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意义 总结了线性分子如何转化为大环分子的示例。 对线性配体和大环配体及其性质进行直接比较，并分析其背后的分子驱动机制。 基于结构的分析，探讨了当代药物发现过程中线性先导化合物转化为大环分子的关键过渡点。 分析并提供了链连接设计的指南，这是大环优化中的一个重要领域。 引言 大环通常被定义为分子结构中至少包含一个不通过共价桥接的环，且该环含有12个或更多原子的化合物。大自然大量使用大环生成具有生物活性的小分子。这表明，大环能够实现其他分子手段难以达到的性质特征。事实上，许多已批准的大环药物（例如，大环抗感染药物或免疫抑制剂）之所以具有重要作用，正因为它们的大环结构至关重要，因为目前没有非大环类的类似药物具有相似的活性。历史上，大多数临床批准的大环药物都来源于天然产物。然而，过去几十年中，从天然来源发现新活性的大环化合物以满足新靶点需求的速度大大放缓。（1）因此，需要新的方法来挖掘大环的潜力。 大环并不是一个同质的化合物类别：它的定义不仅包括小型药物样化合物（例如，Lorlatinib），还包括分子量远超常规药物空间的夹环肽（例如，ALRN-5281）。鉴于大环的化学多样性，本文聚焦于小型药物样大环的从头设计及其后续优化的努力。我们认为，环肽和天然产物衍生的大环化合物具有显著不同的优势和挑战，这些内容不在本文的讨论范围之内。我们特别关注已发布的药物发现项目中，从“线性”化合物向大环化合物过渡的过程。 由于大环的化学多样性，在文献和化学数据库中系统地查找大环化合物变得更加困难。虽然在数据库中搜索“macrocycle”或“macrocyclic”这样的关键词可以筛选出相关的文献，但要做到更精确的选择（例如，筛选出肽类或金属络合剂）仍然需要手动评估。对于提供结构信息的数据库（例如，http://ligand-expo.rcsb.org/，ChEMBL），可以使用像RDKit这样的工具，搜索包含12个以上原子的环系统（示例代码见附录信息）。作为大环的补充资源，读者还可以参考“Macrocycle DB”数据库（https://macro-db.dpbio.tech/），这是来自济南大学的一个专门收录大环化合物的数据库，截至2024年8月，收录了近18,000个条目。 在过去十年中，美国FDA已批准了七种从头设计的大环药物（见图1）。其中五种针对丙型肝炎病毒（HCV）的NS3/A4蛋白酶，另外两种则针对激酶。纯合成来源的大环药物的临床成功证明了大环的强大潜力可以从第一性原理出发进行从头设计。此外，另外五种大环激酶抑制剂、两种KRAS抑制剂、两种蛋白酶抑制剂和三种MCL1抑制剂目前正在不同阶段的临床试验中（见图2）。 图1. 从头设计的大环抑制剂的FDA批准时间线，包括五种NS3/A4蛋白酶抑制剂（2-6）和两种激酶抑制剂（7和8）。 图2. 从头设计的大环化合物在临床试验中的应用，并与已批准的Lorlatinib（7）和Pacritinib（8）进行结构对比。 大环化合物化的最常见优势包括提高药效、选择性，以及在某些情况下改善ADME性质，包括细胞穿透性。我们通过最新的示例，揭示有利于大环化合物相较于线性分子的趋势和潜在机制。在比较大环分子与“线性”分子时，连接两个（或更多）“线性”分子部分以形成大环的化学基团被称为“连接器”（见图3）。由于连接器是形成大环的关键基团，因此我们在最后部分着重讨论连接器的设计，连接器越来越被认为是调整分子性质的一个额外基团。 图3. 大环化效应的可视化。（A）“线性”配体在溶液中可以采取多种构象。（B）只有一部分溶液中的构象能够有效结合目标。（C）通过连接器将配体的两个远离部分连接起来，可以增加能够有效结合结合口袋的构象比例。 通过大环化提高亲和力和配体效能 大多数小分子在溶液中存在多种构象。当与蛋白质结合时，这种构象通常被称为生物活性构象。然而，并非所有分子都倾向于在溶液中采用生物活性构象，这可能导致在靶点结合时需要付出相当大的能量代价。为了避免这种缺点并提高药物候选分子的亲和力，可以通过构象限制帮助分子固定在特定的构象上，理想情况下是尽可能接近生物活性构象。此时，药物发现过程中需要在两种理想化的情况之间做出选择：第一种情况是溶液中的构象（或构象群）能量低于生物活性构象。这意味着在结合时必须付出由焓驱动的能量代价，这会对最终的结合亲和力产生不利影响。第二种情况是接近生物活性构象的多个低能构象被占据，它们具有相似的能量。通过限制结合过程中可用构象的自由度，可以降低总的结合能量，但这主要是由熵驱动的。这种熵的代价对于灵活分子来说尤其高。实际上，通常存在这两种理想化情况的组合。 大环化是另一种限制和控制分子构象群体的策略。因此，大环化是一种强有力的方法，能够将分子的构象约束和微调，使其尽可能接近生物活性构象，从而提高结合亲和力（见图3）。分子的性质不仅仅是线性类似物和连接器性质的简单相加，而是表现出显著不同的新性质，这些新性质通常优于线性对照物。我们的分析表明，大环化策略通常基于线性分子与其靶标结合的结构信息（例如X射线、NMR或建模）。当分子两部分接近并形成U型或C型生物活性构象时，大环化尤其有吸引力。在大多数研究案例中，分子两端的距离小于10 Å。然而，尽管合成方法随着时间推移有所发展，大环化仍然需要相当大的合成努力。我们观察到，药物研发人员越来越多地收集结构数据，例如通过X射线或NMR结构，并对相关分子在溶液中的构象进行额外分析。这使得大环化过程能更具理性，并且成功率更高。随着化学信息学工具的不断增加，计算化学家在设计有前景的连接器时越来越依赖计算工具。对于一些典型的例子，最终得到的最佳大环也会进行结构和构象分析。这确保了亲和力的潜在提升可以归因于构象控制，而不是由于不同的结合模式或连接器区域与蛋白质的额外接触。 在这个背景下的典型例子是针对第四代突变型EGFR抑制剂的药物发现研究。两个独立的研究小组分别为这个靶标开发了大环化合物，且都使用大环化来进行构象控制。在第一系列（2）中，使用了一套计算与实验相结合的方法，在获得X射线共晶结构后，理解初步线性候选分子的构象群。首先，在真空中计算低能构象，然后进行溶剂化分子的分子动力学模拟。这个数据集进一步通过二维NMR分析进行精细化和验证。尽管分子已经在构象上得到刚性化，但仍然发现了一些与生物活性构象显著不同的低能构象。这一情况特别适合进行大环化，因为生物活性构象也是U型的，且潜在的连接点易于识别。拟议的大环化合物再次通过计算进行构象分析，以确保大环能够采用生物活性构象。预测与生物活性构象最佳重叠的分子随后被合成。最终，最佳的大环化合物相比于非大环化的起始配体，其结合亲和力提高了17倍（见表1，条目1）。在药物发现的第一系列大环化合物中，最常见的连接器类型是简单的烷基链。它们相对易于合成，例如通过环闭重排后再还原双键，但它们表现出相对较高的构象灵活性。尤其是当连接器包含多个重原子时，灵活性可能在构象控制的背景下变得适得其反。即使核心骨架在大环化后可能会被锁定在生物活性姿势中，连接器区域中新引入的过多灵活性也可能会削弱获得的亲和力。这也是在前述第四代EGFR系列中发生的情况，其中通过在连接器部分添加甲基进行刚性化进一步提高了大环化合物的性能。连接器本身在大环设计中变得越来越重要，最后部分总结了一些趋势。在大多数药物发现项目中，通常是在项目的后期才考虑大环化，尤其是在候选分子已经优化并且线性类似物陷入瓶颈时。在许多情况下，这些候选分子已经在构象上受到限制，并表现出有限的分子灵活性。如果预测到不利的构象是导致低亲和力的原因，那么仅通过分析单键旋转就足以识别出问题构象。第二个系列针对同一突变型EGFR受体的第四代治疗面临着类似问题（3）。