推荐学习 | 抗体的前世今生

2023-08-09

1890年，日本科学家北里柴三郎发现，感染白喉杆菌的动物康复后，血浆中存在一种能缓解白喉毒性的物质。他将这种物质命名为抗体（antibody）。本文将从抗体定义，抗体分类，抗体-抗原结合，单克隆抗体的生产，应用和生物功能来介绍抗体的前世。一、抗体定义抗体，又称免疫球蛋白（immunoglobulin），由B淋巴细胞产生，是一种Y字型分子，由两条轻链和两条重链组成，分子量约为150kD，其中轻链分子量约25kD，重链分子量约50kD。按照功能划分抗体分子可分为抗原结合区Fab和可结晶区Fc。Fab区域具有高度可变性，能高亲和力结合特异抗原，Fc区域较为保守，主要招募相关细胞引发免疫反应，如吞噬等。Fab与Fc结合处称为铰链区。两条重链和轻链以二硫键相连。在抗体Fc区域还存在大量N-糖基化修饰，这些糖类对于抗体发挥功能有着重要作用。IgG2a结构。Harris et al. 1997二、抗体分类根据抗体重链Fc区域的不同，可将抗体分成五类，即IgA, IgG，IgM, IgD, IgE，对应α, γ, μ, δ，ε五种不同类型重链；轻链有两种类型，分别是κ链和λ链，两者在功能上没有区别，在人体内κ链和λ链的数量比为2:1。五种不同抗体的结构如上图所示，IgG, IgD, IgE在体内均为单体形式存在，IgM被J chain固定在Fc区，形成五聚体IgA既有单体，也有J chain固定的二聚体形式（与J chain形成二硫键）。单体IgA主要分布于骨髓、淋巴结、脾脏，二聚IgA主要位于粘膜表面，如皮肤、肠道，也存在于乳汁、眼泪、汗液等分泌物中。不同抗体分子量、血浆浓度和半衰期IgG是血浆内含量最高的抗体，根据铰链区结构不同可以进一步细分为4个亚型，即IgG1-4.。铰链区可以增加抗体Fab片段的弹性，使其更容易结合抗原表面两个表位，也更容易激活补体。但铰链区越长，越容易被蛋白酶降解，因此寿命越短（IgG3）。四种亚型，IgG4最特殊，它的含量最低，不能激活补体，但却有一项额外技能（由CH3区域赋予）：可以与另一分子IgG4交换半边轻重链，形成杂合抗体（除IgG4外，所有抗体的两个Fab区域都是一样的）。IgG亚型结构。黑色连线代表二硫键根据抗体氨基酸序列保守程度，可以将轻重链分成可变区(V domain)和保守区(C domain)。轻链的C区与V区均由β-sheet方式折叠成两团，对可变区氨基酸进行测序发现，其中某些区域的氨基酸基团可变程度远远高于周围，将这些区域称为超变区（hypervariable region, HV）三维结构上，这些超变区位于β-sheet的连接环(loop)处，由于它们与抗原结合，故被命名为互补决定区域（complementarity-determining region, CDR）。同一条轻链的V区共有3个CDR，这些区域的氨基酸序列决定了抗体能否与抗原特异、紧密结合。为了对抗体不同区域进行研究，可以用蛋白酶切割的方式将抗体从铰链区切断。常用的有木瓜蛋白酶（papain）和胃蛋白酶（pepsin）。在一定条件控制下，Papain较为温和，切断铰链区后产生两分子Fab和一分子Fc；Pepsin则能将Fc切碎，保留铰链区域的二硫键，形成一分子F(ab')2，通过加入还原剂也能得到单分子Fab三、抗体-抗原结合抗体具有高度特异性，主要是通过结合抗原表面某一特定分子结构而产生的，这种抗原表面的特定结构被成为表位（epitope）。抗原可以是任何分子，最主要为蛋白质以及糖类（包括糖蛋白、糖脂）等大分子。对于分子量比较小的，我们称之为半抗原（hapten）。这些小分子需要共价结合在蛋白等大分子上才能被抗体识别。有时候，抗体结合的表位是序列上连续的氨基酸，这种表位称为线性表位（linear epitope）；有时，表位是空间上临近，但蛋白序列上不相邻的氨基酸，这种表位称为不连续表位(discontinuous epitope)。含有多个表位的抗原称为多价抗原（multivalent antigen），可以被不同抗体识别。关于抗体-抗原相互作用强弱的表征，有两个重要概念，分别是affintiy和avidity。两者中文都是“亲和力”的意思，但affinity指单个Fab区域结合抗原表位的强弱，而avidity指整个抗体分子（甚至是抗体的二聚体、五聚体）结合抗原能力的强弱。例如，IgM以五聚体形式存在，虽然Fab区域affinity较低，但由于整个分子存在10个Fab区域，可以结合具有重复表位的抗原，总体avidity还是比较高的。