Daclizumab

1.概述 一个健全的生物制药生产过程受几个要素的支配：集成的工艺设计和关键工艺要素；起始材料的质量；以及质量体系，以确认生产过程是可复制的、一致的和稳健的。工艺设计本身在上游和下游都面临一系列挑战。然而，一个上游工艺和一个能够提供最大回收率的高效纯化工艺可以产出高纯度的产品，这是任何生产过程最理想的特征。 由于生物制药具有复杂的化学结构，目前可用的技术无法合成它们。此外，即使能够合成这些大分子，也很难生产出没有固定结构的分子。因此，生物制药的生产依赖于重组系统，其中DNA产生这些分子；包含感兴趣基因的DNA片段相对容易构建，允许它们作为引擎在活体中制造目标分子。因此，生产生物制药的起始材料是表达目标治疗蛋白的基因改造的细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养系统。 重组制造技术受到专利的广泛保护，包括关键步骤和方法，如目标基因序列的分离（编码所需蛋白）、其扩增、重组DNA的生成、宿主细胞的转化、筛选以及随后选择表达细胞系。例如，美国专利号4,237,224（Cohen等人）现已过期，详细描述了在微生物如大肠杆菌中进行转化过程以生成重组质粒DNA。该专利还描述了制造第一个转化载体的程序。Cohen的专利现已过期，技术已进入公有领域。 重组表达在多种活体系统中进行，如： 原核生物，如古菌和细菌，是单细胞生物，具有外细胞膜，但没有任何膜结合的细胞成分，包括核或线粒体。因此，转录和翻译过程同时进行，mRNA翻译在成熟的mRNA转录本完全合成之前发生。 真核生物，如动物和植物，是多细胞生物，具有核、线粒体和高尔基体；这些也是。转录和翻译过程顺序发生。转录，即DNA到RNA，发生在核中，翻译，即RNA到蛋白质，发生在细胞质中。翻译后修饰（PTMs），是蛋白质功能所需的化学修饰，在蛋白质合成后在内质网和高尔基体中发生（在不同阶段，例如蛋白质折叠前、定位后等）。最常见的PTMs包括糖基化、磷酸化、乙酰化、蛋白水解、特定构象和寡聚反应。这些PTMs的程度和复杂性在真核生物中有所不同。因此，根据要表达的蛋白质，表达系统的选择也有所不同。例如， 糖基化和磷酸化是在简单真核生物如酵母和真菌中发生的至关重要的PTMs。然而，酵母产生的甘露糖残基已经广泛地N-糖基化，这些残基对人类可能具有高度免疫原性。因此，这种表达生物的选择限制在生产简单蛋白质。 需要高度糖基化或其他PTMs的复杂蛋白质最好使用真核生物如哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢[CHO]、人类细胞等）、昆虫细胞和植物细胞来生产。其中，哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，已经成为生产一系列复杂蛋白质（单克隆抗体）最广泛使用的表达系统。超过90%的目前批准的产品，大肠杆菌、CHO细胞和酿酒酵母是最常用的表达系统（宿主）。其他细胞系包括婴儿仓鼠肾（BHK）细胞、小鼠C127、非洲猴肾细胞、激活的淋巴细胞、小鼠骨髓瘤、骨髓瘤NS0和前列腺上皮细胞，除了这些细胞宿主。 表9.1总结了批准的生物治疗蛋白及其用于蛋白质生产的相应宿主细胞系统的例子。 DNA负责生产细胞生存和生理功能所需的蛋白质。重组蛋白表达差异很大——从体内用于结构研究到大规模开发用于生物治疗药物。 转录和翻译分别是基因调控和蛋白质表达的基本机制。遗传密码（DNA）中的信息转录成mRNA。然后，mRNA编码的信息翻译成特定的氨基酸序列，导致形成所需的蛋白质（图9.1）。R DNA是通过一个过程产生的，其中感兴趣的基因首先插入到质粒（例如，病毒）中，然后引入到活细胞（如细菌或哺乳动物细胞）中。质粒修改细胞DNA并迫使它开始产生目标蛋白。 图9.1 重组蛋白表达和生产系统开发流程图 在原核生物中，转录和翻译同时发生，而在真核生物中，这些过程顺序发生，随后是PTMs，进一步改变蛋白质结构或功能，这对于复杂的治疗蛋白至关重要。这些过程是利用活细胞，包括微生物系统、动物细胞和植物细胞，使用重组DNA技术构建所需蛋白质的关键。 根据所需蛋白质的编码构建DNA序列，并插入到宿主系统（也称为生产系统或表达系统）。第3章详细讨论了微生物和哺乳动物表达系统的细胞系开发。 基因插入过程从选择一个宿主质粒开始，该质粒在被指定生产重组蛋白的实体中持有感兴趣的基因（图9.2）。克隆涉及将感兴趣的基因或DNA片段转移到表达载体。 图9.2 pBR322质粒的示意表示，这是最早广泛用作克隆载体的质粒之一 来源：由Ayacop (+Yikrazuul) - 自己的作品，公有领域，commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=11840365 表达载体必须具备以下四个基本关键特征：（i）感兴趣基因盒，（ii）抗生素选择盒，（iii）细菌表达起源（ori），（iv）多个克隆位点链接器，表位标签，蛋白酶识别位点，内质网进入位点和分泌信号。然而，并非所有元素都是必需的。 在图中，箭头表示基因转录的方向。ori表示DNA复制的起源。标记为“amp”和“tet”的区域分别表示抗生素抗性基因氨苄青霉素和四环素。在特定序列（核苷酸）编号处用蓝色标记的区域代表限制酶识别并切割DNA质粒中特定区域的限制位点。 2.表达系统 选择生物体和细胞系类型作为宿主生物是生物治疗生产过程的主要和最重要的方面。