连接两个环的键的扭曲被认为是问题所在，且进行了更详细的分析。这代表了许多药物化学分子中可能的情况，因为（芳香）环是生物活性分子中的常见结构。在这种情况下，通过量子力学计算对这一结构进行分析并将其从分子其他部分分离出来。计算得出的最低能量两环之间的角度与生物活性构象中的角度不同，且相对能量（约1 kcal/mol）显著提高，这表明构象限制可以避免这一能量代价。事实上，最佳的大环化合物显示出两倍的效能提升（见表1，条目2），尽管在大环化之前的一些结构简化使得直接比较变得困难。 表1. 通过大环化与结构上密切相关的匹配对比（大环与线性类似物）实现亲和力提升的示例，包括大环化后观察到的亲和力增益。 a 这些例子表明，大环化合物的性质并非线性类似物和连接器性质的简单相加。大环化合物中的连接器部分用蓝色表示，且对应线性前体中附着点的位置以蓝点标出。在可能的情况下，提供了与靶标共结晶的化合物的PDB条目。两个原子之间的距离及其对应原子在大环化合物中的位置，都是根据各自的晶体结构计算得出的。 在c-Met抑制剂的开发中，第二个例子表明，对孤立键进行扭转扫描足以揭示不利的构象。再次出现的问题是两个环之间的连接；在这种情况下，它们由两个碳原子连接（表1，条目3）。除（建模的）U型生物活性构象外，这也是大环化策略的主要依据。最佳的大环化合物显示出IC50值的2倍提升（表1，条目3），表明简化的构象分析至少对于那些灵活性较小的候选分子，足以识别潜在的构象弱点。 详细的构象分析往往具有挑战性，并且没有一种通用的方法适用于所有情况。但几乎所有的研究项目都得到了计算方法的支持，如分子动力学或量子力学计算。通过实验方法验证计算数据是有用的，而二维核磁共振（NMR）证明能够提供有意义的结果（2,5）。这一点在一系列BCL6抑制剂的开发中得到了体现，其中一个无环前体被发现更倾向于采用两种构象，而这两种构象都与生物活性构象不同（通过X射线结构确定）。大环化导致抑制剂亲和力提高了100倍以上（表1，条目4）。如预期的那样，环状类似物主要占据了所需的生物活性构象，并且更好地定位了一个重要的相互作用。 除了前面展示的代表性研究外，许多其他药物发现项目最终也通过大环化获得了比线性对照物更强的结合亲和力。我们观察到，设计大环化合物的主要原因是采用U型或C型的生物活性构象，并假设大环化可能为已经走到瓶颈的线性候选分子开辟新的道路。药物研发人员常常认为，有益效果主要归因于正向熵效应，但详细的构象分析往往缺失。实际上，许多因素可以共同促进更好的结合亲和力。根据已展示的案例研究，熵并非总是主要的驱动因素，当采取大环化策略时，进行更复杂的分析是值得的。特别是在优化第一系列大环化合物时，这些化合物通常包含灵活的烷基连接器，进一步的构象分析对于刚性化或修饰连接器可能非常有帮助。然而，表1条目5至条目11中列出的一些成功例子表明，大环化无疑是一种提升结合亲和力的优秀方法。必须记住的是，目前尚不完全清楚或尚未证明为什么在这些案例中大环化是有益的。有趣的是，这些例子涵盖了广泛的靶标，包括PI3Kδ（6）（表1，条目5）或CDK（7）（表1，条目6）、HCV NS3蛋白酶（8）（表1，条目7）、细菌NADK（9）（表1，条目8）、凝血因子XIa（10）（表1，条目9）、BACE（11）（表1，条目10）以及HPK1（12）（表1，条目11）。这表明大环化是一个普遍适用的概念，与特定靶标类别无关，尽管目前大多数先进的大环化合物主要集中在激酶和病毒蛋白酶领域。 除了作为一种特殊的构象控制方法外，大环化在高亲和力化合物的应用或其他附加优势方面也具有特殊的作用。由于连接器通常相对较短（1-6个原子），在上述案例中，可以在不显著增加分子量的情况下提升亲和力。对于能够穿越大脑的药物，低分子量是一个特殊要求，且有时很难在不失去过多亲和力的情况下实现。如果分子同时采用U型生物活性构象，则大环化显得尤其具有吸引力。这一点在前述的BACE抑制剂（11）（表1，条目10）中得到了体现，通过大环化，结合亲和力提升了1到2个数量级。虽然未进行构象分析，但因此例中的主要驱动因素仍然不明。然而，这表明大环化在中枢神经系统应用中相比于线性抑制剂可能具有优势。 另一个优势是连接器部分提供了额外的化学空间。在越来越多的情况下，连接器被利用来精确定位额外的相互作用基团，例如新的氢键形成基团，从而提高结合亲和力。大环化合物具有相对刚性的骨架，可以明确地将附加修饰基团定位在环的周围，包括连接器部分。由于连接器通常位于溶剂暴露区域，远离结合口袋，因此也可以调节远离核心骨架的氨基酸。对于线性类似物，通常很难实现这种定位，除非加入过多的额外原子。这一点在前述的BCL6系列中得到了验证，在大环化合物中，初级醇只能在大环中实现有利定位（5）（表1，条目4）。 除了能够在连接器中引入附加结合基团之外，大环化的凝血因子XIa抑制剂（表1，条目9）展示了这些抑制剂的大环化背景的重要性。同样，大环化的初步依据是U型构象，且未进行详细的构象分析。第一系列大环化合物显示出亲和力显著下降，这是由于连接器与蛋白质的羰基发生空间排斥，导致大环化合物进入了不利的构象。随后，利用羰基与连接器之间的接近关系生成了额外的氢键，从而将分子锁定在更有利的结合构象中。这一效果通过引入一个酰胺功能化连接器实现，显著提升了结合亲和力。有趣的是，无环酰胺功能化类似物并未显示这种效果，因为大环化的连接器对于正确定位酰胺NH是至关重要的。由于连接器相对灵活，因此并不令人惊讶的是，进一步刚性化（如E-烯烃）提高了结合亲和力。与线性类似物相比，结合亲和力提升了令人印象深刻的200倍，展示了大环化在药物发现中的巨大潜力。凝血因子XIa抑制剂的发现过程最终促成了临床候选药物Milvexian（16）的诞生。大环化中连接器部分的设计受到了越来越多的关注，关于先进连接器设计的更多方面和令人兴奋的机会将在连接器部分进行详细讨论。 通过大环化改善选择性 大环化合物通过限制可接近的构象范围，使其接近所需的生物活性构象，这一特性也可以用来增强选择性。本节概述了大环化合物可能提高选择性的四种主要机制。 当配体与靶标蛋白的结合方式与其与不良脱靶（off-target）蛋白的结合方式有显著差异时，大环化可以将配体的可接近构象空间限制在与靶标蛋白结合的区域。这一效应在Farand等人的研究中得到了很好的验证，他们成功地设计了一种大环化抑制剂，显著提高了选择性。（13）该方法基于他们研究中的非大环化前体化合物43（PF 562271）的两种不同结合模式，该化合物与焦点粘附激酶（FAK）和富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）共结晶。作者推测，大环化应能去除在FAK结合口袋中观察到的不利构象。结果发现，大环化确实去除了FAK的不利结合模式，同时使得该化合物对Pyk2的结合亲和力提高了175倍，同时将对FAK的结合亲和力降低了2.5倍（图4）。这一效应在文献中较少报道，可能是由于不同蛋白质中可靠结合模式的获取有限。 图4. 大环化去除与不良靶标的结合构象。非大环化激酶抑制剂PF-562271（43）与（A）FAK（PDB: 3BZ3）或（B）Pyk2（大环化位置由紫色箭头指示）（PDB: 5TOB）结合时，呈现出两种不同的结合构象。 (C) 大环化（45）与非大环化（44）FAK/Pyk2抑制剂的直接比较（类似于晶体结构中所示）。 (D) 大环化后，晶体结构显示Pyk2的结合构象与非大环化抑制剂的构象非常相似。 大环化配体的刚性骨架更容易使化学基团与不良结合蛋白的氨基酸发生碰撞。与线性分子相比，大环化合物更为刚性，从而防止配体采取可能避免这些不利相互作用的构象。