解离常数Kd可以表征Fab与抗原作用强弱，一般IgG抗体的Kd都在nM量级。测量抗体Fab的affinity的主要表征手段为表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance， SPR），其原理如下图所示：抗原分子附着在金属表面，抗体Fab与其结合，使得光路发生改变。测量达到平衡时有多少表面分子结合即可算出解离常数。由于抗体-抗原的结合具有特异性和高亲和性，化学上可以利用抗体制造反应催化剂，这种抗体被称为催化抗体（catalytic antibody）。催化抗体的作用机理是结合并稳定反应过渡态分子，降低反应活化能。通过选择、设计合适的半抗原，可以生产出具有高度选择型的催化抗体。抗体具有高度可变性和庞大的数量，远远大于编码蛋白的基因数（2万）。那么，人体是如何产生种类繁多的不同抗体呢？为了产生尽可能多种类的抗体，有两个主要的过程：遇到抗原以前，B细胞通过V(D)J重组（recombination）产生不同抗体；遇到抗原以后，主要通过体细胞超突变（somatic hypermutation，SHM）产生高亲和力抗体（这一过程被称为affinity maturation）。这里主要介绍V(D)J重组过程，SHM将在后一章介绍。编码免疫球蛋白的基因并不是一个基因，而是由许许多多基因片段组成，依次排列在染色体上。在人体，B细胞通过“洗牌”的方式抽取不同基因片段连成完整的重链、轻链基因。免疫球蛋白重链基因座位于14号染色体上，分为V(variable)、D(diversity)、J(joining)三个区域，每个区域分别有约40、23、6种不同的基因片段。轻链的可变区只有V和J两个区域，其中λ链基因座位于22号染色体，对应区域分别有约30、4个片段，κ链基因座位于2号染色体，对应区域分别有约35、5个不同片段。每个B细胞需要从V、D、J区域各随机抽取一个片段组成重链，再从λ或κ链中的一个选择一个V区+一个J区片段组合成轻链，最终形成完整的抗体。这样计算一下抗体可能的总数便有40×23×6×(35×5+30×4)=1.6×10^6种。免疫球蛋白基因座结构B细胞内催化V(D)J重组的酶主要是Rag1和Rag2，在重组过程中一些DNA修复酶也会参与其中。重组信号序列（RSS）是RAG的识别位点，由保守的7mer(5'-CACAGTG-3')，12/23 spacer和保守的9mer(5'-ACAAAAACC-3')组成。RSS位于V片段3'端，D片段两侧和J片段5'端。12spacer RSS和23spacer RSS分别位于同一间隔片段的两端，这样才能保证RAG酶正确切割（称为12/23规则）。RAG复合物从7mer上游切断DNA形成双链断裂切口，并将切口处相邻的核苷酸连在一起。接着，Artemis复合物与DNA结合，切断其中一条链，打开hairpin结构，形成回文核苷酸（Palindromic, P-nucleotide）【注：回文DNA的互补链和正义链序列正好反过来】。这样，切口两端的DNA双链均有一条向外延伸的粘性末端（3' overhang）。TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)会继续在P-nucleotide末端随机插入碱基，进一步增加抗体的多样性。这些插入的碱基称为N-nucleotide。最后，通过非同源末端连接（NHEJ）将两条DNA片段连接到一起，完成一次重组。连接过程使得抗体获得额外多样性，增加的倍数多达3×10^7。四、单克隆抗体的生产单克隆抗体（monoclonal antibody）是指单一种类的抗体。杂交瘤（hybridoma）技术是目前最常用的单克隆抗体生产技术，可以满足目前大量生产抗体的需要。为了获得针对某种抗原的抗体，首先需要将抗原注射到小鼠（或者兔、山羊等动物）体内，待其产生免疫反应后分离其脾脏中的B细胞，同时与永生化的淋巴瘤细胞融合。使用含有HAT的培养基筛选细胞，只有融合成功的B细胞可以存活并扩增。这种细胞既能像成熟B细胞一样产生抗体，又具有淋巴瘤细胞无限分裂和永生的能力。未融合的淋巴瘤细胞会被HAT杀死，而天然B细胞的寿命很短最终也会死去。最后只剩下融合的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞稀释到极低浓度分装于96孔板中，使得每个孔中只有一个细胞，这样孔中的扩增出来的细胞就都是单克隆细胞了。