制造重组药物的起始材料，也是当今生物制药的主要焦点，是表达目标治疗蛋白产品或感兴趣的单克隆抗体的基因改造的原核生物（细菌）或真核生物（例如，哺乳动物细胞如CHO、酵母、昆虫或细胞）。生物仿制药开发商不必使用与参考产品相同的表达系统，但如果涉及PTMs，则不建议这样做。 系统化的细胞库管理，辅以控制监测和测试，是确保细胞系完整性和生物特征的关键。在声誉良好的存储库或商业细胞系开发商处，可能会有一个受控的环境。在获得新的细胞系时，收集中心通常会对细胞系进行表征，以建立和验证其身份，并确保培养的纯度——对于动物细胞来说，至关重要的是要证明细胞系没有微生物污染和支原体。在细胞系中无意中引入错误（例如，交叉污染、外来病毒污染等）的可能性是无限的，而且相当普遍。因此，在处理所有材料时必须小心，以确保尽可能安全的工作环境。这适用于细胞和处理它们的个人。细胞培养被认为是生物危害，危害程度取决于细胞和实验协议。原代培养有很高的风险携带未检测到的病毒。 生物体的稳健性对生物制造过程的成功至关重要，并决定了商业制造的可扩展性。必须提供生物体的历史证据，从创建的第一阶段开始，到建立用于未来生产的细胞系。鉴于生物制药的高成本，产品滴度、细胞密度甚至产品质量的持续显著改进。例如，在早期，使用哺乳动物培养过程生产的抗体产量相对较低，<0.8-1.0 g/L，而近年来，商业工艺的生产力已提高到>3 g/L。 3.细菌细胞 然而，细菌表达系统（如大肠杆菌、芽孢杆菌、链球菌）能够在没有任何PTMs的情况下进行细胞内和细胞外蛋白表达。使用细菌表达系统生产简单目标药物的关键好处是它们的相对短的倍增时间、易于操作、简化处理、高生产力和成本效益，特别是对于大规模生产。 涉及基因表达、克隆和小规模蛋白生产的蛋白质生产过程，大约需要5-7天才能产生足够的蛋白质（每升从几百毫克到克）。细菌生产系统的营养和通气需求简单，允许在发酵罐中相对直接的放大操作。此外，细菌系统在承受增加操作规模和体积时发生的剪切力方面非常稳健。这些发酵过程可以以批量和分批进料模式运行。自1982年批准Humulin（胰岛素）以来，大肠杆菌是最广泛使用的表达系统，特别是用于小蛋白和肽，最近，它已被用于生产抗体片段和衍生物，如不需要任何PTMs的Fab片段单链可变片段抗体。使用大肠杆菌成功生产的一些重组蛋白包括人生长激素、干扰素α2a和2b、白细胞介素、粒细胞-集落刺激因子、甲状旁腺激素和生长抑素。在欧洲和美国批准的生物制药中，大约39%是使用大肠杆菌制造的。表9.1列出了使用大肠杆菌生产系统生产的蛋白质的例子。 图9.3详细说明了基因表达、克隆和重组细菌细胞生成的过程。 图9.3 细菌表达系统 大肠杆菌表达系统生产非糖基化分子的关键特点包括快速生长速率和基本营养需求，同时不妥协滴度。因此，最佳条件包括温度、pH值、溶解氧、通气和搅拌，以及方便的营养进料，是决定发酵生产力的关键参数。 在大肠杆菌中，重组蛋白的表达和生产发生在细胞内（例如，细胞质、周质）和细胞外（细胞外空间）。通常，以细胞质或周质为目标的蛋白表达往往导致称为包涵体的聚集体，其中包含蛋白。这些包涵体在发酵后从其他细胞组分中分离出来，以提取和纯化蛋白。存在于包涵体中的蛋白以非活性状态存在，需要转换为活性状态。这通常通过溶解和重新折叠来实现，以使蛋白进入其天然构象。大肠杆菌表达系统缺乏进行PTMs（如糖基化、二硫键形成和磷酸化等）的能力和机制。因此，通常使用细菌细胞生产不需要任何PTMs的相对简单的蛋白分子。包涵体的形成可以被认为是有利的，特别是在生产的蛋白容易降解或丧失其活性和功能的情况下。产品在其非活性状态下，安全地储存在这些包涵体中。包涵体通常通过离心回收，并用各种化学物质进行额外洗涤，以获得高纯度的包涵体。为了促进二硫键的形成，通常在蛋白重新折叠期间，可以在溶解和/或溶解后添加适当的氧化还原对（例如，GSH/GSSG）或还原剂如二硫苏糖醇或巯基乙醇，以减少任何不希望的分子间和分子内二硫键的形成。在重新折叠过程中，控制产品/蛋白聚集是确保聚集体有限的关键。这通常通过将介质稀释到相对较低的蛋白浓度和控制速率来实现。额外的处理步骤——溶解和重新折叠，尽管在这些步骤中恢复正确的蛋白构象和活性至关重要，但被认为是不利的，增加了液体处理体积（由于在低蛋白浓度下重新折叠）从而增加了总体成本，并可能降低产量。 细菌生产系统经常遇到的另一个重大缺点是细胞-基质杂质的产生/存在，包括内毒素和宿主细胞蛋白（HCPs）。这要求各种过程控制进行监控，以确保内毒素和HCPs在可接受的限度内，并满足剂量中允许量的监管要求。一些可能需要额外过程控制或监控的常见处理步骤包括细胞裂解步骤、体溶解和重新折叠。因此，下游操作必须非常稳健，能够最大限度地减少这些杂质。其他选择，如体外折叠和N端切割，可以作为整体过程改进。尽管存在这些限制，大肠杆菌细胞仍然很受欢迎，是生产简单蛋白分子的首选。 两种最常用的大肠杆菌菌株是K12和B。表9.2详细说明了源自大肠杆菌B菌株和K12菌株的常用菌株。B和K12菌株的生长特性完全不同。因此，这些菌株的特征和特性必须仔细考虑和评估，以确定适当的菌株作为所需蛋白的表达系统的使用。此外，这些菌株在编码蛋白中的二硫键或甚至编码有毒蛋白方面也有所不同。 近年来，各种新菌株有显著改进，被用于生产生物制药（例如，芽孢杆菌、Ralstonia eutropha、Staphylococcus carnosus）。 4.