MPO

摘要：本章将介绍抗体及其类似分子在治疗、诊断和研究中的广泛应用。在本章的第一部分，你将了解到一些选定的批准治疗性抗体的适应症、分子靶标和作用方式。第二章节将讨论抗体在疾病诊断中的应用，包括传染病（特别是结核病和HIV）的诊断，以及在癌症诊断中提到的批准和商业化测试套件。本章的最后一节描述了在生物医学研究中常用的基于抗体的技术和检测格式，如流式细胞术、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定（ELISA）。由于它们出色的特异性，许多基础和常规实验室应用都基于抗体与其相应抗原的相互作用。 1.抗体在治疗中的应用 在过去三十年中，单克隆抗体（mAbs）和类似抗体分子（如抗体片段或双特异性抗体，详见其他章节）在成为有效的人类治疗药物方面取得了巨大成功。第一个获批的单克隆抗体是1986年的穆罗莫纳布（Orthoclone OKT3®; Janssen-Cilag），针对CD3用于预防肾脏移植排斥。它与循环T细胞表面的CD3 epsilon链（T细胞受体复合体的一部分）结合，最终导致T细胞的无能和凋亡，从而保护移植体免受相应的免疫反应。这种分子仍然是完全小鼠源的，由于患者体内产生抗药物抗体，因此对患者构成了严重的免疫原性风险。1990年代分子生物学的重大进展以及基础生物医学科学向临床实践的转化，导致了第一个嵌合体（包含小鼠和人类区域）抗体利妥昔单抗（Rituxan®; Genentech）在1997年获批用于治疗低级别B细胞淋巴瘤。这项技术，随后是人源化和最终完全人类抗体，使得市场批准率大幅增加。第一个获批的完全人类抗体是2004年的阿达木单抗（Humira®; AbbVie），用于治疗类风湿性关节炎。现在大多数正在开发的治疗性抗体要么是人源化的，要么是完全人类。抗体目前也是临床试验中增长最快的生物技术衍生分子群体。2017年，全球单克隆抗体治疗药物市场估值约为950亿美元。目前大约有60种抗体获得FDA批准，并在临床试验的不同阶段用于治疗各种疾病和病症，包括癌症、慢性炎症性疾病、移植、传染病和心血管疾病。以下段落将概述治疗性抗体应用的不同适应症，并讨论一些突出的例子。 肿瘤学目前是治疗性抗体应用的最重要领域。最初仅作为致癌性受体酪氨酸激酶的拮抗剂使用，近年来其治疗应用已显著扩大，包括靶向递送化疗药物（所谓的ADCs—抗体药物偶联物—在本书的另一章中有详细描述）和操纵抗癌免疫反应。目前正在进行多项临床试验，研究这些靶向癌症疗法单独使用或与化疗或其他靶向疗法联合使用。 1.1.西妥昔单抗 受体酪氨酸激酶拮抗剂类别中的一个突出代表是西妥昔单抗（Erbitux®; Merck KGaA/Bristol-Myers Squibb），这是一种嵌合体人-小鼠单克隆IgG1抗体，针对EGFR（表皮生长因子受体）。它通过抑制内源性配体结合、细胞运动、侵袭性、转移和促进凋亡来发挥作用。西妥昔单抗获批用于头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）与放疗联合治疗局部或区域性晚期疾病，与基于铂的疗法联合治疗局部或转移性疾病，或作为单药治疗在基于铂的疗法后进展的复发或转移性疾病。它还获批用于与伊立替康联合治疗转移性结直肠癌，用于对基于伊立替康的化疗耐药的患者，或作为单药治疗在患者已经接受过伊立替康和奥沙利铂方案或对基于伊立替康的化疗不耐受的患者，以及与伊立替康、5-FU、亚叶酸联合治疗一线治疗。 1.2.曲妥珠单抗 针对受体酪氨酸激酶的高效单克隆抗体的另一个例子是曲妥珠单抗（Herceptin®; Genentech）。它与人类表皮生长因子受体2蛋白（HER2/neu）结合，并引起免疫介导的反应和HER2的内化和下调以及细胞周期抑制因子的上调。这最终导致抑制细胞增殖和诱导凋亡。曲妥珠单抗还通过诱导抗血管生成因子和抑制促血管生成因子来介导抗血管生成效应。它获批用于HER2过表达的阳性淋巴结乳腺癌的辅助治疗，作为包含阿霉素、环磷酰胺和紫杉醇或多西他赛或与多西他赛和卡铂的方案的一部分，或作为单药治疗在多模式蒽环类基础治疗后。它也获批用于转移性乳腺癌，其中肿瘤过表达HER2蛋白，包括与紫杉醇联合的一线治疗和在患者已经接受过一种或多种化疗方案的转移性疾病的单药治疗。另一个适应症是转移性胃癌，用于一线治疗HER2过表达的胃癌或胃食管结合部腺癌患者，与顺铂和卡培他滨或5-氟尿嘧啶联合使用。 由曲妥珠单抗衍生的ADC药物ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®; Genentech）获批用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌患者。该分子由与细胞毒素DM1（emtansine）共价连接的曲妥珠单抗组成。 1.3.利妥昔单抗  除了受体酪氨酸激酶，CD（分化群）抗原也是治疗性抗体的常见靶标。属于这一类的一个突出例子是利妥昔单抗（MabThera®; Roche）。这是一种针对正常B细胞和大多数低级别以及一些高级别B细胞淋巴瘤上发现的CD20的嵌合体单克隆抗体。它的作用机制包括诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC），以及诱导凋亡。利妥昔单抗获批用于复发或难治性低级别或滤泡性CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）作为单药治疗，与一线化疗联合用于滤泡性CD20阳性B细胞NHL，以及在患者在接受利妥昔单抗联合化疗后取得完全或部分反应时作为单药维持治疗。其他适应症包括一线联合化疗后的非进展性低级别CD20阳性B细胞NHL作为单药治疗，以及与CHOP（环磷酰胺、羟基柔红霉素、Oncovin®, 强的松）或其他蒽环类基础化疗方案联合用于先前未治疗的弥漫性大B细胞CD20阳性NHL。它还获批用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）与氟达拉滨和环磷酰胺联合用于先前未治疗和先前治疗过的CD20阳性CLL，以及其他免疫性疾病，如类风湿性关节炎和肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎。 肿瘤学领域的一个重要最新发现是免疫检查点分子，这些分子抑制抗癌免疫反应。这些蛋白质包括程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）、其配体程序性死亡配体1（PD-L1）和2（PD-L2），以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），等等。已经开发出免疫检查点蛋白的抑制剂，以“解除”通常受阻的抗癌免疫反应的“刹车”。这种免疫检查点的调节成为治疗多种实体恶性肿瘤的一种手段，因为在许多患者中看到了持久的反应和与传统化疗药物相比改善的副作用概况。 1.4.伊匹单抗  伊匹单抗（Yervoy®; Bristol-Myers Squibb）是目前唯一获得FDA批准的抗CTLA-4抗体。这种完全人类抗体结合并阻断CTLA-4与其配体CD80/CD86的相互作用，导致T细胞的激活和增殖，因此被认为在维持对癌细胞的积极免疫反应中发挥关键作用。伊匹单抗获批用于无法切除或转移性黑色素瘤（2011年），以及与Opdivo联合用于晚期肾细胞癌和转移性结直肠癌（2018年）。 2012年报道了第一个研究抗PD-1抗体的第一阶段I试验，此后该领域有了显著增长。最广泛研究的PD-1抑制剂由nivolumab（Opdivo®; Bristol-Myers Squibb）和pembrolizumab（Keytruda®; Merck Sharp & Dohme）代表，尽管这个类别中还存在其他几种mAbs。nivolumab和pembrolizumab都属于IgG4亚类，但每种的表位结合区域不同。两者都对PD-1具有高亲和力和高特异性，并阻断PD-L1的结合。 1.5.Nivolumab Nivolumab于2014年12月首次获得FDA批准，用于治疗伊匹单抗失败后的无法切除/转移性黑色素瘤（如果BRAF V600突变阳性，则还包括BRAF抑制剂）。进一步的皮肤癌相关适应症包括与伊匹单抗联合治疗BRAF V600野生型、无法切除/转移性黑色素瘤和完全手术切除后的III期黑色素瘤的辅助治疗。2017年，nivolumab获得批准，作为二线单药治疗转移性或手术无法切除的尿路上皮癌，这些患者在先前接受至少一种基于铂的化疗方案后进展或复发。其他适应症包括转移性DNA错配修复缺陷/微卫星不稳定性高结直肠癌；在化疗后进展或复发的复发性SCCHN；在先前接受过血管内皮生长因子抑制剂治疗后失败的肝细胞癌（HCC）；在自体干细胞移植和移植后brentuximab vedotin后进展的经典霍奇金淋巴瘤（cHL）；在先前接受基于铂的化疗后进展的转移性鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）和非鳞状NSCLC；有先前抗血管生成治疗历史的晚期肾细胞癌（RCC）；与伊匹单抗联合用于先前未治疗的晚期肾细胞癌；在先前接受基于铂的化疗和另一种治疗线后疾病进展的小细胞肺癌（SCLC）。 1.6.Pembrolizumab Pembrolizumab于2014年9月首次获得FDA批准，用于治疗黑色素瘤。此后，适应症已扩大；包括在伊匹单抗治疗后疾病进展的转移性黑色素瘤，如果BRAF V600突变阳性，则还包括BRAF抑制剂，以及III期疾病切除后的辅助治疗。其他适应症包括作为二线治疗的宫颈鳞状细胞癌（CSCC）；在多种先前治疗后进展的复发性、晚期胃或胃食管结合部（GEJ）腺癌，已知肿瘤PD-L1表达；一线治疗转移性/不可切除复发性SCCHN，对于已知PD-L1表达的肿瘤单独使用和与基于铂的化疗和氟尿嘧啶联合使用；作为先前接受过索拉非尼治疗的患者的单药治疗的肝细胞癌（HCC）；在接受三线或更多线治疗后难治性或复发性cHL；成人和儿童局部晚期或转移性默克尔细胞癌（MCC）的一线治疗；已知肿瘤PD-L1表达的转移性NSCLC，在先前接受基于铂的化疗后进展；已知肿瘤PD-L1表达的转移性SCLC，在先前接受基于铂的化疗和至少一种其他治疗线后进展；在接受两线化疗后复发的复发性/难治性原发性纵隔B细胞淋巴瘤（rrPMBCL）；以及作为晚期疾病患者的一线治疗的肾细胞癌（RCC）。除此之外，FDA在2017年批准pembrolizumab作为第一个组织不可知的癌症治疗，用于表达MSI-H或dMMR的无法切除或转移性实体瘤，这标志着FDA首次基于生物标志物表达而非特定疾病进行批准。目前的批准适用于在治疗后进展且没有其他当前治疗选择的实体瘤。 1.7.Avelumab 虽然抗PD-1疗法为PD-1/PD-L1轴的调节铺平了道路，但针对PD-L1的mAbs研究紧随其后。Avelumab（Bavencio®; Merck/Pfizer）是一种治疗性抗PD-L1 mAb的例子。它于2017年3月首次获得FDA批准，用于治疗12岁及以上患者的转移性MCC，随后在2017年5月获得加速FDA批准，用于治疗对基于铂的化疗耐药12个月的转移性尿路上皮癌。它还于2019年5月获批与阿西替尼联合用于晚期RCC患者的一线治疗。 1.8.阿达木单抗 尽管肿瘤学显然是最重要的适应症，但治疗性抗体的临床应用领域并不仅限于此。治疗风湿性疾病的单克隆抗体中的一个突出例子是阿达木单抗（Humira®; AbbVie）。阿达木单抗是一种完全人类单克隆抗体，通过结合TNF-α并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用，从而实现免疫抑制。它是FDA于2002年12月批准的第一种用于治疗中度至重度活动性成人类风湿关节炎的人类单克隆抗体。其他适应症包括银屑病性关节炎（2005年）、强直性脊柱炎（2006年）、克罗恩病（2007年）、幼年特发性关节炎（2008年）、慢性斑块状银屑病（2008年）、溃疡性结肠炎（2012年）和化脓性汗腺炎（2015年）。除了传统的单克隆抗体，人们对于开发双特异性抗体（BsAbs）用于治疗应用的兴趣日益增加。在过去十年中，致力于BsAbs的文章数量一直在稳步增加。《自然评论药物发现》杂志在2014年将BsAbs称为“下一代抗体”。双特异性抗体在本书的另一章中有详细讨论。然而，这里应简要提及两个临床应用中的BsAbs示例：blinatumomab（Blincyto®; Amgen）和emicizumab（Hemlibra®; Roche）。 1.9.Blinatumomab Blinatumomab（Blincyto®; Amgen）是一种双特异性CD19导向的CD3“T细胞引导器”。它结合在B细胞谱系来源的细胞和T细胞表面表达的CD19和CD3，分别导致内源性T细胞的激活和通过细胞毒性T细胞溶解CD19阳性的良性和恶性B细胞。它目前被批准用于B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ALL）在第一次或第二次完全缓解中，最小残留疾病大于或等于0.1%，以及复发或难治性B细胞前体ALL。 1.10.Emicizumab Emicizumab（Hemlibra®; Roche）是一种双特异性抗体，它结合在激活的凝血因子IX和因子X上，从而介导后者的激活。这实际上是健康个体中凝血因子VIII的功能，但在血友病A患者中缺失。Emicizumab于2017年11月获得批准，用于治疗对其他治疗产生抵抗的血友病A患者，随后于2018年4月获得批准，用于尚未对其他治疗产生抵抗的患者。 上述讨论的治疗性抗体的额外概览也见于表1。 表 1 列出了选定并批准的治疗性单克隆抗体，并参考了各自的抗体类型、靶点、适应症和作用机制。 2.抗体在诊断中的应用 由于抗体显示出高亲和力和高抗原特异性，它们是疾病诊断和预后评估中非侵入性体内成像和体外免疫测定的理想候选物。抗体应用于肿瘤学、免疫学、微生物学、血液学和病理学等多个学科。此外，它们是识别通过病毒、细菌或寄生虫传播的传染病、诊断代谢紊乱和癌症成像的有用工具。 明确识别给定的传染病病原体不仅对特定患者重要，对公共卫生也很重要。在这方面，对国家卫生研究所来说，区分人类群体中的大流行和仅局部感染是至关重要的。及早识别大流行细菌株或病毒，特别是当感染可以无症状或潜伏时，有助于及时采取所需行动，防止疾病传播。例如，检测由结核分枝杆菌引起的结核病（TB）的一种经过验证的方法是使用商业测试套件Xpert® MTB/RIF（Cepheid）进行特定的嵌套PCR（聚合酶链反应）方法，或者培养细菌，这可能需要数周时间才能获得可靠的结果。Xpert® MTB/RIF测试是一种完全自动化的核酸扩增测试。它极大地促进了控制全球结核感染和降低疾病流行率的目标，因为它是一种快速且敏感的诊断工具。与培养细菌的过程相比，它可以快速提供结果，但成本较高，需要特殊的处理设备（GeneXpert, Cepheid）来提供结果。已经有改进的早期结核病检测方法可用，如Qiagen的QuantiFERON®-TB Gold-Plus（QTF-Plus）干扰素-γ释放测定。QTF-Plus是一种两步测定，包括在全血样本中进行干扰素ɣ（IFNɣ）体外刺激步骤，随后进行酶联免疫吸附测定（ELISA），使用小鼠单克隆抗-INFɣ抗体来量化与M. tuberculosis感染相关的IFNɣ释放量。QTF-Plus需要熟练的操作员和实验室基础设施才能应用。新开发的现场检测试验利用单特异性或双特异性抗体在夹心型、一步法测定中结合拭子或尿液样本中的分枝杆菌脂阿拉伯聚糖（LAM）。基于这种方法的商业免疫学测试套件包括，例如，Determine®-TB Alere（Abott）和FujiLAM（Fujifilm）（www.who.int）。 另一个例子是对患者进行呼吸道合胞病毒（RSV）感染的检测。RSV是一种常见的呼吸道病毒，它引起的症状通常较轻，但对于1岁以下的儿童来说可能会很严重，它是细支气管炎和肺炎的主要原因。除了使用实时PCR（RT-PCR）方法作为检测RSV感染的黄金标准之外，还有CerTest RSV（CerTest Biotec S.L.）这样的定性测试套件可用，它不那么复杂。这是一种一步式彩色色谱免疫分析，通过检测鼻拭子、鼻咽冲洗液或抽吸物样本中的RSV抗原，非常快速地提供关于个人感染状态的信息。尽管这种测试能够快速得到结果，但在特定患者亚群中其敏感性要低得多。CerTest基于色谱免疫分析方法，用于检测来自患者呼吸道分泌物样本的RSV抗原。这种技术以及上述描述的检测结核感染的测试如Determine®-TB Alere背后的技术被称为侧流免疫分析（LFIA）。LFIAs不仅在医疗应用中有用，还用于检测药物滥用、农业安全、动物健康和食品质量。最早的测试之一是检测女性尿液中的人类绒毛膜促性腺激素（hCG），以确认或排除妊娠。LFIA的一个优点是患者可以直接应用，技术简单、快速且成本低。该测试甚至可以在没有熟练人员或实验室设施的情况下进行，这使得它对于没有健全卫生基础设施的发展中国家具有吸引力。根据WHO的特点，LFIAs被描述为ASSURED：负担得起、敏感、特定、用户友好、快速和稳健、无需设备、可交付给最终用户。本节重点介绍使用抗体识别的LFIAs。也在开发利用核酸探针的测试（NALFIA，核酸侧流免疫分析）。对于NALFIA，分析物是通过PCR产生的扩增子，在分析测试条之前。使用特定的引物在扩增子上附加两个不同的标签，随后通过测试条上特定标签的单克隆抗体进行检测。与传统PCR分析相比，这种联合方法更快，因为扩增子不再需要通过电泳分离了。例如，PCR混合物中的扩增子可以通过特定引物用生物素和FITC标记，并在NALFIA的样品垫上添加后，被金纳米粒子标记的单克隆抗FITC抗体结合。这个复合物通过膜迁移并在测试线被固定的抗生物素单克隆抗体结合，金纳米粒子集中并产生与混合物中扩增子浓度成比例的颜色信号。Pecchia和Da Lio描述了这种方法，并将其用于检测土壤样本中的真菌病原体Macrophomina phaseolina。 LFIAs可以用来检测抗体和其他抗原，如激素、肽或毒素，从血液、血清或其他液体和复杂样本中。