一个著名的例子是在ALK抑制剂Lorlatinib 7的开发过程中引入了腈基（nitrile）团（14）。通过与其他激酶的比较分析发现，ALK中的Leu1198比其他激酶中对应的氨基酸要小。腈基团深入指向Leu1198，减少了与该位置含较大氨基酸的激酶的结合亲和力。该机制还可用于与其脱靶蛋白相比更为柔性的蛋白质。一个说明这一机制的例子是选择性FKBP51的研究，研究中将氨基酸引入大环化配体，导致酰胺键的羰基与近似同源物FKBP12和FKBP12.6的Asp发生碰撞（15）。虽然靶标蛋白FKBP51能够重新排列以容纳配体，但FKBP12和FKBP12.6则无法如此。这种新的选择性无法通过非大环化类似物实现，突出了大环化骨架的重要性。 与上述选择性增强机制相关，大环化可以导致环张力，从而使配体采用在线性分子中难以获得的构象。例如，芳香环的平面外扭曲预计会显著改善骨形态发生蛋白受体2（BMPR2）和EGFR的两种大环化配体的激酶选择性（16, 17）。这一方法特别适用于具有高度保守结合口袋的脱靶蛋白，例如激酶。上述两个例子突出了分子中即使是微小的化学变化，也能大幅改变选择性谱。表2中比较了大环化和非大环化配体选择性的变化。 表2. 大环化与非大环化配体选择性的变化 a Amrhein等人报道的大环BMPR2抑制剂表现出更好的激酶选择性（17）。选择性得分S35是通过计算抑制的激酶数量占所有测试激酶的比例，且其抑制度低于对照组的35%来得出。选择性得分S（3 μM）是通过计算与所有测试激酶相比，结合亲和力低于3 μM的激酶比例来得出的。连接子部分的附着点以及由此产生的连接子在图中以蓝色突出显示（1920）。 此外，大环化骨架的张力使得分子中更远的部分能够互相连接。大环化骨架的刚性可作为一种杠杆作用，将靶标蛋白与脱靶位点之间的远距离差异转化为重要的相互作用位点。关于AXL选择性配体的一个例子表明，计算研究表明，能够与脱靶蛋白RET最优相互作用的构象由于与更远的配体部分发生空间冲突而无法结合（18）。 上述例子表明，大环化可以通过消除与脱靶蛋白结合的构象、通过使骨架刚性化强迫配体采取能够区分相关蛋白的构象，或者通过利用连接子部分提供的新的分子空间来诱导选择性增强的相互作用，从而提高选择性。特别是在激酶领域，小型大环分子作为高度选择性抑制剂取得了巨大成功。一种可能的原因是大环化能够实现“共识结合模体”（如ATP模拟物）的三维化。 改善ADME性质 某些天然物质（如环孢素A（51））的口服生物利用度出乎意料地好，这可以通过它们能够调整自身构象以适应周围介质来解释（图5A）。以环孢素A为例，其构象灵活性是通过一个酰胺键的顺反异构化实现的，但其他驱动力可能是分子内氢键或芳香环对极性基团的分子内屏蔽作用。该特性（被称为“变色龙性”）的必要但不充分的前提条件是分子的构象灵活性。除了构象灵活性外，假定不同构象之间足够的极性差异也是至关重要的。尤其对于那些不符合经典口服生物利用度标准的配体，变色龙性提供了一个很好的机会，将足够的细胞渗透性与足够的溶解度结合起来。虽然变色龙性的概念不限于大环化化合物，但这一概念在大环化合物类中尤其相关，因为这类化合物往往不符合经典的口服生物利用度标准，因此结合良好的溶解度和渗透性可能具有挑战性。Poongavanam等人今年初对变色龙性概念做出了很好的总结（46）。这一策略的合理利用标志着在开发环孢素A非免疫抑制替代品的药物研发过程中取得了突破。经过优化的领先化合物——源自Sanglifehrin-A的化合物52，虽然显示出非免疫抑制效果，但缺乏细胞渗透性和口服生物利用度（图5B）（21, 22）。改进的关键在于将内酯替换为内酰胺，并引入了喹啉核心（22）。据报道，异环的氮原子在疏水环境中与酰胺形成内部分子氢键，从而增强了渗透性。同时，该大环在极性环境中会采取替代构象，从而使化合物53具有良好的溶解度和口服生物利用度（图5B）。 图5. 超越Ro5的大环化合物中的变色龙性。 (A) 环孢素A（51）能够适应其化学环境，并表现出显著的良好细胞渗透性（有关3D PSA计算的更多信息，见附录）。异构化的酰胺键以品红色高亮显示。 (B) 源自Sanglifehrin-A的小型大环化合物（52和53）因变色龙性而改善了药物性质。 到目前为止，这一现象尚未在从头设计的小分子大环化合物中得到系统性应用。一个可能的原因是缺乏系统性的研究和指导理性设计的模型。为数不多的几项系统性研究之一比较了小分子大环化合物与匹配的非大环化合物的扩散系数。尽管相关的大环化合物一致显示出较高的扩散系数，但作者未能找到令人满意的解释（45）。 最近，科学家们假设，受限的构象灵活性以及分子中疏水和亲水区域的特定空间分布通常有利于渗透性。这一基于4300个大环化合物的渗透性数据分析进一步发展了上述的屏蔽概念，甚至引导作者提出了一种关于如何获得具有高膜渗透性的宏环化合物的通用假设（23）。这些发现具有高度相关性，因为细胞渗透性是化合物口服生物利用度的前提条件。例如，通过分析1000多种非大环的类药物化合物，研究人员发现化合物的口服生物利用度与可旋转键的数量呈负相关，表明更刚性的骨架具有优势（24）。令人惊讶的是，这一效应也出现在分子量超过500 Da的化合物中。这一点对于超越Ro5的分子尤其适用，因为这些分子通常含有许多可旋转的键，且通常具有更高的灵活性。 除了渗透性外，大环化合物化也被认为是改善非大环药物候选分子其他ADME（吸收、分布、代谢、排泄）和药代动力学（PK）特征的可行工具。平均而言，与非大环化物相比，这些药物候选分子可能表现出更好的理化性质，但并非所有问题都能通过大环化解决。然而，在有利情况下，通过连接子对构象进行限制，可以去除分子中的其他部分，同时保持结合亲和力的最小损失。此外，连接子可以通过引入额外的残基来实现所需的性质。ASK1抑制剂（25）的开发展示了大环化如何作为一种工具在先导化合物优化中发挥作用。该项目的目标是优化线性先导化合物Selonsertib 54，以提高其对中枢神经系统（CNS）的穿透能力（图6A）。首先，去除54中溶剂暴露的部分，以最小化外排比率（ER），然后将核心部分进行环化以保持生物活性构象。按照预期，得到的小系列简化大环化合物仍保持对ASK1的亲和力。然后，通过理性设计（系列1）和并行合成（系列2）进一步优化具有最有利药代动力学特征的化合物。最终，系列1和系列2的结合产生了具有低外排比率（ER）和良好CNS可用性的化合物60。 图6. (A) 从Selonsertib (54) 开始的优化过程。 (B) FDA批准的Lorlatinib (7) 开发过程中的主要步骤。 除了获得或保持结合亲和力外，在先导化合物优化过程中，连接子额外的合成把手也可用于微调理化性质，如亲脂性。最具代表性的例子可能是FDA批准的ALK抑制剂Lorlatinib (7)。在优化线性先导化合物的过程中，研究人员确定了中枢神经系统（CNS）活性与测试分子的亲脂性之间的关系，从而确定了理想的LogD和LLE范围（14）。实现这一目标的工具是大环化合物化。首先，具有较高外排比率（ER）的线性化合物61被环化，作为进一步先导优化的起点（图6B）。环化的目的是减少分子灵活性，创建更紧凑的骨架，并提高细胞渗透性。第一代大环化合物通过醚键连接，导致其针对靶激酶的IC50值降至低至两位数纳摩尔（例如化合物62）。用内酰胺连接子替代第一代大环化合物中的醚键，改善了亲脂性谱，形成了更先进的第二代环状化合物。这一系列中的杰出化合物7，后被命名为Lorlatinib，展示了较低的清除率，对ALK突变体具有良好的细胞活性，相较于以前的抑制剂显示出更强的活性，且具有优越的外排比率和CNS暴露，最终于2018年获得FDA批准。 大环分子还可以提供额外的方法来增强代谢稳定性。