酵母 酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）是两种作为表达系统越来越多被使用的酵母种类（表9.3）。它们具有高效率（短倍增时间、高细胞密度、由于单细胞生长形态中更好的营养物质传递而获得的高产量）、低发酵成本。1991年，食品药品监督管理局（FDA）授权Novo公司的人胰岛素作为第一个由酿酒酵母菌株S. cerevisiae制造的产品。此后，这种酵母已被用于表达和合成40多种不同的重组蛋白，如胰岛素肽、人血清白蛋白和肝炎疫苗。S. cerevisiae的完整基因组序列已知，FDA已将其指定为“普遍认为安全”。与细菌不同，酵母细胞可以直接将蛋白质表达或分泌到培养基中，表达的蛋白质可以经历PTMs。 酵母细胞具有特征性的坚硬细胞壁。因为酵母细胞将表达的蛋白质分泌到培养基中，与细菌细胞不同，宿主细胞相关杂质的可能性较小，但在细菌细胞中更为突出。与细菌系统相比，酵母表达系统的纯化过程也相对简单（由于产品分泌），并消除了需要额外处理的需求，如回收包涵体、它们的溶解和重新折叠以实现天然蛋白质折叠。尽管有这些优点，酵母系统的缺点之一是缺乏PTMs和意外的单糖和二糖基化形式的目标蛋白，这些可能很难去除。 虽然S. cerevisiae是最常用的酵母，裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和脂解酵母（Yarrowia lipolytica）也有使用。使用S. cerevisiae的普及主要归因于其高细胞密度和快速生长特性，这些特性可以在不影响成本和生产时间表的情况下轻松实现。表9.3详细列出了使用S. cerevisiae生产的重组蛋白。 另一种常用于生物制造的酵母菌株是毕赤酵母（Pichia pastoris）。与S. cerevisiae一样，甲型毕赤酵母（Pichia pastoris）可以生长到非常高的细胞密度，并具有严格调控的表达系统。与S. cerevisiae一样，Pichia pastoris菌株能够将重组蛋白分泌到培养基中或在细胞内表达。毕赤酵母是一种甲型微生物，将甲醇作为其主要能源（碳源），这一特性用于准备表达系统。酒精氧化酶基因1（AOX1）启动子用于克隆感兴趣的基因。在发酵过程中添加甲醇以诱导蛋白表达。处理大量甲醇时必须遵循额外的保护措施，因为它是一种挥发性溶剂。在Pichia pastoris中生产的一些重组蛋白包括人血清白蛋白、人胰岛素、激肽释放酶抑制蛋白、干扰素α2b和微纤溶蛋白肝素结合表皮生长因子样生长因子，等等。该系统的N-糖基化模式与高等真核生物不同，这一观察可以推广到其他酵母菌株。P. pastoris的一个主要缺点是蛋白水解降解，这在高细胞密度培养中尤其成问题。这导致产量和生物活性的损失。提出了各种策略，包括添加蛋白酶抑制剂（例如，苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、苯甲酰胺和蛋白酶抑制剂混合物）、酵母蛋白胨；优化发酵培养条件（例如，pH值）；使用培养基、进料或补充物中的某些特定成分（例如，胱氨酸；使用其他替代碳源；优化诱导策略，正在评估以克服这一挑战。 酵母被认为是大规模生产重组蛋白的理想选择，这些蛋白大多可以在高度复杂的真核生物中生产，这得益于其高度进化但定义明确的遗传系统、高生产力、快速生长、易于放大、能够支持某些PTMs以及减少制造时间和成本。然而，管理酵母中存在的蛋白酶是具有挑战性的，因为这些酶可以降解重组蛋白。 表达载体是酵母生产系统的核心。由于其有丝分裂稳定性，通常使用能够整合并建立在宿主细胞中的载体进行表达研究。对于某些酵母系统，染色体外载体（在宿主细胞中能够自主复制的非染色体DNA）是基因组整合的替代品。表达载体包括酵母启动子/终止子和可选择标记盒，它们允许克隆基因插入下游的分泌领导者。表达载体的这一能力允许异源蛋白从细胞分泌到培养基中。在酿酒酵母中用于蛋白表达的三种最常见载体是： 酵母整合质粒（YIp）：这是单拷贝质粒，可以整合到宿主基因组中。 酵母着丝粒质粒（YCp）：这是复制的单拷贝质粒，用于互补研究。 酵母染色体外质粒（Yep）：这是复制的多拷贝质粒，用于重组蛋白生产。 图9.4展示了使用S. cerevisiae创建目标蛋白表达系统的过程。 图9.4 酵母蛋白表达系统：酿酒酵母 使用S. cerevisiae创建目标蛋白表达系统的典型过程从识别编码感兴趣蛋白的感兴趣基因开始。然后使用感兴趣基因生成cDNA，克隆到细菌系统（有能力的E. coli细胞）。使用选择标记识别携带修改质粒的阳性克隆，然后分离克隆，将其转化为酵母细胞以整合质粒到酵母染色体，并筛选阳性转化子。最后，选择一个高表达克隆并放大，以创建细胞系以进一步生产感兴趣的蛋白。转化到酵母的常用方法包括原生质体转化、使用醋酸锂的全细胞转化和电穿孔。醋酸锂和聚乙二醇的组合也是一种广泛使用的转化方法，主要用于单链DNA。通常，通过应用可选择标记来选择转化子，以便在筛选阳性克隆时可以检测到它们（图9.4）。 使用优势选择标记，如对G418、甲醛、铜离子或环己酰胺的抗性。 通过互补，其中质粒包含宿主菌株中不存在（突变）的功能基因（例如，trp1、his3和ura3）。 针对提高产量、改变N-糖基化组成和提高亲和标签性能的目标工程化酵母菌株的数量正在增加。 尽管酵母细胞具有快速生长、简单的培养基要求和PTMs等优点，但主要缺点之一是可能发生过度糖基化，这可能会显著影响免疫原性，如前所述；鉴于蛋白质在培养基中表达和分泌，蛋白质降解的可能性仍然是一个主要问题。