该方法依赖于色谱和免疫染色的结合。在LFIA技术的初期，测试被设计为只给出定性结果，如信号的出现或缺失，转化为是或否的结果。现在正在开发的测试可以提供半定量结果，并与自动化读取设备结合使用。图1显示了一个典型的测试条构造。测试条由许多不同的元素组成，通常比看上去更复杂。含有分析物的液体样本被施加到样品垫上，在那里它与重组缓冲液、盐和表面活性剂或其他液体混合。这一步对样本准备很重要，确保恒定的流速和样本向结合垫和测试控制线的控制分布，对抗原-抗体相互作用至关重要，因为蛋白质的溶解度受pH影响。许多抗体的等电点（pI）在pH 5.5和7.5之间。因此，pH 7.0和7.5之间可能是最佳的，缓冲条件应相应调整。另一方面，流速由膜本身的材料决定。硝酸纤维素是一种常用的材料。其他如聚偏氟乙烯、改性尼龙和聚醚砜。有利的膜材料具有优越的毛细作用力和恒定的流速，并允许在测试和控制线上容易结合和固定抗体。结合机制主要是静电和疏水相互作用。固定能力由聚合物表面积、孔隙度、厚度和材料本身的结构特征定义。在施加液体样本后，它迁移到结合垫。这持有检测复合物并将样本和检测复合物传递到膜和测试控制线。与胶体金纳米粒子结合的识别抗体是通常用于结合垫的检测复合物。纤维素纳米珠、乳胶珠、顺磁性珠或荧光分子也可以使用。选择识别/捕获抗体是设计特定LFIA中最重要的部分，因为结合特性如抗体的结合常数（KD）和特异性对测试灵敏度和背景信号有很大影响。信号在其最简单的形式是一个比色信号，它是由分析物相关联的聚集（夹心测定）或解聚（竞争测定）产生的。识别抗体被吸收到金颗粒上，并且可以结合到复杂样本中的分析物。其他标签可以是荧光染料、发光分子和量子点。使用这些标签可能会提高LFIA的灵敏度，但不能再由操作员直接用肉眼检测，并且需要额外的设备，如荧光读取器。Shi等人使用超顺磁性纳米粒子和磁性读取器，将测定灵敏度提高了十倍。通过应用酶信号放大反应可以增强比色信号。辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）在提高ELISA灵敏度方面都有很好的效果，尽管也用于LFIAs。测试条的末端有一个吸收垫。它的主要功能是吸收液体，从而增加分析样本的体积。 图1 展示了标准侧流测定（侧面视图）的示意图。测试条通常位于一个塑料外壳内，外壳有一个或在多重格式下有不同数量的开口用于样本管理，以及一个窗口用于观察测试和控制线的结果。液体样本通过样本端口被施加到样本垫上，在那里它与重组缓冲液组分和化学品如洗涤剂、表面活性剂或封闭剂以及其他根据测试的具体应用而变化的物质混合。样本迁移到重叠的结合垫上，检测复合物就位于那里。复合物被重组并且随着样本移动到膜上，在那里它通过测试和控制区域。在测试条的末端，吸收垫吸收液体并增强测试条的整体容量。吸附垫通过这种方式增加测定的灵敏度。在测试和控制线测定中，特定的捕获抗体被固定，它们捕获分析物-检测器或控制复合物。 总的来说，LFIAs可以分为直接和间接测定。激素和其他蛋白质和肽类分析物通常通过夹心测定进行分析，因为这类分析物通常具有多个表位，分析物可以被不同的抗体种类结合，这对于双重抗体夹心测定是必要的。半抗原和小化学物质如药物及其代谢产物通常通过竞争或抑制测定进行分析。因此，LFIAs像其他免疫测定格式一样被设计。与其他复杂格式如ELISA不同，它们是简单的基于纸张的分析测试，并且可以设计成微阵列和多重格式，提供快速结果，无需训练有素和熟练的操作员。尽管它们有缺点，如定量结果较少和灵敏度通常较低，但它们在临床护理和近患者诊断领域做出了巨大贡献。 酶联免疫吸附测定（ELISA）非常特异和灵敏，能够检测和定量简单或复杂样本中非常低的分析物浓度。其原理基于抗原和抗体之间非常特异的相互作用。它的应用在科学和诊断中有许多，例如，检测自身免疫疾病生物标志物。这些可能是患者血清样本中的自身抗体。通常使用三种类型的ELISA，如图2所示：间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。在间接ELISA中，含有分析物的样本（例如，患者的血清）被包被到微孔板的孔中。在阻断剩余结合位点之后，添加检测抗体和与初级检测抗体特异性结合的酶标记的二抗。添加底物后，可以使用特定的ELISA读取设备测量转化为有色产物的过程。也可以开发基于化学发光和荧光的报告分子，并可能提高测定灵敏度。在这方面需要特殊设备。信号强度与样本中分析物浓度直接相关，并与标准曲线进行比较。为了准备标准曲线，必须有纯化的分析物样本，以便同时分析标准曲线和样本稀释液。分析物浓度与信号强度之间的线性关系受到狭窄动态范围的限制。间接ELISA通常用于识别和定量如抗体或人血清样本中的细胞因子水平，例如，诊断内分泌疾病（人类IL-13 Quantikine ELISA KIT, R&D Systems, Inc.）。间接ELISA方法容易受到基质效应的影响，如果分析物是血或血清等复杂基质的一部分，可能会抑制完整分析物的恢复。通过稀释血清样本可以限制不利的基质效应。通过使用特定的捕获抗体将分析物固定在板孔表面，ELISA可以非常特异。在夹心ELISA中，固定的捕获抗体从基质中结合分析物，然后可以使用酶标记的检测抗体检测针对不同表位的初级抗体。剩余结合位点的阻断不充分或洗涤不充分会导致假阳性结果，因为分析物会非特异性地结合到孔表面，或者未结合的检测抗体残留在溶液中。酶标记的二级检测抗体结合捕获的分析物，并在添加底物后实现比色读出。分析物被夹在两种抗体之间。PerkinElmer, Inc.的Alliance HIV-1 p24 ELISA测试是检测血清、血液和细胞培养样本中病毒标志物衣壳蛋白p24的常用测试套件。感染初期p24水平非常低，以及感染者血液样本中游离p24抗原和抗p24抗体的复合物，可能导致检测到的感染不一致。常规ELISA测试很难检测到复合抗原。可以应用基于HRP的光化学信号放大方法，将该ELISA的灵敏度提高多达40倍。在竞争ELISA中，样本中检测抗体和结合抗原的复合物被添加到孔中，孔表面包被重组纯化抗原。样本中的分析物（分析物）和包被抗原竞争与抗体结合。在这种设置中，信号强度的降低与分析物浓度相关。 此外，抗体在识别肿瘤疾病中的异常细胞和识别起源细胞谱系方面也很有帮助，这对于癌症类型的诊断和后续治疗的确定至关重要。例如，抗体用于通过流式细胞术免疫表型分类从淋巴结细针抽吸物、组织样本和其他体液中的淋巴瘤亚型。在这种方法中，可以通过同时应用几种与不同荧光团结合的特定单克隆抗体，平行检测多个生物标志物，例如细胞表面的抗原。例如，可以通过检测这些抗原的表达模式的修改来识别恶性细胞。在流式细胞术中，含有待评估活细胞的患者样本预先与抗原特异性荧光标记的单克隆抗体一起孵育。在流式细胞仪中，细胞被分散，并以悬浮状态逐个通过激光束。被标记的细胞被激光激发，并发射与荧光团光谱相对应的特定波长的光，由探测器测量。使用一套合适的标记抗体和激光源，可以分析复杂人群中每个细胞的各种物理参数，这些参数产生关于表面抗原表达模式和细胞的粒度和大小的信息。这与IHC相反，IHC一次只能评估一个或两个标记。为了亚型化淋巴瘤，分析白细胞标志物的表型表达是有利的。这些标志物的表达模式可以通知细胞类型的起源和分化阶段，可以预测肿瘤细胞克隆在治疗中的反应。在这方面，流式细胞术使得可以同时、多参数和定量分析几个表面标志物，并有助于区分，例如，慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和更具侵略性的白血病类型。治疗后，流式细胞术用于分析在治疗期间未被消除的最小剩余恶性细胞的数量，这些细胞可以引发癌症复发。这称为最小残留病，是慢性淋巴细胞性白血病的可靠预后标志。 在治疗期间，监测治疗反应以及疾病进展和严重程度是有利的，通常也是必需的。一个重要的例子是乳腺癌肿瘤的分类。预后和治疗决策主要取决于肿瘤分期、肿瘤分级、激素受体状态和HER2状态。只有HER2阳性肿瘤才使用抗HER2抗体曲妥珠单抗进行治疗。通常使用两种不同的方法来分析乳腺癌肿瘤的HER2状态。FISH（荧光原位杂交）分析HER2基因扩增，而IHC（免疫组织化学）分析组织样本中HER2的表达和分布。HER2过表达通常与预后不良相关。FDA批准的测试套件包括，例如，HercepTest™ 、InSite® (BioGenex Laboratories Inc.)、Bond Oracle™ (Leica Biosystems)和Ventana HER2 Pathway® System (Ventana Medical Systems, Inc.) 。它使用兔单克隆抗HER2抗体（克隆4B5）和过氧化物酶结合的二抗，通过免疫组织化学测定半定量分析甲醛固定和石蜡包埋的乳腺癌组织样本的HER2状态。不幸的是，测试程序和样本处理中的变量会影响测试结果。这些是固定剂的类型、固定时间、石蜡块的存储和切片的厚度（手动 Agilent/DAKO）。甲醛处理通常对初级检测抗体的表位识别产生不利影响，这种影响可能对染色模式产生很大影响。事实证明，通过FISH分析HER2基因扩增是在这方面更可靠的诊断技术。 在免疫分析检测试剂的特殊类别中，双特异性抗体分子代表了一类。在诊断分析中使用双特异性抗体可以减少分析复杂性，通过减少程序步骤总数和提高单特异性抗体的灵敏度。这是通过它们固有的结合两个不同表位的能力实现的。在免疫分析中，双特异性检测抗体可以用一个臂结合分析物，用另一个臂结合报告分子。这种安排的优点是报告分子（例如，FITC（荧光素）或酶）和抗体不再彼此共价结合，这可能会对它们的功能产生不利影响。 免疫PET（基于免疫的正电子发射断层扫描）是癌症成像的应用之一。免疫PET用于分析体内肿瘤抗原的表达和分布，基于此，有助于选择最合适的靶向治疗。免疫PET探针通常由正电子发射放射性同位素标记的单克隆抗体组成，这些抗体特异性结合肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面分子或生物标志物，以及PET扫描仪。在这方面的一个关键方面是抗体分子的生物半衰期和放射性同位素的物理半衰期需要平衡。由于抗体由于其大尺寸（150 kDa）和FcRn（新生儿Fc受体）循环而在体内保留时间较长，它们与较小分子（如重组抗体片段）相比，肿瘤穿透性也较差。因此，它们需要与具有适当半衰期的放射性同位素耦合，因为成像通常在注射后1天进行，以实现探针的生物分布。抗体探针应用于循环中，并结合肿瘤相关抗原，对病变进行特异性标记。在那段时间里，患者会接触到一定量的辐射，这随着探针在体内的保留时间而增加。改进这种方法的一个例子是，将双特异性抗体的一个结合位点设计成对半抗原的特异性。半抗原本身被放射性同位素标记，例如，用68Ga或18F。另一个结合位点特异性结合肿瘤相关抗原CEA（癌胚抗原）。CEA 半抗原双特异性抗体显示出特异性肿瘤靶向和对CEA阴性组织的较小靶向。这种使用双特异性抗半抗原抗体的预靶向方法，从循环中更快地清除放射性同位素，没有非特异性标记，并且对肿瘤的可视化良好且快速。它减少了患者接触同位素的总体时间，这对患者可能是一个巨大的好处。另一种方法是使用较小的抗体片段，如F(ab)2或scFv片段，以提高靶向的清除率。 图2 展示了三种常用的ELISA格式，用于诊断应用。(a) 显示了直接ELISA的设置，其中感兴趣的抗原（分析物）被包被到ELISA板的孔表面。抗原通过酶标记的检测抗体结合，或者为了信号放大，通过检测抗体然后通过多克隆酶标记的二级抗体结合。在 (b) 中，以示意图形式展示了夹心型ELISA测定。分析物通过捕获抗体的结合附着到孔表面，并通过另一个表位被酶标记的检测抗体结合，或者再次通过使用多克隆酶标记的二级抗体进行信号放大。(c) 显示了竞争ELISA设置的一个例子。要检测的分析物被固定到孔表面，并且可以被酶标记的检测抗体结合。如果样本中分析物的浓度增加，检测抗体更有可能结合到可溶性分析物上，这转化为信号强度的降低。 3.抗体在科学中的应用  抗体对特定抗原的极高灵敏度和特异性也使它们成为许多研究应用的理想试剂。事实上，随着现代生物技术大规模生产的便利，抗体已经成为生物医学研究的主要工具。单克隆（均质同种型和抗原特异性）和多克隆（异质同种型和抗原特异性）抗体都可以从工业供应商那里获得。多克隆抗体是从免疫目标抗原的动物血清中分离出来的。它们包含针对同一抗原的不同表位的不同抗体的混合物，并且可能还含有针对不相关蛋白的抗体，这可能会影响测定结果。此外，多克隆抗体的供应依赖于来源动物，因此没有两批针对特定抗原的多克隆抗体是相同的。相比之下，单克隆抗体来自杂交瘤或通过表达载体重组制备，两者都确保了均质抗体的持续供应。 3.1.免疫沉淀  免疫沉淀（IP）是一种使用抗体从水溶液中沉淀或“拉下”其相应目标抗原的方法，例如细胞裂解物或生物流体。沉淀过程是通过使用特殊珠子来促进的，这些珠子与抗体的Fc区域结合（通常是通过抗Fc抗体或蛋白A/G的共价结合）。珠子本身通常由琼脂糖、琼脂糖或其他合成聚合物组成。通过离心、磁场力或其他机械方法实现珠子上抗体-抗原复合物的分离。IP测定通常用于许多生化、细胞或分子生物学应用。一个基本应用是简单地纯化目标蛋白以进行后续测定，如电泳或西方印迹（见下文）。IP也可以用来分析多种蛋白质的相互作用。在这些情况下，使用抗体沉淀目标蛋白，并使用后续测定（如质谱分析）来确定是否有其他蛋白被拉下复合物。 3.2.染色质免疫沉淀 染色质免疫沉淀（ChIP）是IP的一种特殊变体，用于分析蛋白质与核酸的相互作用。该方法最初是为评估RNA聚合酶II与其目标基因核苷酸序列而开发的。在这个过程中，细胞被固定以交联DNA与任何结合蛋白。在细胞裂解和DNA-蛋白质复合物裂解成100-300碱基对的片段后，使用针对感兴趣蛋白（例如，转录因子）的抗体按照标准IP协议进行免疫沉淀。DNA-蛋白质复合物最终通过解决交联来解离，并通过PCR扩增分析沉淀的DNA片段。ChIP也可以用来分析其他与DNA共沉淀的蛋白质，通过质谱分析。有时化学交联可能会改变抗原表位的结构，导致抗体结合的破坏。对于这种情况，可以进行NChIP，即省略交联步骤并在天然抗原上进行IP的ChIP变体。然而，这种策略仅限于与DNA强烈结合的目标蛋白。ChIP的最新进展是ChIP-chip，即基因组范围内的ChIP分离DNA的微阵列分析，以及ChIP-seq，即在免疫沉淀DNA后进行高通量测序。 3.3.西方印迹 西方印迹（WB）是一种方法，它将凝胶电泳的分辨率与抗体检测的特异性结合起来。在这个过程中，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后通过电荷转移到吸收性印迹膜上。对于那些在蛋白质变性后不识别其相应目标抗原的抗体，也可以应用原生PAGE（不含SDS）。蛋白质转移后，印迹膜被封闭以减少非特异性蛋白质结合，随后与目标蛋白特异性的初级抗体孵育。由于初级抗体通常没有标记，因此使用标记的二抗来检测，二抗特异性结合初级抗体的Fc部分。相应的标签通常是用于比色或化学发光反应的酶，或者是荧光团，这取决于后续分析的类型。WB可以用来检测抗原的存在和数量、其分子量以及抗原提取的效率。这种方法在处理不溶性、难以标记或容易降解的抗原时特别有用，因此不适合如免疫沉淀等程序。 3.4.酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA方法已在“抗体在诊断中的应用”部分描述，因为它是一种成熟且稳健的方法，用于检测和定量复杂生物样本（如人血清）中与疾病相关的极低量的分析物。一般来说，酶联免疫吸附测定是一种识别和分析流体中分子浓度的方法。它依赖于抗体与其特异性抗原的非常特异性和高亲和力的相互作用。用于ELISA的酶包括，例如，β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果添加了特定的可溶性底物，就会发生酶-底物反应，并产生在分光光度计上在400-600 nm处读取的比色产品信号，根据标准曲线通知分析物的浓度。ELISA通常用于肽和蛋白质分析。除了其他非常敏感和更现代的方法外，它仍然是一种稳健、简单且经常应用的测定系统，不需要太多的自动化。尽管如此，包含移液机器人、微孔板洗涤器和吸光度读数器的完整自动化系统是可用的（参见，例如，Hamilton公司）。在1975年Köhler和Milstein引入的杂交瘤技术用于单克隆抗体生产期间，ELISA用于分析免疫动物的血清抗体滴度。在抗体产生B细胞和不朽骨髓瘤细胞融合后，相应的杂交瘤细胞产生单克隆抗体。使用ELISA筛选细胞上清液，以识别产生抗体的杂交瘤细胞。在使用噬菌体展示进行重组抗体发现时，噬菌体-ELISA应用于筛选后富集噬菌体池的生化特征。 3.5.免疫组织化学/免疫细胞化学 免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）通常是用于原位检测组织和细胞内蛋白质存在和位置的方法。虽然ICC是在从周围细胞外基质中移除的完整细胞上进行的，但IHC是在固定的整个组织切片上进行的（图3）。这两种方法都使用单克隆或多克隆抗体来检测目标结构。然而，重要的是要考虑后者是识别多个表位的抗体的异质混合物，这也可能导致非特异性结合。染色可以通过直接标记初级抗体或使用标记的二抗来完成，二抗特异性结合初级抗体的恒定部分。根据后续检测方法的不同，可以使用不同的染色报告器。使用酶联抗体和比色底物的比色染色通常使用。这种方法相对容易，幻灯片可以通过标准显微镜分析。缺点是可能由于内源性酶活性而导致更高的信号背景，以及每个样本只能针对一个或两个抗原。另一种方法是使用荧光标记抗体（免疫荧光），这允许同时标记和检测多个抗原。这可以通过使用来自不同物种或亚类的初级抗体以及相应的标记二抗来实现IHC和ICC。对于高分辨率分析，也可以应用免疫金染色（IGS）。这种方法使用与不同大小的金颗粒链接的抗体，允许在单个样本中检测不同的抗原。样本分析最终在高分辨率的电子显微镜扫描中进行，具有高灵敏度，允许在细胞和组织内非常精确地定位目标抗原。IHC和ICC在基础研究中广泛用于理解生物标记物和不同细胞或生物组织部分中差异表达蛋白的分布和定位。 图3 展示了免疫组织化学程序的示意图。组织样本被安装在载玻片上（a）。组织样本与特异性初级抗体孵育（b）。