与线性分子相比，其改善可以有不同的解释。一种假设认为，大环结构通过遮蔽代谢软点，使其无法被代谢酶攻击。然而，识别和合成这些构象受限的大环化合物并非易事。为数不多的几项比较线性与匹配的大环化合物的已发布例子之一是关于因子XIa抑制剂的研究（10）。此前发现的非大环化合物63缺乏效能和代谢稳定性。大环化的目的是主要是预组织生物活性构象（如前所述）。有趣的是，所有大环化合物在人体肝微粒体（HLM）稳定性实验中的半衰期都较其相应的线性参考化合物70更长（图7）。稳定性的差异以及与70的比较支持了构象依赖的代谢稳定性假设（26,27）。 图7. 因子XIa抑制剂的先导化合物优化。通过大环化合物化优化了线性先导化合物，相比于线性参考化合物，优化后的化合物在效能、渗透性和稳定性方面均有显著改善。 另一个有趣但相对少见的应用是利用大环化合物化来掩蔽前药前体。特别是，内酯连接子容易作为酯酶敏感的前药使用。采用（酰氧基）烷氧基连接子的环状双前药，展示了大环化合物在这一应用中的潜力（图8）（28）。通过大环化，线性前体71的正负电荷同时被掩蔽，形成了化合物72和73。这两个大环化合物相比于先导化合物71，表现出显著改善的细胞渗透性。此外，大环化合物73的溶解度较线性参考化合物提高了超过2倍。实验数据显示，化合物72和73迅速转化为所需抑制剂71（在40分钟内转化率超过99%），这一转化确实是由于酯酶水解及连接子后续断裂所致。值得注意的是，无环线性参考化合物74无论在体外还是体内均未转化为71。 图8. 用于凝血酶抑制剂的大环双前药。 总之，大环化合物化被证明是药物化学家在药物发现过程中优化多种参数的有效工具。然而，目前尚无通用的研究或规则能够预测大环化合物可能具有的优异性能。然而，一个反复出现的重要方面是连接化学，它为合成提供了额外的操作途径，能够控制大环化合物的构象，并微调其性质。 连接子设计的进展 通常，最初使用非功能化的烷基链来研究结构骨架与大环化合物化的兼容性，通过变化出口矢量和环的大小。这些连接子，即原始非大环配体的连接点之间的闭环实体，越来越多地用于进一步的衍生化和优化。以下部分提供了几个例子，展示了精心设计的连接子如何进一步改善大环化合物的不同性质。 精心选择的连接子长度对优越的活性至关重要，这在开发大环异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）抑制剂时得到了证明。基于已批准的IDH2抑制剂Enasidenib的共晶结构，合成了一系列大环化合物。所安装的饱和和不饱和连接子在长度（6-9个原子）和与苯基部分的连接方式上有所不同。只有引入一个7元饱和烷基连接子才导致活性比线性类似物提高了5倍。相比之下，更长的连接子略微降低了活性，而少一个碳的短连接子则大幅降低了化合物的活性。作者解释称，这是由于之前所描述的化合物在生物活性构象中的锁定。 如果线性起始物已经采用了有利的构象，那么单纯通过刚性化分子本身来增强亲和力的效果则不那么显著。然而，连接子可以作为进一步修改的骨架，最终可能会提升其性质。这一点在开发大环FKBP51抑制剂时得到了说明，对于这种抑制剂，简单的烷基和烯烃连接子与线性参考物相比既没有改善也没有妥协其结合能力。然而，随后引入极性官能团导致结合亲和力显著提高，这很可能是通过促进水介导的氢键的形成。 优化连接子与靶蛋白之间的相互作用是微调大环化合物性质的重要领域。天然产物大环化合物通常不具有药物化学家容易识别为连接子的部分。通常，天然产物的所有部分都具有高度的功能化，并对分子的药理性质做出贡献。其缺点是合成过程复杂，限制了更多衍生物的获得。到目前为止，已经开发出大量金属催化方法，将天然产物启发的结构单元引入合成可得的大环化合物中。这些方法将天然产物的化学空间和高功能化性与合理的合成工作量相结合。 连接子设计还被证明是克服突变易感性的一种工具，这一点在已批准的药物达鲁那韦（Darunavir）中得到了应用。连接子作为骨架与蛋白质主链相互作用，从而实现了与氨基酸的独立性，因为这些氨基酸在突变的蛋白质变体中频繁发生交换。在HIV-1蛋白酶抑制剂的例子中，这是通过在连接子中引入杂原子来实现的。含有柔性苄基醚连接子的抑制剂显示出低纳摩尔级的抑制活性，并且对多个达鲁那韦耐药突变体表现出更高的活性。X射线共晶结构证实了连接子氧与蛋白质主链之间新形成的水介导的氢键。 图9. (A) 大环HIV-1蛋白酶抑制剂的开发。 (B) 化合物76在HIV-1蛋白酶结合口袋中的共晶结构（PDB: 5WLO）。该化合物对达鲁那韦耐药的HIV-1突变株表现出高活性，原因在于连接子氧原子与Asp29和Gly27的主链原子之间形成了额外的水介导氢键（青色，虚线）。 除了与蛋白质主链的亲水相互作用外，连接子部分还可以作为一个平台，诱导新的疏水相互作用。作为大环骨架中的半刚性结构，连接子能够精确地将取代基定位到靶蛋白的特定区域。这一策略在Milvexian（16）开发过程中起到了至关重要的作用，Milvexian是一个临床候选药物，已获得FDA快速通道认证，作为抗凝药物用于治疗缺血性卒中、急性冠脉综合症和房颤。（37）基于12元和13元环状骨架（10），通过系统地修饰连接子上的甲基基团（位置和构型各异），使得它能够进入凝血因子XIa的疏水性结合口袋，从而提高了抑制活性。对分子其他部分的进一步优化最终促成了Milvexian（16，图10）的开发。（38） 图10. Milvexian（16）的开发。连接子设计，包括在不同位置系统地引入甲基基团，是临床候选药物Milvexian开发中的关键部分。 在开发丙型肝炎病毒NS3/A4蛋白酶（39）（图11）抑制剂的过程中，采用了类似的策略，成功地证明了连接子部分在残基定位中的潜力。从一个未功能化的烷基链起步，该链本身就比非大环参考化合物Asunaprevir（77）提高了8倍的活性，随后在连接子上引入了甲基基团。两个甲基基团的相互作用通过调节构象灵活性并增加与蛋白质的疏水相互作用，从而提高了抑制活性（80a）。 图11. 基于Asunaprevir（77）开发的大环HCV NS3/A4蛋白酶抑制剂。引入烷基残基对已发布的大环化合物的抑制活性和代谢稳定性至关重要。 此外，连接子修饰不仅可以增强大环的活性，还可以改善其药代动力学特性。在上述案例中，将其中一个甲基基团替换为体积更大、疏水性更强的乙基基团，有助于提高代谢稳定性和口服生物利用度（81）。为了进一步获得代谢稳定的大环HCV NS3/A4蛋白酶抑制剂，研究人员在连接子中引入了杂原子。然而，这一方法未能成功，只有使用立体位阻较大的gem-二甲基基团才成功得到化合物83，具有100%的口服生物利用度，这相较于使用未取代烷基连接子的化合物82，生物利用度提高了2倍（图12）。（8） 图12. 大环化合物82的药代动力学特性改善。 MCL1是治疗多种癌症的另一具有挑战性的靶点，几种已发布的抑制剂依赖于大环结构（图13）。在开发具有口服生物利用度的MCL1抑制剂AMG176（19）过程中，连接子设计被广泛应用于优化药效和代谢稳定性（图14）。（40）大环化合物89由线性抑制剂发展而来，结构NMR分析其结合模式，为合理的连接子设计提供了指导。受X射线共结晶结构的启发，未功能化的烷基连接子被修饰上了一个羟基、一个甲基基团和一个反式环丁烷环（90）。这些改动通过与靶蛋白形成新的相互作用，使亲和力提高了14倍。进一步通过引入反式烯烃（91）对连接子进行限制，最终增强了亲和力。根据共结晶结构分析和分子建模，这一改进可通过增加生物活性构象的丰度来解释。最后，通过甲基化连接子和羟基基团来提高口服生物利用度，而不损失活性（图14）。 图13. 最近开发的大环MCL1抑制剂。 图14. 