药渡Cyber解析拜耳开发的TRPA1拮抗剂BAY-390的设计及优化过程

2024-02-17

临床1期临床结果临床终止临床2期

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程瞬时受体电位 A1（TRPA1）是一种电压依赖性、配体门控的离子通道，其激活与多种疼痛状况有关。临床前研究已经证明TRPA1受体在急性、炎症和神经性疼痛动物模型中的作用。TRPA1拮抗剂GRC-17536（Glenmark公司）的临床研究已证实其在疼痛性糖尿病神经病变患者上具有疗效。因此，TRPA1是镇痛药物的潜在靶点。采用高通量筛选（HTS）命中在人和啮齿动物TRPA1均具有活性的化合物15，对其芳香片段、连接基团和环己基片段分别进行SAR研究，发现一种新型的血脑屏障通透性TRPA1拮抗剂（化合物18，BAY-390），该拮抗剂目前正作为开源的探针分子使用。本文梳理了BAY-390的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-390的优化过程瞬时受体电位 A1（TRPA1）是一种电压依赖的配体门控通道，可渗透一价和二价阳离子。TRPA1在外周和中央神经系统中均有表达，也在胶质细胞，免疫细胞，血管内皮，屏障组织，肺细胞，关节细胞和癌细胞中表达。RPA1通过直接或间接，内源性或外源性，非反应性配体等多种方式激活，并受pH和/或温度的变化影响。内源性介质，如氧化脂质、前列腺素、代谢物和反应分子（即过氧化氢），可在体外激活TRPA1，从而启动Ca2+信号。TRPA1与多种病理疾病有关，如疼痛性疾病、皮肤病、肺部疾病、泌尿生殖系统疾病和胃肠道疾病。特别是，TRPA1受体在急性痛觉、慢性炎症性和神经性疼痛中的作用被广泛研究。TRPA1基因的功能获得突变被证明是导致家族性发作性疼痛综合征的原因。临床研究证明TRPA1拮抗剂2（GRC-17536）对患有疼痛性糖尿病神经病变患者有疗效。在一项I期研究中，TRPA1拮抗剂GDC-0334能够减少TRPA1激动剂诱导的皮肤血流量、疼痛和瘙痒。近年来，多种化学结构分子被鉴定为TRPA1拮抗剂（图2），这些化合物有些具有显著的物种差异，有些物理化学性质，如溶解性、代谢稳定性和血脑屏障通透性等不足，导致仅有少数化合物进入了临床研究。近日JMC报道了有关TRPA1拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法，命中了化合物15，对该分子进行针对不同的位点开展SAR研究，获得双重抑制人及啮齿动物TRPA1的先导化合物18。采用位置突变的方法，发现化合物18的结合位点在TRPA1的位点1a。化合物18不仅具有良好的药理性质，并且在多种疼痛及炎症模型上显示出体内药效活性。设计和优化过程总结如下：图2. 文献中报道的TRPA1拮抗剂Hit发现研究人员用重组表达人TRPA1和遗传编码钙指示剂GCaMP6的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行Ca2+内流检测。针对包含400万个化合物的结构库进行高通量筛选，旨在识别具有可口服等特性的新型TRPA1拮抗剂。其中，化合物15在人类（hTRPA1 IC50=14nM）和啮齿动物（rTRPA1 IC50=1370nM）TRPA1上均具有较高活性（表1）。SAR研究化合物15包含非对映异构体（未知比例），具有合适的亲脂性（log D 4.1），但结构中的硝基结构不利于成药。因此，针对硝基进行修饰（表1）：（1）F原子取代硝基后，分离对映体，只有一种对映体（(rac)-16）与15几乎等效；（2）Cl或氰基的引入导致活性下降；（3）供电子基团，如甲基（24c）、对甲氧基（24d）或酰胺（24e）的引入，导致完全失去活性；（4）间位F（24f）及氰基（24g）取代，邻对位双F（24h）导致活性明显降低。说明苯环上引入取代基的耐受性较差。去除化合物(rac)-16上的偕二甲基，然后分离单一异构体，得到对人类和大鼠TRPA1活性（hTRPA1 IC50＝4.0nM，rTRPA1 IC50＝24nM）均明显提高的17（表2）。化合物17的立体化学性质与16a相反，但log D（3.8）改善不明显。进一步对17进行结构修饰：（1）将苯环变为Cl-噻吩27a，对hTRPA1活性相似，但rTRPA1下降。（2）将苯环变为极性杂环（27b−h），导致TRPA1活性下降，且rTRPA1活性下降更明显；（3）将亚甲基连接基团变为O（31）或NH（18，BAY-390），活性高效且亲脂性（logD分别为3.5和3.0）略低于早期化合物。采用圆二色谱（VCD）测定18的绝对立体构型为R,R-构型，该分子表现出更好的溶解度；（4）对化合物18进一步改构，如N上烷基化（32a和32b）或环化（32e和32f），导致活性降低。结合位点研究目前缺乏TRPA1与小分子结合的结构信息，研究人员对hTRPA1进行突变，比较前期发表的不同结构类型的化合物与突变和野生型hTRPA1蛋白结合的研究。图3显示的是化合物4的冷冻电镜（cryoEM）结构。F909T和T874V突变体被称为结合位点1a；M911A突变接近F909，为结合位点1b；N855S突变和G238K/N249S/K270N突变分别为结合位点2和3。