组织样本与标记有报告分子的二级抗体孵育，该二级抗体特异性结合初级抗体的恒定区域（c）。 3.6.免疫PCR和邻近连接测定 免疫PCR是ELISA和聚合酶链反应（PCR）的结合。在这种情况下，检测抗体与DNA寡核苷酸链接，该寡核苷酸通过PCR扩增。扩增的DNA分子可以使用标准荧光方法检测。邻近连接测定（PLA）是一种技术，它扩展了经典免疫PCR的能力，以包括以高特异性和灵敏度检测蛋白质相互作用。该方法基于使用带有寡核苷酸标记的二抗（称为PLA探针）。这些抗体结合针对目标抗原的不同初级抗体的恒定区域。当PLA探针彼此靠近（大约20-40 nm，例如，当两个分析的目标抗原相互作用或形成蛋白质复合物的一部分时），寡核苷酸探针可以杂交并在添加两个“连接寡核苷酸”和DNA聚合酶后参与循环DNA合成。产生的扩增的圆形结构仍然共价连接到其中一个PLA探针上，并且可以通过标准荧光方法再次检测。 3.7.流式细胞术 流式细胞术是一种高度复杂的方法，用于分析单个细胞（包括细菌和微生物细胞）的多个物理参数，这些细胞来自含有大量细胞的样本，并具有高通量。也可以分析人工颗粒，如可以装载蛋白质和荧光分子的聚合物珠子。因此，该方法在临床中用于支持细胞水平的疾病诊断，例如免疫表型（见“抗体在诊断中的应用”），以及在科学中筛选大型肽和基于蛋白质的文库，用于定向进化。流式细胞术的原理是通过被分析的细胞和颗粒散射和发射光。给定细胞的形态结构和荧光团装载与光散射和荧光发射相关。流式细胞术设备的重要组件包括流体学、光学、探测器、光电倍增器和计算机。它们共同工作，将含有细胞的液流和激光束聚焦到流动室，使细胞逐一通过激光，通过探测器检测发射和散射的光。检测荧光信号需要特殊的滤光片，这些滤光片依赖于发射荧光的波长。探测器下游的光电倍增器将光信号转换为放大的电子信号。 对于科学应用来说，将流式细胞术与分选单元耦合的可能性特别吸引人。通常，使用特殊的FACS（荧光激活细胞分选）机器。FACS能够从大型异质细胞群体中分离出具有定义参数的单个细胞。通过使含有细胞的液滴通过由两个偏转板产生的强电场来偏转液滴，从而实现单个细胞的分选。在抗体工程领域的定向进化方法中，可以从在微生物细胞上展示的大型基于抗体的文库中分离出具有改进特性的结合物，例如特异性或结合常数（KD）。 流式细胞术的重要发现是量子点，它在光谱分辨率方面显示出优越的特性，并减少了传统荧光团（如FITC（荧光素）或PE（R-藻红蛋白））所知的重叠光谱问题。量子点不褪色且非常光稳定。尽管如此，它们尚未成功建立一个稳健的工具产品系列，因此在二级染色分子领域仍然由抗体-荧光团缀合物主导。 3.8.质谱 质谱（MS）是一种分析方法，用于测量离子的质量-电荷（m/z）比，以识别和定量简单和复杂基质中的分子。MS是蛋白质组学、药物发现、环境分析和生物医学研究等广泛科学领域的主要工具。然而，MS的一个常见问题是高丰度蛋白的存在，这些蛋白掩盖了一些感兴趣的蛋白。克服这个问题的策略是将MS与基于抗体的亲和方法结合。在基于免疫沉淀的质谱（IP-MS）中，使用IP捕获和隔离感兴趣的分子，然后通过MS分析。已经开发了几种定量和定性应用，通过将MS与基于抗体的免疫分析结合，提高了MS的灵敏度和特异性。2004年引入的稳定同位素标准和通过抗肽抗体捕获（SISCAPA）是一种方法，其中感兴趣的肽（在使用例如酶胰蛋白酶进行蛋白水解后）通过使用固定在流穿柱或磁性珠子上的抗肽抗体富集。通过选择仅在选定目标蛋白中出现的序列的目标肽，目标肽可以直接作为目标蛋白的定量替代品。将含有稳定同位素标签的合成目标肽以已知量添加到消化样品中，作为内部标准。由于目标肽和标准品由于稳定同位素标签的质量差异可以分别测量，它们的比率提供了目标肽量的所需定量估计。SISCAPA在蛋白质组学领域的多种研究中使用，以及在临床血液检测中，例如，用于验证和定量乳腺癌患者中的生物标志物，如人血清转铁蛋白受体（sTfR）。与SISCAPA类似的方法是免疫-MALDI（iMALDI），其中蛋白水解肽也用抗肽抗体捕获，但富集的样本随后点到特定基质上，最终通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MS分析。该方法已用于诊断不同病理，如高血压和阿尔茨海默病。另一种类似方法是免疫-MRM，将多反应监测质谱（MRM-MS）与基于抗体的肽混合物富集相结合。在MRM-MS中，串联质谱仪的第一阶段选择特定质量的离子，第二阶段选择前体离子的碎片反应的离子产物进行检测。质谱免疫分析（MSIA）是一种自上而下的基于MS的方法，结合了免疫亲和分离和质谱检测。针对目标蛋白的抗体附着在安装在移液器尖端入口的多孔微柱上，可直接从生物样本中进行蛋白亲和提取。亲和捕获后，蛋白可以直接洗脱到目标板上进行MALDI MS分析，或用少量洗脱溶液进行随后的液相色谱-MS（LC-ESI MS）分析。质谱细胞术是流式细胞术和元素质谱的融合。在这种方法中，细胞上的目标蛋白用与独特稳定重金属同位素缀合的抗体标记。随后将标记的细胞雾化，通过氩等离子体使金属缀合抗体离子化。然后通过飞行时间（TOF）质谱仪分析质量-电荷比。该方法克服了基于传统荧光团的宽发射光谱的流式细胞术中的光谱重叠限制。相反，元素质谱能够以高精度区分具有不同原子量的同位素。这一根本差异使得可以使用基于质量的平台同时检测更多的细胞特征。然而，质谱细胞术的当前限制是流速低和操作成本高（与传统流式细胞术相比）。 要点: 抗体是非常多功能的工具，已经成为治疗、诊断和生物医学科学中最重要的生物分子类别。 下章预告：双特异性抗体 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

侃言 此前多次分享过“小分子大环化”这种分子编辑策略在药物化学中改善候选分子效力、选择性、物化特性、和ADME特性等应用实例和总数观点。 近期，EJMC上也刊载了一篇相关综述，文末“阅读原文”可直达原英文文献地址。 此前分享的JMC上的一篇“小分子大环化”的综述，主要从大环化对分子各种性质的影响以及连接器的应用的角度来讲述。本篇EJMC的综述文章更注重从不同类型的蛋白质靶点出发，讲述近5年，“大环化”分子编辑策略在具体药化实例中的优势和应用。 1 “大环化”的优势 “大环”一般指的是在重原子的基础上，具有12个活更多成员的环状化合物。根据“环”形成的核心化学性质，大环类化合物可以分为环肽类、环内酰胺类、环内酯类、环醚类/胺类等。 从药物化学的角度，根据大环药物成环的化学特征，可将其细分为环肽、和大环。 近些年，化学药物发现领域不断涌现出具有多种创新机制的新药，包括：大环类药物（大环/环肽）、靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs）、分子胶、抗体偶联药物（ADC）、共价抑制剂等。其中，“大环化”后的大环类药物，由于能够在部分刚性结构中提供功能多样性和立体化学复杂性，具有几个独特的优势： 为药物研究提供新颖的化学空间和知识产权（IP); 大环刚性结构提供相对开环结构表现出更高的亲和力、选择性。在结合具有挑战性药物靶点，解决小分子药物耐药性的问题上具有优势； 在药物发现过程中，优化药物性质； 因此，小分子大环化在近期的药物研发中，已经成为一种热门分子编辑手段，用来改善药物功效和药物类药性特性。 2 “大环化”在先导化合物优化中的应用 接下来，作者汇总了近5年来，在不同的靶点先导化合物优化的过程中，利用“大环化”改善“小分子”功效和特性的实例，大约近30个实例。 01 ATP柠檬酸裂解酶抑制剂 ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）是一种催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的酶，在糖代谢和脂质生物合成中起重要作用。催化过程为一些重要分子（如胆固醇、脂肪酸等）的生物合成提供合成砌块，并在蛋白质乙酰化中起重要作用。 ACLY过表达会导致代谢疾病和恶性肿瘤，因此，这种酶是一种潜在的药物治疗靶标。然而，ACLY抑制剂的研发过程中，低活性、细胞渗透性、毒性、药代动力学特性等，一直是阻碍候选分子进一步进入临床研究的障碍。 如上图，在观察化合物1与ACLY的共晶结构时发现，其与靶标呈“U”型结构结合，并且处于活性构象时，苯环与酯基结构非常接近。这里出现了关环以稳定其活性构象的切机！ 通过优化，大环化后的分子在保持了相当的功效（IC50、KD)的同时，其代谢稳定性得到了极大的提高：半衰期提高了158倍，人肝微粒体清除率减少了258倍！ 02 CGRP受体拮抗剂 降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体(CGRPR)是偏头痛治疗的潜在靶点，当前已有几种口服CGRP拮抗剂上市。 CGRPR由降钙素样受体（CLR)和受体活性修饰蛋白1（RMAP1)的复合物形成，具有宽、浅、溶剂暴漏的结合位点，最适合大环化配体结合。 如上图，在研究化合物3与CGRPR的共晶结构时发现，一个吲唑甲基片段填充了亲脂腔，取代了疏水性热点重叠的“高能水”区。因此，研究人员尝试设计大环化，以稳定化合物3的活性构象。 通过分子对接，发现大环化分子（4a、4b)与无环化化合物3的活性构象刚好吻合。验证也发现，环化后的分子的效力提高了4倍，亲脂效率（LEE)提高了1.3倍。更有趣的是，非对映体5也是针对靶标有效的，并且是完全不同的结合模式，有助于设计新的CGRP受体拮抗剂。 03 CTG重复序列结合物 DNA或RNA靶向也是一个比较快速发展的药物研究领域。例如，肌强直性营养不良是一种遗传性疾病，其蛋白激酶（DMPK）基因的3’-非翻译区含有扩增的d(CTG）重复序列和扩增的r(CUG）重复序列隔离肌盲样（MBNL）家族蛋白，在剪接中起重要作用。 化合物6可以选择性识别d(CTG）和r(CUG），结合常数在次微摩尔级别，然而，其在该浓度范围内也表现出了细胞毒性。 经过分析，化合物6存在如上图中的堆叠构象和非堆叠构象。非堆叠构象，一方面发挥与DNA、RNA的非特异性结合，另一方面因非特异性结合而增加的剂量会导致细胞毒性。因此，通过环化，锁定化合物在堆叠的活性构象，可以增加分子的特异性和效力，进而减少细胞毒性。 正如预期，化合物8a细胞毒性降低了10倍；化合物8b的效力、选择性等都得到了显著提高。 04 因子XIa抑制剂 凝血酶或凝血因子XIa(FXIa)是抗血栓治疗的新靶点。 BMS研发的化合物9是FXIa潜在的抑制剂，具有nM级抑制常数。然而，该化合物具有较大的极性表面积，以及较差的PK属性：仅3%的生物利用度，以及较多的氢键导致极低的渗透性。 通过配体与靶标的共晶结构，发现化合物9咪唑附近的两个苯环彼此邻近，具有大环化的潜力，进而有可能改善分子的效力和选择性。 在后续的优化中，研究人员通过去除四氮唑和酰胺氢，以降低PSA，改善不良的渗透性和口服吸收。环化后的化合物10，虽然与靶标的结合力常数略有升高，但仍保持在有效的范围内。同时，降低了PSA，其药效更强、生物利用度更好，并且增加了靶标特异性。 05 FKBP51抑制剂 FK506结合蛋白（FKBP51）是一种隶属于免疫亲和蛋白家族的肽基脯氨酸异构酶，在调节糖皮质激素受体活性中起重要作用，并作为共同伴侣，参与HSP90蛋白折叠。FKBP51是许多疾病的潜在靶点，包括与压力相关的精神障碍、肥胖引起的糖尿病、和慢性疼痛等。 如上图，化合物11a、11b是首次报道的FKB51选择性配体，具有个位数nM级别的抑制活性。在研究化合物11b与靶标的共晶结构时发现，两个芳环上的醚键彼此靠近，具有环化的潜力，以锁定生物活性构象。 如上图，通过从尝试一系列连接子，含有两个羟基的化合物12相比于非环化前体，药效最强。感觉整体选择性降低了，变泛配体了？ 06 谷氨酰胺酶1抑制剂 谷氨酰胺酶（GLS)是水解谷氨酰胺，获得谷氨酸盐的关键性酶。在一些癌症中，“谷氨酰胺成瘾”，维持癌细胞增殖所需要的能量。人类GLS酶包括两种类型：GLS1，广泛分布于肝外组织的肾型谷氨酰胺酶；GLS2，主要分布于成人肝脏的肝型谷氨酰胺酶。其中，GLS1的活性与肿瘤生长速率相关，是癌症潜在的治疗靶点。 如上图，化合物13是一个临床候选分子。早期研究期待通过环化获得新型的抑制剂，然而效力均不理想。直到在分析化合物13与GLS1的共晶结构时，在结合的生物活性状态观察到了“U”构象。分子处在生物活性构象时，两端的基序彼此靠近，提供了环化的切机。 环化后的化合物14，效力提高了3.6倍，并且稳定性也获得了显著的提高：半衰期提高了2倍、清除率降低了1/3。然而，生物利用度相比于前体13有所降低（9% vs 19%）。 07 异柠檬酸脱氢酶2（IDH2)抑制剂 异柠檬酸脱氢酶（IDH)是一种影响三羧酸循环中异柠檬酸和α-酮戊二酸相互转化代谢途径的酶。 化合物15是一种FDA批准的用于治疗复发性和难治性急性髓性白血病的药物。研究人员尝试通过大环化获得构象限制的新型IDH2抑制剂。通过观察化合物15与IDH2R140Q突变体的共晶结构，发现吡啶N的部分与脂肪侧链非常接近，因此合成了大环化合物16。 环化后的化合物对R140Q突变体抑制性最强，具有个位数nM级抑制活性，而对野生型IDH2无抑制作用。同时，环化后的化合物还具有良好的生物利用度和代谢稳定性。 08 激酶凋亡信号调节激酶1（ASK1）抑制剂 凋亡信号调节激酶1（ASK1)通过调节细胞应激反应，在炎症和凋亡中发挥重要作用。ASK1调节可有治疗神经系统疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病、阿尔兹海默病等。 如上图，Selonsertib是表现最好属性的ASK1抑制剂，具有生化和细胞效力以及良好的药代动力学特征。然而，其是P-gp底物，不适合作为中枢神经系统药物。 通过研究其与靶标蛋白质在溶剂暴露区和催化赖氨酸结合位点附近的激酶结构域的共晶结构发现，具有大环化的潜力，或许可以解决CNS渗透性问题。 如上图，获得了两种类型的大环化产物：化合物17、18。然而，环化后的产物并没有比母体更具有效力。CNS渗透性可以通过引入适当的官能团来调节。如上图，含氟化合物17表现出低至中等的CNS穿透性，而咪唑类化合物18表现出更优异的脑暴露性。 09 激酶骨形态发生蛋白受体II型（BMPR2) 骨形态发生蛋白受体II型(BMPR2)是一种丝氨酸/苏氨酸受体激酶，属于酪氨酸激酶样(TKL)组，是肺动脉高压、癌症、阿尔兹海默病等疾病的靶点。 如上图，化合物19具有BMPR2靶标次纳摩尔级的结合力以及双位数nM级的抑制活性；然而，其同时抑制468个激酶中的262个，表现出极差的特异性的混杂行为。 通过分析化合物19与VRK1的共晶结构，发现氰基与环丙烷彼此靠近，设计连接子，或许可以提高其选择性。如上图中，环化后的化合物20，其效力虽不如前体，但仍保持在次微摩尔级的有效范围。而其选择性获得了提供。 10 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）抑制剂 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，与周期蛋白伙伴相互作用。CDK-周期蛋白复合物失调，会导致癌细胞失去周期和转录控制。 其中CDK2抑制剂对CDK4/6抑制剂治疗产生耐药性的患者有益。 研究人员发现化合物21对CDK2参与的PPI作用具有有效的抑制作用。以此为起点，结合AI技术和基于片段的变分自编码器生成模型来识别CDK2抑制剂。通过分析其对CDK2/cyclin E1的共晶结构，发现其呈“U”型结构，吡啶与溶剂暴露的异丙基靠近，具有大环化的潜力。 在一系列的大环化衍生物中，化合物22最具潜力。其针对CDK2/E1的抑制效力提高了21倍，然而，针对CDK1/A2的选择性略有下降。 11 周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）抑制剂 髓样细胞白血病-1(Mcl-1)是一种抗凋亡蛋白，在癌细胞存活中起重要作用。Mcl-1在多种癌症的细胞增殖过程中过表达，特别是在EGFR突变的细胞系中，而CDK9抑制可下调Mcl-1。 化合物23是一种有效抑制CDK9的苗头化合物，然而，其同时对其它CDK蛋白具有抑制活性，如CDK2/4/12，具有较差的选择性以及因此而导致的体内毒性。 研究人员试图通过大环化来固定二面角，以抑制柔性旋转。通过优化大环化连接子以及酰胺侧链，如上图，获得化合物24，保持了针对CDK9效力的同时，具有良好的选择性。 12 c-Met激酶抑制剂 c-Met是一种受体酪氨酸激酶（RTK)，是肝细胞生长因子（HGF)/分散因子（SF)的受体。靶向HGF/c-Met信号通路，是非小细胞肺癌的潜在治疗策略。一些小分子已被用于靶向c-Met，包括已上市的药物(克唑替尼、卡马替尼、替波替尼、萨沃替尼和卡博赞替尼等)。 如上图，在基于先导化合物设计新型c-Met抑制剂时，发现了与c-Met共晶结构中存在“U”型结合模式，使用不同的连接子使小分子大环化，能够产生在生化、细胞活性等方面的差异性。 通过大环化，可以使分子维持在折叠的低能构象，以避免结合自由能熵补偿。如上图，大环化后的化合物26，获得了改善的生物活性、选择性。 13 酶双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A/B 双特异性酪氨酸（Y)磷酸化调节激酶1A (DYRK1A) 在神经系统疾病和癌症中都起作用。 如上图，化合物27是一种有效的DYRK1A抑制剂，然而，其是一种泛激酶抑制剂，具有广谱抑制作用。在研究化合物27与DYRK1A的共晶结构时，发现了“U”型结合模式，其中苯环的3-位与吡啶环的5-位非常接近。 因此，研究人员以此合成大环化分子，实现了对靶标的高亲和力和选择性。 14 激酶表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂 表皮生长因子受体(EGFR)携带del19或L858R突变体时，它是一种致癌驱动因子，特别是在肺癌中。 如上图，化合物30是勃林格殷格翰发现的具有潜力的苗头化合物。在详细的构象分析中发现，化合物30具有活性和非活性构象，因此，研究人员决定通过大环化来稳定其活性构象。 如上图，大环化后的产物31，其抗增殖效力得到了极大的提高。 