在预防严重病例方面的有效性为100%，辉瑞疫苗在预防COVID-19方面的有效性为95%。然而，尽管使用了更高的剂量，ZyCoV-D的效力较低——在接种两剂后预防COVID-19的有效性为66.6%，在预防严重和中度病例方面的有效性为100%（附录表1）。值得注意的是，ZyCoV-D的3期临床试验发生在印度Delta株流行期间，这可能是单价DNA疫苗相对较低效力的直接原因。 两种疫苗平台之间在剂量和效力方面的巨大差异主要是由于DNA传递在启动抗原生产之前的细胞内障碍更大。无论注射途径如何，DNA疫苗都需要克服细胞膜和核膜的生理屏障，才能到达细胞转录机制。之后，从DNA转录的mRNA离开细胞核并在细胞质中进行翻译。相比之下，mRNA疫苗在被翻译成目标抗原之前不需要到达细胞核，LNP配方中的可电离阳离子脂质可以大大促进细胞表面的跨膜运输和细胞内mRNA的内质网逃逸。因此，开发策略以克服DNA疫苗传递的生理屏障对于提高其效力和减少所需剂量至关重要。 基于mRNA和DNA疫苗治疗癌症的临床数据也已经发表，尽管与COVID-19疫苗研究相比，涉及的患者数量较少。在针对多种自体癌症的1/2期试验（NCT03480152）中，包括肝细胞癌（HCC），编码新抗原的mRNA疫苗每两周肌肉注射一次，最多4剂，剂量为0.13毫克或0.39毫克。所有接种疫苗的患者（100%，2名患者中的2名在任何剂量水平）显示出循环抗原特异性T细胞的增加。然而，他们中没有人（在任何剂量水平）显示出对治疗的临床反应（客观肿瘤退缩）。 在完成的1期研究（NCT00199849）中，使用NY-ESO-1质粒DNA疫苗（pPJV7611）治疗表达NY-ESO-1或LAGE-1抗原的各种肿瘤患者，如非小细胞肺癌（NSCLC）。参与者在近距离的不同位置通过粒子介导的表皮传递接受pPJV7611。第一组参与者接受了4×1微克pPJV7611在4个不同位置的传递；第二组参与者接受了8×1微克pPJV7611在8个位置的传递；第三组参与者接受了2×4微克pPJV7611在2个不同位置和4个不同时间（第1、3、5和8天）的传递。治疗在4周和8周后重复。研究报告表明，在第一次疫苗治疗后13周，所有三个队列中对肿瘤反应的受试者数量为0（0.0%）。在多达13周内具有NY-ESO-1特异性CD4+T细胞免疫的受试者数量分别为第一队列3（100.0%），第二队列5（83.3%），第三队列7（100.0%）。在多达13周内具有NY-ESO-1特异性CD8+T细胞免疫的受试者数量分别为第一队列1（33.3%），第二队列0（0.0%），第三队列1（25.0%）。 这些研究中取得的有限效力可能归因于给予患者的质粒DNA或mRNA疫苗的低剂量以及缺乏与其他免疫治疗剂的联合使用；否则，在临床研究中观察到了有利的结果。在针对晚期HCC的1/2期试验（NCT04251117）中，一种编码多达40个新抗原的个性化治疗性癌症DNA疫苗（GNOS-PV02）与编码白介素-12（pIL12）的质粒共同配制，并以1毫克GNOS-PV02和0.34毫克pIL12的剂量每3周一次皮内注射给参与者，随后进行电穿孔。在前四次治疗中，参与者接受了1毫克GNOS-PV02和0.34毫克pIL12的剂量，随后每9周一次直至第二年结束，之后每12周一次直至第五年结束。此外，参与者每3周接受一次200毫克的PD-1抑制剂pembrolizumab治疗，为期2年。治疗结果很有希望，因为新抗原特异性T细胞反应率为86.4%（22名可评估患者中的19名），客观反应率为30.6%（36名患者中的11名），其中8.3%（36名患者中的3名）实现了完全反应。 在另一项1/2期研究（NCT03164772）中，NSCLC受试者要么接受Durvalumab（一种抗PD-L1抗体）和包含6个编码不同肿瘤相关抗原（MUC1、Survivin、NY-ESO-1、5 T4、MAGE-C2和MAGE-C1）成分的BI 1361849 mRNA疫苗的联合治疗（A组），要么接受Durvalumab、Tremelimumab（一种抗CTLA-4抗体）和BI 1361849 mRNA疫苗的联合治疗（B组）。BI 1361849 mRNA疫苗的每个成分分别以80微克的剂量给予两次。