此外，培养基的低氧化还原电位也常常导致二硫键断裂。 重组蛋白的过度表达，导致细胞内积累和低产量，是酵母系统的另一个常见问题，常常导致细胞应激增加。正在开发几种新系统，以促进酵母细胞中重组蛋白的轻松表达。为了改进重组生物制药的处理，CRISPR/Cas9已成功用于酵母工程，以插入特定位点的基因或敲除特定不需要的基因。 5.哺乳动物细胞 细胞培养对人类的影响以及在生物学上取得的进步是巨大的。例如，疫苗、新药实体或抗体药物偶联物、双特异性抗体、细胞治疗和基因治疗等生物制药的进步主要依赖于细胞培养。人们越来越倾向于使用哺乳动物系统（人类和非人类[动物细胞系]）进行生产，特别是对于需要PTMs的复杂蛋白。所有细胞类型在其生长特性、最佳条件和营养需求方面都有所不同。 动物细胞的动态代谢需要多种营养物质。因此，胎牛血清，作为乳制品和牛肉行业的副产品，现在广泛用于细胞培养基。最近对传染性海绵状脑病（TSEs）和血液传播感染的担忧，以及对TSEs和牛海绵状脑病（BSEs）严格的监管要求，导致了大量的无血清、无动物产品甚至无蛋白培养基配方的出现。最近，重组胰岛素、转铁蛋白和牛血清白蛋白（由细菌发酵产生），以及由酵母发酵产生的人类血清白蛋白，已经在各种现代细胞培养过程中替代了动物源血清，而没有显著影响过程性能或产品质量。 哺乳动物细胞对培养条件极为敏感，它们经常对温度、pH值、通气和搅拌速度的微小变化反应过度。在对数生长期，动物细胞的增殖速度比细菌细胞慢，倍增时间为15-48小时。 动物细胞自然比微生物细胞更脆弱，因为它们的细胞壁缺乏强度。因此，它们无法耐受微生物细胞能够忍受的大多数发酵条件，需要使用特制的发酵罐。对于动物细胞的培养友好方法，出现了几种新型的“气升”和“发酵罐”设计，用泵代替叶轮。 在搅拌过程中，传统的叶轮破坏悬浮在培养基中的脆弱细胞的风险很大。尽管使用圆刃叶轮（如用于驱动摩托艇的三叶轮）来产生减少的剪切应力，但它们与细胞接触的剪切力可能同样有害。 在动物细胞的生长和培养中，使用强制空气吹扫或其他方法将空气引入混合物。在悬浮培养中，一些动物细胞系通过在液体介质中浮动而增殖，而其他细胞则需要一个固体基质来粘附在滚瓶的内壁、“中空纤维”生物反应器中的气体渗透聚合物管或微载体珠或塑料微载体珠或平板上。 对于动物细胞培养操作，强制空气吹扫是将空气注入生物反应器培养基的一种方式。培养一些动物细胞（附着依赖性）需要一个坚固的基质，这些基质粘附在滚瓶的内壁、“中空纤维”生物反应器中的气体渗透聚合物管或塑料微载体珠或平板上。某些动物细胞系通过在液体介质中悬浮来增殖。 传统上，附着依赖性细胞（主要是原代细胞系）表现出高水平的表达。为了达到高表达水平，如NS0、CHO、人类子宫颈（HeLa）和HEK-293等流线型细胞系已成功用于悬浮培养。相反，悬浮细胞系被证明更有用和有利，特别是对于更大体积的蛋白质生产程序。 至关重要的是要意识到，一些生物反应器培养条件可能导致细胞凋亡（细胞死亡），这种培养条件可以收集不需要的产品和细胞碎片，这将减慢下游过程。 5.1.非人类细胞系 5.1.1.中国仓鼠卵巢细胞 通常在如CHO细胞、HeLa细胞、非洲绿猴肾细胞（COS）、BHK细胞和杂交瘤等哺乳动物细胞中生产单克隆抗体和需要PTMs的复杂真核蛋白。这些哺乳动物细胞被用来生产单克隆抗体和其他经过PTMs的复杂真核蛋白等生物制药。 在大多数情况下，目标蛋白以原始形式产生，并直接分泌到培养基中。建立一个能够生产从每升几毫克到克的蛋白质的小规模过程可能需要大约4-5个月，从基因组装、克隆生成和选择开始。因为蛋白质在培养基中表达，下游处理是直接的。下游程序应该是健全的，能够消除或最小化宿主细胞蛋白（HCPs）、细胞碎片、核酸和其他在发酵过程中通常产生的组分。由于病毒污染的可能性很大，下游处理过程中必须包括病毒灭活和去除的步骤。为了验证病毒清除，必须应用广泛的控制措施（例如，生产结束时的测试，验证病毒的存在）。在N-1或最终纯化阶段之后，通常的做法是通过降低培养基的pH值来加入病毒灭活步骤，并通过过滤来加入病毒消除步骤。 动物细胞比微生物细胞更脆弱，生长非常缓慢，这使它们特别容易受到剪切力的影响；批次或分批进料培养通常用于抗体合成，而其他重组蛋白可以在持续4-8周的培养中产生。动物细胞的生长比微生物细胞慢，其生长特性也更复杂。此外，这些动物细胞的脆弱性使它们极易受到剪切力的影响。最常用的发酵模式是批次或分批进料培养，但最近的进展使连续培养和灌注同样成功，特别是对于高产量。 培养基的营养需求类型使其相对于用于微生物和酵母蛋白表达的培养基来说极其昂贵。这，加上低表达水平，使得整个生产过程成本过高。然而，鉴于复杂蛋白不能在微生物或酵母细胞中表达，哺乳动物细胞比转基因植物或动物更受青睐。 在细胞遗传学研究中，T. Puck在1957年创造了第一个CHO细胞系。Genentech创造的组织型纤溶酶原激活剂Activase最初在1987年使用CHO细胞生产。自从CHO细胞系一直主导着生物制药行业，作为重组蛋白制造的首选系统，所有目前批准的重组产品都是使用CHO细胞系生产的。最初的CHO细胞系已经被亚克隆很多次，产生了大量变体。生物制造中最常用的细胞系是CHO-K1、CHO DG44和CHO-S细胞，它们源自不同的CHO谱系（图9.5）。这幅图展示了几篇发表的论文的插图，记录了今天广泛使用的CHO细胞系的历史和演变。 