Brentuximab Vedotin

注：文章内容源自书籍Antibody-Drug Conjugates--The 21st Century Magic Bullets for Cancer (Second Edition)第5章内容的翻译。 摘要：ADCs是一类结构复杂的分子，旨在为癌症患者提供靶向治疗。ADC通常由抗体与小分子细胞毒性药物偶联形成，偶联方式主要有两种：一是通过赖氨酸的ε-氨基形成赖氨酸连接型ADC，二是通过链间胱氨酸还原产生的巯基形成偶联物。THIOMAB药物偶联物（TDCs）是ADC的一个新子类，其抗体特定位点上经基因工程改造的游离半胱氨酸残基可与细胞毒性药物发生偶联。目前市面上及处于研发阶段的大多数ADC都含有一个共同结构单元--硫代琥珀酰亚胺连接子，该连接子易发生琥珀酰亚胺的水解反应和硫醚键的断裂反应。ADC是由不同载药量的抗体物种组成的异质混合物，而TDCs中连接子-药物的分布则更均一。连接子稳定性、载药量分布以及药物抗体比率（DAR）被认为对ADC产品的疗效和安全性起着关键作用。本章将介绍相关分析方法和制剂策略，以了解并表征这些关键质量属性，从而开发出稳定的ADC制剂。文中阐述了DAR对ADC聚集性的影响，此外，还介绍了pH值与缓冲液、抗氧化剂、表面活性剂等制剂参数，并最后探讨了冻干制剂的优缺点。 关键词：制剂；药物抗体比率；稳定性；ADC聚集；冻干 5.1 引言 ADCs有望在为癌症患者带来更强肿瘤杀伤作用的同时，减少副作用。ADC结合了靶向单克隆抗体（或抗体片段）与强效抗癌治疗药物的特性，能够实现精准且具有选择性的递送。多种细胞毒性药物，如奥瑞他汀类、美登素类、卡奇霉素、倍癌霉素以及其他小分子药物，均已通过与单克隆抗体偶联制备成ADC。过去20年间，研究人员开发了多种连接子化学结构，包括酸不稳定腙键、位阻型（SPDB）和非位阻型（SPP）二硫键、可裂解（VC）和不可裂解肽键、不可裂解硫醚键（SMCC）等。半胱氨酸和赖氨酸是两种最常用的天然氨基酸，药物可通过连接子与这两种氨基酸结合，进而实现与抗体的偶联。基于巯基的迈克尔加成反应具有反应特异性高、反应速度快且无副产物等优点，因此被广泛用于蛋白质、多肽与药物的共价偶联，该反应通过游离半胱氨酸或巯基与马来酰亚胺发生作用实现。以2011年美国FDA批准的维布妥昔单抗（ADCETRIS）为例，该药物中维布妥昔单抗通过抗体链间二硫键还原产生的半胱氨酸巯基，与马来酰亚胺-VC-PAB-MMAE发生偶联。这种反应同样应用于新型研发的TDCs中，在TDCs里，抗体特定位点上经基因工程改造的游离半胱氨酸残基可与细胞毒性药物偶联。对于2013年获批的曲妥珠单抗-美坦新偶联物（KADCYLA），其制备过程为先将曲妥珠单抗（Tmab）上的赖氨酸残基与连接子SMCC修饰形成中间体Tmab-MCC，随后该中间体再与细胞毒性药物DM1反应，最终形成抗体药物偶联物T-DM1。尽管这些偶联物的合成路线各不相同，但它们的连接子都含有相同的硫代琥珀酰亚胺结构单元，该结构单元的稳定性对产品质量、安全性和疗效至关重要。TDCs中连接子- 药物的分布更均一，而赖氨酸连接型和半胱氨酸连接型ADC通常会导致小分子药物与抗体偶联后的分布呈现异质性。 连接子稳定性、DAR和载药量分布对ADC产品的质量、安全性和疗效均具有关键影响。本章重点介绍用于解决这些关键质量属性的分析方法和制剂策略，探讨硫代琥珀酰亚胺连接子的降解途径、DAR对ADC聚集倾向的影响，以及制剂开发过程中需要考虑的因素，包括pH值与缓冲液的选择、抗氧化剂、表面活性剂的使用，还有液体制剂和冻干制剂相关的问题。 5.2 硫代琥珀酰亚胺连接子的稳定性 5.2.1 降解途径机制 由于ADC结构复杂且降解产物多样，在抗体本身存在多种降解途径的情况下，单独研究连接子的稳定性具有一定难度。研究人员通过合成小分子模型化合物S-（N-乙基琥珀酰亚胺基）-N-乙酰-L-半胱氨酸（NEM-NACys）（图5.1），对硫代琥珀酰亚胺连接子的降解过程展开了研究。研究发现该连接子主要存在两种降解途径：（i）琥珀酰亚胺发生水解反应，形成开环结构；（ii）在巯基化合物存在的条件下发生逆迈克尔反应。