也有研究人员基于Gefitinib的结构尝试大环化，如上图，化合物32针对突变体的抑制效力虽略有不如前体，但也保持了次nM级抑制效力；而其针对野生型的选择性获得了极大的提高。 15 造血祖激酶1（HPK1）抑制剂 造血祖激酶1 (HPK1)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调节T细胞、B细胞和树突状细胞的功能，是免疫治疗潜在的治疗靶标，作为肿瘤转移患者潜在的治疗策略。 如上图，化合物33是BMS发现的一种有效的HPK1抑制剂，并且针对GLK具有39倍选择性。研究发现，HPK1与GLK的差别之处在于HPK1具有更宽的入口口袋，因此，这种差别赋予了两个靶标的空间冲突选择性。而研究发现，化合物33的苯基基序的柔韧性可以引起构象变化，符合GLK。若通过大环化来实现构象限制，则有可能进一步提高选择性。 如上图，环化后优化的产物34，其针对HPK1的效力提高了4.6倍；选择性提高了101倍；代谢稳定性提高了3倍；抗hERG活性低于化合物33等。此外，其还获得了中等的渗透性，无外排倾向，对CYP3A4无明显抑制作用。 16 Janus激酶2（JAK2）抑制剂 Janus激酶2（JAK2）是一种细胞内非受体酪氨酸激酶，属于Janus激酶家族（JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2），可以作为骨髓增生性肿瘤、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病的治疗靶点。 如上图，研究人员以Fedratinib为起点，探索基于深度学习的JAK2大环化抑制剂设计。Fedratinib已批准于治疗骨髓纤维化，但其激酶选择性较差。 研究人员在两个芳环之间设计连接子，并鉴于结构分析去除磺酰胺，通过分子对接，从产生的218个大环化分子中选择最具潜力的分子进行合成、验证，其中化合物35与Pacritinib非常相似。其效力略不如前体，然而其仅抑制17种野生型激酶，相比于前体的34种，选择性得到了很大的提高。同时，PK属性获得了提高。 17 激酶Pim-1抑制剂 Pim-1编码基因具有致癌潜力，Pim-1激酶是前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的信号蛋白。 如上图，化合物36是一种μM级的Pim-1抑制剂，通过配体竞争饱和方法进一步优化，获得更高效的抑制剂37，以及选择性靶向Pim-2、Pim-3。然而，其细胞渗透性差。 分析化合物36、37与Pim-1的共晶结构，发现芳环上的氯原子与侧链N原子旁边的碳原子非常接近，具有大环化的潜力。通过设计不同的大环化连接子，最终确定了最有效的化合物38，保存了化合物37相当的效力，同时具有μM级细胞活性。 18 脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂 脾酪氨酸激酶（SYK）是一种主要在造血干细胞种表达的非受体酪氨酸激酶，也是B细胞受体（BCR)信号的调节因子，是治疗自身免疫性疾病和血液病的潜在治疗靶点。 如上图，化合物39是阿斯利康发现的一种有效的、选择性SYK抑制剂。然而，其具有不良的药代动力学（PK）特性。因此，研究者尝试用大环化的分子编辑手段进行进一步优化。 首先，基于溶液态NMR数据，观察到化合物39主要以“U”型构象存在，发现了大环化的切机。在众多大环化分子中，化合物40最具有潜力。尽管其效力和细胞活性略有降低，其在大鼠肝清除和人肝微粒体清除研究中更加稳定。同时，其没有hERG抑制活性，提高了激酶选择性。此外，其渗透性由于羟基极性的引入而降低，这或许需要用前药的方法来进一步解决。 19 原肌球蛋白受体激酶（TRK）抑制剂 原肌球蛋白受体激酶（TRK）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，有三种亚型（TRKA、TRKB、TRKC）组成，分别由神经营养受体酪氨酸激酶1、2、3基因编辑。TRKs调控哺乳动物中枢和周围神经系统的生理功能，是NTRK融合阳性癌症的潜在治疗靶点。 如上图，Larotrectinib是一种FDA获批的TRK抑制剂，并且在临床上通过将二氟苯和吡咯烷基序连在一起，产生了两种新型药物Selitrectinib、Repotrectinib。 此外，也有研究通过Schrodinger软件，以Larotrectinib为起点生成TRKAG595R突变体的对接，实现大环化。在分析了结合模式后，通过环化3-羟基吡啶部分和二氟苯的溶剂暴露区域，合成了3种类型的大环化化合物，共23个。其中，化合物41是比前体更具有效力的。 丁克教授也在该项目上做了大量工作，如上图。他们首先确定了苗头化合物42，具有TRKA、TRKB、TRKC抑制活性。 以苗头化合物42为起点，新的设计首先采用了骨架跃迁的策略，获得先导化合物43，其在针对野生型TRKA、TRKC、以及突变体TRKAG667C等生化试验中显示有效活性。 通过对43的结合模式进行预测分析，发现了该化合物以II型结合模式与TRKC的APT结合口袋结合，因此，在此基础上计划将苯环和胺基序环化以获得刚性结构。 环化后的化合物44表现出比先导化合物更有效的生化活性、和细胞活性、以及更高的激酶选择性。对连接子和侧链进一步优化，获得化合物45，其效力、细胞活性、选择性进一步获得了提高。 20 TYK2激酶抑制剂 TYK2也隶属于前面提到了Janus激酶家族一员，是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点。 如上图，化合物46是一种有效的Tyk2抑制剂，通过共晶结构分析，在氧杂吡咯烷酮与吡啶基序之间的溶剂暴露区发现了大环化的切机。环化后的化合物47尽管效力没有改善，其针对JAK1、JAK3的选择性得到了极大的提高。 21 髓过氧化合物酶(MPO)抑制剂 髓过氧化物酶(MPO)是一种人类含血红素过氧化物酶，是中性粒细胞初级颗粒的主要成分。其过表达和氧化产物的形成与炎症性疾病，特别是动脉粥样硬化有关。适当调节这种酶，对预防心血管疾病很重要。 如上图，化合物48是一种有效的MPO抑制剂，针对TPO的选择性约25倍，而化合物49具有相当的MPO抑制活性。通过将结合了MPO活性位点的48、49的晶体结构于同一位置的三唑并吡啶环重叠，发现化合物48的茚环与化合物49的苯环距离很近，几乎重叠。因此，研究人员设计融合两个化合物的构象特点，通过设计大环化来提高分子的效力和选择性。 优化后，获得的化合物50，其MPO抑制效力提高了约10倍，选择性提高了1580倍！ 22 NS3/4A蛋白酶激动剂 Asunaprevir是获批NS3/4A蛋白酶药物，然而却常常诱导R155K和D168N突变而产生耐药性。这种耐药性机制可能是配体结合诱导Arg155与P2*杂环接触，Arg155与Asp168结合而稳定。因此任何一个位点的突变，都会破坏配体与NS3/4A蛋白酶结合。 因此，BMS试图通过环化P1、P3来稳定结合的活性构象，以避免耐药性突变的发生。通过优化后，获得的大环化化合物51，其激动剂活性针对所有的基因型均获得了改善。同时，除了食蟹猴以外，大鼠和狗的生物利用度也获得了很大的提高。 23 PI3K δ抑制剂 磷酸肌醇3-激酶δ（PI3K δ）可催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3)，在细胞生长、增殖、存活和迁移相关信号通路中起重要作用，主要在白细胞中表达，是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的靶点。 如上图，化合物52是一个临床候选化合物发现的起点。通过其与PI3Kδ共晶结构分析发现，磺酰胺基团的甲基与酰胺键的羰基之间靠近，具有大环化的机会。 对比环化前体，环化后的产物其针对PI3Kδ抑制效力和结合力显著提高，配体效力（LE)略微改善、体内/体外的清除率明显降低。 24 PI3K/m-TOR抑制剂 PI3K/AKT/m-TOR信号通路的激活与乳腺、结肠、肺、血液等恶性肿瘤的发生发展有关。 如上图，Omipalisib是已知的PI3Kα、m-TOR抑制剂，以此为起点，通过对其共晶结构的分析、以及分子对接的了解，研究人员通过环化两个溶剂前沿区域的靠近基序，获得的产物55，其PI3Kα抑制活性得到了改善，m-TOR抑制效力降低，p-AKT激动活力提高了3倍以上等。 25 PI3K/m-TOR/PIM抑制剂 PIM激酶通过参与PI3K/m-TOR/PIM通路参与癌症的发展。 如上图，环化产物57比非环化前体56更具有效力和选择性，且具有泛PIM抑制活性。 26 纤溶酶抑制剂 纤溶蛋白是一种类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，在生理条件下参与纤维蛋白凝块的降解，控制循环中纤溶和凝血的平衡。纤溶酶活性增强的情况，如心脏手术合并体外循环、和器官移植，会增加出血性疾病的风险。 如上图，化合物58是一种非特异性抑制剂，具有次nM级抑制力活性。在分子模拟研究中发现，P2、P3侧链与美表面或溶剂暴漏区的方向相同；而且，除了纤溶酶外，其它蛋白酶的“发卡”结构会与P2、和P3形成的大环产生空间冲突，因此，这为大环化后提供了潜在的选择性。 通过优化后，获得大环后产物59，其抑制效力保持，而且选择性获得了极大的提高。 27 RORC2反向激动剂 视黄酸受体相关孤儿受体C2(RORC2, RORγt)是一种与IL-17A和IL-17F表达相关的核激素受体。因此，一种合适的调节RORC2受体的小分子，特别是作为一种逆激动剂，可能抑制体外IL-17A的产生，并对牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎症性肠病和多发性硬化症的体内模型有效。 如上图，化合物60是辉瑞发现的一个低分子量的先导化合物，进一步的改善获得化合物61，其表现出合理的RORC2反向激动作用和IL-17A抑制性，但理化特性没有得到改善。 通过共晶结构分析发现，化合物61具有“U”型活性构象，因此，将两个靠近的基序进行连接、大环化，获得产物62，其活性略有降低，然而其物化特性获得了极大的改善。 28 突变呼吸道合胞病毒融合(RSV F)蛋白 呼吸道合胞病毒（RSV）是一种传染性病毒，可引起下呼吸道感染，特别是婴幼儿和患有其它疾病的老人。 如上图，Presatrovir是目前正在临床阶段的很有前景的RSV F蛋白抑制剂。然而，已经观察到耐药性突变，这是一个非常严重的问题。 研究Presatrovir和野生型A2 RSV F蛋白分子模型发现，磺胺的氢和吡唑环的氮相互作用。将分子模型数据与单晶结构进行比较，结果很吻合。为了稳定这种构象，尝试基于先导化合物63进行大环化，来靶向野生型和D486N突变型RSV F。 其中各项最平衡的产物是化合物64，其针对野生型的活性降低，但针对突变体活性获得了极大的提高。然而，NMR分析，其具有拓扑异构混合物的存在。进一步优化，扩展环获得化合物65，其针对野生型、突变体的活性都获得了极大的提高，没有拓扑异构混杂的现象。捅死，在10μM环境下，仍没有CYP3A抑制活性。 29 干扰素基因刺激剂（STING) 干扰素基因刺激剂（STING)是一种衔接蛋白，在免疫应答相关的信号通路中发挥重要作用。因此，STING激动剂用于感染性疾病和癌症免疫治疗；而STING抑制剂用于自身免疫性疾病和炎症的治疗。 如上图，环化后的产物比前体具有更高的亲和力以及活性。 3 总结   在药物发现中，越来越多的证据表明，大环提供了一种新颖的化学类别，它占据小分子和生物制剂之间独特的化学空间。基于独特的构象特征，大环的药物特性使它们能够靶向其它化学类别不易接近的细胞外和细胞内的位点。 基于大环的药物设计或小分子“大环化”的分子编辑策略，在药物法中具有潜在的优势。 大环可以为靶蛋白提供更大的相互作用表面，从而在结合强度和特异性方面增强了结合亲和力； 大环的复杂性和三维特性增加了可能有助于提高靶蛋白的选择性，从而减少脱靶效应，增加治疗的安全性和选择性； 线性化合物的“大环化”通常提供更好的细胞渗透性，从而提高生物利用度； 大环的约束构象和刚性结构还可以提高稳定性，增加抵抗酶降解的能力，进而延长药物在体内的半衰期； 大环提供独特的化学支架，扩大化学空间的多样性； 大环能够更好的平衡亲脂性、亲水性、和分子量等性质，获得最佳的类药性； 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要：疫苗是对抗传染病的最重要的医学干预措施之一。自1796年爱德华·詹纳发现以来，疫苗已经将包括天花、白喉、肝炎、疟疾和流感在内的传染病的全球传播降低到根除水平。然而，开发安全有效的疫苗的复杂性仍然是对抗更多传染病的障碍。免疫刺激剂（或佐剂）是疫苗开发中不可或缺的因素，尤其是对于灭活和亚单位疫苗，因为与整个病原体疫苗相比，它们的免疫原性降低。佐剂在结构上非常多样；然而，它们在疫苗构建中的总体功能是相同的：增强和/或延长免疫反应。然而，必须承认并仔细管理由于使用佐剂可能导致的不良反应。了解佐剂效力和安全性的具体机制是疫苗中使用佐剂的关键先决条件。因此，对佐剂开发进行严格的临床前和临床研究至关重要。总体而言，佐剂的加入为推进疫苗开发提供了更多机会，免疫刺激剂的重要性推动了新型和更有效佐剂的出现。本文重点介绍了疫苗佐剂开发的最新进展，并提供了针对传染病的临床前和临床研究的详细数据。疫苗佐剂开发的未来展望也被强调。 关键词：免疫佐剂；传染病；临床前和临床试验 1.引言 传染病（或称传染性疾病）是由一个人（或动物）传给另一个人的传染性病原体引起的，这些病原体对全球人类健康产生了巨大影响。这些感染是由细菌、寄生虫、病毒或真菌（或其有毒副产品）引起的，传播方式包括直接、间接或通过媒介（例如蚊子）。根据世界卫生组织（WHO），低收入国家（占世界人口的36%）的十大主要死因与主要传染病有关，包括疟疾、结核病、人类免疫缺陷病毒（HIV）和流感（例如H1N1和H5N1），这些疾病在过去十年中严重影响了全球经济。最近，COVID-19（来自SARS-CoV-2冠状病毒家族）首次在中国武汉市被观察到，并且在2020年3月11日被世界卫生组织宣布为大流行后，现在已经占据了全球头条新闻。 Baker等人的综述强调了城市化对传染病的影响，以及气候、技术和人口变化对疾病出现、动态和传播的影响。在过去的几十年里，病原体的传播发生在野生和/或家养动物与人类之间，导致了全球严重的致命流行病（例如HIV-1、HIV-2、1918年流感和中东呼吸综合征冠状病毒）。农业和畜牧业的扩张导致了家养动物中抗生素的过度使用和杀虫剂的使用，对人类健康产生了负面影响。 存在一个界面，即人口老龄化与免疫功能下降，以及可能增加的控制传染病的任务，这增加了病原体出现的概率。随着全球景观的变化，药物和抗生素抗性增加的证据已经演变（例如抗疟疾药抗性）。尽管抗菌药物/抗生素已经显示出对治疗几种传染病（例如败血症、脑膜炎、白喉）的增加效果，但疫苗被视为长期预防（和/或治疗）全球传染病的最佳方法，因为疫苗在限制疾病爆发和疾病负担方面发挥着关键作用。 疫苗是18世纪晚期Jenner等人进行的开创性研究的结果，他们研究了针对牛痘病毒的疫苗开发，现在是全球用于刺激对传染病的保护性免疫的最有效公共卫生策略，并被认为每年拯救了数百万人的生命。尽管已经开发了一系列成功的疫苗，这些疫苗基于减毒或灭活的微生物（或其毒素），但至今仍缺乏有效疫苗用于治疗和/或预防当今已知的许多传染病。 随着疫苗开发的进展，从传统的疫苗（由整个、灭活（或减毒）的有机体组成）到最近发现的亚单位疫苗（使用感染性抗原的一小部分），疫苗显示出巨大的商业潜力，副作用最小。由于大多数临床开发中的疫苗候选物是高度纯化的蛋白质和肽，由于它们自身免疫原性差（主要与去除危险信号和它们的小尺寸有关），需要免疫学佐剂（免疫刺激剂）来增强和/或指导免疫反应。然而，尽管公认需要新型佐剂，但目前许可的人类疫苗中佐剂仍然非常少。 本综述总结了佐剂在临床前和临床传染病研究中的应用，评估了佐剂在有效疫苗开发中的作用，重点关注了它们的药物和免疫学特性。佐剂按其来源、作用机制或化学特性进行分类，表1识别了在临床前和临床开发中研究的传染病疫苗的佐剂类型。 2.疫苗佐剂  尽管有些模糊，但佐剂是根据其来源、作用机制和/或物理化学特性进行分类的（表1）。后基因组时代的疫苗开发进展使得设计高度纯净、安全和简单的疫苗成为可能。其他疫苗开发挑战也同时出现，包括蛋白质和肽的固有缺乏免疫刺激性特性。因此，疫苗佐剂被认为是现代疫苗学中的关键组成部分，提供了增强和/或塑造免疫反应所需的帮助。尽管基于整个（或灭活）细菌或病毒的疫苗对病原体具有固有的免疫原性，但佐剂是低免疫原性抗原疫苗（例如肽、小半抗原）所需的组成部分。此外，佐剂还具有许多其他有利特性，包括能够克服老年人的免疫衰老，延长疫苗的记忆，扩大抗体库（包括抗体反应的幅度和功能性），提供剂量节约的手段，以及增强有效的T细胞反应。一般来说，佐剂通常执行两种免疫学功能：（1）免疫刺激剂，它们本质上作用于免疫系统，以改善抗原的免疫反应；以及（2）疫苗载体（例如乳液、脂质体、病毒体、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒佐剂和基于脂质的纳米颗粒佐剂），它们准确地传递和呈现疫苗抗原，以有效的方式和速度被抗原呈递细胞摄取，以诱导和/或增强抗原特异性免疫反应。 2.1.佐剂功能中的T辅助细胞相互作用 佐剂对于增强和指导疫苗抗原的适应性免疫反应至关重要，这种反应由两种类型的淋巴细胞——B细胞和T细胞介导。在细胞因子激活后，B细胞分化为记忆B细胞（长寿命的抗原特异性B细胞）或浆细胞（负责分泌大量抗体的效应B细胞）。在这里，大多数抗原通过激活的T辅助（Th）细胞激活B细胞，主要是Th1和Th2细胞（图1）。 Th1细胞分泌干扰素（IFN）γ激活巨噬细胞，并诱导Th2细胞产生吞噬抗体，导致对细胞内病原体（侵入性细菌、原生动物和病毒）的细胞反应。Th1反应激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL），诱导感染细胞内病原体的细胞死亡。