从大环化合物89出发，精心的连接子设计帮助开发了临床候选药物AMG176（19）。 AMG176（19）的骨架被用作起点（图15），通过精细调节连接子，进一步改善了ADME/PK特性，同时尽量减少了心脏毒性。（41）最初，连接子中的环丁基部分被换成了四氢呋喃基（THF）残基，以增加极性。尽管19中的环丁基与靶蛋白中的疏水性口袋结合，但更极性的THF环也能良好耐受，因此其亲和力与19相似。为了弥补引入更极性THF环后，细胞活性下降了4倍的情况，研究人员尝试对烯烃部分进行氟化，以提高细胞渗透性（92）。实际上，新引入的氟原子有助于提高亲和力和细胞活性，但未改变这两个参数之间的偏差，表明细胞渗透性未发生变化。为了进一步提高活性，研究人员引入了甲氧基吡唑基磺酰亚胺基团，通过将高能水分子从结合口袋中排除，增加了超过40倍的结合亲和力（93）。除了增强的抑制活性外，极性基团还提高了溶解度和口服生物利用度，并减少了心脏毒性。 图15. 93是AMG176（19）的THF-烯丙基变体，经过改造后兼具高亲和力、细胞内活性及平衡的ADME特性。 由Revolution Medicines开发的分子胶14和15令人印象深刻地展示了“高级连接子改造”的能力。（47,48）这些大环化合物最初来源于天然产物Sanglifehrin A，并经过工程化设计，旨在诱导环孢素A（CypA）与KRas之间的三元复合物。然而，除了CypA核心结合基序外，几乎所有配体的其他部分都发生了改变，包括重新连接的大环骨架（图16）。RAS结合基序可以理解为连接子，在这种情况下，连接子被修改以优化KRas结合，当其处于CypA结合形式时。由此，连接子在大环化合物中的概念在分子胶的背景下获得了新的维度，因为它们是三元复合物诱导活性的关键成分，而这种活性正是分子胶的核心特性。 图16. 大环化合物作为分子胶的骨架。KRas结合分子胶RMC-6236（15）通过重新设计天然产物Sanglifehrin A发现。（A）RMC-6236（品红色）诱导的环孢素A（CypA，绿色）与KRas（小麦色）及GMPNP（青绿色）组成的三元复合物的晶体结构（PDB: 9AX6）。(B) 天然产物Sanglifehrin A（红色）和分子胶RMC-6236（品红色）的CypA结合基序非常相似，并用绿色高亮显示。 即使是在连接子中的化学修饰，也可以诱导与蛋白质的接触，并对大环化合物的三维结构产生重大影响。在VII因子抑制剂的开发过程中，曾开发的抑制剂（94）中芳香族苯基甘氨酸残基部分引入甲基基团，部分导致了抑制活性的增强。这与存在对映异构体（图17）相关。由于两种对映异构体中的一种更有利于蛋白质结合，因此通过计算预测方法，开发了策略来锁定抑制剂在期望的对映异构体构型中。在这种情况下，连接子中引入了一个苯基甲基基团。由此得到的化合物（96）被锁定在有利的对映异构体中，并且引入的甲基基团通过指向疏水性口袋与蛋白质形成了新的相互作用，导致抑制活性提高了16倍。（42） 图17. 在94中引入两个甲基基团将化合物限制为一种有利的对映异构体，从而增强了对VII因子的结合。 对映异构现象在药物开发中可能成为一个严重的问题。开发具有从分钟到天甚至几个月的互变半衰期的对映异构体，可能会面临诸多挑战，原因在于在药物制造和患者给药过程中准确量化对映异构体比例的复杂性，以及确定体内半衰期的难度。（43）为应对野生型和突变型呼吸道合胞病毒（RSV）融合糖蛋白的宏环化合物被描述为存在这一问题，它们以两种对映异构体的形式存在，互变时间在几分钟范围内。通过使用母体烷基连接子作为工具，通过减少对映异构体的互变时间来提高化合物的开发性。最终通过系统性地引入杂原子实现了这一目标，得到了一个16元大环，其具有基于酰胺的连接子，且对映异构体之间的互变时间缩短至秒级。（44） 总结 构象的控制是宏环化合物诸多有益特性背后的关键驱动因素。这包括生物活性构象的预先组织，使得原本不利的构象变得更有利，或排除对于非靶向结合至关重要的构象。此外，宏环化合物的环化过程可以有利于掩盖代谢弱点，并促进分子内部氢键的形成。宏环化合物环化策略的潜在好处在实际应用中，往往被合成工作量的增加和合成通量的降低所抵消。虽然合成挑战可以通过合成方法学的进步逐步克服，但对于非肽类宏环化合物缺乏可靠的预测技术，仍然制约着宏环化合物在药物发现中的更广泛应用。近年来，肽类宏环化合物的计算预测已取得显著进展（49），这表明未来或许也能实现对非肽类宏环化合物的类似精确建模。 目前，启动宏环药物发现项目的最常见策略是基于与线性前体的共晶结构进行的宏环化方法。在这一过程中引入的连接子基团越来越被认为是宏环化合物的重要组成部分，是宏环优化的关键部分。当连接子被埋入结合口袋时，它们可以构成一个骨架，与靶蛋白建立额外的相互作用。相反，当连接子暴露在溶剂中时，它们代表了调节物理化学性质（例如极性）的机会。迄今为止，系统化的连接子设计在许多宏环发现计划中仍然处于较低的关注度。我们预计，连接子将变得更加精细，“连接子学”将在未来的宏环药物开发中成为一个重要组成部分。尤其是在连接子变得更长时，这一点将尤为重要，特别是当从结合模式为C型（相比U型）结合的前体开始时。 参考文献： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c01163

侃言 此前多次分享过“小分子大环化”这种分子编辑策略在药物化学中改善候选分子效力、选择性、物化特性、和ADME特性等应用实例和总数观点。 近期，EJMC上也刊载了一篇相关综述，文末“阅读原文”可直达原英文文献地址。 此前分享的JMC上的一篇“小分子大环化”的综述，主要从大环化对分子各种性质的影响以及连接器的应用的角度来讲述。本篇EJMC的综述文章更注重从不同类型的蛋白质靶点出发，讲述近5年，“大环化”分子编辑策略在具体药化实例中的优势和应用。 1 “大环化”的优势 “大环”一般指的是在重原子的基础上，具有12个活更多成员的环状化合物。根据“环”形成的核心化学性质，大环类化合物可以分为环肽类、环内酰胺类、环内酯类、环醚类/胺类等。 从药物化学的角度，根据大环药物成环的化学特征，可将其细分为环肽、和大环。 近些年，化学药物发现领域不断涌现出具有多种创新机制的新药，包括：大环类药物（大环/环肽）、靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs）、分子胶、抗体偶联药物（ADC）、共价抑制剂等。其中，“大环化”后的大环类药物，由于能够在部分刚性结构中提供功能多样性和立体化学复杂性，具有几个独特的优势： 为药物研究提供新颖的化学空间和知识产权（IP); 大环刚性结构提供相对开环结构表现出更高的亲和力、选择性。在结合具有挑战性药物靶点，解决小分子药物耐药性的问题上具有优势； 在药物发现过程中，优化药物性质； 因此，小分子大环化在近期的药物研发中，已经成为一种热门分子编辑手段，用来改善药物功效和药物类药性特性。 2 “大环化”在先导化合物优化中的应用 接下来，作者汇总了近5年来，在不同的靶点先导化合物优化的过程中，利用“大环化”改善“小分子”功效和特性的实例，大约近30个实例。 01 ATP柠檬酸裂解酶抑制剂 ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）是一种催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的酶，在糖代谢和脂质生物合成中起重要作用。催化过程为一些重要分子（如胆固醇、脂肪酸等）的生物合成提供合成砌块，并在蛋白质乙酰化中起重要作用。 ACLY过表达会导致代谢疾病和恶性肿瘤，因此，这种酶是一种潜在的药物治疗靶标。