通过ELISA法筛选，可以选出结合特定抗原的单克隆抗体。将该细胞扩增，收集上清液，就能纯化出抗体。纯化抗体使用的是从金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）中分离出的Protein A，这是一种能特异结合IgG等抗体Fc区域的蛋白。同样来源于链球菌，Protein G也能结合抗体Fab和Fc保守区，被用于提纯抗体。但Protein G对于血清蛋白albumin也有一定结合能力，需要删去结合域。Protein L来源于Peptostreptococcus magnus，可以结合抗体轻链部分。五、应用1.ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）中文名称酶联免疫吸收法，是一种最常见的利用抗体特异性分析物质浓度的方法，其基本原理如下图所示：待分析物（抗原）吸附在固定相表面，加入抗体孵育，抗体与抗原结合，洗涤去除非特异性吸附。抗体表面连有酶，可以催化某些化学反应发生，产生荧光物质。最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢-鲁米诺体系，该反应十分灵敏，可以检测到nmol量级甚至更低的蛋白。Luminol化学发光反应机理2. Western blot（免疫印迹法）该方法的基本原理和ELISA类似，是将蛋白样品通过凝胶电泳分离（SDS-PAGE）、转膜后，分别孵育一抗和二抗，最后荧光法显色。该方法广泛应用于生化分析，是生物学实验的必备技能之一。3. 抗体共价药物（antibody-drug conjugates，ADC）利用抗体结合抗原的特异性，可以将抗体作为载体定点释放药物，从而减少药物的毒副作用、增强药效。抗体共价药物，顾名思义就是通过化学反应在抗体分子上共价连接小分子药物。目前获FDA批准上市的抗体共价药物包括Adcetris®（anti-CD30，治疗霍奇金淋巴瘤），Kadcyla®等，均用于癌症治疗。这些抗体药物首先结合肿瘤细胞表面特异靶蛋白，被细胞内吞后分解释放出具有细胞毒性的小分子药物，从而有效杀死肿瘤细胞。六、生物功能抗体主要通过中和（neutralizing）、调理（opsonization）、和抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）三种方式清除病原体。中和：直接与细菌、病毒以及毒素结合，防止其进入细胞内。调理：抗体结合病原体后，被巨噬细胞、粒细胞等吞噬细胞（phagocyte）表面的Fc受体识别、内吞并消化。此外抗体也能激活补体系统，增加病原体被吞噬的概率。ADCC：NK细胞表面Fc受体能识别被抗体标记的细胞（如肿瘤细胞和被病毒感染的细胞），并分泌毒素杀死异常细胞。抗体参与的中和、调理过程，最右为补体参与的调理过程。不同类型的抗体的Fc区域有很大差异，因此发挥的功能也不一样，下表是抗体功能的总结：可以看到，IgG家族蛋白功能最为广泛，几乎囊括了中和、调理、补体激活和ADCC的全部功能。IgE比较特殊，只能激活肥大细胞，是过敏反应的元凶。小结：抗体是体液免疫的重要组成。本章介绍了抗体的基本结构、分类以及生物功能，同时也涉及到抗体在生物实验和医药方面的重要应用。抗体-抗原相互作用的特异性和高亲和性是抗体发挥免疫功能的基础。抗体的多样性来源于VDJ重组和SHM，本章对前者的机理做了详细解释。参考文献：【1】 Murphy, Ken, and Casey Weaver.Janeway's immunobiology. Garland Science, 2016.【2】Parham, Peter.The immune system. Garland Science, 2014.【3】Sievers, Eric L., and Peter D. Senter. "Antibody-drug conjugates in cancer therapy."Annual review of medicine64 (2013).【4】Pandey, Shivanand. "Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies."Hybridoma1.2 (2010): 017.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。