在研究期间，每位参与者共接受了12次mRNA皮内注射（总共960微克mRNA）。A组估计的中位无进展生存期为2个月，B组为1.8个月。在第8周无进展的受试者数量分别为A组11（47.8%）和B组11（32.4%）。这些数字在8周到第24周之间随时间单调下降。 2.4.不良事件和安全数据 2.4.1.常见观察到的不良事件 mRNA和DNA疫苗相关的不良事件（AEs）通常与注射外来物质有关，如核酸、水溶液和脂质纳米颗粒（LNPs），尽管在一些研究中，ZyCoV-D疫苗注射相关的AEs低发生率归因于使用无针皮内注射系统而非针头。大多数mRNA或DNA疫苗接种相关的AEs轻度至中度。大多数可用数据基于COVID-19疫苗的临床研究。比较两种平台COVID-19疫苗的表现，DNA疫苗在诱发和非诱发AEs的严重程度和发生率方面比mRNA疫苗展现出更好的安全档案。在mRNA-1273的3期临床试验（附录表2）中，接种组比安慰剂组更频繁地报告诱发AEs，第一剂后（87.8%对48%）和第二剂后（92.2%对42.8%）。并且局部和全身AEs的严重程度和发生率在第二剂后比第一剂后增加。在ZyCoV-D的3期临床试验（附录表2）中，接种组（4.49%）和安慰剂组（4.47%）之间诱发AEs的发生相似。中期分析还表明，疫苗作为加强剂对接受者来说耐受性良好，因为与第一剂相比，第三剂后AEs的频率没有增加，大多数报告的事件是在第一剂而不是第二剂或第三剂后。这与mRNA-1273试验的结果形成对比，表明重复接种会引发更强的诱发AEs。mRNA-1273和ZyCoV-D的非诱发AEs与相应的安慰剂组相似，但mRNA-1273的发生率高（23.9%）比ZyCoV-D试验（3.27%）。有趣的是，尽管ZyCoV-D使用的核酸剂量是mRNA-1273的30倍，但ZyCoV-D的AEs严重程度和发生率更低。这可能归因于mRNA-1273中使用的LNP在ZyCoV-D中不存在。然而，重要的是要注意，这两项临床试验由不同的科学家在不同的国家和人类群体中进行，这可能会使不同疫苗报告的AEs之间的比较复杂化。与ZyCoV-D类似，另一种DNA疫苗COVID-eVax在1期试验中显示出在第二次免疫后全身和局部诱发AEs的发生率比第一次后低。第一次后局部为35-87%，全身为40-50%，第二次后局部为20-55%，全身为30-45%，取决于疫苗剂量。这些发生率高于ZyCov-D，可能由于COVID-eVax使用了不同的给药程序：肌肉内针头注射后通过移动电脉冲发生器进行电穿孔，这些程序更具侵入性和炎症性。DNA疫苗作为加强剂比mRNA疫苗更易被耐受的原因尚不清楚，了解它们的分子机制对于设计更好的平台很重要。对于mRNA和DNA疫苗在预防除COVID-19以外的疾病方面的安全性数据也有一些，但不多。例如，一项mRNA疫苗已在临床试验中用于预防狂犬病。在10%的接受者中观察到3级全身AEs，这些被归因于mRNA疫苗的炎症特性。 2.4.2.其他安全问题 除了常见的AEs外，关于DNA疫苗的一个主要担忧是其可能被整合到受体细胞的基因组中，因为它们需要进入细胞核以表达抗原。已经进行了大量研究以确定DNA整合到人类染色体的风险，从而激活致癌基因或增加染色体不稳定性。这些研究的数据表明，这种风险低于由自发基因组突变引起的风险。人类临床试验研究进一步证实了DNA疫苗的安全性和耐受性，尽管仍需要更多的长期临床数据来完全解决这一安全问题。另一方面，mRNA疫苗在患者中相对安全，因为它们在宿主中的保留时间相对较短，mRNA不太可能进入细胞核。对于mRNA疫苗，超敏反应是一个主要问题。它们是由某些材料如非天然脂质的传递载体引起的。在一项临床前研究中，Ndeupen等人表明，一些已经过仔细表征并在临床前mRNA疫苗研究中广泛使用的商业LNPs具有高度炎症性，并导致动物中高死亡率（约80%）。还有临床证据表明，COVID-19的一些mRNA疫苗中的聚乙二醇（PEG）可以诱导血液中的抗PEG抗体，导致过敏反应。然而，报告的结果相互矛盾。Carreno等人的研究表明，BNT162b2接种患者的血清中未检测到PEG特异性抗体，并且过敏反应与mRNA-1273诱导的抗PEG抗体之间没有明显的相关性。此外，mRNA疫苗接种诱导的抗PEG抗体对疫苗效力的影响仍然未知。