图9.5 CHO细胞系 CHO-K1是从原始CHO细胞（卵巢组织分离物）的单克隆产生的第一细胞系。后来，这些细胞被修改用于悬浮和无血清培养基的工业用途。使用这个定制的CHO-K1细胞系开发了几种表达系统。它们与谷氨酰胺合成酶（GS）选择策略结合使用，在这种策略中，感兴趣的基因与GS基因的副本一起被引入宿主细胞，这允许稳定的细胞仅在无谷氨酰胺培养基中被选择。此外，使用甲磺酸乙酯对CHO-K1细胞系进行突变，形成了CHO-DXB11（也称为CHO-DUKX）细胞系，该细胞系缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR）活性。 原始的CHO细胞通过伽马辐射诱变，导致DHFR等位基因的丢失和DHFR缺陷型CHO-DG44细胞系的出现。嘌呤、胸腺嘧啶和其他氨基酸的从头合成，以及CHO细胞的增殖需要DHFR。因此，CHO-DG44细胞必须在含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶（GHT）的培养基中生长。这个特性与GS选择系统在胸腺嘧啶或GHT缺乏的培养基中筛选转化体（选择标记）时的方式相同。如果转化的克隆（表达感兴趣基因和替代DHFR基因的重组质粒DNA）有效地吸收了重组质粒DNA，那么它们将在GHT缺乏的培养基中生长。 作为一种筛选转化DHFR缺陷细胞的选择压力，甲氨蝶呤（MTX）被广泛用于筛选转化体。缺乏DHFR的CHO细胞将在MTX处理的细胞中扩增转基因。MTX与DHFR酶的催化位点结合，阻止二氢叶酸转化为活性形式的四氢叶酸，而四氢叶酸是DNA合成所必需的。通过增加转化的DHFR缺陷CHO细胞（编码感兴趣基因、DHFR和载体）的培养基中MTX浓度来诱导选择压力。这导致DHFR和感兴趣基因在基因组中被扩增，使细胞能够产生更多的重组蛋白。然而，MTX介导的基因扩增可能会导致由于染色体异常导致的克隆不稳定，这是生物制造中的一个重要问题。 CHO-S是CHO细胞的一个亚群，可以在没有锚定或粘附表面的情况下作为悬浮生长（源自CHO pro-5细胞系）。CHO细胞在悬浮中生长的能力是颠覆性的，为在搅拌罐式反应器中大规模重组合成铺平了道路。市售的符合cGMP储存条件的CHO-S细胞可用。 CHO细胞的多样性决定了不同的生长条件、选择压力和用于蛋白表达的培养基，以实现包括PTMs和高细胞密度以及过程的特定生产力在内的功能属性。CHO工艺特别感兴趣的是糖链分布，因为糖链模式的变化可能影响产品质量、功能甚至安全性。在很大程度上，PTMs是细胞系选择和过程条件（包括培养基、进料、补充物、温度、pH值和溶解氧）的结合。因此，优化这些参数是生产满足其关键质量属性的所需产品的关键。 CHO细胞通常用于表达重组蛋白并生成稳定细胞系。使用缺乏DHFR酶的CHO细胞进行重组蛋白表达的标准方法是将目标基因和DHFR基因都克隆到单一的哺乳动物表达系统中。然后，重组DNA质粒（携带两个基因）转染到宿主细胞（DHFR缺陷型CHO细胞）。DHFR基因作为选择标记，只允许转染的细胞在无胸腺嘧啶的培养基中生长。接下来，使用限制稀释法获得单细胞稳定克隆。然后进一步评估这些克隆的表达水平、产品质量和稳定性，以生成表达感兴趣蛋白的最终细胞系。 5.1.2.CHO表达系统 用于大规模制药加工的其他哺乳动物非人类细胞系包括小鼠骨髓瘤细胞系NS0和Sp2/0、BHK细胞、非洲绿猴的Vero细胞和狗的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。Vero和MDCK细胞主要用于疫苗研究，而其他细胞则用于生产重组蛋白。 5.1.3.骨髓瘤细胞 自20世纪70年代以来，骨髓瘤细胞在杂交瘤技术中被使用，已成为抗体开发的主力军，直到最近才被CHO细胞超越用于重组蛋白表达。骨髓瘤细胞的一些优点包括在悬浮培养中生长、使用无血清培养基和易于放大。然而，鉴于骨髓瘤细胞能够产生非人糖型，可能导致免疫原性和不良反应，它们被视为潜在风险。小鼠细胞中内源性逆转录病毒丰富，这使得病毒清除非常繁重。最常用的骨髓瘤细胞系是NS0和Sp2/0，它们已成功用于生产生物制药。例如，Sp2/0细胞系用于生产Remicade（英夫利昔单抗）和Erbitux（西妥昔单抗），NS0用于Zenapax（达克珠单抗）和Soliris（依库珠单抗）以及其他畅销产品。NS0细胞缺乏完整的内源性GS表达，需要在培养基中添加外源胆固醇以促进生长和蛋白生产。使用动物源性成分的风险和合成胆固醇的价格导致了胆固醇独立型NS0克隆的发展。缺乏完全功能的GS被用作识别转染细胞的选择压力。 为了有效使用骨髓瘤细胞，至关重要的是要识别产生这些非人糖结构低水平的克隆。 5.1.4.人类细胞 第一个人类细胞系HeLa于1951年建立。在20世纪60年代，人类二倍体细胞被用于疫苗生产，但当时对肿瘤病毒的担忧阻碍了人类细胞的广泛使用。相反，非人类细胞，即CHO和鼠骨髓瘤细胞系，已成功用于生产批准的重组治疗剂。就人类细胞系而言，HEK293、成纤维肉瘤HT-1080细胞系和Namalwa淋巴瘤细胞已被用于批准的产品。最近，Per.C6和CAP被用于开发中的产品。 HEK293细胞系于1977年建立，自那时以来，它已成为生产重组治疗剂、病毒载体（腺病毒、逆转录病毒和慢病毒）和其他研究用蛋白的多功能系统。HEK细胞可以作为无血清培养基中的悬浮培养。