然而，ACLY抑制剂的研发过程中，低活性、细胞渗透性、毒性、药代动力学特性等，一直是阻碍候选分子进一步进入临床研究的障碍。 如上图，在观察化合物1与ACLY的共晶结构时发现，其与靶标呈“U”型结构结合，并且处于活性构象时，苯环与酯基结构非常接近。这里出现了关环以稳定其活性构象的切机！ 通过优化，大环化后的分子在保持了相当的功效（IC50、KD)的同时，其代谢稳定性得到了极大的提高：半衰期提高了158倍，人肝微粒体清除率减少了258倍！ 02 CGRP受体拮抗剂 降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体(CGRPR)是偏头痛治疗的潜在靶点，当前已有几种口服CGRP拮抗剂上市。 CGRPR由降钙素样受体（CLR)和受体活性修饰蛋白1（RMAP1)的复合物形成，具有宽、浅、溶剂暴漏的结合位点，最适合大环化配体结合。 如上图，在研究化合物3与CGRPR的共晶结构时发现，一个吲唑甲基片段填充了亲脂腔，取代了疏水性热点重叠的“高能水”区。因此，研究人员尝试设计大环化，以稳定化合物3的活性构象。 通过分子对接，发现大环化分子（4a、4b)与无环化化合物3的活性构象刚好吻合。验证也发现，环化后的分子的效力提高了4倍，亲脂效率（LEE)提高了1.3倍。更有趣的是，非对映体5也是针对靶标有效的，并且是完全不同的结合模式，有助于设计新的CGRP受体拮抗剂。 03 CTG重复序列结合物 DNA或RNA靶向也是一个比较快速发展的药物研究领域。例如，肌强直性营养不良是一种遗传性疾病，其蛋白激酶（DMPK）基因的3’-非翻译区含有扩增的d(CTG）重复序列和扩增的r(CUG）重复序列隔离肌盲样（MBNL）家族蛋白，在剪接中起重要作用。 化合物6可以选择性识别d(CTG）和r(CUG），结合常数在次微摩尔级别，然而，其在该浓度范围内也表现出了细胞毒性。 经过分析，化合物6存在如上图中的堆叠构象和非堆叠构象。非堆叠构象，一方面发挥与DNA、RNA的非特异性结合，另一方面因非特异性结合而增加的剂量会导致细胞毒性。因此，通过环化，锁定化合物在堆叠的活性构象，可以增加分子的特异性和效力，进而减少细胞毒性。 正如预期，化合物8a细胞毒性降低了10倍；化合物8b的效力、选择性等都得到了显著提高。 04 因子XIa抑制剂 凝血酶或凝血因子XIa(FXIa)是抗血栓治疗的新靶点。 BMS研发的化合物9是FXIa潜在的抑制剂，具有nM级抑制常数。然而，该化合物具有较大的极性表面积，以及较差的PK属性：仅3%的生物利用度，以及较多的氢键导致极低的渗透性。 通过配体与靶标的共晶结构，发现化合物9咪唑附近的两个苯环彼此邻近，具有大环化的潜力，进而有可能改善分子的效力和选择性。 在后续的优化中，研究人员通过去除四氮唑和酰胺氢，以降低PSA，改善不良的渗透性和口服吸收。环化后的化合物10，虽然与靶标的结合力常数略有升高，但仍保持在有效的范围内。同时，降低了PSA，其药效更强、生物利用度更好，并且增加了靶标特异性。 05 FKBP51抑制剂 FK506结合蛋白（FKBP51）是一种隶属于免疫亲和蛋白家族的肽基脯氨酸异构酶，在调节糖皮质激素受体活性中起重要作用，并作为共同伴侣，参与HSP90蛋白折叠。FKBP51是许多疾病的潜在靶点，包括与压力相关的精神障碍、肥胖引起的糖尿病、和慢性疼痛等。 如上图，化合物11a、11b是首次报道的FKB51选择性配体，具有个位数nM级别的抑制活性。在研究化合物11b与靶标的共晶结构时发现，两个芳环上的醚键彼此靠近，具有环化的潜力，以锁定生物活性构象。 如上图，通过从尝试一系列连接子，含有两个羟基的化合物12相比于非环化前体，药效最强。感觉整体选择性降低了，变泛配体了？ 06 谷氨酰胺酶1抑制剂 谷氨酰胺酶（GLS)是水解谷氨酰胺，获得谷氨酸盐的关键性酶。在一些癌症中，“谷氨酰胺成瘾”，维持癌细胞增殖所需要的能量。人类GLS酶包括两种类型：GLS1，广泛分布于肝外组织的肾型谷氨酰胺酶；GLS2，主要分布于成人肝脏的肝型谷氨酰胺酶。其中，GLS1的活性与肿瘤生长速率相关，是癌症潜在的治疗靶点。 如上图，化合物13是一个临床候选分子。早期研究期待通过环化获得新型的抑制剂，然而效力均不理想。直到在分析化合物13与GLS1的共晶结构时，在结合的生物活性状态观察到了“U”构象。分子处在生物活性构象时，两端的基序彼此靠近，提供了环化的切机。 环化后的化合物14，效力提高了3.6倍，并且稳定性也获得了显著的提高：半衰期提高了2倍、清除率降低了1/3。然而，生物利用度相比于前体13有所降低（9% vs 19%）。 07 异柠檬酸脱氢酶2（IDH2)抑制剂 异柠檬酸脱氢酶（IDH)是一种影响三羧酸循环中异柠檬酸和α-酮戊二酸相互转化代谢途径的酶。 化合物15是一种FDA批准的用于治疗复发性和难治性急性髓性白血病的药物。研究人员尝试通过大环化获得构象限制的新型IDH2抑制剂。通过观察化合物15与IDH2R140Q突变体的共晶结构，发现吡啶N的部分与脂肪侧链非常接近，因此合成了大环化合物16。 环化后的化合物对R140Q突变体抑制性最强，具有个位数nM级抑制活性，而对野生型IDH2无抑制作用。同时，环化后的化合物还具有良好的生物利用度和代谢稳定性。 08 激酶凋亡信号调节激酶1（ASK1）抑制剂 凋亡信号调节激酶1（ASK1)通过调节细胞应激反应，在炎症和凋亡中发挥重要作用。ASK1调节可有治疗神经系统疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病、阿尔兹海默病等。 如上图，Selonsertib是表现最好属性的ASK1抑制剂，具有生化和细胞效力以及良好的药代动力学特征。然而，其是P-gp底物，不适合作为中枢神经系统药物。 通过研究其与靶标蛋白质在溶剂暴露区和催化赖氨酸结合位点附近的激酶结构域的共晶结构发现，具有大环化的潜力，或许可以解决CNS渗透性问题。 如上图，获得了两种类型的大环化产物：化合物17、18。然而，环化后的产物并没有比母体更具有效力。CNS渗透性可以通过引入适当的官能团来调节。如上图，含氟化合物17表现出低至中等的CNS穿透性，而咪唑类化合物18表现出更优异的脑暴露性。 09 激酶骨形态发生蛋白受体II型（BMPR2) 骨形态发生蛋白受体II型(BMPR2)是一种丝氨酸/苏氨酸受体激酶，属于酪氨酸激酶样(TKL)组，是肺动脉高压、癌症、阿尔兹海默病等疾病的靶点。 如上图，化合物19具有BMPR2靶标次纳摩尔级的结合力以及双位数nM级的抑制活性；然而，其同时抑制468个激酶中的262个，表现出极差的特异性的混杂行为。 通过分析化合物19与VRK1的共晶结构，发现氰基与环丙烷彼此靠近，设计连接子，或许可以提高其选择性。如上图中，环化后的化合物20，其效力虽不如前体，但仍保持在次微摩尔级的有效范围。而其选择性获得了提供。 10 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）抑制剂 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，与周期蛋白伙伴相互作用。CDK-周期蛋白复合物失调，会导致癌细胞失去周期和转录控制。 其中CDK2抑制剂对CDK4/6抑制剂治疗产生耐药性的患者有益。 研究人员发现化合物21对CDK2参与的PPI作用具有有效的抑制作用。以此为起点，结合AI技术和基于片段的变分自编码器生成模型来识别CDK2抑制剂。通过分析其对CDK2/cyclin E1的共晶结构，发现其呈“U”型结构，吡啶与溶剂暴露的异丙基靠近，具有大环化的潜力。 在一系列的大环化衍生物中，化合物22最具潜力。