无论是在体内还是体外环境中，琥珀酰亚胺都是蛋白质或多肽中天冬酰胺（Asn）脱酰胺化和天冬氨酸（Asp）异构化反应的关键中间体。在这些反应中，琥珀酰亚胺的形成是决定反应速率的关键步骤。天冬酰胺的脱酰胺化反应依赖于氢氧根离子（[OH⁻]）浓度，即使在pH值为3-4的弱酸性条件下也会发生，且在中性和碱性pH条件下，随着琥珀酰亚胺水解速率的加快，脱酰胺化反应会迅速加剧。与琥珀酰亚胺的水解反应不同，在缺乏巯基类化合物等迈克尔供体的情况下，硫醚键相对稳定。逆迈克尔反应的动力学过程以及巯基交换的程度，会受到迈克尔供体反应活性的调控。需要注意的是，琥珀酰亚胺开环后，硫醚键会变得更加稳定，因此即使存在迈克尔供体，也不会再发生巯基交换反应。 图5.1 模型化合物S-（N-乙基琥珀酰亚胺基）-N-乙酰-L-半胱氨酸（NEM-NACys）的降解途径：（i）琥珀酰亚胺水解；（ii）在迈克尔供体（GSH，谷胱甘肽）存在下发生逆迈克尔反应 对模型化合物中硫代琥珀酰亚胺结构单元降解机制的研究，有助于理解ADC中硫代琥珀酰亚胺连接子的稳定性。有研究报道，半胱氨酸连接型ADC可通过逆迈克尔交换反应释放游离药物，并形成白蛋白加合物。研究人员采用放射性同位素标记法和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）发现，该过程的第一步是可逆解离反应，在此反应中，与硫代琥珀酰亚胺连接的细胞毒性药物会从抗体上解离下来。 血浆中含量最丰富的含巯基蛋白质--白蛋白，其34位存在一个具有反应活性的半胱氨酸残基。白蛋白会与结合有细胞毒性药物的马来酰亚胺发生反应，形成白蛋白-药物加合物。然而，在磷酸盐缓冲液中，由于不存在迈克尔供体，并未观察到逆迈克尔反应的发生。 连接子的稳定性对ADC的安全性和疗效至关重要。以TDCs为例，研究人员设计了三种单克隆抗体重组变体，每种变体的半胱氨酸分别位于轻链（LC）、重链（HC）和Fc区域（Fc），这些变体的局部电荷环境和溶剂可及性存在差异，进而通过迈克尔加成反应形成偶联物。其中，轻链偶联位点所处环境的正电荷密度最高，而Fc区域偶联位点的溶剂可及性最强。研究人员对比了这三种变体中琥珀酰亚胺的水解程度和白蛋白加合物的形成量。由于轻链结构域正电荷环境下氢氧根离子的局部浓度较高，轻链TDC变体中琥珀酰亚胺的水解速度远快于重链和Fc区域的TDC变体。因此，轻链TDC变体形成的白蛋白加合物量最少，这是因为琥珀酰亚胺开环后硫醚键稳定性增强，从而阻止了进一步的巯基-马来酰亚胺交换反应。另一方面，Fc区域TDC变体的溶剂可及性最强，因此通过逆迈克尔反应形成的白蛋白加合物量最多。在利用食蟹猴开展的研究中，研究人员观察到由于溶剂可及位点在白蛋白或谷胱甘肽（GSH）等其他迈克尔供体存在的情况下发生马来酰亚胺交换反应，蛋白质偶联物出现了生物活性丧失和毒性现象。 若ADC采用稳定的琥珀酰亚胺开环连接子，则不会发生逆迈克尔交换反应，其体外和体内稳定性以及潜在的治疗活性都可能得到显著提升。为实现这一目标，研究人员开发了一种修饰型硫代琥珀酰亚胺连接子，通过在马来酰亚胺基团附近引入一个碱性氨基，在中性pH值和室温条件下实现琥珀酰亚胺水解的快速分子内碱催化。该水解反应可在2小时内完成，适用于生产工艺。这类自稳定型ADC的抗肿瘤活性和安全性得到了显著改善，代表了当前ADC技术的一项潜在突破。 5.2.2 ADC中硫代琥珀酰亚胺水解的表征 连接子稳定性是ADC的关键质量属性之一。对于硫代琥珀酰亚胺连接子而言，琥珀酰亚胺发生水解后，开环结构会产生额外电荷，导致其电荷状态和疏水性发生改变。常用于蛋白质中琥珀酰亚胺鉴定和定量的分析方法，同样适用于ADC。反相高效液相色谱-质谱联用技术（rpHPLC-MS）已被用于分析血清血浆中完整ADC的硫代琥珀酰亚胺连接子水解情况。近期，研究人员开发了一种快速FabRICATOR®（Genovis AB）反相高效液相色谱图谱分析方法，该方法利用一种新型蛋白水解酶的独特特异性，在温和的生理pH条件下，仅需几分钟就能在铰链区实现切割，生成纯净的F(ab′)₂片段和Fc片段，且不会发生进一步降解。