Kozma等人的一项研究表明，这些抗PEG抗体可能会降低疫苗效力，而Guerrini等人和Ju等人的其他研究表明，抗PEG抗体对mRNA疫苗产生的抗刺突中和抗体没有影响。因此，PEG对mRNA疫苗的潜在不良影响仍然是一个活跃的研究和辩论领域。需要更多的研究和监测数据来对这个问题得出明确结论。与此同时，已经开发了下一代PEG衍生物，如POEGMA，作为改善药物和基因传递的替代聚合物。这些聚合物具有与PEG相似的功能属性，但引起的抗PEG抗体较少。它们可能被用来稳定mRNA疫苗。mRNA和DNA疫苗的另一个潜在安全问题与反复接种可能产生的抗mRNA或DNA反应和诱导全身自身免疫疾病有关。但发表的研究有限，以解决这个问题。一项关于癌症DNA疫苗的1期临床试验报告称，在66名注册患者中，没有检测到抗双链DNA抗体或PBMCs中的质粒，并且报告称没有接受者出现自身免疫疾病的症状，但需要更大规模的临床研究的证据来完全解决这一问题。总体而言，迄今为止mRNA和DNA疫苗显示出良好的安全档案，并且由于安全问题而退出临床试验的疫苗候选者很少。有必要进行更多的研究和分析，以全面评估安全方面，为在行业和临床中建立更好的标准和法规。 2.5.临床使用的批准 由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D获得了印度药品监管总局（DCGI）在2021年8月批准的紧急使用限制，迄今为止，它是唯一获得批准的DNA疫苗。它包含一个编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白和免疫球蛋白E（IgE）信号肽的单一质粒DNA，以促进转染细胞的分泌。 康希诺（研究名称：BNT162b2）由辉瑞-BioNTech开发，于2020年12月获得美国FDA的紧急使用授权（EUA），适用于成人，并于2021年8月获得同一机构的批准，用于预防16岁及以上个体的COVID-19。斯皮克瓦克斯（研究名称：mRNA-1273）由Moderna开发，于2020年12月获得美国FDA的EUA，适用于18岁及以上个体。其在成人中的完全批准于2022年1月获得。斯皮克瓦克斯和康希诺及其后续加强疫苗的更详细的临床试验和批准历史在图3中说明。到目前为止，它们是唯一获批用于常规临床使用的mRNA疫苗。更多的DNA和mRNA疫苗用于预防和治疗许多其他疾病，目前处于不同的临床试验阶段，并已显示出令人兴奋的疗效和安全数据。我们将在第3.1节中更详细地讨论正在进行和已完成的临床试验。作为首批展示强大保护效果并获得批准的疫苗，mRNA疫苗在COVID-19大流行期间受到了公众和研究领域的前所未有的关注。它们在大流行情况下的历史性批准以及后来在预防疾病传播方面的出色表现，使它们立即比DNA疫苗处于更有利的位置。当前的资金和研究重点显然倾向于mRNA疫苗，原因之一是更高的效力和较少的公众对基因插入突变的担忧。然而，考虑到上述讨论的所有DNA疫苗的独特优势，mRNA疫苗的成功不应成为忽视DNA疫苗的理由。同样，正如我们社会在应对COVID-19大流行中的经验所证明的那样，平行开发多种替代疫苗平台也很重要，在大流行之前，mRNA疫苗也基本上被忽视，不被认为是与基于蛋白质和病毒的疫苗相竞争的。 图3. COVID-19 mRNA和DNA疫苗的临床试验及里程碑。辉瑞-BioNTech于2020年4月开始对其COVID-19 mRNA疫苗候选物BNT162b2进行I/II期临床试验，随后在2020年7月进行了II/III期试验。BNT162b2（商品名：Comirnaty）是首个获得美国紧急使用授权（EUA）的COVID-19疫苗——成人使用的EUA于2020年12月授予。2021年8月，FDA完全批准Comirnaty用于16岁及以上个体。Moderna于2020年3月开始对其COVID-19 mRNA疫苗候选物mRNA-1273进行I期临床试验，5月进行II期试验，7月进行III期试验。美国FDA于2020年12月授予mRNA-1273（商品名：Spikevax）紧急使用授权，紧随Comirnaty之后获得紧急使用授权。2022年1月，FDA完全批准Spikevax用于成人。