图3. TRPA1拮抗剂的结合位点瞬时转染上述突变体及野生型，采用基于荧光的FLIPR钙离子检测，比较目前报道的活性分子对突变型和野生型的活性。如表3所示，大于3倍的变化被认为是显著的，具体分析如下：（1）化合物BAY-390、3、4、5、10和13对T874V和F909T突变体显示活性的显著变化，表明它们结合在TRPA1的位点1a；（2）化合物6对M911A突变体活性差别较小，可能需要双突变（M911A/M912A）才能看到显著的效果；（3）化合物1和2对N855S突变活性发生显著变化，证实了它们与位点2的结合；（4）测试的化合物均未受到G238K/N249S/K270N突变的影响，说明这些化合物都没有结合在位点3；（5）化合物14和7对任何突变体都没有活性损失，化合物14被推测与蛋白内半胱氨酸共价结合，化合物7的结合未知。所述突变研究的结果与已发表的数据一致，表明BAY-390与1a位点结合。BAY-390药理性质评价化合物BAY-390在大鼠肝细胞中的体外代谢稳定性为中等水平（Clblood 2.4 [L/h/kg]），但其具有高渗透性和低外排（CaCo-2A−B：293nm/s；efflux ratio=0.6），合适的溶解度和口服暴露量。在多种动物模型中表现出了良好的疗效，最低暴露量（fu%rat=0.6）均高于体外IC50。BAY-390药效性质评价BAY-390减弱肉桂醛（CA）诱导的大鼠的伤害行为在大鼠足底注射TRPA1激动剂CA会导致TRPA1介导的伤害性反应，其特征是强烈的退缩和舔舐行为（图4A）。使用这种动物模型可以直接研究TRPA1介导的反应，并评估TRPA1拮抗剂的靶向效应。BAY-390口服剂量分别为3、10和30 mg/kg，显示显著减少退缩的数量和舔爪的时间（图4A），从而证实了BAY-390在体内抑制TRPA1激活的能力。给药1h后的游离血浆浓度（3、10和30mg/kg对应浓度为10、35和115nM）达到了体外IC5016nM)。图4. BAY-390在大鼠体内疼痛模型中的药理疗效。（A）肉桂醛（CA）诱导的伤害行为；（B）完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症性疼痛；（C，D）脊神经结扎（SNL）引起的神经性疼痛BAY-390减少完全弗氏佐剂（CFA）诱导的大鼠炎症性疼痛在大鼠足底注射CFA可引起炎症性疼痛。这种外周炎症性疼痛模型的特征是产生机械性疼痛，可用于评估化合物的镇痛和抗炎作用。如图4B所示，口服BAY-390，在给药2h及4h后，10和30mg/kg给药组均显著减少机械性疼痛。BAY-390逆转大鼠脊神经结扎（SNL）神经性疼痛模型中机械异常性疼痛从SNL手术后的第15天到第24天，连续10天，给药BAY-390（p.o., b.i.d），2小时后进行疼痛测试（图4C）。口服90mg/kg的BAY-390，6天后开始产生明显影响（p<0.05），10天后能够持续保持（p<0.05）（图4D）。先导化合物进一步优化BAY-390的苯胺类代谢物可能会有遗传毒性（Ames）风险，因此进行进一步SAR优化（表4）：（1）氰基（34b）取代导致了活性的丧失；（2）Cl原子（34a）取代具有很好的耐受性；（3）取代基位置的变化都降低活性，特别是对rTRPA1；（4）34e具有良好的hTRPA1和中等rTRPA1活性，代谢稳定性（Clblood 2.3 [L/h/kg]）也与BAY-390相当，但PK研究显示暴露量（fu%rat=0.36）降低；（5）34f和34g对rTRPA1活性显著下降；（6）吡啶（34d）等杂环的引入耐受性较差（hTRPA1 IC50=440nM，rTRPA1 IC50=6300nM）。结论采用高通量筛选方法，获得Hit化合物15（hTRPA1 IC50=14nM，rTRPA1 IC50=1370nM）。优化活性和理化性质，成功获得先导化合物18（BAY-390），该分子在炎症和神经性疼痛的体内模型中具有良好的药效，适合作为体外和体内探针来研究TRPA1在啮齿类动物临床前模型中发挥的中枢和外周作用。BAY-390已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01830请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就TRPA1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“TRPA1”，选中关联“TRPA1 (Homo sapiens)”搜索TRPA1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于TRPA1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3. 在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到TRPA1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。