结合质谱检测技术，FabRICATOR®反相高效液相色谱方法还能够通过分离和定量开环形式与闭环形式的连接子，实现对特定位点硫代琥珀酰亚胺水解情况的监测。另一种常用的替代分析方法是成像毛细管等电聚焦（icIEF），这是一种用于蛋白质电荷变体分离的高分辨率分析方法。若要通过icIEF准确测定硫代琥珀酰亚胺连接子的水解程度，需扣除ADC中抗体部分脱酰胺化反应对检测结果的影响。图5.2展示了半胱氨酸连接型ADC与其未偶联单克隆抗前体的icIEF图谱叠加结果。酸性区域icIEF图谱的异质性，是由ADC因连接子脱酰胺化和琥珀酰亚胺水解反应获得的多种负电荷共同导致的。假设：（i）电荷变体仅由脱酰胺化反应和硫代琥珀酰亚胺连接子水解反应产生；（ii）主峰向酸性区域偏移的每个峰均代表获得一个电荷，研究人员采用了一种加权峰面积法来定量ADC中硫代琥珀酰亚胺的水解程度，该方法同时考虑了电荷状态和载药量。 图5.2 （a）在pH 9下孵育48小时的未偶联单克隆抗体溶液的icIEF谱图：由脱酰胺作用产生的带负电荷的变体；（b）在pH 9下孵育8、16、24和48小时的半胱氨酸连接的抗体药物偶联物的icIEF谱图：由脱酰胺作用和琥珀酰亚胺水解共同产生的带负电荷的变体 5.3 DAR对ADC稳定性的影响 5.3.1 DAR与载药量分布的测定 目前已有多种分析方法用于DAR的测定。若抗体和药物的最大吸收波长存在明显差异，可采用简单便捷的紫外-可见分光光度法。该方法能够分别测定抗体和药物的浓度，进而计算出平均DAR值，且适用于半胱氨酸连接型和赖氨酸连接型两种ADC。但需要注意的是，在不同缓冲液、离子强度或pH条件下，抗体和药物的吸光系数可能会受到影响。疏水相互作用色谱（HIC）也可用于半胱氨酸连接型ADC的DAR测定，其原理是基于疏水性的差异--疏水性最弱的未偶联形式最先洗脱，疏水性最强、载药量最高的物种最后洗脱。HIC采用相对温和的非变性条件，不会破坏ADC的结构，因此能够对具有不同DAR的完整ADC的载药量分布进行测定。通过各峰面积占比及其对应的载药量，可计算出平均DAR值。采用反相高效液相色谱（rp-HPLC）也可获得类似结果，且相较于HIC，rp-HPLC在DAR测定中具有更高的分辨率。然而，反相高效液相色谱流动相中含有的有机溶剂和少量有机酸，可能会对完整的半胱氨酸连接型ADC造成破坏。使用二硫苏糖醇（DTT）等还原剂处理ADC，可使链间二硫键完全还原，生成稳定的轻链、载有1个药物的轻链、重链以及载有1-3个药物的重链。根据各峰面积占比及其对应的载药量，可计算出平均DAR值。近期，借助FabRICATOR®反相高效液相色谱方法，反相高效液相色谱测定DAR的技术得到了进一步改进。此外，液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）也是一种快速直接的DAR测定方法，该方法通过对完整ADC进行质量测定来确定载药量分布，并利用各物种的峰面积计算DAR值。为降低质谱图的复杂性，通常需要进行去糖基化处理，并消除C端赖氨酸的异质性。 5.3.2 聚集性 半胱氨酸连接型和赖氨酸连接型ADC通常都会导致药物分子与抗体偶联后的分布呈现异质性。以维布妥昔单抗为代表的半胱氨酸连接型ADC，其偶联位点为抗体链间二硫键非特异性还原产生的巯基，这类ADC通常会形成抗体分子上结合0-8个药物的混合物。以曲妥珠单抗-美坦新偶联物为代表的赖氨酸连接型ADC，通过抗体上的赖氨酸残基实现偶联，其DAR值范围为0-9。研究表明，与未偶联的单克隆抗体相比，这两种类型的ADC都更易发生聚集，原因主要有两点：一是疏水性细胞毒性药物的结合改变了ADC的表面性质；二是载药量导致抗体的高级结构发生改变，进而引发新的分子间或分子内相互作用。例如，对于平均DAR值为3.5的半胱氨酸连接型ADC，在热应激条件下，DAR值为6和8的高DAR物种是形成高分子量物质（HMWS）的主要原因。研究发现，这些高DAR物种是ADC的不可逆非共价结构改变形式。