在HEK细胞中生产的四种重组产品（Xigris、Alprolix、Eloctate和Nuwiq）已获批准。 Per.C6于1998年从非肿瘤人类胚胎视网膜母细胞瘤细胞中建立，已被用于腺病毒载体和重组蛋白生产。这个细胞系也可以在无血清培养基中悬浮培养，并能达到高细胞密度。 在重组蛋白生产过程中，哺乳动物细胞通常面临的挑战是低生产力和低过程效率。正在评估稳定和瞬时表达过程，以提高生产力和可扩展性。 6.藻类 绿色微藻，如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），已被用于生产全长人类抗体、信号分子如血管内皮生长因子以及具有强二硫键的结构蛋白如纤维连接蛋白。藻类叶绿体与其他真核物种（如酵母）一样具有表达基因的能力。虽然由于基因沉默减少和蛋白积累增加，藻类核基因组也可以转化，但叶绿体基因组在大多数情况下是迄今为止转基因表达的来源。 使用藻类平台生产了100多种抗体、亚单位疫苗、免疫毒素、亚单位口服疫苗和生长因子。 虽然丝状真菌被广泛用于生产酶，但由于产量低和蛋白质产生的变异性或引入的形态缺陷，它们在重组治疗蛋白生产中的有效利用并不广泛。用于制造重组蛋白的常见真菌包括曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和里氏木霉（Trichoderma reesei）。 7.昆虫细胞 在20世纪90年代，昆虫细胞杆状病毒表达系统被创建为哺乳动物表达系统的替代品。杆状病毒系统迅速获得认可，因为它有潜力将鳞翅目昆虫细胞转化为高水平的表达系统。此外，与酵母和细菌表达系统相比，这些系统具有更好的糖基化能力。昆虫细胞最常见的表达机制是瞬时的。 为了创建表达系统，需要昆虫宿主细胞和病毒载体，例如杆状病毒Autographa californica多重核多角体病毒，简称AcMNPV。杆状病毒是一种在鳞翅目昆虫中经常扩增的裂解性双链DNA病毒。它在脊椎动物中不具传染性，在哺乳动物细胞中的启动子不活跃，这使得它对人类使用是安全的。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf9和Sf21）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）是最常见的昆虫宿主细胞系。为了学术和工业研究与开发，MultiBac，一种复杂的杆状病毒/昆虫细胞系统，已经被设计和使用，以产生包含以前无法获得的组分的多蛋白复合物。自推出以来，已经生产了许多MultiBac载体衍生物，以表达带有可切割N端信号肽的蛋白。 2009年，FDA批准了GSK的开创性昆虫细胞产品Cervarix，一种人类乳头瘤病毒疫苗。 将编码感兴趣基因的重组DNA质粒表达（与含有形成和繁殖病毒颗粒所需的病毒基因的第二质粒）共转染到宿主昆虫细胞中。感兴趣基因插入到一个强启动子后面，杆状病毒基因组转导到昆虫细胞导致病毒基因和感兴趣基因的表达。然后纯化并扩增重组病毒库。在确定的时间点（感染时间）将病毒库添加到宿主细胞中，每个细胞有特定数量的病毒。蛋白生产一直进行到细胞裂解，通常在感染后48小时。昆虫细胞可以在无血清和无蛋白培养基中作为悬浮细胞或细胞团生长。适宜生长的最佳温度大约为27°C–28°C，但昆虫细胞比哺乳动物细胞更容易受到剪切力的影响。昆虫细胞非常适合生产细胞质和分泌蛋白。 7.1.昆虫细胞表达系统：Sf9和Sf21 与哺乳动物细胞相比，昆虫细胞的整个生产周期更快，尤其是从重组病毒的产生到感兴趣蛋白的纯化结束。这个周期大约需要4周才能完成。由于细胞对剪切应变的脆弱性，发酵只以单批或半连续批次进行。在发酵周期中，昆虫细胞数量在大约一周内增加了近50倍，但只有在单批或半连续批次中，因为它们对剪切力的敏感性。 培养基费用从中等（无血清培养基）到昂贵（细菌和酵母培养基）。由于细胞可以在感染前健康培养，该技术非常适合生产危险细胞产品。尽管如此，由于需要特殊通风和高表达水平所需的质粒感染类型，放大是有问题的。 杆状病毒不感染脊椎动物，因此没有健康危险，而外来病毒的风险仍然未知，需要病毒灭活和主动过滤。宿主细胞的反复死亡和随后的裂解导致细胞内蛋白和核酸释放到培养基中，使下游纯化过程承受极大压力（例如，带有包涵体的细菌细胞）。昆虫细胞具有主要的监管轨迹，但尚未有FDA批准的产品。 与哺乳动物细胞培养相比，昆虫细胞培养在成本较低和更容易培养方面具有优势。通过这种技术实现的异源蛋白表达水平通常变化很大，从1到600 mg/L培养基。在10-40 mg/L的蛋白表达水平下，某些胶原蛋白在昆虫细胞中合成。昆虫细胞的一个问题是它们很少产生重组蛋白，因为它们更倾向于将合成的蛋白保留在细胞质中。这一特性归因于使用的转染方法，这可能使下游处理更加困难。杆状病毒表达载体（对人类不具传染性）通常被用作培养昆虫细胞中异源蛋白的表达系统。多亚单位蛋白复合物的生产、共表达蛋白修饰酶以增加异源蛋白生产以及新的杆状病毒展示技术应用是最近的一些进展。 基于昆虫细胞的表达系统有几个缺点，包括非哺乳动物糖基化模式和低生产力。昆虫细胞无法消化最初作为较大的不活性前体蛋白产生的蛋白质（例如，肽激素、神经肽、生长因子和基质金属蛋白酶）。然而，已经研究了几种解决这个问题的方法。一种方法是在杆状病毒中与感兴趣基因共表达这些酶，另一种方法是将哺乳动物糖基转移酶引入昆虫细胞。 8.比较分析 表9.3比较了商业生产重组产品的工业属性，指出了负面属性（因此，较低的评级更受欢迎）。