自然杀伤（NK）细胞也被Th1反应激活，这些细胞在诱导病毒感染细胞的凋亡中起着重要作用。 图1.疫苗接种后的免疫反应示意图。在适应性免疫中，与佐剂结合的抗原被传递给并结合到未成熟的树突状细胞，形成抗原呈递细胞（成熟的树突状细胞），这些细胞被主要组织相容性复合体(MHC)类I和MHC-II识别，从而分别与未成熟CD8+细胞和未成熟CD4+T细胞上的T细胞受体结合。未成熟的CD4+细胞刺激产生Th1（或Th2），分别负责分泌不同的细胞因子，并诱导细胞和体液免疫。 Th2细胞分泌细胞因子（例如，白细胞介素和I型干扰素），这诱导B细胞，导致中和抗体的产生。Th2细胞通常诱导体液（抗体）反应，这对于身体防御细胞外病原体至关重要。识别免疫球蛋白Fc部分的受体(FcR)在应对传染病和预防慢性炎症或自身免疫疾病中起着重要作用。不同的FcR识别并结合不同的免疫球蛋白，将信号传递到细胞内。典型的免疫球蛋白(Ig) G(IgG)、IgM和IgA被FcR受体识别，由异质受体激活产生的细胞信号控制，通常称为内外控制。 由于通过使用佐剂大大调节了对疫苗的Th反应的幅度和类型，随着我们对“免疫原性”和“佐剂性”机制的理解增加，正在开发和/或优化新的佐剂和佐剂配方。2.2.模式识别受体在佐剂功能中的重要性 Toll样受体(TLR)激动剂构成了一个大的佐剂家族。它们已被证明在刺激对传染病疫苗开发的先天和适应性免疫中发挥关键作用（表1）。Toll样受体作为模式识别受体家族，是先天免疫系统识别入侵病原体的主要感应器。 在1988年，TLRs最初被识别为参与果蝇Drosophila胚胎发育和抵抗细菌及真菌感染的因素，甚至低至线虫（例如秀丽隐杆线虫和肠线虫）也发现了TLRs。人类中有10种TLRs（TLR1-TLR10），小鼠中有12种TLRs（1-9和11-13）。TLRs位于细胞表面（TLR1、2、4、5和6）或细胞内腔室（TLR3、7、8和9）。TLRs识别微生物中的不同结构（激动剂），这些结构被称为病原体相关分子模式或损伤相关分子模式。这些结构的配体与TLRs结合，引发一系列细胞内信号传导途径，诱导产生参与炎症和免疫的因素。这些激动剂针对的是病原体细菌、病毒、寄生虫和真菌中常见的广泛模式，包括核酸、脂肽、肽聚糖和脂蛋白。TLR激动剂佐剂（表达在巨噬细胞和树突状细胞上）的主要优势在于它们在配体结合后激活信号传导途径的能力，刺激先天和适应性免疫。小分子TLR激动剂佐剂的设计对于根除炎症、癌症、感染和自身免疫具有巨大潜力。例如，TLR1/2和TLR3佐剂（L-pampo）与SARS-CoV-2抗原结合，形成COVID-19疫苗候选物。Jeong的研究小组将这种疫苗候选物接种给雌性BALB/c小鼠和雌性雪貂。据报道，L-pampo佐剂对SARS-CoV-2抗原刺激了强烈的体液和细胞介导的免疫反应。抗体水平高于其他佐剂（例如，氢氧化铝、AddaS03TM和氢氧化铝与CpG的结合。L-pampo不仅产生了中和抗体，而且在雪貂中保持了保护效果。 TLR激动剂在临床传染病疫苗研究中具有巨大潜力。TLR激动剂的使用受到某些信号传导途径中炎症反应过表达的限制，这在加强炎症性疾病方面产生了显著影响。不可能作为抗感染或抗肿瘤剂载体特异性激活免疫细胞，导致激活自身克隆，从而产生自身免疫反应。TLR激动剂的另一个缺点是增加了对肿瘤的易感性风险。因此，对于TLR激动剂作为传染病疫苗佐剂的使用，尤其是对人类，需要严格监管，以最小化不良反应的风险。 在最近的研究中，鞭毛蛋白、Pam3CSK4、L-pambo衍生物作为TLR 1/2激动剂，GLAAF、单磷酸脂A（MPL）作为TLR4激动剂，Resiquimod（R-848）作为TLR7/8，以及胞嘧啶和鸟嘌呤的寡脱氧核苷酸，带有磷酸二酯骨架（CpG ODNs）作为TLR9激动剂，在临床前和临床试验中显示出改善的效力和安全性。 3.基于矿物的佐剂  铝盐（100-1000纳米不溶性凝胶状颗粒）在佐剂发现中有着悠久的使用历史，大部分在人类疫苗中显示出极佳的安全性，始于20世纪30年代的白喉和破伤风疫苗中的氢氧化铝佐剂。铝佐剂的商业来源包括磷酸铝、氢氧化铝、无定形磷酸硫酸铝、硫酸磷酸氢氧化铝或铝和镁氢氧化物的混合物，具有不同的物理化学特性（包括大小和电荷）。 氢氧化铝能够刺激强烈的体液反应（Th2），尽管氢氧化铝与免疫系统的相互作用尚未明确。氢氧化铝佐剂允许短期储存库效应，这使得抗原在注射部位得到控制释放。这种储存库形成是在静电相互作用（可溶性抗原与氢氧化铝之间）之后发生的，间接延长了注射部位的抗原释放，而氢键、范德华力、疏水相互作用和配体交换也起着重要作用。此外，研究表明，免疫后14天抗原-氢氧化铝储存库减少，对免疫反应没有任何影响。相反，也有关于氢氧化铝在引发这种储存库效应方面作用的相反说法。 氢氧化铝盐有可能刺激Nod样受体（NLR）家族，含吡啶结构域3（NLRP3）炎症体激活。一些研究得出结论，氢氧化铝佐剂诱导NLR3炎症体诱导的caspase-1激活，以及分泌IL-1β、IL-18和IL-33细胞因子到其生物活性形式，这影响了氢氧化铝介导的细胞招募、树突状细胞成熟、抗原摄取和T细胞分泌。然而，炎症体在氢氧化铝盐佐剂活性中的作用仍在讨论中。氢氧化铝佐剂的刺激性因子直接触发辅助T细胞类型2（Th2）免疫反应，通过招募免疫球蛋白（Ig）G1、IgE、IL-4、IL-5和嗜酸性粒细胞，提高氢氧化铝佐剂疫苗的免疫刺激性活动。 作为佐剂，磷酸铝与抗原的亲和力比氢氧化铝高，仅仅是由于体内更强的配体交换。在这里，通过使用适当的磷酸盐缓冲液预处理氢氧化铝盐来修改氢氧化铝佐剂的亲和力。对铝盐的扩展研究增强了它们作为疫苗佐剂的作用方式的理解，并导致它们在传染病疫苗开发中的广泛使用（表2）。氢氧化铝盐价格低廉，安全且易于配制、储存和运输，但通常比现代乳液型佐剂弱。氢氧化铝佐剂（例如TWINRIX®、PEDIARIX®、Alhydrogel®和Adju-Phos®）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的监管批准，用于25种商业传染病疫苗（例如甲型肝炎、甲型流感和脑膜炎球菌B群），尽管它们最突出地用于白喉和破伤风疫苗，在那里它们与类毒素和灭活有机体结合使用（表2）。 矿物基佐剂的局限性包括免疫沉淀不足（与其他佐剂类别相比）、Th1介导的和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）细胞反应的低产生，以及嗜酸性粒细胞和IgE分泌的增加，导致过敏反应和/或过敏性反应的风险增加。由于矿物基佐剂不可生物降解，肾功能受损的患者已被证明会因系统性积累铝矿物而引发神经系统疾病和骨骼疾病。 钙磷酸盐（CaP），最初在法国用作白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗的佐剂，在1980年代末被氢氧化铝盐完全替代。今天，CaP佐剂仍然是世界卫生组织批准的人类疫苗佐剂，被认为是疫苗中铝盐的安全替代品。CaP佐剂已被证明能对病原体引发体液、细胞和粘膜免疫反应，具有出色的生物降解特性。与基于铝的佐剂相比，CaP佐剂增强了IgG1抗体的分泌，同时减少了IgE抗体。 3.1.矿物基佐剂的临床前和临床开发 随着各种基于氢氧化铝的佐剂在商业疫苗中的成功，对矿物基佐剂的临床研究继续更深入地探索它们的功能、机制和安全概况（表2）。 3.1.1.氢氧化铝佐剂 尽管氢氧化铝佐剂在疫苗开发中已被广泛使用数十年，但这些佐剂的宿主代谢途径尚未完全理解。Khoomrung等人的临床前研究评估了小鼠接种含有2%氢氧化铝的结核病（M. tuberculosis H56融合蛋白）疫苗后血清中脂质浓度的水平（表2）。这项研究发现脂质代谢参与了小鼠皮下给药后氢氧化铝佐剂疫苗的摄取。在这里，接种H56融合蛋白加氢氧化铝和单独H56融合蛋白的小鼠中发现了代谢物和脂质的差异。据报道，与接种抗原单独的小鼠相比，接种H56加氢氧化铝的小鼠在接种后24小时的甘油三酯（TAGs）的脂质代谢反应显著增加。与单独抗原相比，接种后24小时的长链不饱和脂肪TAGs的脂质代谢在接种后24小时减少，短链脂肪酸在接种后168小时减少。最近的证据强调了脂肪酸合成和脂质氧化显著影响免疫细胞分化和功能。需要进一步研究以评估氢氧化铝佐剂给药后刺激的脂质氧化和脂肪谱是否代表特征性的Th2免疫反应，以及与其他佐剂相比如何。 氢氧化铝佐剂的主要局限性是它们刺激IL-10的产生，这抑制了Th1反应。与单独用PBS处理的小鼠相比，用氢氧化铝结合利什曼病主要抗原（来自利什曼物种的重组多蛋白，MML多蛋白）的小鼠在腹腔内注射后迅速产生IL-10，以确定腹膜腔、引流淋巴结和脾脏中活细胞和IL-10阳性细胞的总数。由于Th1免疫反应对于消除几种传染病（例如，HIV、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌）至关重要，氢氧化铝在刺激树突状细胞和巨噬细胞产生的IL-10分泌中的参与，以及氢氧化铝对Th1反应的潜在抑制作用，因此阻碍了氢氧化铝成为通用疫苗佐剂。 氢氧化铝的免疫原性和安全性继续是其在新型传染病疫苗中使用的强大优势。2017年完成了一项含氢氧化铝的呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗的1期临床研究（NCT01905215）（表2）。在这项1期临床试验中，用两种氢氧化铝佐剂配方（30 µg RSV-PreF/氢氧化铝和60 µg RSV-PreF/氢氧化铝）对128名健康志愿者进行了纯化的重组RSV蛋白F疫苗（设计为优先保持融合前构象的RSV-PreF）的免疫接种，分析了安全性和免疫原性。这种RSV-PreF疫苗对氢氧化铝佐剂配方的免疫反应增强，而所有研究组从接种后60天起免疫反应下降，突出了疫苗接种时机在疾病保护中的重要作用。在两种氢氧化铝佐剂RSV疫苗中，除了常见的疫苗副作用（例如，注射部位疼痛、疲劳）外，疫苗配方在安全性和反应原性方面没有显著差异，没有报告与疫苗相关的严重不良事件或退出。 此外，还测试了与磷酸铝共同给药的重组RSV融合蛋白疫苗（RSV F）在育龄女性中的安全性和免疫原性2期研究（NCT01704365；表2）。得出结论，所有疫苗都是可耐受的，最常见的不良反应（注射部位反应、中度疼痛、疲劳、可接受的头痛）是可以接受的。与单独疫苗相比，与磷酸铝结合的RSV F疫苗增强了更强的免疫反应和保护性抗体。基于2期临床试验的成功结果，对孕妇进行了RSV F疫苗的3期临床试验（NCT02247726），表明接种RSV疫苗的孕妇所生的婴儿在出生时的抗F免疫球蛋白G（IgG）和帕利珠单抗竞争抗体水平高于接受安慰剂疫苗的妇女所生的婴儿。在这里，这种呼吸道合胞病毒融合（F）蛋白疫苗（RSV F）的耐受性更好，只有轻微和短暂的注射部位疼痛，与安慰剂组报告的类似。 由于HIV在人类免疫系统中的快速变异，开发安全有效的HIV疫苗已被证明极其困难。在HIV患者中发现广泛中和抗体，促使研究将HIV-1包膜作为疫苗抗原进行研究。HIV包膜糖蛋白（Env）刺突是病毒编码的抗原，暴露在病毒表面，触发中和抗体的分泌。HIV疫苗设计已集中在产生可溶性Env三聚体模拟物，以克服原始Env三聚体的固有不稳定性和灵活性。在过去的几十年中，HIV-1疫苗的安全性和有效性已在早期人体试验中进行了测试，导致选择了几种包膜蛋白（例如，1086.C gp120、1086.C gp140、BG505 SOSIP.644 gp140）作为有希望的HIV疫苗候选物。 2005年，AIDSVAX B/E（含有gp120抗原并用氢氧化铝佐剂的HIV疫苗候选物）未能通过3期临床试验（NCT00006327；表2），因为它未能成功预防HIV感染。2013年，优化的HIV衍生BG500 SOSIP，gp140三聚体被证明能分泌中和抗体，消除了大多数循环HIV病毒的中和表型（滴度1），中和自体病毒株（滴度2），以及一些异质（滴度2）HIV病毒。2019年，与氢氧化铝共同给药的HIV Env三聚体（BG505 SOSIP.664 gp140）在临床前开发中提供了增强的免疫原性和安全概况，与单独的Env三聚体相比，从这一结果出发，这种疫苗在1期临床研究中进行了评估（NCT04177355），结果未知。 2019年冠状病毒病爆发（COVID-19），由SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）病原体引起，对全球人类健康和经济造成了重大影响。由于疫苗接种被视为预防这种致命传染病进一步传播的主要方法，发现冠状病毒病毒表面的糖基化刺突蛋白对病毒进入宿主细胞至关重要。因此，这种刺突蛋白成为人类免疫抗体和全球协作疫苗开发的首要目标。 用氢氧化铝盐佐剂的灭活SARS-CoV-2疫苗（PiCoVacc）增强了啮齿动物中S特异性、受体结合域（RBD）特异性和N特异性IgG。此外，任何SARS-CoV2疫苗引发的T细胞反应都得到了很好的控制，以消除免疫病理。基于这一临床前评估，PiCoVacc疫苗在3期临床研究（NCT04456595）中进行了评估，再次诱导了RBD特异性IgG和中和抗体，但未在人类中引发特定的细胞免疫反应。未报告不含氢氧化铝的抗原评估。 SCB-2019是领先的COVID-19亚单位疫苗候选物之一，是通过哺乳动物细胞系中的三聚体标签技术工程化的重组SARS-CoV-2融合蛋白。在1期临床试验中，这种抗原与AS03或氢氧化铝/CpG佐剂（NCT04405908；表2）联合进行了临床评估，与不同的SCB-2019抗原剂量配方。在测试剂量水平下，佐剂化的SCB-2019（AS03或CpG/Alum）分泌了更高的IgG滴度和更强的免疫原性，与非佐剂化的SCB-2019相比。在两次免疫后，CpG/Alum和AS03佐剂化的SCB-2019疫苗均显示出增强的Th1极化和CD4+ T细胞反应，分泌针对SARS-CoV-2的保护性抗体。与AS03佐剂疫苗相比，用CpG/Alum佐剂的致病性抗原增强了较低剂量依赖性免疫反应，特别是在老年疫苗组中。 当前的临床前和临床研究继续改进我们对氢氧化铝作为传染病疫苗佐剂的理解和应用。氢氧化铝在新型疫苗试验中的持续突出使用，包括最近的COVID-19疫苗，证明了其有效性和安全性。在这里，氢氧化铝在人类中诱导了中等强度的IgG抗体反应，但未能产生细胞免疫反应。尽管先进的研究增加了对氢氧化铝作为疫苗佐剂的知识，但研究诱导细胞反应和生物功能（例如，IL-1β和中性粒细胞积累）仍然对于推进其在全球传染病疫苗开发中的作用至关重要。 3.1.2.钙磷酸盐佐剂 钙磷酸盐（CaP）佐剂在几种针对传染病的临床前疫苗试验中进行了探索（表2）。人类口蹄疫病毒（FMDV）是亚太地区（包括马来西亚、新加坡和日本）最常见的致死原因。自1969年发现以来，数百万儿童（5至10岁之间）受到这种传染病的影响。人类肠道病毒71（也称为肠道病毒A71或HEV-71），是小RNA病毒科肠道病毒属的一种病毒，以其在儿童中引起严重神经系统疾病和手足口病的流行而闻名。遗憾的是，市场上尚未有疫苗和有效的抗病毒疗法来预防这种疾病。Saeed及其同事证明，与单独抗原相比，用CaP共同给药的灭活HEV-71在兔体内经皮给药后刺激了更高水平的EV-7特异性和保护性IgG抗体。此外，这一临床前试验表明，纳米级（73纳米）CaP佐剂产生了更高的HEV-71抗体滴度和显著的保护性免疫反应，与微米级（1.7微米）CaP佐剂相比。此外，Jopappa及其同事用CaP包裹的FMDV'O'P1-3CD DNA抗原（包括口蹄疫病毒衣壳的所有结构和非结构基因）在纳米级（直径50-100纳米）给小鼠和豚鼠腹腔内给药（表2）。与裸露（未佐剂化的）DNA疫苗相比，CaP包裹的FMDV DNA疫苗诱导了更强、显著的细胞介导和体液免疫反应。尽管这种纳米颗粒DNA疫苗的中和抗体滴度低于传统的FMD疫苗（与氢氧化铝或皂角苷佐剂结合的化学灭活全病毒抗原），但在这一临床前试验中，观察到小鼠（100%）和豚鼠（87.5%）对FMD病毒的更高保护。这种疫苗显示出疗效潜力，但迄今为止尚未记录临床试验。另一种使人衰弱的传染病是单纯疱疹病毒（HSV），它属于包括1型（HSV-1）和2型（HSV-2）的单纯疱疹病毒亚科。HSV-1主要引起口腔和眼部感染，而HSV-2引起生殖器感染。HSV-1和HSV-2均在神经系统上引起严重感染和神经系统疾病（例如，失明、脑膜炎和脑炎）。一个研究HIV疫苗的研究小组，He等人，评估了一种含有灭活HSV-2病毒蛋白的CaP纳米颗粒包裹的疫苗。在小鼠腹腔内给药后，CaP佐剂HSV-2疫苗刺激了增加的IgG2a反应，有效保护了活HSV-2感染，并与氢氧化铝佐剂疫苗配方相比减少了IgE反应。迄今为止，只报告了矿物基佐剂HSV疫苗的临床前数据，其他佐剂类别（例如，AS04、Matrix-M和QS-21）已进入临床试验（表2）。尽管CaP佐剂的作用机制未知，但它被认为与铝佐剂类似，允许储存库效应，并解释了抗原随时间的缓慢释放。通过在CaP纳米颗粒中包裹病原体（例如，HIV-1病毒蛋白），宿主细胞有效地摄取复合物，促进随后的抗原表达。因此，由于其简单的配方、物理化学特性以及能够用于需要不同给药途径的疫苗，CaP佐剂将在具有持续释放能力的单剂量疫苗的未来设计中发挥巨大潜力。CaP纳米颗粒已在临床试验中获得广泛批准，用于诊断目的和骨再生，预计将在未来几年开始评估CaP纳米颗粒疫苗的临床试验。 3.1.3.其他矿物佐剂 除了铝和钙佐剂外，其他金属盐（例如，铁和铍）也被用作疫苗佐剂。例如，具有出色的安全性和低成本生产的氧化铁（IO）纳米颗粒（<20纳米），被用作寻找疟疾疫苗的疫苗传递平台。Pusic及其同事选择了红细胞表面蛋白1（rMSP1）作为重组疟疾抗原，并与IO纳米颗粒佐剂（rMSP1-IO），在小鼠模型中皮下给药后，这一临床前试验报告了100%的响应性，抗体滴度（IgG），与用Montanide ISA-51佐剂的rMSP1小鼠相比，诱导了高水平的抑制寄生虫抗体。 4.微生物/细菌佐剂  4.1.鞭毛蛋白佐剂  鞭毛蛋白是鞭毛的结构组成部分（亚单位蛋白），鞭毛是革兰氏阴性细菌上发现的一种鞭毛状运动器官。鞭毛蛋白由高度保守的N-和C-末端域（D1和D2域）组成，中间是一个高度可变区域（D3域）。