通过差示扫描量热法（DSC）分析推断，热应激会导致ADC分子的铰链区/CH2结构域失稳（图5.3）。随着抗体平均DAR值的增加，CH2结构域的熔融起始温度会降低，从而出现多个CH2结构域熔融转变峰。在曲妥珠单抗-美坦新偶联物中也观察到了类似现象，该偶联物中抗体的修饰和偶联会显著影响其热稳定性，且主要影响CH2结构域。 图5.3 未偶联的ADC 1以及平均药物抗体比（DAR）分别为2、3.5和6的ADC 1批次的差示扫描量热（DSC）热谱图 离子强度也可能对ADC的稳定性产生影响，使其相较于未偶联抗体更易发生聚集。近期有研究显示，某一ADC在离子强度增加时会形成大量聚集体，而在浓度高达500 mM的氯化钠溶液中，单克隆抗体的热稳定性并未受到影响。溶液离子强度的增加可能会加剧DAR对ADC物理稳定性的影响。通过差示扫描量热法对热诱导去折叠与载药量之间的相关性进行分析发现，在高离子强度溶液（20 mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5，100 mM氯化钠）中，相同DAR物种的熔点显著低于在低离子强度溶液（20 mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5）中的熔点（图5.4）。其他应激条件，如搅拌、光照、氧化应激或静脉给药时稀释到生理盐水中，也可能诱导ADC发生聚集，这与大多数单克隆抗体在这些应激条件下的反应相似。 图5.4 低离子强度溶液（20 mmol/L醋酸组氨酸，pH 5.5）和高离子强度溶液（20 mmol/L醋酸组氨酸，pH 5.5，100 mmol/L氯化钠）中半胱氨酸连接的ADC的热稳定性受离子强度影响的情况 聚集现象可能会对ADC的安全性和疗效产生影响。控制DAR值和载药量分布，有助于ADC的分析表征和制剂开发。在抗体特定位点设计经基因工程改造的游离半胱氨酸残基（如TDCs），可得到以2-DAR物种为主的均一ADC，这为开发质量和稳定性更优的新型ADC提供了一种潜在策略。 5.4 制剂考量因素 ADCs的制剂开发与单克隆抗体（mAbs）的制剂开发存在相似性。为向患者提供稳定、安全且有效的产品，ADCs产品的额外关键质量属性（如药物抗体比率DAR、游离药物释放量）需得到严格控制。在ADCs制剂开发过程中，需综合权衡抗体、细胞毒性药物、连接子的稳定性以及偶联物的特定属性。 5.4.1 pH值与缓冲液 与mAbs中脱酰胺、片段化、异构化等降解途径的控制类似，制剂pH值和缓冲液的选择对ADCs中硫代琥珀酰亚胺醚连接子的琥珀酰亚胺水解速率控制起着关键作用。研究人员利用模型四肽建立了脱酰胺、异构化及琥珀酰亚胺水解的pH-速率曲线（如图5.5所示），该曲线揭示了这些反应对氢氧根离子浓度的依赖性。在硫代琥珀酰亚胺反应中也能观察到类似现象。有研究报道，在较低pH值条件下会发生脱酰胺反应，但这一过程主要通过与琥珀酰亚胺形成无关的机制进行。 图5.5 四肽（Ac-Gly-x-Gly-NHMe）的pH-速率曲线：x 为天冬酰胺（Asn）或天冬氨酸（Asp）或琥珀酰亚胺（Asu）。（数据根据参考文献重建） 脱酰胺速率随pH值升高而迅速加快，而天冬氨酸（Asp）的pH-速率曲线显示，在pH值3-6范围内，其反应速率具有pH依赖性；当pH值高于7时，反应速率不再受pH值影响，且在接近相应羧基表观pKa的pH值处出现一个明显的速率最大值。尽管碱性增强会促使去质子化的肽氮发生分子内亲核进攻，从而推动天冬氨酸残基中琥珀酰亚胺的形成，但要完成成环反应，还需OH⁻或O⁻基团脱离。在较高pH值条件下，氮原子的进攻速率加快，然而，在高pH值环境中易形成的O⁻是一种较差的离去基团，这两种作用相互抵消。因此，从天冬氨酸（Asp）的成环反应来看，当pH值在5及以上时，该反应不受pH值影响。除pH值外，其他因素如氨基酸序列以及相邻氨基酸侧链的空间位阻效应，也可能对蛋白质中的脱酰胺和异构化速率产生影响。对于天冬酰胺（Asn）的脱酰胺反应和天冬氨酸（Asp）的异构化反应，其速率决定步骤是琥珀酰亚胺中间体的形成，由此推测，硫代琥珀酰亚胺连接子的琥珀酰亚胺水解速率会快得多。