印度制药公司Zydus Cadila于2020年7月开始对其COVID-19 DNA疫苗候选物ZyCoV-D进行I/II期临床试验，并于2021年1月进行III期试验。2021年8月，印度药品监管总局（DCGI）批准ZyCoV-D在印度限制性紧急使用。 3.mRNA和DNA疫苗的正在进行开发 本节重点讨论已完成和正在进行的mRNA和DNA疫苗的临床试验结果，这些结果可能影响它们未来的临床使用，改进空间，以及新平台的开发。 3.1.已完成和正在进行的临床试验 尽管目前获批的mRNA和DNA疫苗仅用于COVID-19，但正在进行的研究正在扩大它们的应用范围，以应对其他疾病。在COVID-19 mRNA和DNA疫苗取得胜利后，核酸疫苗（图4）的临床试验数量和规模都有了显著增加。 图4. mRNA/DNA疫苗技术的临床应用。mRNA和DNA疫苗已在临床试验中广泛测试，用于治疗癌症和预防传染病，如SARS-CoV-2、流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、寨卡病毒（ZIKV）。目前涉及传染病临床试验的mRNA和DNA疫苗编码一种或少数几种蛋白（抗原），例如SARS-CoV-2的刺突蛋白、流感的血凝素（HA）、RSV的融合（F）糖蛋白、HIV的包膜（Env）蛋白、寨卡病毒的前膜和包膜（prME）蛋白以及寨卡病毒类病毒颗粒（VLP）。对于当前临床试验中的癌症疫苗，mRNA和DNA编码的蛋白包括个性化的新抗原、致癌病毒抗原（例如HPV E6和E7致癌蛋白）以及肿瘤相关抗原（TAA）。此外，mRNA和DNA已被用作遗传佐剂，编码细胞因子，如白介素-12（IL-12）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以增强对抗原的免疫反应。 3.1.1.mRNA疫苗的临床试验 mRNA疫苗涉及的临床试验目标包括流感、疟疾、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、巨细胞病毒（CMV）、结核病、狂犬病和寨卡病毒（ZIKV）（附录表3）。此外，mRNA疫苗已在临床上用于癌症治疗，如非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌、胰腺腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌等（附录表3）。 在撰写本综述时，目前有301项mRNA疫苗的临床试验正在进行，15项试验已被终止或暂停，129项已完成。它们大多数处于1期、2期或1/2期。所有24项已完成的3期或4期试验都与SARS-CoV-2有关。目前在3期试验中活跃并有积极中期结果的候选疫苗之一是Moderna的mRNA-1345（ConquerRSV），用于对抗RSV感染。该疫苗基于LNP平台，编码一种名为预融合F糖蛋白的RSV蛋白。尽管大多数以前的针对RSV的mRNA疫苗临床试验由于中和抗体产量不足而失败，Moderna最近（2023年1月）宣布了其ConquerRSV 3期关键效力试验的积极数据，涉及超过37,000名60岁及以上的成年人，声称“已经实现了主要效力终点，包括针对RSV相关的下呼吸道感染（RSV-LRTD）的疫苗效力为83.7%（95.88% CI：66.1%，92.2%；p < 0.0001），如定义的两个或更多症状。”2023年1月，美国FDA授予mRNA-1345突破性疗法认定，适用于60岁及以上的成年人。辉瑞和Moderna都已启动了基于mRNA的流感疫苗的临床研究。mRNA-1010是Moderna评估的五种流感疫苗候选之一，是一种四价疫苗，编码来自四种季节性流感病毒的血凝素（HA）蛋白，包括A/H1N1、A/H3N2、B/Yamagata和B/Victoria谱系。2023年2月，Moderna宣布了mRNA-1010 3期临床试验的中期安全性和免疫原性结果。根据新闻稿，与活性疫苗对照相比，mRNA-1010在A/H3N2和A/H1N1的血清转换率上表现出优越性，在A/H3N2的几何平均滴度（GMT）比率上表现出优越性，并且在A/H1N1的GMT比率上表现出非劣性。然而，对于流感B/Victoria和B/Yamagata谱系菌株，血清转换率或GMT比率的非劣性未达到。