每个细丝包含超过20,000个单体鞭毛蛋白（Flic）。鞭毛蛋白具有很强的寡聚潜力，可以在体外聚合成细丝，通过胚系编码的模式识别受体，Toll样受体（TLR）5，刺激先天和适应性免疫反应。在这里，鞭毛蛋白的D1和D2域对TLR5的识别至关重要，刺激促炎反应。鞭毛蛋白有助于激活B细胞和T细胞上的TLR5，增强长期、T细胞依赖的抗体免疫反应，而聚合鞭毛蛋白佐剂通过交联B细胞受体激活B细胞，刺激体液IgM免疫反应，无需T细胞的帮助。鞭毛蛋白还刺激大量先天和非免疫细胞（例如，B细胞和T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和上皮细胞）分泌促炎细胞因子和趋化因子，这导致激活抗原特异性适应性免疫反应。使用鞭毛蛋白作为疫苗佐剂，引流淋巴结中实现了更高浓度的趋化因子和细胞因子，最大化了抗原特异性淋巴细胞遇到其抗原的机会。 Flagellin佐剂的临床前和临床开发 VAX-102流感疫苗（表2）包含流感A病毒基质蛋白（M2e）抗原，这是一种24个氨基酸的小型非糖基化外域，与来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白佐剂结合。VAX-102在小鼠肌肉免疫后，与未佐剂化的抗原相比，显示出更强的免疫反应。VAX-102的1期临床试验（NCT00603811）在健康志愿者中得出了有希望的安全性数据，M2e/鞭毛蛋白疫苗显示出增强的强烈免疫反应，并最大化了接种后的保护反应。这次试验的结果暗示了针对老年人口的改进型流感A疫苗，目前的流感A疫苗需要每年免疫，诱导新的免疫反应，目前随着年龄的增长，这种反应显著恶化。 针对老年人口的疫苗开发是公共卫生服务面临的一个重大挑战，因为不可避免的老化免疫系统。这是由于先天免疫系统细胞受体的故障、未成熟T细胞的减少、T细胞组成群体的改变以及记忆细胞的复制性衰老。因此，与年轻群体相比，老年人的疫苗接种效果显著降低。因此，有必要为老年人设计特定疾病的疫苗，同时考虑到诱导长期和保护性免疫反应的重要性。 VAX-125结合了流感A血凝素（HA）1域的球形头部（氨基酸62-84）和鞭毛蛋白，这种疫苗旨在保护老年人口免受季节性流感的侵害。VAX-125在65岁以上健康人（NCT00966238）和18至49岁之间的年轻成人（NCT00730457）的1期临床试验中进行了评估。两项试验的结果表明，VAX-125在所有剂量水平上的肌肉给药均能良好耐受，注射部位有轻度至中度疼痛，没有严重不良事件。研究表明，年轻健康成人分泌IgG抗体，并诱导针对原生病毒的功能体液免疫。此外，VAX-125在65岁以上疫苗组中产生了增强的（10倍）IgG抗体水平增加，并保持了疫苗后的保护。因此，鞭毛蛋白被视为消除老年人口免疫衰老的有用和有效佐剂，使VAX-125成为预防年轻人和老年人口流感A流行的有希望的新疫苗候选物。此外，VAX2012Q疫苗（表2）包含四种季节性流感株（H1N1流感A的HA1-2亚单位；H3N2流感A的HA1球形头部的57个氨基酸蛋白；山形流感B的HA1亚单位；维多利亚流感B的HA1-2亚单位），每个都与鞭毛蛋白佐剂结合。这种疫苗已完成成人季节性流感疫苗的1期临床研究，现在正在进行2期临床研究（NCT02434276；表2）。1期研究的结果（NCT02015494；300名健康成人；年龄在18至40岁之间）表明，VAX2012Q疫苗在所有剂量水平上都能耐受，除了轻度注射部位疼痛和短暂的寒战和发烧外，没有不良事件。VAX2012Q在所有剂量水平上产生了IgG抗体，并增强了体液免疫反应，具有保护性免疫反应。 鼠疫是一种急性和致命的人类和动物传染病，由革兰氏阴性球杆菌耶尔森氏菌引起，迄今为止，没有商业疫苗针对肺鼠疫提供保护。Mizel及其同事设计了两种保护性抗原（F1和V蛋白）的耶尔森氏菌重组蛋白，然后与鞭毛蛋白的高变区域结合，形成最终的疫苗候选物（鞭毛蛋白-F1-V）。在小鼠和两种非人灵长类动物中进行鼻内免疫后，所有动物种均报告了强效的抗F1和抗V体液免疫反应，细菌在接种后3天内完全清除，与未佐剂化的疫苗相比，显示出显著的接种后保护性免疫反应。 在这些出色的结果之后，开始了一项1期临床试验（NCT01381744），将鞭毛蛋白F1-V重组融合蛋白肌肉免疫到45岁的健康志愿者中；然而，迄今为止，这次试验没有进一步的信息。 4.2.脂多糖佐剂 脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜上的内毒素，由三部分组成：多糖O抗原、核心寡糖和疏水性脂质A（图2）。 图2.大肠杆菌脂多糖的结构。缩写：Gal：D-半乳糖；Glu：D-葡萄糖；Hep：L-甘油-D-甘露-庚糖；KDO：3-脱氧-D-甘露-辛-2-酸；P：磷酸盐。 许多革兰氏阴性生物的脂多糖（包括细菌和病毒）衍生的内毒素与模式识别受体复合体（例如，TLR4、CD14）和髓样分化蛋白2（MD-2；一种25-kD糖蛋白）结合，导致免疫细胞的激活和炎症细胞因子的产生，进而诱导对致病抗原的先天和适应性免疫反应。作为佐剂，脂多糖已被证明能诱导Th1偏向的免疫反应，然而，脂多糖结构的修饰触发了疫苗对抗特定病原体所需的免疫反应，同时降低其毒性。 脂多糖的化学处理与脂多糖生物合成途径的遗传修饰相结合，已导致内毒素的有希望的减少，同时仍保持脂多糖的免疫刺激性特性。对佐剂开发重要的修饰脂多糖衍生物的例子包括MPLA（单磷酸脂A）和GLA。 脂多糖佐剂的临床前和临床开发 由于TLR激动剂具有强大的免疫原性潜力，新型给药途径一直是疫苗研究的前沿。TLR4是哺乳动物中首次鉴定的类视黄醇受体，它在炎症途径中起着关键作用，使其成为佐剂开发的理想的激动剂。MPLA是革兰氏阴性细菌脂多糖内毒素的生物活性部分，也是TLR4激动剂，已被批准用于几种FDA和欧洲疫苗中的人类佐剂。例如，MPLA已在乙肝疫苗、Fendix®（从乙肝病毒中选择的致病DNA序列）中获得许可，该疫苗广泛用于肾功能衰竭患者，以及人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗、Cervarix®（来自HPV-16和HPV-18的病毒样颗粒），在减少持续性感染和宫颈病变方面非常有效（表2）。有趣的是，MPLA的临床级形式（3-O-去酰基-40-单磷酸脂A[MPL]佐剂™）与其他佐剂（例如，氢氧化铝、佐剂系统[AS]01，AS02）结合，形成了一种组合佐剂，以改善疫苗抗原的“机械”传递（表2）。GLA是一种合成的TLR4激动剂，从明尼苏达沙门氏菌中纯化而来，是一种去毒化的细菌脂多糖，是一种六酰化分子。与异质的MPLA相比，作为佐剂，GLA在摩尔基础上更具效力，当测试激活人类树突状细胞和外周血单核细胞时，增强了共同给药重组抗原的免疫原性，允许细胞因子分泌（例如，IL-1、IL-10和INF-α）并产生细胞介导和Th1免疫反应。皮肤是疫苗给药的有效部位，可以作为皮下、肌肉内或皮内给药等传统免疫途径的替代。皮内疫苗技术（例如，微针贴片，其表面含有一层干燥的抗原，通过接种后微针将其嵌入皮肤内）能够以较低剂量产生相当于其他给药途径的抗体反应，这被称为“剂量节省”。这些微针贴片易于自行在皮肤上给药，减轻了需要训练有素的卫生专业人员来接种疫苗的必要性。狂犬病是一种在世界100多个国家发生的动物源性疾病，一旦症状出现就是致命的。然而，通过肌肉内给药的狂犬病疫苗的全剂量成本限制了其在低收入国家的广泛应用。狂犬病疫苗的皮内给药提供了一种同样安全和免疫原性的疫苗，仅需要20%的剂量用于暴露后预防，显著降低了传统疫苗的成本60%至80%。因此，狂犬病的皮内疫苗接种在印度、斯里兰卡和泰国得到接受和使用，每年大约接种1500万剂。有趣的是，使用不同给药途径（肌肉内和皮内）对患者进行相同的乙肝疫苗免疫接种，结果显示皮内给药比肌肉内给药具有更高的免疫原性，血清转换率显著优于肌肉内给药的疫苗。然而，已经使用了几种类型的微针（例如，涂层或溶解型）在疫苗传递中，将干燥的抗原释放到表皮和真皮中，而没有控制抗原释放。Du及其同事开发了一种空心微针，用于将模型抗原（卵清蛋白）与四种不同的佐剂（包括PLGA纳米颗粒、脂质体、明胶纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒）一起传递到小鼠体内。这四种佐剂的临床前结果表明，空心微针传递诱导了强烈的体液免疫反应，其中PLGA纳米颗粒和脂质体比明胶纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒诱导更强的IgG2a反应，作为本研究的一部分。最近的一项临床研究使用皮内疫苗接种治疗流感，使用从致病性流感病毒株H5N1中鉴定出的Medicago H5-VLP抗原。这种Medicago H5-VLP抗原与TLR4 GLA佐剂一起作为水性配方（GLA-AF）共同给药。在小鼠、豚鼠和雪貂中进行了临床前研究，每个体内试验都有不同的目的。第一项研究（小鼠）评估了免疫原潜力，其中佐剂组与对照组（未佐剂）相比，诱导了增加的IgG2c水平。在这里，GLA佐剂被证明能诱导Th1偏向的免疫反应。除此之外，只有在GLA-AF接种的小鼠中检测到骨髓源性浆细胞，这表明当GLA存在时，可以产生更持久的免疫反应。第二项微针研究（豚鼠）评估了疫苗的安全性，皮肤状况、体重和体温变化是三个主要的调查元素。在这里，测试和对照动物都没有显示出任何安全问题。第三项，也是最后一项研究，调查了GLA佐剂的功能和必要性，使用雪貂挑战模型来确定保护效果。流感疫苗（Medicago H5-VLP抗原+GLA-AF佐剂）旨在刺激对大流行威胁的快速反应，因此，在接种疫苗后3周，对异源A/Vietnam/1203/04 H5N1流感病毒株的挑战中，GLA-AF佐剂疫苗提供了80%的生存率，与没有GLA-AF的对照动物相比。这些临床前研究为开始多剂量第1阶段临床试验（NCT01657929；表2）提供了足够的证据，该试验包括多个中心的105名志愿患者。这项试验评估了安全性、免疫原性和耐受性，包括高血凝抑制（HAI）滴度、血清转换和血清保护。免疫原性数据显示，GLA-AF佐剂疫苗比单独抗原具有更高的血凝抑制滴度。有趣的是，疫苗反应在皮内和肌肉内给药途径之间没有统计学上的显著差异。正如预期的那样，皮内接种的参与者经历了短暂的红斑，但没有发生严重不良事件。肌肉内接种组报告的最常见不良反应是注射部位的疼痛、触痛、红斑、疲劳和轻度头痛。GLA目前与其他佐剂成分（例如，稳定乳液或氢氧化铝盐）配制而成，以改善疫苗相容性，作为对抗流感的组合佐剂。除了由基于二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）的胶束（GLA-AF）组成的水性配方外，GLA-SE佐剂（与稳定乳液配制而成GLA）是获批的季节性疫苗Fluzone®的一部分，与单独的Fluzone®相比，它增强了对H1N1和H3N2流感的免疫原性。此外，灭活四价分裂病毒流感疫苗（包括四种流感病毒株的血凝素）与GLA-SE佐剂配制而成，通过肌肉内给药进入老年人体内，产生了更多的外周血单核细胞，并增强了Th1免疫反应，克服了老年人的免疫衰老。这突显了含有GLA的组合佐剂的优势，提高了潜在疫苗抗原的免疫原性和稳定性。 4.3.霍乱毒素佐剂 霍乱毒素（通常缩写为CT、Ctx或CTX），是由霍乱弧菌分泌的致病蛋白复合物，其中CT在感染患者中引起腹泻。近几十年来，CT作为一种强大的粘膜佐剂，已被证明可以改善疫苗抗原的B细胞和T细胞反应。CT由两个主要蛋白组成：亚单位A（CTA；作为球形结构表达的单一蛋白链，具有突出的C末端α-螺旋延伸）和亚单位B（CTB；由五个CTB单体连接的五聚体结构，每个单体通过氢键和盐桥与两个邻近分子相连）。CTA被蛋白水解裂解为两个亚单位（CTA1和CTA2），分泌CT，导致霍乱感染/症状。CTB，一个无毒亚单位，由于其受体的细胞分布，被认为是疫苗开发中潜在的佐剂，由于其受体的细胞分布。CT的佐剂作用源于其与不同细胞类型相互作用的能力，并与上皮细胞结合，增加粘膜屏障的通透性，允许CT和共传递的抗原穿过粘膜屏障，诱导树突状细胞的成熟，激活原始T淋巴细胞。 CT佐剂通过CD40配体激活的树突状细胞成熟。此外，CT佐剂能够通过脂多糖抑制白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C-C基序配体-5（也称为RANTES）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）和MIP-1β的产生，作为诱导树突状细胞成熟的第二条途径[143]。Snider等人指出，使用CT佐剂的一个潜在缺点是可能刺激对旁观者抗原的不需要的免疫反应。 霍乱毒素佐剂的临床前开发 CT主要作为粘膜佐剂（表1），导致树突状细胞成熟，诱导与Th2相关的细胞因子和抗体的产生，以及诱导（或抑制）Th1反应。Th17细胞是最近鉴定的CD4 T细胞的一个亚群，Th17细胞分泌IL-17，在自身免疫和粘膜部位的细胞外病原体控制中起着重要作用。Datta及其同事假设Th17细胞有助于粘膜CT佐剂对抗传染病。在这里，Datta的研究小组将源自炭疽芽孢杆菌（含有或缺乏编码炭疽保护性抗原的基因）的灭活芽孢与粘膜CT佐剂结合作为炭疽吸入的候选疫苗。小鼠通过鼻腔接种与PBS、卵清蛋白（OVA）或CT加OVA（CT + OVA）结合的灭活芽孢。这一研究表明，与对照组相比，接种CT + OVA的小鼠在对抗炭疽吸入时，无论是粘膜IgA还是系统IgA和IgG1抗体都存在。Naegleria foeleri是一种自由生活的嗜热阿米巴，在环境中无处不在，引起原发性阿米巴脑膜脑炎（PAM），这是一种罕见且致命的中枢神经系统感染。PAM的第一个病例发生在20世纪60年代的南澳大利亚，现在全球范围内有更多的PAM病例报告。对这种致命疾病的认识和诊断很差且有限，目前还没有针对PAM感染的疫苗。Lee等人评估了一种口服疫苗，该疫苗由重组Naegleria fowleri（rNfa1）蛋白与CTB共同给药，以对抗阿米巴N. fowleri感染和致命的阿米巴脑膜脑炎。在小鼠模型中进行了临床前评估，通过鼻腔给药后，与单独接种Nfa1的小鼠（0%存活率）相比，CTB佐剂疫苗增强了IgG和IgA滴度，小鼠存活率达到100%。然而，需要额外的研究来确定抗原呈递途径、小鼠的免疫状态以及对N. fowleri感染的保护。 疟疾是世界上最常见和最严重的传染病之一，特别是在低收入和中等收入地区，死亡率和发病率很高，每年报告的新疟疾病例超过5亿，估计有110万人死亡。抗生素、化疗和物理保护方法（例如，经杀虫剂处理的蚊帐）已经显著减少了这种疟疾流行，然而，疟疾疫苗是消除这种致命疾病的重要和有用的方法。有100多种疟原虫，其中5种主要物种（P. falciparum、P. malariae、P. ovale、P. vivax和P. knowlesi）导致高死亡率。P. vivax是疟疾相关发病率的主要原因，也是复发性疟疾的主要原因，其中P. falciparum和P. vivax是疟疾疫苗开发的主要病原体。Miyata及其同事将P. vivax疟疾卵囊表面蛋白（Pvs25）与CTB粘膜佐剂物理结合，作为针对疟疾的传播阻断疫苗（AdPvs25）。在这项临床前研究中，AdPvs25疫苗通过皮下、肌肉内或鼻腔给药到小鼠体内，并提供了CTB佐剂疫苗减少向蚊子传播寄生虫的证据，与未佐剂疫苗相比，通过皮下和鼻腔给药增强了更强的免疫原性。 有趣的是，CTB与其他佐剂（例如，IFA、细胞因子）共同给药，对传染病抗原产生了更强的免疫反应。例如，CTB和编码IL-12的质粒与HIV致病蛋白（HIV Env蛋白）结合。通过鼻腔给药到小鼠体内后，佐剂疫苗导致了强大和提升的HIV特异性CD8反应，与单独的CTB佐剂相比具有保护能力。尽管在多种动物模型中记录了CT作为粘膜疫苗佐剂的潜在用途，但天然的CT对人类来说作为粘膜佐剂具有很高的毒性。此外，在小鼠中，环状二核苷酸（CDNs）似乎比CT更安全的粘膜佐剂，促进了对H5N1流感、金黄色葡萄球菌、链球菌和克雷伯氏菌感染的保护性免疫。 4.4.卡介苗 卡介苗（BCG）是牛分枝杆菌的减毒株，其发现和开发可以追溯到一百多年前。分枝杆菌种，包括M. tuberculosis和M. bovis，统称为结核杆菌，是哺乳动物宿主严重结核病的原因。在1908年，Albert Calmette和Camille Guérin从患有结核性乳腺炎的奶牛中分离出一株M. bovis的有毒株。他们继续在牛胆汁-土豆培养基中培养有毒的牛型结核杆菌，经过13年和200多次传代后，豚鼠实验表明有毒的结核杆菌最终被减毒为一种稳定的非毒性形式（现在更普遍地被称为卡介苗，BCG）。作为佐剂，BCG增强了非特异性免疫反应，提供了保护，BCG在预防性临床前和临床疫苗开发中被广泛用于预防传染病（例如，TB、肺炎、COVID-19）。 卡介苗的临床前和临床开发 预防性BCG佐剂疫苗对抗TB表现出控制结核病所需的细胞免疫反应，允许在肺组织中分泌系统记忆反应，以防止未来的TB感染（表2）。BCG的皮内（和肌肉内）给药在肺部没有引起强烈的记忆反应，Darrah等人表明在恒河猴中静脉注射高剂量的BCG疫苗导致抗原反应性T细胞显著增加，对TB感染的保护更强。在481名青少年中进行了一项BCG疫苗接种（与重组蛋白疫苗H4:IC31和H56:IC31）和BCG重新接种的1b期临床试验（NCT02378207），其中两次H4:IC31和H56:IC31疫苗肌肉内给药相隔56天，单剂量BCG皮内给药（表2）。这项临床试验表明，这三种TB疫苗是安全且可耐受的，没有报告严重副作用。H4:IC31和H56:IC31疫苗均诱导了分泌IgG抗体的CD4+ T细胞免疫反应，这些抗体被证明能够与TB抗原结合。此外，BCG重新接种刺激了强大和多功能的BCG特异性CD4+免疫反应，没有IgG结合抗原，并减少了临床试验组中发生的CD8+ T细胞免疫。一项涉及990名以前接种过BCG疫苗的青少年的2期临床试验（NCT02075203）表明，BCG重新接种对于预防未感染人群的TB感染是必要的（表2）。BCG还被评估为与COVID-19致病抗原（SARS-CoV-2衍生的非结构蛋白3肽）结合的佐剂，以激活适应性免疫反应并提供持久的保护。