如图5.5所示，四肽中琥珀酰亚胺的水解速率可能是天冬酰胺（Asn）脱酰胺速率或天冬氨酸（Asp）异构化速率的10至100倍。鉴于此，即使在大多数单克隆抗体制剂常用的pH值5-7范围内，ADCs中琥珀酰亚胺的水解速率依然较快，这使得ADCs制剂pH值范围的选择受到限制。因此，建议采用略酸性的pH值，以最大程度减少脱酰胺和琥珀酰亚胺水解反应的发生；但同时需注意，pH值不宜过低，否则若存在天冬氨酸（Asp）异构化现象，其程度可能会变得显著。此外，为从根本上避免这些水解降解问题，可考虑采用冻干制剂。 除pH值外，缓冲液成分和离子强度在ADCs制剂中也发挥着重要作用，这与它们在单克隆抗体制剂中的作用类似。由于天冬酰胺（Asn）的脱酰胺、天冬氨酸（Asp）的异构化以及琥珀酰亚胺的水解均依赖于氢氧根离子浓度，因此需要关注不同缓冲液体系中温度对氢氧根离子浓度（[OH⁻]）的影响。在不同温度条件下，缓冲物质会对降解速率趋势产生影响，这是因为溶液中的[OH⁻]会随温度发生变化。在较高温度下，组氨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等碱性缓冲液产生的氢氧根离子量会少于乙酸盐等酸性缓冲液。例如，乙酸盐这类缓冲物质，在加速试验温度下可能在减少降解方面并无优势，但在长期储存温度下，却可能成为更优的选择。组氨酸缓冲液是商业单克隆抗体制剂中最常用的缓冲成分之一，人们认为它在抑制ADCs聚集方面也能起到较好的保护作用。然而，在考虑使用组氨酸缓冲液时需谨慎，因为它可能导致氧化降解。选择合适的缓冲剂，有可能同时实现pH值控制和抗体稳定的双重目标。 5.4.2 抗氧化剂 在生物制药稳定制剂的开发过程中，氧化是一个主要关注点。蛋白质中易被氧化的氨基酸残基包括甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）。近年来的研究发现，亮氨酸（Leu）也可能通过自由基反应发生氧化。为预测甲硫氨酸（Met）或色氨酸（Trp）残基的氧化潜力，研究人员常使用过氧化氢（H₂O₂）、叔丁基过氧化氢（tBHP）、臭氧或紫外线（UV）对蛋白质进行胁迫处理。有研究人员开发了一种使用自由基发生剂2,2'-偶氮二（2-甲基丙脒）二盐酸盐（AAPH）的特异性且可重复的胁迫模型，用于评估甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）的氧化倾向。由于AAPH胁迫可同时作用于蛋白质和细胞毒性药物，因此该方法也可用于研究ADCs的氧化潜力。 在蛋白质制剂中，甲硫氨酸（Met）常被用作稳定剂，以保护蛋白质免受氧化。已有文献对其他多种抗氧化剂进行了综述，但其中部分抗氧化剂并不适用于蛋白质制剂，原因如下：丁基羟基茴香醚（BHA）和二丁基羟基甲苯（BHT）仅适用于含脂质或表面活性剂的制剂；硫醇类化合物（如硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽）可能引发二硫键交换反应；而还原剂（如亚硫酸盐）和抗坏血酸则已被证实会引发不良反应。乙二胺四乙酸（EDTA）或二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等螯合剂常用于防止金属离子诱导的氧化反应，但在部分情况下，研究发现EDTA在防止金属诱导氧化方面效果不佳。甘露醇或蔗糖等其他药用辅料也显示出一定的抗氧化作用。多元醇被认为是一种通用稳定剂，可同时抑制物理降解和化学降解。甘露醇是一种已知的羟基自由基清除剂，但对烷基过氧化物或过氧化氢（H₂O₂）无清除作用。蔗糖的抗氧化效果与甘露醇相似，但效力相对较弱。在包含ADCs分子在内的多种候选药物的不同剂型中，抗氧化剂作为稳定剂的应用价值仍需进一步探索。 5.4.3 表面活性剂 聚山梨酯20和聚山梨酯80等非离子表面活性剂，因其在低浓度下即可发挥作用、性质稳定且与蛋白质混合使用时具有长期安全使用记录，已在生物制药制剂中得到广泛应用，用于在生产、运输、储存乃至给药过程中防止蛋白质的表面吸附和聚集。