另一种四价流感疫苗候选是辉瑞开发的modRNA。正在进行的一项3期主动对照研究（NCT05540522）涉及53,200名参与者，旨在评估modRNA的安全性和效力，并预计将在2024年完成。 3.1.2.DNA疫苗的临床试验 DNA疫苗的临床试验针对的传染病包括SARS-CoV-2、寨卡病毒、乙型肝炎、流感、HIV等（附录表4）。值得注意的是，DNA疫苗在临床试验中用于治疗癌症已有相对较长的历史，如三阴性乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、人乳头瘤病毒（HPV）、宫颈癌和卵巢癌（附录表4）。但很少有完成和正在进行的癌症DNA疫苗试验通过了2期。 一个例子是针对晚期、erb-b2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）阳性乳腺癌的治疗性DNA疫苗（pNGVL3-hICD）的1期试验，共有66名患者。该试验在2001年至2010年间在美国华盛顿州的Fred Hutchinson癌症中心进行，监测疫苗毒性10年。试验中使用的疫苗是一种质粒DNA，编码ERBB2的细胞内域（ICD）；它以递增剂量（10 μg、100 μg、500 μg）皮内注射，固定剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）蛋白（100 μg）作为佐剂。结果分析表明，大多数患者对ERBB2 ICD的1型免疫反应呈剂量依赖性；反应显著且持久，并与外周血液中中央记忆T细胞的增加相关。疫苗在患者中耐受性良好——大多数与疫苗相关的AEs为1级和2级。在患者的PBMCs中未检测到抗双链DNA抗体或疫苗质粒，并且没有接受者出现自身免疫疾病的症状。在根据不同剂量组的73.5-118.6周的中位随访期间，只有一名患者（在100 μg剂量组）在注册后2.2年发展为可能与疫苗接种相关的淋巴细胞性结肠炎。接种疫苗后一年以上观察到的其他AEs不被认为是与疫苗接种相关的。这些观察结果表明，用治疗性ERBB2 ICD DNA疫苗免疫具有有利的短期和长期安全档案，以及显著、持久的Th1反应水平。因此，DNA疫苗目前正在低表达ERBB2的患者中进行随机2期试验（NCT05163223）。 直接比较DNA和mRNA疫苗的试验清楚地指出，mRNA目前比DNA更受青睐——几乎所有处于第三阶段的核酸疫苗试验都是基于mRNA而非DNA，这表明了早期mRNA试验取得了更好的结果。mRNA试验通常规模更大，表明资金更容易获得，公众对mRNA疫苗的接受率更高。然而，由于RNA和DNA平台都在快速发展，未来情况可能会改变。考虑到它们的独特优势，如果DNA疫苗的效力得到提高，特别是在针对特定疾病的应用场景中，DNA疫苗可能是一个更好的选择。 3.2.疫苗改进 核酸疫苗的历史相对较短，但仍在积极开发中，以满足广泛的应用需求，并在效力、安全性和稳定性方面进行优化。还进行了大量研究，以确定mRNA和DNA疫苗的物理、化学和生物特性，以及免疫反应的分子机制。正在进行的研究将解决当前的限制，并创造一个临床应用的格局，展示针对特定疾病mRNA和DNA最合适的平台。 3.2.1.mRNA疫苗的改进 mRNA疫苗的改进主要集中在RNA及其序列修饰、LNP递送系统、抗原的选择和组合以及佐剂。多个mRNA结构元素已成为修饰的目标，包括非翻译区（UTRs）、5′端帽、开放阅读框架（ORF）和聚（A）尾。为了减少mRNA的免疫原性并增强翻译效率，通常使用诸如5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿苷（ψ）核苷等碱基对修饰。这些修饰的核苷酸能够避开由干扰素（IFNs）诱导的抗病毒途径，这些途径特别针对并降解入侵的mRNA。结果，核苷酸修饰的mRNA疫苗大大增加了抗原的翻译效率，并诱导较少的非期望炎症反应。 其他修饰，如密码子优化和N1-甲基假尿苷（1 mΨ）核苷替换，也已进行以改善mRNA翻译。密码子优化是必要的，因为通过不同的密码子分配编码相同蛋白的mRNA序列可能具有截然不同的蛋白表达水平。因此，用哺乳动物细胞中常用的密码子替换稀有密码子可以增加抗原产量。 