目标蛋白的类型、PTMs、表达水平、知识产权和制造成本影响表达系统的选择。每个当前的表达系统都有自己的优缺点（表9.4）。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导语 社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)是全球主要的传染病负担，是入住ICU的常见病因，指在医院外罹患的感染性肺实质炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染在人院后于潜伏期内发病的肺炎。临床统计约22%～42%的CAP患者需要住院治疗，其中17%～21%的住院患者为重症社区获得性肺炎（SCAP）。SCAP病的原学调查研究表明，SCAP患者最常见的病原体包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和嗜肺军团杆菌等，在免疫功能低下的患者中，肺孢子菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌是最常见的病原体。 SCAP是一种严重且危及生命的感染，治疗方案的核心必须是有效覆盖所有可能的致病菌。许多国家制定了SCAP的诊断和治疗指南，不同的指南有不同的患者分层标准和治疗药物，但总的原则是相同的，即：覆盖解释患者病变特征和当地流行致病菌以及抗生素耐药性的最可能的所有致病菌。 病例分享 55 岁男性，既往体健，因发热咳嗽 3 天入院。 患者 3 天前发热，热峰 40 ℃，伴干咳、胸闷、乏力与反应迟钝、小便失禁。 查体：体温 36.0 ℃，血压 105/56 mmHg，R 35 次/分，指脉氧 92%（面罩无创通气中，氧浓度 60%），嗜睡，呼之能应，两肺湿罗音，心率 90 次/分，律齐，无杂音，下肢无浮肿。 实验室检查： 血常规：WBC 4.05 × 109/L，N% 85.4%，淋巴细胞计数 0.38 ×109/L，CRP > 220 mg/L，PCT 14.99 ng/mL 。 血生化：AST 283 U/L，ALT 91 U/L，LDH > 2150 U/L，BUN 15 mmol/L ，Cr 295 μmol/L，Na+132.7 mmol/L。 血气分析：PH 7.37，PaO266 mmHg（FiO2 60%），PaCO256 mmHg；新冠核酸检测（-）、流感检测（-）。 胸部 CT：提示左肺上叶与右肺中叶炎症。 诊断：重症社区获得性肺炎、呼吸衰竭。 后因氧合持续恶化，急诊气管插管机械通气后收入呼吸科。 当时的值班医生分析，重症社区获得性肺炎（SCAP）病情危重，死亡率较高。使用碳青霉烯类药物联合万古霉素/利奈唑胺，覆盖广谱耐药革兰氏阴性菌和耐药革兰氏阳性菌（包括MRSA），大包围合情合理，因此选择亚胺培南/西司他丁联合万古霉素经验性抗菌治疗。 问 以上方案是否合理？ 不合理！ 答 《中国成人社区获得性肺炎诊断 和治疗指南（2016年版）》推荐 （1）对于无基础疾病的青壮年重症CAP患者，推荐使用青霉素类/酶抑制剂复合物（阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/舒巴坦等）、第三代头孢菌素（静脉注射：头孢曲松、头孢唑肟、头孢噻肟等；口服：头孢地尼、头孢泊肟酯、头孢克肟等）、头霉素类（头孢西丁、头孢替尼、头孢美唑、头孢米诺等）、氧头孢烯类（拉氧头孢、氟氧头孢）、厄他培南等碳青霉烯类联合大环内酯类或单用呼吸喹诺酮类静脉治疗。 （2）对于老年或有基础疾病的重症CAP患者，推荐青霉素类/酶抑制剂复合物、第三代头孢菌素或其酶抑制剂复合物、厄他培南等碳青霉烯类联合大环内酯类，或联合呼吸喹诺酮类。 （3）对于年龄≥65岁或有基础疾病的住院CAP患者，应考虑肠杆菌科细菌感染的可能。进一步评估产ESBL（超广谱β-内酰胺酶）菌感染的风险。高危患者的经验性治疗包括头霉素类、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦或厄他培南等。 （4）对于具有铜绿假单胞菌感染危险因素的CAP，推荐使用具有抗假单胞菌活性的β-内酰胺类药物(头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、氨曲南、哌拉西林/他唑林)、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南/西司他丁、头孢哌酮、美罗培南等），具有抗假单胞菌活性喹诺酮类（环丙沙星、左氧氟沙星），具有抗假单胞菌活性的β-内酰胺类联合喹诺酮类或氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素等），具有抗假单胞菌活性活性β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类三药联合。 该患者为青壮年，无基础疾病，指南没有推荐使用亚胺培南/西司他丁，也没有推荐万古霉素、利奈唑胺等抗MRSA药物。 该患者入院后最初接受经验性亚胺培南/西司他丁联合万古霉素抗菌治疗，但高热持续，氧合状况未见改善。第5天，肺泡灌洗液报告检出嗜肺军团菌，病原学诊断：军团菌肺炎，故患者改用阿奇霉素抗菌治疗。患者病情好转，体温逐渐恢复正常，最终顺利拔管出院。 