由于ADCs具有不均一的DAR分布，且其细胞毒性药物本身具有疏水性，相较于单克隆抗体，ADCs更易发生聚集，因此在ADCs制剂中可能需要添加更多的聚山梨酯。此外，评估给药过程中的稳定性也至关重要。对于静脉注射（IV）给药方式，需对静脉输液袋的体积、材质、顶空体积、稀释剂、稀释倍数、给药浓度、给药时长以及稀释后的运输模拟情况进行全面评估，以确定制剂中聚山梨酯的适宜含量。 尽管聚山梨酯在防止蛋白质聚集和吸附方面效果显著，但它并非完全无害。在使用聚山梨酯时，需关注其氧化潜力。在储存过程中，若受到光照、温度升高或催化剂的影响，聚山梨酯会产生大量过氧化物，这些过氧化物会导致聚山梨酯自身以及蛋白质发生氧化。近年来，聚山梨酯的降解问题已引起关注。Mahler等人对聚山梨酯的详细降解机制展开了研究，发现聚山梨酯会在聚氧乙烯醚键和脂肪酸酯键处发生断裂。聚山梨酯的降解产物会导致蛋白质聚集，并形成可见和亚可见颗粒。2014年，LaBrenz报道了一种由酶催化引起的聚山梨酯水解降解新机制。研究指出，单克隆抗体制备原液中存在的一种脂肪酶类酶会导致聚山梨酯80发生显著降解，同时伴随颗粒数量的增加。当聚山梨酯无法作为有效稳定剂时，可考虑使用其他替代表面活性剂。 5.4.4 液体制剂与冻干制剂 一种成功的制剂需确保能向患者提供易于生产、稳定、安全、有效、外观良好且具有市场竞争力的产品。临床和商业应用中制剂的选择受多种因素影响，产品稳定性是其中的关键驱动因素之一。此外，生产能力、成本、给药便利性以及竞争格局等因素也需纳入考量。无论是液体制剂还是冻干制剂，在产品开发的早期和后期阶段，了解主要降解产物的化学性质和含量都至关重要。为此，需设计合理的临床前和临床研究，以评估与产品相关的降解产物和杂质可能产生的影响。 由于ADCs结构复杂，其制剂开发不仅需要了解单克隆抗体的理化稳定性，还需掌握小分子细胞毒性药物、连接子部分的理化稳定性，以及ADCs自身固有的不稳定性。除ADCs易聚集这一特性外，制剂中游离药物含量过高是影响其疗效、安全性和稳定性的主要问题之一，过量的游离药物可能引发严重的不良反应。尽管液体制剂在生产和给药便利性方面具有优势，但由于人们担心其在水溶液中的稳定性，冻干制剂往往成为更优选择，即便其生产过程更为复杂。这一点从包括Brentuximab Vedotin和Trastuzumab Emtansine在内的众多临床和商业产品中可见一斑。然而，冻干并非解决所有稳定性问题的“万能方案”。关于稳定冻干制剂的合理设计，已有大量文献进行了综述。通常认为，低含水量有助于提高制剂稳定性，但也有研究探讨了比表面积对蛋白质物理和化学稳定性的影响。暴露于表面的蛋白质更易受损，且制剂稳定性的提升似乎与表面暴露量的减少相关，在蛋白质含量较低的冻干制剂中这一现象尤为明显。在某些情况下，即使残留水分含量相同的产品，由于比表面积不同，在储存过程中也可能表现出截然不同的稳定性。在稳定性试验、制剂开发以及冻干周期开发过程中，通常需要对可溶性聚集体、可见和亚可见颗粒、水分含量、饼状物外观、复溶时间以及游离药物等关键质量属性进行评估。此外，为实现表征目的，建议采用基于氮多层吸附（随相对压力变化）的Brunauer-Emmett-Teller（BET）分析法来测量冻干产品的比表面积。这些研究对于开发稳健的冻干周期、获得成功的冻干制剂至关重要。

免疫缺陷相关淋巴增殖性疾病/淋巴瘤（PID-LPD/L）是一类继发于先天性或获得性免疫缺陷的淋巴系统恶性增殖性疾病，兼具免疫缺陷的基础病变复杂性与淋巴瘤的恶性增殖特性，是临床诊疗中极具挑战性的罕见病类型。其发病核心源于机体免疫监视功能缺陷，导致淋巴细胞异常增殖、分化失控，最终进展为恶性淋巴瘤，相较于普通淋巴瘤，该病具有发病年龄早、侵袭性高、预后差、治疗反应不佳等特点，也成为血液科、免疫科多学科诊疗的重点与难点。 