还进行了大量研究以优化mRNA疫苗的另一个重要组成部分，即LNPs。除了在生理环境中保护mRNA免受核酸酶降解和克服细胞内递送障碍外，LNPs还被发现对某些mRNA疫苗表现出强烈的佐剂活性。已经设计和使用了不同的LNPs进行mRNA疫苗制备，并且正在开发更多。选择具有上述最佳功能的同时，在人体中具有低毒性的LNP是一个复杂但值得的任务。为了避免上述LNPs的不良影响，也在探索其他mRNA递送策略，如基于细胞外囊泡、类脂材料、合成聚合物和生物材料。细胞外囊泡是自然分泌的，并被哺乳动物细胞用作细胞间通信的方式，特别是癌细胞。因此它们可以很容易地被重新用作mRNA和其他治疗剂的递送工具，具有出色的生物相容性和安全性，在某些情况下还具有组织靶向效果。 将针对不同抗原的mRNA组合在一个疫苗产品中，可能对单一病原体或一系列病原体诱导更广泛的免疫反应。最近，Arevalo等人已经证明，由20种编码不同血凝素的mRNA组成的多价mRNA疫苗可以保护动物免受所有已知的甲型和乙型流感病毒亚型。除了诱导广泛的交叉反应性免疫反应外，这种通用疫苗策略还可以大大减少针对一组病原体的疫苗接种复杂性，从而节省疫苗开发和部署所需的时间、金钱和努力。 3.2.2.DNA疫苗的改进 DNA疫苗的改进可以分为四个主要类别：抗原的选择和组合、DNA构建设计、DNA递送和佐剂的结合。 第一类别中的策略对DNA疫苗来说并不独特。它们与基于RNA的疫苗相似。目标是确定最佳抗原或抗原组合以实现有效的疫苗接种。 DNA构建设计涉及优化抗原的密码子组成、不同序列的最佳组合以递送几个抗原或融合蛋白与单一载体，以及结合特定启动子、增强子和DNA核靶向序列。例如，使用结合病毒和真核元素的混合启动子，以防止纯病毒启动子可能发生的转录沉默。一个特别针对APCs的启动子允许将抗原和佐剂表达限制在特定细胞类型，如DCs，从而防止调节细胞类型如骨髓源抑制细胞（MDSCs）的耐受。 Ross等人和Bros等人已经证明了使用Fascin-1启动子在小鼠和人类中实现DCs的转录靶向的可行性，Sudowe等人在随后的研究中将Fascin-1启动子应用于DCs靶向DNA疫苗的设计。 将不同抗原通过连接子组合在一个疫苗中，可以用来诱导广泛的CD4+/CD8+ T细胞反应。 与编码不变链的序列融合可以增强抗原加载到APCs表面表达的MHC II分子上。 DNA比mRNA更难递送，因为DNA需要进入哺乳动物细胞的核以表达抗原，这对mRNA疫苗来说不是必需的。在已经开发的不同方法中，电穿孔（也称为“电转染”）迄今为止是最有效和方便的方法。它基于脉冲电场，暂时在细胞质膜中创建孔，允许小的、不透过膜的分子进入细胞质。但较大的分子，如质粒和mRNA主要通过电脉冲触发的内吞作用进入细胞。电穿孔越来越多地用于人类临床试验，以增强DNA疫苗针对不同疾病的效果，包括SARS-Cov-2、HIV和HPV。Dross等人还使用基因枪递送DNA疫苗给猕猴，并证明了与mRNA疫苗相当的免疫反应。 用于改善DNA跨细胞膜递送的其他常见方法基于由各种材料组成的纳米载体，如脂质、聚合物、蛋白质和无机材料。还开发了策略以提高DNA跨核膜递送的效率。例如，Dean等人发现将DNA核靶向序列纳入DNA载体中，使其能够与具有核定位信号（NLS）的内源性蛋白结合，通过核孔复合体（NPCs）促进DNA进入细胞核。 抑制进入细胞的DNA疫苗的溶酶体降解也是提高疫苗效力的目标。然而，截至本综述之时，上述讨论的方法尚未获得FDA批准用于改善人类DNA疫苗递送。 第四类别的策略是将佐剂纳入DNA疫苗中，以增强APC激活和T细胞吸引及极化。佐剂可以是化学药品，如氢氧化铝，或遗传物质，如免疫刺激性的2′,3′-环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。常见的佐剂还包括促炎细胞因子，如GM-CSF。这些细胞因子可以直接作为蛋白质添加，或通过与DNA疫苗共给药的表达载体编码。探索当前佐剂的使用和设计新的强效佐剂可以显著增强DNA疫苗的效果。同时，选择临床用途的佐剂需要额外考虑，特别是在儿童、老年人和有特殊医疗状况的个体，如自身免疫疾病、糖尿病和充血性心力衰竭患者的疫苗接种中。 3.3.