其针对CDK2/E1的抑制效力提高了21倍，然而，针对CDK1/A2的选择性略有下降。 11 周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）抑制剂 髓样细胞白血病-1(Mcl-1)是一种抗凋亡蛋白，在癌细胞存活中起重要作用。Mcl-1在多种癌症的细胞增殖过程中过表达，特别是在EGFR突变的细胞系中，而CDK9抑制可下调Mcl-1。 化合物23是一种有效抑制CDK9的苗头化合物，然而，其同时对其它CDK蛋白具有抑制活性，如CDK2/4/12，具有较差的选择性以及因此而导致的体内毒性。 研究人员试图通过大环化来固定二面角，以抑制柔性旋转。通过优化大环化连接子以及酰胺侧链，如上图，获得化合物24，保持了针对CDK9效力的同时，具有良好的选择性。 12 c-Met激酶抑制剂 c-Met是一种受体酪氨酸激酶（RTK)，是肝细胞生长因子（HGF)/分散因子（SF)的受体。靶向HGF/c-Met信号通路，是非小细胞肺癌的潜在治疗策略。一些小分子已被用于靶向c-Met，包括已上市的药物(克唑替尼、卡马替尼、替波替尼、萨沃替尼和卡博赞替尼等)。 如上图，在基于先导化合物设计新型c-Met抑制剂时，发现了与c-Met共晶结构中存在“U”型结合模式，使用不同的连接子使小分子大环化，能够产生在生化、细胞活性等方面的差异性。 通过大环化，可以使分子维持在折叠的低能构象，以避免结合自由能熵补偿。如上图，大环化后的化合物26，获得了改善的生物活性、选择性。 13 酶双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A/B 双特异性酪氨酸（Y)磷酸化调节激酶1A (DYRK1A) 在神经系统疾病和癌症中都起作用。 如上图，化合物27是一种有效的DYRK1A抑制剂，然而，其是一种泛激酶抑制剂，具有广谱抑制作用。在研究化合物27与DYRK1A的共晶结构时，发现了“U”型结合模式，其中苯环的3-位与吡啶环的5-位非常接近。 因此，研究人员以此合成大环化分子，实现了对靶标的高亲和力和选择性。 14 激酶表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂 表皮生长因子受体(EGFR)携带del19或L858R突变体时，它是一种致癌驱动因子，特别是在肺癌中。 如上图，化合物30是勃林格殷格翰发现的具有潜力的苗头化合物。在详细的构象分析中发现，化合物30具有活性和非活性构象，因此，研究人员决定通过大环化来稳定其活性构象。 如上图，大环化后的产物31，其抗增殖效力得到了极大的提高。 也有研究人员基于Gefitinib的结构尝试大环化，如上图，化合物32针对突变体的抑制效力虽略有不如前体，但也保持了次nM级抑制效力；而其针对野生型的选择性获得了极大的提高。 15 造血祖激酶1（HPK1）抑制剂 造血祖激酶1 (HPK1)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调节T细胞、B细胞和树突状细胞的功能，是免疫治疗潜在的治疗靶标，作为肿瘤转移患者潜在的治疗策略。 如上图，化合物33是BMS发现的一种有效的HPK1抑制剂，并且针对GLK具有39倍选择性。研究发现，HPK1与GLK的差别之处在于HPK1具有更宽的入口口袋，因此，这种差别赋予了两个靶标的空间冲突选择性。而研究发现，化合物33的苯基基序的柔韧性可以引起构象变化，符合GLK。若通过大环化来实现构象限制，则有可能进一步提高选择性。 如上图，环化后优化的产物34，其针对HPK1的效力提高了4.6倍；选择性提高了101倍；代谢稳定性提高了3倍；抗hERG活性低于化合物33等。此外，其还获得了中等的渗透性，无外排倾向，对CYP3A4无明显抑制作用。 16 Janus激酶2（JAK2）抑制剂 Janus激酶2（JAK2）是一种细胞内非受体酪氨酸激酶，属于Janus激酶家族（JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2），可以作为骨髓增生性肿瘤、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病的治疗靶点。 如上图，研究人员以Fedratinib为起点，探索基于深度学习的JAK2大环化抑制剂设计。Fedratinib已批准于治疗骨髓纤维化，但其激酶选择性较差。 研究人员在两个芳环之间设计连接子，并鉴于结构分析去除磺酰胺，通过分子对接，从产生的218个大环化分子中选择最具潜力的分子进行合成、验证，其中化合物35与Pacritinib非常相似。其效力略不如前体，然而其仅抑制17种野生型激酶，相比于前体的34种，选择性得到了很大的提高。同时，PK属性获得了提高。 17 激酶Pim-1抑制剂 Pim-1编码基因具有致癌潜力，Pim-1激酶是前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的信号蛋白。 如上图，化合物36是一种μM级的Pim-1抑制剂，通过配体竞争饱和方法进一步优化，获得更高效的抑制剂37，以及选择性靶向Pim-2、Pim-3。然而，其细胞渗透性差。 分析化合物36、37与Pim-1的共晶结构，发现芳环上的氯原子与侧链N原子旁边的碳原子非常接近，具有大环化的潜力。通过设计不同的大环化连接子，最终确定了最有效的化合物38，保存了化合物37相当的效力，同时具有μM级细胞活性。 18 脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂 脾酪氨酸激酶（SYK）是一种主要在造血干细胞种表达的非受体酪氨酸激酶，也是B细胞受体（BCR)信号的调节因子，是治疗自身免疫性疾病和血液病的潜在治疗靶点。 如上图，化合物39是阿斯利康发现的一种有效的、选择性SYK抑制剂。然而，其具有不良的药代动力学（PK）特性。因此，研究者尝试用大环化的分子编辑手段进行进一步优化。 首先，基于溶液态NMR数据，观察到化合物39主要以“U”型构象存在，发现了大环化的切机。在众多大环化分子中，化合物40最具有潜力。尽管其效力和细胞活性略有降低，其在大鼠肝清除和人肝微粒体清除研究中更加稳定。同时，其没有hERG抑制活性，提高了激酶选择性。此外，其渗透性由于羟基极性的引入而降低，这或许需要用前药的方法来进一步解决。 19 原肌球蛋白受体激酶（TRK）抑制剂 原肌球蛋白受体激酶（TRK）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，有三种亚型（TRKA、TRKB、TRKC）组成，分别由神经营养受体酪氨酸激酶1、2、3基因编辑。TRKs调控哺乳动物中枢和周围神经系统的生理功能，是NTRK融合阳性癌症的潜在治疗靶点。 如上图，Larotrectinib是一种FDA获批的TRK抑制剂，并且在临床上通过将二氟苯和吡咯烷基序连在一起，产生了两种新型药物Selitrectinib、Repotrectinib。 此外，也有研究通过Schrodinger软件，以Larotrectinib为起点生成TRKAG595R突变体的对接，实现大环化。在分析了结合模式后，通过环化3-羟基吡啶部分和二氟苯的溶剂暴露区域，合成了3种类型的大环化化合物，共23个。其中，化合物41是比前体更具有效力的。 丁克教授也在该项目上做了大量工作，如上图。他们首先确定了苗头化合物42，具有TRKA、TRKB、TRKC抑制活性。 以苗头化合物42为起点，新的设计首先采用了骨架跃迁的策略，获得先导化合物43，其在针对野生型TRKA、TRKC、以及突变体TRKAG667C等生化试验中显示有效活性。 