许多国家（例如，德国、芬兰和比利时）由于其对抗TB和麻风病的有效性，要求新生儿接种BCG疫苗（一种活的减毒M. Bovis株）。 在这里，Escobar及其同事发现卡介苗（BCG）疫苗接种与COVID-19死亡率之间存在负相关。据报道，作为佐剂的BCG诱导了针对相应COVID-19衍生肽段的人类CD4+和CD8+ T细胞反应性。此外，BCG疫苗接种增加了干扰素-γ的产生，并通过佐剂效应增强了非特异性人类免疫反应，这种反应可以作为对COVID-19流行的交叉保护。在法国对1120名医疗工作者进行了SARS-CoV-2包膜蛋白与BCG佐剂结合的3期临床试验（COVID19-BCG），与安慰剂接种组相比，COVID-19感染有所减少（NCT04384549；表2）。此外，在荷兰（NCT04328441）和澳大利亚（NCT04327206）对医疗工作者进行了这种COVID-19-BCG疫苗的随机3期临床试验，参与者（分别为1500人和10078人）与安慰剂接种组相比，也显示出对COVID-19感染的显著保护。尽管BCG尚未被认可为商业疫苗佐剂，但鉴于最近对其作为针对COVID-19感染的疫苗佐剂的研究，其作为基于蛋白疫苗的领先佐剂的潜力是有希望的。 5.乳液佐剂  水包油（和油包水）是乳液基础佐剂的两个子类型，这些混合物的油性相成分来源于角鲨烯（从鲨鱼肝脏或植物中获取，包括米糠、橄榄和小麦胚芽）。这些佐剂通过持续的抗原释放诱导库效应，这一类别的常见佐剂包括完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）和蒙旦剂（例如，MF59®、AS03和糖基化脂质佐剂-稳定乳液（[GLA-SE]））。MF59®和AS03都是水包油乳液系统，而GLA-SE是油包水乳液。 5.1.完全和不完全弗氏佐剂 将热杀死的M. tuberculosis、M. butyricum或其提取物（在接种部位聚集巨噬细胞）与矿物油和表面活性剂甘露单油酸酯结合，构成CFA乳液。与CFA佐剂疫苗观察到的库效应促进了免疫宿主内长达六个月的缓慢抗原释放。CFA佐剂通过激活TLR2、4和9来引发细胞和体液免疫。在某些情况下，CFA在注射部位引起过度炎症，有报道称由于非代谢矿物油引起的免疫毒性。因此，目前CFA不适用于人类使用，尽管对CFA激活的研究为临床疫苗开发提供了可靠的结果。IFA的配方与CFA相同，但去除了Mycobacterium。IFA旨在最小化与CFA观察到的过度炎症效应，结果，IFA佐剂已经被（并继续）用于兽医疫苗。然而，对于人类疫苗，当IFA在流感、破伤风和霍乱疫苗的临床试验中使用时，报告了一系列严重的副作用（例如，注射部位持续疼痛的肉芽肿和无菌脓肿），限制了其在基于人类的疫苗开发中的应用，以对抗传染病。水包油乳液（例如，IFA和CFA）由于使用非代谢矿物油而具有高风险的不良反应，这种矿物油在疫苗中未获许可。弗氏佐剂诱导强烈的适应性免疫，但如此反应原性，以至于即使在实验室动物中的使用也不鼓励。弗氏佐剂的临床前和临床开发 CFA通常被用作实验性抗体产生的有效佐剂，其一般的免疫刺激性能力尚未被任何其他佐剂所取代。然而，CFA的各种损伤，包括注射部位肉芽肿、脊髓压迫、坏死性皮炎和肾脏肉芽肿形成，导致了CFA（和IFA）在临床试验中使用的显著限制。IFA已经在人类中广泛测试，它比商业佐剂（例如，氢氧化铝和MF59）增强了更强大的体液免疫反应。IFA与其他佐剂（例如，皂苷或细胞因子）结合使用，可在动物模型中导致强大的适应性免疫反应，并可能很快在临床研究中进行测试。IFA的毒性通过使用高等级油和纯化表面活性剂来控制，结果，IFA已经出现在最近的传染病（例如，HIV；表2）的临床试验中。在最近的HIV疫苗开发中，Levine及其同事对25名参与者（NCT00381875）进行了IFA乳化的HIV-1免疫原的临床研究。这种HIV-1疫苗在人类免疫后没有显示出显著的不良反应，有趣的是，参与者在6年的跟踪期内，有12名（25名参与者中的）维持了更高水平的抗体反应。必须考虑这种HIV免疫原的临床效果以及HIV延迟型超敏反应与更有利的临床过程之间的显著相关性。 5.2.蒙旦剂 蒙旦剂是包含角鲨烯的水包油乳液，与表面活性剂（例如，甘露单油酸酯表面活性剂）稳定。蒙旦佐剂有效地诱导Th1/Th2细胞因子的分泌，以刺激体液和细胞反应。与此同时，库效应、抗原呈递细胞的激活，以及通过与细胞膜的相互作用改善抗原摄取，使蒙旦剂能够比基于氢氧化铝的佐剂刺激更高的免疫反应。 蒙旦剂的临床前和临床开发 蒙旦ISA-51是一种乳液佐剂，由甘露单油酸酯家族与矿物油结合而成。ISA-51增强了临床研究中的抗原特异性抗体滴度和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。ISA-51佐剂在免疫部位缓慢释放抗原，刺激抗原呈递细胞摄取，并增强淋巴结中淋巴细胞的积累。乳剂佐剂的按蚊唾液疫苗（AGS-v）是一种亚单位疫苗，由四种不同的按蚊唾液蛋白组成，与ISA-51佐剂结合，以对抗这种蚊子传播的疾病。在49名健康志愿者中进行了AGS-v疫苗的1期临床试验（NCT03055000；表2），表明与单独的抗原（AGS-v）相比，佐剂疫苗刺激了更快和更强的免疫反应。顺便说一句，与未佐剂疫苗相比，ISA-51疫苗在注射部位报告了更多的局部副作用（例如，发红、肿胀、瘙痒），没有报告其他严重的安全问题。这项研究为蒙旦ISA-51在唾液蛋白疫苗中的有效性和安全性提供了第一证据，导致未来几年在其疫苗开发中的使用增加。 5.3.MF59® MF59®（图3）是一种包含角鲨烯油（胆固醇的前体）的油包水乳液，是第一个在1992年作为流感疫苗临床试验的一部分获得FDA批准的油包水佐剂。MF59®于1997年首次在意大利获得许可，现在作为流感疫苗佐剂在全球范围内获得广泛批准（例如，季节性、大流行和禽流感疫苗）。 图 3.MF59®的化学成分，MF59由角鲨烯和两种表面活性剂（Span 85和Tween 80）组成。MF59®和AS03不仅成分相似，而且组成也类似。这些成分在油相中混合，形成油包水乳液。 为了制备乳液，亲脂性和亲水性乳化剂（特定配方）分别溶解在油相和水相中，通过非常高的搅拌速率（例如，高剪切搅拌器）混合两相形成粗乳液。对粗乳液施加高压（例如，高压均质器）或强烈的声波处理后，通过过滤形成平衡乳液。 MF59®佐剂激活肌肉中的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，从而分泌各种趋化因子，导致注射部位免疫细胞显著迁移。在这里，MF59®招募抗原特异性抗体，刺激Th1和Th2免疫反应。MF59®的间接库效应允许延长免疫细胞反应和长期抗体分泌。因此，基于乳液的传递系统在发现角鲨烯后有着强大的开发历史，这促进了MF59®和AS03（在H5N1和H1N1疫苗中获批）的创造，为在其他传染病疫苗中的应用铺平了道路。 MF59®的临床前和临床开发 MF59®已在人类流感疫苗中获批，这些疫苗在全球30多个国家使用。MF59®在流感（Novartis）和H1N1大流行流感疫苗（Focetria®和Celta®）中的使用尤为突出。尽管MF59®通常具有高安全性记录，但由于老年人口免疫系统较弱，佐剂在成人>65岁疫苗中的效果促使进行更严格、针对性的测试。随后，Kelly Linbert进行了统计分析，确认了MF59佐剂三价流感疫苗（aIIV3；Fluad®）（NCT04576702）在老年患者中的安全性。 MF59®还佐剂了在I期临床试验中评估的SARS-CoV-2 sclamp抗原（NCT04495933；表2）。在这里，发现MF59佐剂SARS-CoV-2 sclamp疫苗是安全且耐受性良好，两剂疫苗诱导了强烈的SARS-CoV-2特异性多功能CD4+ T细胞反应，偏向于Th1型。 角鲨烯油在油包水乳液中很突出；然而，其围绕油组成结构/功能的免疫学机制尚不清楚。此外，由于角鲨烯的主要来源是鲨鱼肝脏，这限制了其大规模生产。来自松科（松树）的乳化油提供了一个潜在有效的补充选择，并且最近在小鼠、猪和雪貂中作为乳化油疫苗针对大流行流感进行了评估。 尽管MF59®是传染病疫苗中获批的佐剂，但这种佐剂的副作用仍然需要考虑和针对新疫苗进行测试。此外，理解基于乳液的佐剂的作用机制预计将扩大这些系统的使用。 5.4.GLA-SE 佐剂 GLA-SE包含TLR4激动剂葡萄糖基脂质佐剂（GLA）和稳定的乳液纳米乳液角鲨烯油-水（SE）。GLA-SE诱导针对各种传染病（例如，结核病、利什曼病或麻风杆菌感染）的强大Th1和平衡的IgG1/IgG2反应。添加GLA-SE还产生了来自CD4+ T细胞的大量多功能细胞因子或/和趋化因子（例如，TNF-α、IL-6和IL-12），具有可接受的安全性和耐受性。 GLA-SE的临床前和临床开发 过去三十年中，GLA-SE已在疫苗开发中广泛使用。呼吸道合胞病毒（RSV）是老年人中的致命疾病，迄今为止，还没有获批的疫苗。Patton及其同事评估了包含RSV可溶性融合蛋白的选定抗原的RSA疫苗的免疫原性，并将它们与GLA-SE结合（表2）。在猕猴免疫后，与未佐剂的RSV疫苗相比，GLA-SE佐剂RSV抗原刺激了更强大和持久的体液和Th1偏向的细胞免疫反应。Cauwelaert等人证明，这种GLS-SE佐剂刺激了先天免疫反应，导致NK细胞和记忆CD8+细胞的IFN-γ表达，以及刺激Th1免疫反应。GLA-SE还增强了适应性免疫反应，导致结核病保护。 血吸虫病（也称为比尔哈尔齐亚病或蜗牛热）是由寄生虫引起的疾病，感染生活在热带气候中的人。血吸虫病是仅次于疟疾的最具破坏性的寄生虫病，全球有超过8亿人处于风险之中，在74个国家约有2亿人感染。使用Sm14抗原（来自S. mansoni致病蛋白）和GLA-SE佐剂的抗血吸虫病疫苗在巴西进入了1期临床试验（NCT01154049；表2）。与安慰剂组相比，这种疫苗刺激了增强的抗Sm14 IgG抗体反应，除了注射部位轻微疼痛和发红外，没有副作用。此外，包含M. tuberculosis蛋白（ID93）和GLA-SE佐剂的结核病疫苗的1期临床试验（NCT01599897）。在60名健康志愿者免疫后，ID63-GLA-SE疫苗产生了更高滴度的ID93特异性抗体（IgG和Ig4亚类），并刺激了更强大的Th1型细胞和体液反应，与单独的ID93疫苗相比，多功能性CD4+ T细胞细胞因子的幅度更大。 5.5.TiterMAX 佐剂 TiterMax佐剂（TiterMax®和TiterMax Gold®）包含可代谢的角鲨烯油、山梨醇单油酸酯80、非离子嵌段共聚物（CRL8941和CRL8300）和微粒二氧化硅。典型的水包油乳液TiterMax®佐剂，毒性低于CFA，不含生物材料。非离子嵌段共聚物由亲水性聚氧乙烯和亲脂性聚氧丙烯的线性链组成，分泌补体免疫细胞，并增强巨噬细胞上的MHC-II表达，导致更高水平的IgG1和IgG2a抗体免疫反应。TiterMax Gold®被认为是传统TiterMax佐剂的改进版本。TiterMax Gold®是动物研究中增强细胞和体液免疫反应的有效佐剂，作为完全弗氏佐剂的替代品，因为更安全、更易使用。TiterMax Gold®佐剂的免疫潜力取决于稳定的水包油乳液，它包裹来自病原体的有效抗原。由于产生类似的抗体滴度，TiterMax佐剂常被用作CFA的替代品，尽管TiterMax已被证明可诱导免疫引起的病变。例如，Leenaars及其同事证明，腹腔内免疫TiterMax引起了严重病变，而皮下免疫相同疫苗佐剂后发现的病变最小（和低免疫原性），显著限制了TiterMax作为临床研究中佐剂的使用。 TiterMAX佐剂的临床前开发 TiterMax®和TiterMax Gold®是基于它们的安全性和有效性，在动物研究中作为Freund完全佐剂的替代品。Henker等人将重组肌球蛋白调节轻链包裹在TiterMax Gold®佐剂中，然后皮下免疫大鼠。这项研究表明，与未佐剂组相比，吸虫负担显著减少61.5%（p < 0.001），混合Th1/Th2免疫反应。此外，Leite等人评估了TiterMax®佐剂作为抗血吸虫病疫苗的一部分，表明产生了更强的招募肥大细胞和嗜碱细胞，导致更多的IgG2a抗体。 5.6.RIBI 佐剂 与Freund佐剂不同，RiBi佐剂系统（RAS）是自1985年以来一直在研究的水包油佐剂。这种RAS佐剂系统由可代谢的角鲨烯油、免疫刺激剂和Tween 80表面活性剂组成，其中抗原在乳化前被油包裹。RAS水包油乳液易于通过过滤灭菌，RIBI佐剂系统中常用的三种免疫刺激剂：海藻糖6,60-二肌酸肌醇脂（TDM）、细胞壁骨架（CSW）和单磷酸脂A（MPL）。TDM是从致病性分枝杆菌菌株中分离出的分枝杆菌菌体成分的脂质成分，已知在疫苗接种后诱导体液和细胞免疫反应。CSW从分枝杆菌细胞壁中提取，CSW的强烈免疫原性与来自分枝杆菌细胞的免疫反应性肽聚肌苷二肽（MDP）的聚合形式有关。MDP增强抗体产生，增加对病原体（包括细菌、真菌、病毒和寄生虫）的非特异性免疫反应和细胞因子释放，诱导自身免疫和细胞介导的免疫。MPL是一种TLR4激动剂，可诱导B细胞和T细胞免疫反应，是从脂质A化学改性而来，细胞毒性降低。然而，RIBI佐剂系统已知在动物中引起病理性病变，Johnston等人在1991年证明，RIBI在兔子中引起的病变与CFA相同。因此，RIBI佐剂获准用于动物研究中疫苗开发，而不是临床试验。 RIBI佐剂系统的临床前开发 Mullerad及其同事在Mycobacterium paratuberculosis (MPT)中评估了RASs的免疫原性。在这里，他们过表达并纯化了MPT的85B抗原，并将其与RAS结合后给小鼠接种。这项临床前试验的结果显示，与无佐剂疫苗相比，RIBI佐剂产生了更高水平的IL-10、一氧化氮和IgG1和IgG2a抗体的分泌。Cargnelutti及其同事开发了重组病毒核蛋白（NP）作为流感大流行的主要病原体，并用RAS佐剂。在小鼠免疫后，与未佐剂的NP疫苗相比，NP-RAS疫苗观察到更高水平的IFN-γ、IgG2a抗体和更强大的体液和细胞介导的免疫反应。 比较和评估RIBI佐剂引起的病理性病变的临床前研究产生了不同的结果。Johnston及其同事（1991年）和Leenaars及其同事（1994年）在兔子中发现了与CFA引起的病变相似的病变，而其他研究在使用RIBI作为佐剂时只发现了最小的病变。与CFA和RIBI在小鼠中腹腔内给药的比较研究一致报告RIBI引起的病理性病变较少。除了Lipman小组在小鼠中的报告外，比较RIBI和CFA/IFA之间的抗体反应的一般研究表明，CFA/IFA方案的抗体产生量要高得多。 6.免疫刺激性复合物  6.1.细胞因子  非毒性佐剂增强针对特定疾病的免疫反应。细胞因子作为一种非毒性佐剂，影响免疫反应的功能多样性，并在抗体和细胞介导的免疫反应之间发挥重要作用。细胞因子是细胞释放的小蛋白，直接影响细胞之间的相互作用和通信。细胞因子是这些小而重要的蛋白的广泛和松散的类别名称，其他名称包括：淋巴因子（由淋巴细胞产生的细胞因子）、单核因子（由单核细胞分泌的细胞因子）、趋化因子（具有趋化活性的细胞因子）和白细胞介素（IL）（由一种白细胞产生并作用于其他白细胞的细胞因子）。细胞因子可能作用于分泌它们的细胞（自分泌作用）、附近细胞（旁分泌作用）或某些情况下的远距离细胞（内分泌作用），由于它们的冗余，不同细胞因子诱导相似的功能。通常，一种细胞因子激活其目标细胞，导致额外细胞因子的分泌和常见的级联反应。由于多种细胞因子负责诱导先天和适应性免疫反应，这影响了抗原呈递细胞的成熟、Th1和Th2细胞的分化以及细胞毒性自然杀伤细胞和CTL的分泌，最终形成针对侵入性感染的有效保护层。因此，几种细胞因子（包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[GM-CSF]、干扰素[INFs]、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18和趋化因子）具有作为疫苗佐剂的巨大潜力，用于刺激针对感染的强效免疫反应，特别是在DNA疫苗中。质粒DNA疫苗包含编码所需抗原及其相应表位的基因，这些表位刺激适应性免疫（但免疫原性差）。然而，商业和传统疫苗佐剂无法增强DNA疫苗所需的免疫原性。因此，分子佐剂（例如，细胞因子、趋化因子和免疫靶向基因）作为质粒编码蛋白，已被评估为疫苗佐剂。这些靶向先天免疫受体或调节信号识别。通过感染细胞在注射部位适度分泌重组细胞因子有效限制了细胞因子的不良反应。细胞因子编码基因作为单独的质粒传递，以及在特定抗原内编码的额外基因，这些抗原包含针对感染的质粒（例如，HIV、流感和SARS-CoV）。GM-CSF直接影响树突状细胞形成的刺激，导致成功的抗原摄取、CD4+和/或CD8+ T细胞的产生，并刺激针对感染的特定适应性免疫反应。干扰素（INFs）佐剂最初被发现是一种抗病毒因子，它干扰哺乳动物细胞中病毒的复制。感染的细胞和活跃的先天免疫反应可以分泌干扰素，以及细胞因子的产生以及自然杀伤细胞功能的诱导和抗原呈递。根据它们的结构同源性和相关特定受体，INFs被分类为三种不同类型（I型、II型和III型）。I型IFNs诱导侵入性病毒的凋亡，增强交叉启动和病毒肽段的呈递。I型IFNs作为B细胞激活剂，分泌各种抗体，并通过鼻内（或肌肉内）给药诱导强烈的体液免疫反应。T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）和自然杀伤T（NKT）细胞产生2型INFs，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。这种2型INF细胞因子通常控制巨噬细胞的分化、抗原呈递细胞中MHC表达和Th1（CD4+）和细胞毒性CD8+细胞的成熟。此外，2型INF调节免疫球蛋白类别转换。白细胞介素（IL）家族细胞因子（例如，IL-1、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18）在佐剂开发中显著参与。IL-1是一种古老且重要的促炎细胞因子，对宿主免疫系统产生强效影响。IL-1增强了先天免疫反应所需的细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和NK细胞）的活性，激活并加强了极化T细胞的功能。