核酸疫苗的替代设计 除了广泛使用的mRNA-LNP和质粒DNA平台外，还有激动人心的核酸疫苗新设计正在出现。对于RNA平台，它们包括自我复制RNA（saRNA），由于其在细胞内自我复制的能力，可以在低剂量下导致更高和更长时间的抗原产生，以及与线性RNA相比具有增强稳定性的环状RNA（图5）。DNA平台的新设计包括小圈DNA（mcDNA）和纳米质粒DNA载体，由于它们的较小骨架尺寸，它们显著提高了递送效率和抗原产生水平，以及可以在不整合到基因组中的情况下实现高抗原表达水平的环状DNA载体，因为它在染色体外停留和复制。在此，我们将讨论一些有潜力开启RNA和DNA疫苗新时代的有前景的设计。 图5. 传统mRNA疫苗与自扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）疫苗的比较。(A) 传统mRNA呈线性格式。mRNA进入宿主细胞后（1），被核糖体用于翻译蛋白抗原（2）。同时，由于mRNA的线性结构，它们容易受到核酸酶（包括内切核酸酶和外切核酸酶）的降解（3）。因此，传统mRNA在宿主细胞中的半衰期短，蛋白抗原表达有限。(B) saRNAs包含来自自复制单链RNA病毒的遗传工程复制子。saRNA进入宿主细胞后（1），通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）复合体在宿主细胞中进行自我扩增（2）。这导致宿主细胞中抗原编码mRNA的数量更多、可用时间更长，从而增加了蛋白抗原的产生并延长了其持续时间（3）。与mRNA类似，saRNA也可以被核酸酶降解（4）。(C) circRNA是共价连接的，并包含IRES序列以实现内部核糖体进入。circRNA进入宿主细胞后（1），被用于翻译蛋白抗原（2）。circRNA可以被内切核酸酶降解（3），但由于其共价闭合的环状结构，降解速度比mRNA和saRNA慢（4）。因此，circRNA更稳定，在宿主细胞中的半衰期更长。从这些RNA翻译的蛋白抗原将被转移到抗原呈递细胞（图中未显示）进行处理，并在MHC复合体上呈现以激活宿主的免疫反应。UTR，非翻译区。CDS，编码序列。IRES，内部核糖体进入位点。 3.3.1.自我复制RNA疫苗 自我复制RNA（saRNA）是一种替代非复制mRNA的RNA疫苗平台。它是为了解决传统mRNA疫苗由于mRNA在细胞内半衰期短导致的抗原产生不足的问题，需要重复接种以诱导足够的免疫原性。saRNA包含从自我复制的单链RNA病毒衍生的遗传工程复制子，通常是正链α病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、辛德比斯病毒（SINV）和Semliki森林病毒（SFV）。它们可以作为病毒复制子颗粒（VRPs）递送，saRNA包装在病毒颗粒中。由于缺陷的包膜结构，结果VRPs在最初感染细胞后无法形成传染性病毒颗粒；只有saRNA可以在宿主细胞中进一步扩增。saRNA的细胞内扩增是通过由正链α病毒复制酶基因编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）复合物实现的，它在原位扩增合成的转录物。为了避免病毒载体的隐患，采用了与mRNA递送中使用的非病毒制剂相似的各种非病毒制剂，如阳离子脂质、LNPs、聚合物和硫酸鱼精蛋白，以及电穿孔等物理技术，作为施用saRNA疫苗的替代方法。例如，Hekele等人已经证明了针对H7N9流感的LNP配方saRNA疫苗在小鼠中足够的免疫原性。由于自我复制能力，saRNA可以在比传统mRNA疫苗更低的剂量下施用，以达到类似的抗原表达水平。与每剂需要30和100 µg mRNA的辉瑞和Moderna COVID-19 mRNA-LNP疫苗相比，最近针对COVID-19 saRNA-LNP疫苗（COVAC1）的临床试验仅在2剂方案中每剂使用了0.1-10 µg，并在接种者中诱导了良好的（但不是100%）血清转化。在免疫后6周，接受5.0和10.0 µg疫苗的组别达到了最高的血清转化率（87%）。数据表明，saRNA疫苗在低剂量需求方面有潜力超越传统mRNA疫苗，从而允许剂量节省策略、更好的耐受性和更低的制造成本。