通过对43的结合模式进行预测分析，发现了该化合物以II型结合模式与TRKC的APT结合口袋结合，因此，在此基础上计划将苯环和胺基序环化以获得刚性结构。 环化后的化合物44表现出比先导化合物更有效的生化活性、和细胞活性、以及更高的激酶选择性。对连接子和侧链进一步优化，获得化合物45，其效力、细胞活性、选择性进一步获得了提高。 20 TYK2激酶抑制剂 TYK2也隶属于前面提到了Janus激酶家族一员，是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点。 如上图，化合物46是一种有效的Tyk2抑制剂，通过共晶结构分析，在氧杂吡咯烷酮与吡啶基序之间的溶剂暴露区发现了大环化的切机。环化后的化合物47尽管效力没有改善，其针对JAK1、JAK3的选择性得到了极大的提高。 21 髓过氧化合物酶(MPO)抑制剂 髓过氧化物酶(MPO)是一种人类含血红素过氧化物酶，是中性粒细胞初级颗粒的主要成分。其过表达和氧化产物的形成与炎症性疾病，特别是动脉粥样硬化有关。适当调节这种酶，对预防心血管疾病很重要。 如上图，化合物48是一种有效的MPO抑制剂，针对TPO的选择性约25倍，而化合物49具有相当的MPO抑制活性。通过将结合了MPO活性位点的48、49的晶体结构于同一位置的三唑并吡啶环重叠，发现化合物48的茚环与化合物49的苯环距离很近，几乎重叠。因此，研究人员设计融合两个化合物的构象特点，通过设计大环化来提高分子的效力和选择性。 优化后，获得的化合物50，其MPO抑制效力提高了约10倍，选择性提高了1580倍！ 22 NS3/4A蛋白酶激动剂 Asunaprevir是获批NS3/4A蛋白酶药物，然而却常常诱导R155K和D168N突变而产生耐药性。这种耐药性机制可能是配体结合诱导Arg155与P2*杂环接触，Arg155与Asp168结合而稳定。因此任何一个位点的突变，都会破坏配体与NS3/4A蛋白酶结合。 因此，BMS试图通过环化P1、P3来稳定结合的活性构象，以避免耐药性突变的发生。通过优化后，获得的大环化化合物51，其激动剂活性针对所有的基因型均获得了改善。同时，除了食蟹猴以外，大鼠和狗的生物利用度也获得了很大的提高。 23 PI3K δ抑制剂 磷酸肌醇3-激酶δ（PI3K δ）可催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3)，在细胞生长、增殖、存活和迁移相关信号通路中起重要作用，主要在白细胞中表达，是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的靶点。 如上图，化合物52是一个临床候选化合物发现的起点。通过其与PI3Kδ共晶结构分析发现，磺酰胺基团的甲基与酰胺键的羰基之间靠近，具有大环化的机会。 对比环化前体，环化后的产物其针对PI3Kδ抑制效力和结合力显著提高，配体效力（LE)略微改善、体内/体外的清除率明显降低。 24 PI3K/m-TOR抑制剂 PI3K/AKT/m-TOR信号通路的激活与乳腺、结肠、肺、血液等恶性肿瘤的发生发展有关。 如上图，Omipalisib是已知的PI3Kα、m-TOR抑制剂，以此为起点，通过对其共晶结构的分析、以及分子对接的了解，研究人员通过环化两个溶剂前沿区域的靠近基序，获得的产物55，其PI3Kα抑制活性得到了改善，m-TOR抑制效力降低，p-AKT激动活力提高了3倍以上等。 25 PI3K/m-TOR/PIM抑制剂 PIM激酶通过参与PI3K/m-TOR/PIM通路参与癌症的发展。 如上图，环化产物57比非环化前体56更具有效力和选择性，且具有泛PIM抑制活性。 26 纤溶酶抑制剂 纤溶蛋白是一种类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，在生理条件下参与纤维蛋白凝块的降解，控制循环中纤溶和凝血的平衡。纤溶酶活性增强的情况，如心脏手术合并体外循环、和器官移植，会增加出血性疾病的风险。 如上图，化合物58是一种非特异性抑制剂，具有次nM级抑制力活性。在分子模拟研究中发现，P2、P3侧链与美表面或溶剂暴漏区的方向相同；而且，除了纤溶酶外，其它蛋白酶的“发卡”结构会与P2、和P3形成的大环产生空间冲突，因此，这为大环化后提供了潜在的选择性。 通过优化后，获得大环后产物59，其抑制效力保持，而且选择性获得了极大的提高。 27 RORC2反向激动剂 视黄酸受体相关孤儿受体C2(RORC2, RORγt)是一种与IL-17A和IL-17F表达相关的核激素受体。因此，一种合适的调节RORC2受体的小分子，特别是作为一种逆激动剂，可能抑制体外IL-17A的产生，并对牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎症性肠病和多发性硬化症的体内模型有效。 如上图，化合物60是辉瑞发现的一个低分子量的先导化合物，进一步的改善获得化合物61，其表现出合理的RORC2反向激动作用和IL-17A抑制性，但理化特性没有得到改善。 通过共晶结构分析发现，化合物61具有“U”型活性构象，因此，将两个靠近的基序进行连接、大环化，获得产物62，其活性略有降低，然而其物化特性获得了极大的改善。 28 突变呼吸道合胞病毒融合(RSV F)蛋白 呼吸道合胞病毒（RSV）是一种传染性病毒，可引起下呼吸道感染，特别是婴幼儿和患有其它疾病的老人。 如上图，Presatrovir是目前正在临床阶段的很有前景的RSV F蛋白抑制剂。然而，已经观察到耐药性突变，这是一个非常严重的问题。 研究Presatrovir和野生型A2 RSV F蛋白分子模型发现，磺胺的氢和吡唑环的氮相互作用。将分子模型数据与单晶结构进行比较，结果很吻合。为了稳定这种构象，尝试基于先导化合物63进行大环化，来靶向野生型和D486N突变型RSV F。 其中各项最平衡的产物是化合物64，其针对野生型的活性降低，但针对突变体活性获得了极大的提高。然而，NMR分析，其具有拓扑异构混合物的存在。进一步优化，扩展环获得化合物65，其针对野生型、突变体的活性都获得了极大的提高，没有拓扑异构混杂的现象。捅死，在10μM环境下，仍没有CYP3A抑制活性。 29 干扰素基因刺激剂（STING) 干扰素基因刺激剂（STING)是一种衔接蛋白，在免疫应答相关的信号通路中发挥重要作用。因此，STING激动剂用于感染性疾病和癌症免疫治疗；而STING抑制剂用于自身免疫性疾病和炎症的治疗。 如上图，环化后的产物比前体具有更高的亲和力以及活性。 3 总结   在药物发现中，越来越多的证据表明，大环提供了一种新颖的化学类别，它占据小分子和生物制剂之间独特的化学空间。基于独特的构象特征，大环的药物特性使它们能够靶向其它化学类别不易接近的细胞外和细胞内的位点。 基于大环的药物设计或小分子“大环化”的分子编辑策略，在药物法中具有潜在的优势。 大环可以为靶蛋白提供更大的相互作用表面，从而在结合强度和特异性方面增强了结合亲和力； 大环的复杂性和三维特性增加了可能有助于提高靶蛋白的选择性，从而减少脱靶效应，增加治疗的安全性和选择性； 线性化合物的“大环化”通常提供更好的细胞渗透性，从而提高生物利用度； 大环的约束构象和刚性结构还可以提高稳定性，增加抵抗酶降解的能力，进而延长药物在体内的半衰期； 大环提供独特的化学支架，扩大化学空间的多样性； 大环能够更好的平衡亲脂性、亲水性、和分子量等性质，获得最佳的类药性； 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