一、疾病核心特征与分类 PID-LPD/L的发生与免疫缺陷密切相关，根据免疫缺陷类型可分为两大类别：一类是先天性免疫缺陷病（PID） 相关，如X连锁无丙种球蛋白血症、常见变异型免疫缺陷病、重症联合免疫缺陷病等，这类患者因先天基因缺陷导致免疫细胞发育或功能异常，儿童期即可出现反复感染，淋巴增殖性疾病发病风险较正常人群升高数十倍；另一类是获得性免疫缺陷（AID） 相关，以艾滋病（HIV感染）、实体器官移植后免疫抑制治疗、自身免疫病长期使用免疫抑制剂为主要诱因，其中HIV相关淋巴瘤是最常见的类型，移植后淋巴增殖性疾病（PTLD）则是器官移植后的严重并发症，病死率较高。 该病的病理类型以B细胞来源为主，少数为T/NK细胞来源，常见亚型包括弥漫大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤等，且多为高侵袭性亚型，病变可累及淋巴结、骨髓、胃肠道、中枢神经系统等多个部位，部分患者还会出现多器官浸润，临床表现复杂多样。 二、临床诊疗面临的多重挑战 （一）早期诊断困难，易漏诊误诊 PID-LPD/L的临床表现缺乏特异性，早期常以反复发热、淋巴结肿大、持续感染为主要症状，与免疫缺陷本身的症状重叠，临床医生易将其归因于普通感染，忽视淋巴增殖的可能；同时，部分基层医疗机构缺乏免疫缺陷相关的筛查手段，对PID的诊断能力不足，导致PID-LPD/L确诊时多已处于疾病晚期，错失最佳治疗时机。此外，该病的病理诊断需结合免疫缺陷背景，部分病例的病理形态与反应性淋巴增殖难以区分，需借助基因检测、流式细胞术等精准手段，进一步增加了诊断难度。 （二）基础免疫缺陷与淋巴瘤治疗的矛盾 免疫缺陷是PID-LPD/L的发病根源，但淋巴瘤的治疗常需使用化疗、免疫治疗等手段，这类治疗会进一步抑制机体免疫功能，导致患者感染风险急剧升高，如严重细菌、真菌、病毒感染，甚至发生败血症、感染性休克，成为治疗过程中最主要的致死原因。同时，先天性免疫缺陷患者的骨髓造血功能本身存在异常，化疗药物的骨髓抑制作用会加重贫血、血小板减少等症状，增加治疗相关不良反应的发生率，限制了化疗方案的剂量强度。 （三）传统治疗疗效有限，预后极差 普通淋巴瘤的一线治疗方案（如CHOP方案）对PID-LPD/L的疗效显著降低，原因在于患者免疫功能缺陷，无法有效配合化疗发挥抗肿瘤作用，且高侵袭性亚型居多，疾病进展迅速。对于PTLD患者，减少或停用免疫抑制剂是基础治疗，但部分患者停药后会出现移植物排斥，而继续使用免疫抑制剂则会加速淋巴增殖，形成治疗两难；HIV相关淋巴瘤患者在化疗的同时需进行抗反转录病毒治疗（ART），但ART药物与化疗药物之间存在相互作用，可能影响药效或增加毒副作用，治疗方案的制定难度较大。此外，该病复发率高，复发后缺乏有效的二线治疗手段，5年生存率显著低于普通淋巴瘤患者。 （四）罕见病特性导致诊疗数据匮乏 PID-LPD/L属于罕见病，不同免疫缺陷类型对应的淋巴增殖性疾病临床特征存在差异，缺乏大样本、多中心的临床研究数据，目前尚无统一的诊疗指南，临床治疗多依赖医生的经验性决策。同时，该病的发病机制尚未完全阐明，免疫缺陷与淋巴恶性增殖之间的分子调控通路尚不明确，限制了靶向治疗药物的研发与应用。 三、新型治疗策略的研究与应用 随着对PID-LPD/L发病机制的深入研究，以及肿瘤精准治疗、免疫治疗的快速发展，针对该病的新型治疗手段不断涌现，打破了传统治疗的瓶颈，为患者带来了新的希望，核心治疗思路围绕“修复免疫功能、靶向杀伤肿瘤细胞、平衡治疗疗效与安全性”展开，主要包括以下几类： （一）靶向免疫调控通路的生物制剂 1. CD20单克隆抗体：利妥昔单抗是抗CD20单克隆抗体的代表，可特异性结合B细胞表面的CD20分子，诱导肿瘤B细胞凋亡，是目前PID-LPD/L中应用最广泛的生物制剂。对于B细胞来源的PID-LPD/L，利妥昔单抗联合低剂量化疗方案可在保证疗效的同时，降低化疗的毒副作用，减少感染风险；对于PTLD患者，利妥昔单抗单药或联合减量免疫抑制剂即可取得较好的疗效，有效避免移植物排斥。 2. CD30、CD79b等靶点单抗：针对CD30阳性的T/NK细胞来源PID-LPD/L，维布妥昔单抗（CD30抗体药物偶联物）可实现靶向杀伤肿瘤细胞，减少对正常免疫细胞的损伤；抗CD79b单抗则为复发难治性B细胞PID-LPD/L提供了新的治疗选择，进一步提高了靶向治疗的精准性。 （二）细胞免疫治疗 细胞免疫治疗是通过改造患者自身免疫细胞，增强其抗肿瘤能力，同时兼顾修复免疫功能，契合PID-LPD/L的治疗需求，目前最成熟的是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗。针对CD19阳性的B细胞PID-LPD/L，CD19 CAR-T治疗可特异性识别并杀伤肿瘤B细胞，对复发难治性病例具有显著疗效，且相较于化疗，感染等不良反应发生率更低。对于先天性免疫缺陷患者，可通过基因编辑修复其免疫细胞的基因缺陷后，再进行CAR-T治疗，实现“修复免疫+抗肿瘤”的双重目标。此外，NK细胞治疗、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗等也在临床试验中，为PID-LPD/L的细胞免疫治疗提供了更多可能。 （三）靶向肿瘤微环境与分子通路的药物 PID-LPD/L的发生与NF-κB、PI3K/AKT、MYC等分子通路的异常激活密切相关，这类通路不仅调控淋巴细胞的增殖，还与免疫缺陷的病理过程相关，成为靶向治疗的重要靶点。PI3K抑制剂、BTK抑制剂可抑制B细胞的异常增殖，对难治性B细胞PID-LPD/L具有一定疗效；NF-κB抑制剂则可同时调控免疫细胞功能与肿瘤增殖，有望成为联合治疗的重要药物。此外，免疫检查点抑制剂（PD-1/PD-L1单抗）可恢复患者的免疫监视功能，但其单独使用疗效有限，常与化疗、靶向治疗联合应用，需注意避免在严重免疫缺陷患者中使用，防止诱发严重感染。 （四）造血干细胞移植（HSCT） 造血干细胞移植是目前唯一能根治先天性免疫缺陷病的方法，同时可通过异基因造血干细胞重建患者的正常免疫功能，从根源上消除淋巴增殖性疾病的发病基础，是先天性PID相关LPD/L的根治性治疗手段。对于儿童先天性免疫缺陷合并高侵袭性淋巴瘤，在淋巴瘤缓解后及时进行异基因HSCT，可显著提高患者的长期生存率，减少疾病复发。但HSCT存在移植相关排斥、感染等并发症，且供体匹配难度较大，需严格把握手术指征，做好围移植期的免疫支持与感染防控。 （五）个体化综合治疗与多学科管理 PID-LPD/L的诊疗需兼顾免疫缺陷与淋巴瘤两大疾病，单一治疗手段难以取得理想效果，个体化综合治疗成为核心原则：对于获得性免疫缺陷相关病例，首先调整免疫抑制剂（如PTLD）或优化ART方案（如HIV相关），恢复基础免疫功能，再联合低剂量化疗、靶向治疗；对于先天性免疫缺陷相关病例，优先考虑根治性的HSCT，同时结合化疗、靶向治疗控制淋巴瘤进展。此外，该病的诊疗需要血液科、免疫科、病理科、移植科等多学科团队（MDT）协作，从诊断、治疗方案制定到围治疗期感染防控、长期随访，实现全流程管理，最大程度降低治疗风险，提高疗效。 四、未来诊疗方向与展望 PID-LPD/L的诊疗挑战本质上是“免疫缺陷”与“恶性肿瘤”双重病理过程的叠加，未来的研究与发展方向将围绕精准诊断、机制靶向、免疫修复与抗肿瘤结合展开。一方面，需要加强对PID的早期筛查，通过基因检测、免疫功能评估实现PID的早诊断，进而对高风险患者进行淋巴增殖性疾病的监测，实现PID-LPD/L的早期干预；另一方面，深入研究免疫缺陷与淋巴恶性增殖的分子调控机制，挖掘新的治疗靶点，研发兼具免疫修复与抗肿瘤作用的新型药物，减少治疗对免疫功能的进一步损伤。 同时，随着罕见病诊疗体系的不断完善，多中心临床研究的开展将为PID-LPD/L积累更多诊疗数据，推动统一诊疗指南的制定，实现治疗的标准化与个体化。此外，细胞治疗、基因编辑技术的不断创新，将进一步提高根治性治疗的成功率，为先天性免疫缺陷相关PID-LPD/L患者带来长期生存的希望。 总之，PID-LPD/L的诊疗是一项系统工程，需要突破传统淋巴瘤的治疗思维，将免疫缺陷的修复置于与抗肿瘤同等重要的位置。随着医学技术的不断进步，精准诊断与新型治疗手段的结合，将逐步破解该病的诊疗难题，显著改善患者的预后，为这类罕见病患者点亮生命之光。