尽管需要进一步优化以达到其全部能力，辉瑞公司开发的saRNA疫苗（PF-07852352, PF-07836391, PF-07836394, PF-07836395, PF-07836396, 和 PF-07867246）已进入I期临床试验（NCT05227001）。我们预计未来几年将有更多的saRNA疫苗被设计和临床测试。 3.3.2.小圈和纳米质粒DNA疫苗 小圈DNA（mcDNA）因其与传统质粒DNA疫苗相比的显著特点，目前正在广泛研究其在疫苗接种中的使用。mcDNA消除了质粒DNA中对细菌扩增必需但对哺乳动物细胞表达不必要的原核序列，从而产生了更小的DNA疫苗，提高了基因递送效率和编码抗原的表达。mcDNA疫苗也比质粒DNA疫苗更安全，因为它们避免了对宿主免疫系统识别的原核序列的炎症反应，并防止接受者获得由质粒DNA中包含的抗生素选择标记基因诱导的抗生素抗性。然而，复杂的生产和纯化过程以及与制造相关的高成本目前限制了mcDNA在疫苗接种中的使用。mcDNA通常通过在E. coli中通过一个重组酶如ϕC31整合酶和一个限制酶（RE）如I-SceI进行分子内重组产生，这些酶通过一个可诱导的基因表达系统激活。重组酶促进识别序列（attB和attP）的位点特异性重组，导致形成两个环状DNA分子：具有真核表达盒的mcDNA和包含细菌骨架的小质粒（MP）。然后MP被诱导的RE降解；mcDNA被提取和纯化，其程序与常规质粒DNA类似。为了改进mcDNA生产，正在探索新的方法。例如，Jiang等人开发了一个mcDNA平台，允许整个质粒DNA在体内通过Cre重组酶介导自发转化为mcDNA，并证明了mcDNA平台在保护鸡免受新城疫病毒中的效力。在另一项研究中，Kay等人构建了一个经过基因改造的E. coli菌株，可以通过稳定表达可诱导的ϕC31整合酶和I-SceI同源内切酶高效生产纯化的mcDNAs。到目前为止，mcDNA疫苗尚未在临床上进行评估。 纳米质粒载体被开发出来，旨在解决mcDNA的制造限制，同时保留其优势。纳米质粒使用RNA/RNA相互作用的非编码选择标记系统（“RNA-OUT”）来消除传统质粒骨架中对抗生素抗性标记的需求。由于其较小的骨架大小（<500 bp），纳米质粒载体已显示出在体外和体内都具有强大的转染效率，这一效率比使用传统质粒DNA高出多达十倍。由于这两个优势，它们已被用于流感[222]、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）和埃博拉病毒的疫苗的临床前研究，并与传统质粒DNA疫苗相比显示出增强的免疫反应。EG-70，一种编码视黄酸诱导基因I（RIG-I）激动剂和IL-12的纳米质粒产品，目前正在进行针对非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的I/II期临床试验（NCT04752722）。 4.结论性评论 核酸疫苗是研究和开发中的一个令人兴奋的新领域，其应用范围从预防各种传染病到治疗癌症。在COVID-19大流行之前，核酸在疫苗领域的潜力在很大程度上被忽视了，但基于mRNA和DNA的COVID-19疫苗的批准代表了它们成为与传统病毒或蛋白基础疫苗相比的替代和更好的平台的革命性突破。使用核酸技术在有效性、安全性以及简单性和快速设计和制造方面提供了几个优势。 随着核酸疫苗受到广泛关注，了解哪些平台在特定应用中更合适至关重要。通过本综述中对mRNA和DNA平台的全面比较，平均来看，目前的mRNA疫苗比DNA疫苗具有更高的临床影响，特别是在COVID-19大流行期间。从技术上讲，mRNA疫苗在抗原表达和免疫系统激活方面更有效，需要的剂量更低，并且公众对插入性突变风险的担忧较少。另一方面，DNA疫苗拥有许多其他优势，包括低成本的生产、运输和储存，以及低报告的不良事件（AEs）。 目前，RNA和DNA疫苗都在经历快速的演变，两个平台上都出现了令人兴奋的新技术，这些技术将提高有效性并影响未来在预防、治疗和控制各种疾病中平台的偏好。与此同时，由于RNA和DNA疫苗在临床开发和使用中的历史相对较短，需要更多的研究来优化平台，收集长期的有效性和安全性数据，并了解抗原呈递和免疫反应的分子机制。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。