《2019 ATS/IDSA临床实践指南： 成人社区获得性肺炎的诊断和治疗》推荐 （1）对于无耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）或铜绿假单胞菌感染风险的重症CAP患者，推荐使用β-内酰胺类药物（氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、头孢噻肟、头孢洛林）联合口服大环内酯类药物（阿奇霉素、克拉霉素） 或呼吸道喹诺酮类药物（左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星）。 （2）有MRSA或铜绿假单胞菌危险因素的成人CAP患者应选择抗MRSA药物（万古霉素、利奈唑胺）、抗铜绿假单胞菌药物（哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、氨曲南、美罗培南）。 目前，我国市场上销售的碳青霉烯类抗生素有5个品种：亚胺培南、帕尼培南、比阿培南、美罗培南和厄他培南。 碳青霉烯类抗菌药物抗菌谱广，抗菌活性强，对需氧菌和厌氧菌均具有抗菌作用，特别是多重耐药革兰氏阴性杆菌，如产ESBL肠杆菌科细菌有很强的抗菌活性。 近年来，我国碳青霉烯类抗菌药物临床应用中出现了一些不合理的现象，耐青霉烯耐药革兰阴性杆菌感染的发病率呈快速上升趋势，尤其是碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌、碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌、碳青霉烯耐药大肠埃希菌和碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌等因其高耐药性和快速传播能力，给临床诊疗和感染防控带来巨大挑战。 《抗菌药物临床应用指导原则 （2015年版）》中明确了 碳青霉烯类抗菌药物临床应用的适应证 具有多重耐药性但对此类药物敏感的需氧革兰氏阴性杆菌引起的严重感染，包括肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌等肠杆菌科细菌、不动杆菌属等细菌所致血流感染、下呼吸道感染等。 2021年，BMJ发表的综述《Management of pneumonia in critically ill patients》表明，与非大环内酯类药物相比，β-内酰胺类药物联合大环内酯类药物可显著改善重症CAP患者预后。与氟喹诺酮类药物相比，β-内酰胺类药物联合大环内酯类药物治疗可降低重症肺炎患者的14天和30天死亡率。联合治疗的优点是覆盖非典型病原体，并可能受益于大环内酯类药物的免疫调节作用，以减轻细菌毒力因子和过度的全身炎症反应。 CAP的经验性抗感染治疗必须以临床微生物思维为基础，避免抗菌药物的过度使用，并及时考虑特殊病原体感染或非感染性肺部疾病。 综上所述，对于重症CAP患者，初始治疗为大环内酯类或氟喹诺酮类药物与β-内酰胺类药物联合治疗。β-内酰胺的选择基于假单胞菌风险因素的存在，对于MRSA的额外覆盖基于特定风险因素的存在决定。 根据 IDSA/ATS 指南的建议，只有在患者存在MRSA危险因素（既往MRSA呼吸道隔离、过去90天内住院和过去90天内使用非肠道抗生素，以及当地确认的MRSA的危险因素）时，才针对MRSA进行抗菌治疗，使用药物如万古霉素或利奈唑胺。 参考文献： [1]瞿介明,曹彬.中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2016,39(04):253-279. [2]郑旭婷,陈佰义.社区获得性肺炎经验性抗感染治疗的临床微生物思维[J].中华结核和呼吸杂志,2021,44(06):588-591. [3]中华人民共和国国家卫生健康委员会.抗菌药物临床应用指导原则（2015 年版）[J].chrome-extension://ibllepbpahcoppkjjllbabhnigcbffpi/http://www.nhc.gov.cn/ewebeditor/uploadfile/2015/09/20150928170007470.pdf. [4]中华人民共和国国家卫生健康委员会.碳青霉烯类抗菌药物临床应用专家共识[J]. http://www.nhc.gov.cn/cms-search/xxgk/getManuscriptXxgk.htm?id=95f65ca473b44746b24590e94468b8ff. [5]郑旭婷,陈佰义.社区获得性肺炎经验性抗感染治疗的临床微生物思维[J].中华结核和呼吸杂志,2021,44(06):588-591. [6]黄丹,徐中良.2016—2020年医院碳青霉烯类抗菌药物与常见碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌调查分析[J].临床合理用药杂志,2022,15(14):40-43.DOI:10.15887/j.cnki.13-1389/r.2022.14.012. [7]C Cillóniz, Torres A ,  Niederman M S . Management of pneumonia in critically ill patients[J]. BMJ (Clinical research ed.), 375:e065871. 编辑：Yan