IL-2主要由CD4+ T细胞产生，影响T细胞的增殖和诱导，刺激体液和细胞免疫反应。IL-2参与树突状细胞上CD48和CD80的表达，以及它们在CD4+ T细胞上相应配体（CD2和CD28）的上调。IL-12是一种Th1促炎细胞因子，由吞噬细胞和树突状细胞在对致病微生物感染的反应中产生。IL-12增强NK、T和B细胞的产生，并调节Th1细胞的分化。IL-15由单核细胞、树突状细胞、上皮细胞、骨髓基质细胞和成纤维细胞产生，与IL-12具有高度同源性和结构相似性。IL-15调节NK和T细胞的分泌和增殖，以及B细胞抗体产生。IL-18由巨噬细胞和Kupffer细胞产生，调节IL-2和IL-12的分泌，并增强NK和CD8+ T细胞的增殖和活性。IL-18作为Th1免疫反应的主要促进剂，影响Th1免疫细胞的分化和IFN-γ的产生。 细胞因子的临床前和临床开发 GM-CSF是一种多效性细胞因子，已在针对结核分枝杆菌、Epstein-Barr病毒和人类免疫缺陷病毒的传染病研究中使用。Kasahara及其同事确定GM-CSF受体（由配体结合亚单位[GM-CSFRα/Csf2ra]组成的异二聚体）是针对曲霉的共同信号转导亚单位（GM-CSFRβ/Csf2rb）。在这里，没有GM-CSF受体B链的小鼠表达了侵入性菌丝生长，并在感染A. fumigatus后表现出生存率降低。然而，给予重组GM-CSF的小鼠增强了中性粒细胞NADPH氧化酶（催化电子转移到氧产生超氧化物）功能、抗白念珠菌活性和强大的真菌清除。作为佐剂，GM-CSF与伪狂犬病病毒（PrV）糖蛋白结合并作为疫苗给小鼠接种。这导致IgG的产生改善和更强的T细胞介导的免疫反应偏向Th1型反应，从而增强了针对PrV感染的保护性免疫，与无佐剂疫苗相比。此外，GM-CSF与HIV-1包膜糖蛋白（Env）结合作为HIV疫苗送入恒河猴。这项临床前试验得出结论，GM-CSF佐剂与HIV抗原的结合诱导了更高的中和抗体水平，并且比单独的抗原疫苗更好地控制了初次感染和病毒再出现。此外，Fabrizi及其同事使用GM-CSF结合乙型肝炎病毒表面蛋白开发了乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，并在187名患者中进行了元分析。这项研究表明，GM-CSF/HBV疫苗显著提高了这些晚期肾病患者的血清保护率。Brekke及其同事将HIV Vacc-C5（包含HIV-1病毒C5结构域489-511残基）与GM-CSF佐剂结合作为基于肽的治疗性疫苗针对HIV。在这个1/2期临床研究中，用GM-CSF佐剂的Vacc-C5肌肉内给药36名参与者，并为GM-CSF佐剂疫苗在所有患者中的安全性和耐受性提供了证据，并与单独疫苗相比诱导了更强的T细胞免疫反应（NCT01627678）。正在进行的1期临床试验正在评估含有用GM-CSF作为佐剂的S-蛋白装载的树突状细胞的疫苗，该疫苗肌肉内注射175名未感染参与者，以评估其安全性和抗SARS-CoV-2免疫（NCT04386252）。 这个试验刚刚开始，临床结果尚未出来。作为疫苗佐剂，GM-CSF增强了疫苗的免疫原性，以产生强烈的免疫反应。GM-CSF已经在动物和人类试验中作为疫苗佐剂进行了测试，针对感染以及前列腺、乳腺或肺癌的抗肿瘤免疫疗法。1型干扰素（IFN）是用于粘膜疫苗接种的常见佐剂，针对H1N1病毒、H3N2病毒、乙型肝炎病毒和流感B病毒。例如，Bracci及其同事将灭活亚单位H1N1流感蛋白抗原与1型IFN结合，该IFN在C243-3细胞系中制备，并通过硫酸铵沉淀和透析对磷酸盐缓冲液（PBS）进行浓缩和部分纯化，作为流感亚单位疫苗，通过鼻内给药到小鼠。这项临床前研究表明，这种流感亚单位疫苗产生了更高的抗体滴度（IgG2a和IgA），并增加了鼻粘膜层中与抗原相关的吞噬细胞的百分比，与单独的流感抗原相比，导致对A/New Caledonia/20/1999（H1N1）流感病毒的流感挑战产生了强大的体液保护。1型IFN佐剂增强了实验性疫苗在小鼠中针对流感病毒的效力，产生了抗体和长期免疫记忆。1型IFN佐剂通过刺激树突状细胞以及B和T细胞，使疫苗诱导的体液免疫。然而，Couch等人将灭活流感病毒疫苗与MPL、1型IFN或霍乱毒素B结合，作为流感疫苗通过鼻内给药到健康成年志愿者。接种疫苗耐受性良好，而1型IFN对于通过鼻内给药到人类中的灭活流感病毒的体液免疫反应没有表现出佐剂效果。慢性乙型肝炎病毒（CHB）感染是一个重要的全球公共卫生问题，是严重疾病（例如，肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌）的原因，影响着超过2.8亿人，每年有超过80万人死亡。乙型肝炎病毒感染后6个月以上检测呈阳性的患者被诊断为慢性乙型肝炎病毒感染，人类免疫系统无法清除病毒。目前没有预防和/或治疗CHB感染的疫苗。BRII-179是一种基于病毒样颗粒的疫苗，包含所有三种乙型肝炎病毒表面包膜蛋白（Pre-S1、Pre-S2和S），与IFN-α结合作为CHB疫苗。这种CHB疫苗的1期临床试验已经完成，肌肉内给药到年龄在18至60岁之间的健康志愿者（ACTRN12619001210167）。在这里，BRII-179作为一种新型配方蛋白疫苗，包含所有三种乙型肝炎病毒表面包膜蛋白（Pre-S1、Pre-S2和S），与IFN-α佐剂结合，安全、耐受性好，并诱导乙型肝炎病毒特异性T细胞免疫反应，但在病毒抑制、非肝硬化的CHB患者中效力有限。最近进行的2期临床试验（NCT04749368）进一步评估了BRII-179和与INF-α佐剂结合的BRII-179以及另一种乙型肝炎病毒特异性疫苗BRII-835的效力，它们是研究性的乙型肝炎病毒靶向siRNA序列，与IFN-α佐剂结合，皮下给药到135名患者。预计这项2期临床试验将在2023年公布其临床结果。流感是一种从鼻子到末端细支气管的呼吸道粘膜病毒感染，大部分抗体分泌发生在粘膜表面。因此，流感疫苗应诱导粘膜免疫反应和Th2细胞反应，分泌抗体和记忆细胞。此外，从流感病毒A（H1N1和H3N2）中选出的20至99个氨基酸株与INF-α佐剂结合，在90名年龄在18至40岁之间的健康志愿者中通过鼻内免疫后进行了临床评估（NCT00436046）。这项1期试验得出结论，与安慰剂组相比，鼻内给药产生了更高水平的IgA和IgG2抗体，并诱导了所需的保护性粘膜免疫。1989年，Stürchler及其同事将疟疾孢子体肽与INF-α佐剂结合，作为疟疾疫苗候选物肌肉内给药到健康志愿者。这项临床试验表明，与安慰剂组相比，INF-α佐剂组产生了更高的抗体滴度和更强的针对孢子体肽的体液免疫反应。然而，产生针对孢子体的保护性免疫反应所需的抗体量未知，但由于对INF-α作为佐剂的了解不清楚，因此对INF-α与孢子体疫苗结合后产生的抗体量提出了质疑，表明这项临床研究有显著的局限性。INF-α佐剂是具有长期临床使用记录的多效性细胞因子。INF-α影响先天和适应性免疫，并引发INF-DC相互作用，以刺激适应性免疫反应。INF-α佐剂是使用IFN-α或IFN-α条件树突状细胞针对感染（例如，疟疾、流感和乙型肝炎病毒）以及抗肿瘤疗法。此外，流感疫苗研究一直是白细胞介素研究发展的基础，针对IL-1、IL-2和IL-12。IL-2是流感疫苗开发中的第一个佐剂。2006年，Henke及其同事生成了流感病毒A病毒双顺反子质粒时，与IL-2共同传递了DNA疫苗。这种DNA疫苗候选物通过鼻内注射到小鼠体内，与未用IL-2佐剂接种的疫苗相比，有效地预防了流感病毒的致命挑战。此外，Hu及其同事在2009年针对严重急性呼吸综合征（SARS）设计了IL-2编码的DNA疫苗质粒。IL-2基因作为细胞因子佐剂编码的SARS-CoV核蛋白DNA疫苗通过肌肉内给药到小鼠体内，与未用IL-2佐剂接种的疫苗相比，产生了更高的IgG滴度和更有效的特异性免疫反应。单一疫苗使用IL-1作为传染病疫苗的佐剂。在这里，IL-1是另一种安全有效的佐剂，已在流感粘膜疫苗开发中使用。Kayamuro等人设计了一种含有IL-1家族细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-33）的重组流感病毒血凝素结合物，通过鼻内给药到小鼠。这项临床前试验表明，接种疫苗后，血浆IgG和粘膜IgA显著增加，并产生Th1和Th2细胞因子，与非佐剂组相比，导致针对流感病毒的体液免疫反应，没有急性毒性。特定的IL-1细胞因子已被用作疫苗佐剂，以诱导针对感染（流感）或癌症的强烈适应性和记忆免疫反应，是粘膜疫苗的有效佐剂。IL-18负责激活肥大细胞，并增强IL-33作为粘膜佐剂引发的CTL免疫反应。尽管IL-1家族细胞因子是针对传染病的有效鼻内疫苗佐剂，但将IL-1细胞因子与商业佐剂（MF59或氢氧化铝佐剂）结合是诱导针对进入粘膜层的病原体的体液和粘膜免疫反应的有效途径。为了进一步针对流感的佐剂研究，也调查了IL-12（粘膜佐剂）。小鼠通过鼻内给药流感疫苗候选物（包含可溶性血凝素（H1）、神经氨酸酶（N1）和可溶性重组IL-12佐剂），导致血清中IgG2a抗H1N1抗体水平增加，以及与单独的抗原相比，支气管肺泡灌洗液中的IgG1、IgG2a和IgA抗体水平增加。此外，IL-12佐剂显著增强了小鼠的存活率，刺激了更强的保护性粘膜免疫反应。Kumar等人将IL-12与灭活的耶尔森氏菌CO92激动剂结合，并通过鼻内给药到小鼠。结果表明，与肺炎鼠疫相比，安全性、免疫原性和保护效力增强。来自HIV株的RNA优化HIV-1基因DNA通过肌肉内单独给药或与IL-12或IL-15质粒细胞因子佐剂剂量递增结合在健康志愿者中给药（NCT00111605）。这项1期临床研究表明，与细胞因子佐剂结合的HIV免疫原疫苗接种是安全且耐受性好的，没有显著的不良事件，而IL-12和IL-15细胞因子佐剂对增强细胞免疫的能力很小。 IL-12是一种典型的异二聚体细胞因子，由巨噬细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞分泌，诱导小鼠模型针对感染（如流感或HIV）的粘膜和适应性免疫反应。然而，由于免疫原性低，很少有关于IL-12作为疫苗佐剂针对感染的临床试验。编码IL-15的细胞因子质粒与克氏锥虫（查加斯病的病原体）跨唾液酸酶（TS）基因质粒共给药到小鼠，显著改善了CD8+记忆T细胞分泌后的长期保护。此外，IL-15还被评估为基于病毒的HIV gp160疫苗的一部分在小鼠模型中。在这里，IL-15的结合诱导了长期、抗原特异性的CD8+ T细胞免疫反应以及长期且强大的抗体介导的免疫反应。最后，IL-18，被称为IFN-γ诱导因子，是IL-1细胞因子家族的成员。它的最初发现可以追溯到上个十年，IL-18似乎包含独特的特性，其中一些可以治疗脓毒症和感染（流感、脑炎和HSV-1）。例如，IL-18佐剂的单纯疱疹病毒DNA疫苗（HSV-1），在小鼠模型中经过临床前评估后，IL-18佐剂疫苗大大增强了Th1免疫反应，对HSV-1感染具有强大的保护性免疫。细胞因子是针对传染病疫苗的潜在佐剂，因为它们诱导有效的粘膜和记忆免疫。因此，细胞因子作为鼻内疫苗佐剂与商业佐剂（氢氧化铝、MF59和AS03）结合，可以增强强大的适应性免疫，简单的鼻内给药。 6.2.趋化因子 趋化因子是一类小蛋白，以其刺激细胞迁移的能力而闻名，已鉴定出超过50种趋化因子（和18种趋化因子受体）。这些趋化因子根据前两个保守的半胱氨酸残基的排列分为四个不同的家族（CC、CXC、C和CX3C）。趋化因子影响淋巴细胞的增殖和成熟，调节先天和适应性免疫反应，因此，基于其影响适应性和/或保护性免疫反应的能力，趋化因子已被用作疫苗佐剂。与DNA疫苗共给药的趋化因子佐剂增强了APC传递到注射部位，其中抗原被摄取，改善了针对感染的免疫反应。然而，关于趋化因子佐剂剂量相关毒性问题和稳定性的限制已有报道。 趋化因子的临床前开发 CCL3趋化因子吸引NK和CD8+ T细胞，已用作HIV-1疫苗的佐剂。在这里，Kuczkowska等人创建了一个截短的HIV-1 Gag抗原与小鼠趋化因子CCL3作为HIV疫苗，导致诱导强烈的抗体滴度和CD4+ T细胞反应。此外，CCL28已在流感疫苗中使用，其中CCL28与流感病毒样颗粒佐剂并鼻内给药到小鼠。这项研究表明，CCL28趋化因子增强了IgA（而不是IgG或IgM）的产生，促进IgA迁移到不同的粘膜部位，并与未佐剂疫苗相比，增加了粘膜抗体滴度和长期保护性免疫反应。RANTES，也称为CCL5趋化因子，识别单核细胞、记忆T细胞和嗜酸性粒细胞，诱导粘膜和系统性免疫反应。在2000年，Kim等人编码RANTES表达质粒与乙型肝炎表面抗原（HBsAg）共给药作为DNA疫苗，并通过肌肉内（或阴道内）免疫小鼠。结果表明，与霍乱毒素佐剂相比，RANTES编码质粒与HBsAg的阴道给药产生了更高水平的血清IgG和粘膜IgA，并具有更强的保护性免疫反应。此外，在2001年，一种巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）质粒，与编码单纯疱疹病毒（HSV gB）糖蛋白B的DNA疫苗共给药，鼻内给药到小鼠，产生了比MIP-2 DNA疫苗更强的IgG免疫反应和Th1样免疫反应。巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）是一种α-趋化因子，具有强烈的中性粒细胞趋化吸引。Eo及其同事将MIP-2质粒与编码单纯疱疹病毒（HSV gB）糖蛋白B的DNA疫苗结合，鼻内给药到小鼠，产生了与单独的DNA疫苗相比更高水平的IgG滴度和Th1免疫反应，而MIP-2 DNA疫苗没有粘膜免疫反应。胸腺源性趋化因子3（TCA 3）对单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞表达趋化活性。Tsuji及其同事（1997年）将编码小鼠TCA3的质粒与表达HIV-1的DNA疫苗共给药，通过肌肉内给药到小鼠，导致强烈的HIV-1细胞介导的免疫反应，而没有显著的体液免疫。迄今为止，尽管这些临床前结果充满希望，但尚未报告使用趋化因子作为传染病疫苗佐剂的进一步临床研究。 趋化因子可以轻易地工程化为DNA疫苗构建体或作为单独的质粒给药，增强系统性或粘膜免疫反应。因此，与细胞因子相比，趋化因子更稳定，毒性更小，有潜力成为针对传染病的DNA疫苗佐剂。 7.颗粒佐剂  7.1.咪唑喹啉  咪唑喹啉源于核苷类似物的开发，尽管它们的分子结构与核苷类似，但咪唑喹啉具有与核苷样活性不同的机制。咪唑喹啉主要与TLR7（和/或TLR8）结合，分别产生1型和2型INF细胞因子IL-12和TFN-α，从而诱导先天免疫反应和强大的Th1偏向适应性免疫反应。咪唑喹啉作为小合成分子，成本效益高，纯度高，最初于2010年获得食品药品监督管理局（FDA）批准，作为5%乳膏，广泛用于治疗生殖器疣和皮肤癌。未配方的咪唑喹啉（例如，R848）由于其大小和溶解度影响系统性免疫激活。然而，咪唑喹啉作为疫苗佐剂已参与癌症治疗性疫苗的临床试验，而这种佐剂尚未在针对感染的人类研究中使用。 咪唑喹啉的临床前开发 咪唑喹啉已在癌症和细菌疾病的临床评估中使用，但未在传染病中使用。与共价连接的咪唑喹啉佐剂的鼻内RSV疫苗在小鼠中的临床前评估表明，与未佐剂小鼠相比，当小鼠肺部发生炎症传播时，IgG1抗体水平更高，具有强大的体液免疫反应。Resiquimod（R848），一种咪唑喹啉，是一种双重TLR7和TLR8合成激动剂，已被用作针对病毒疾病的人类免疫刺激剂。R848与灭活流感病毒（IPR8-R848）结合，在新生儿非人灵长类动物模型中显示出强大的效力和安全性，与未佐剂灭活病毒疫苗相比，刺激增强的病毒特异性T细胞反应和IgG和IgM抗体。 7.2.病毒样颗粒和病毒体佐剂 微米和纳米颗粒已被用作疫苗的佐剂（或传递系统），在传染病研究中常用的包括病毒样颗粒（VLPs）和病毒体。在这些系统中，通过物理吸附或化学键合的方式将抗原包裹在这些颗粒的表面（或内部）。 VLPs保留了病毒衍生的结构，具有与原生病毒颗粒相似的大小和形态，但不包含病毒本身的DNA/RNA成分，使其无法感染宿主细胞。VLPs中存在二十面体和杆状结构，这些是由病毒结构蛋白自组装形成的。VLPs可以在各种表达系统中实验性地生产（例如，哺乳动物细胞系、植物、细菌、酵母和昆虫细胞系），作为生物和纳米材料（包括疫苗或药物）的载体，利用其结构内的腔体。在这里，具有自组装结构衣壳蛋白的VLPs的形态类似于原生病毒，其中抗原展示在外部表面。从注射部位运输到淋巴结的VLPs被抗原呈递细胞和树突状细胞有效摄取，引发强烈的免疫反应。VLP上抗原的重复排列激活B细胞，刺激更强的体液免疫反应，同时诱导T细胞激活和细胞介导的免疫反应。基于VLPs的结构，可以分为非包膜VLPs和包膜VLPs（eVLPs）。非包膜VLPs包含特定病毒的单个或多个衣壳蛋白，具有简单和相对的结构。包膜VLPs在结构上更为复杂，包含病毒和宿主膜成分。包膜VLPs的免疫刺激性有限（基于所使用的结构蛋白），更有效地作为抗原和佐剂的传递系统，免疫原性材料展示在VLP的外表面（图4），而脂质双层也包含免疫原性颗粒以增强抗体反应。几种预防性疫苗（例如，针对乙型肝炎病毒的Recombivax HB和Engerix-B，针对人乳头瘤病毒的Gardasil、Cervarix和Gardasil-9，以及针对乙型肝炎病毒的Hecolin）是非感染性病毒结构蛋白，作为基于VLP的疫苗使用，并在市场上商业化。 图 4. 病毒样颗粒（VLP）的示意图，其表面由嵌入天然脂质双层（包围细胞膜）中的抗原（例如，衣壳蛋白）构成，形成包膜VLPs。(a) 非包膜VLPs仅包含单个或多个衣壳蛋白。两种类型的VLP均不含传染性材料（例如，DNA/RNA）。(b) 双层包膜VLPs的配方与其表面多个糖蛋白有关。 作为疫苗传递系统的病毒样颗粒（VLPs）的优势包括特定靶向、有效的宿主细胞穿透、生物相容性和可降解性。VLPs与天然病毒相似，VLPs表面暴露的抗原，被抗原呈递细胞有效摄取，并促进内吞作用和抗原在宿主细胞中的穿透。此外，VLPs的蛋白酶解机制可以使基于VLPs的疫苗易于降解，且降解产物具有生物相容性。 尽管有许多细胞平台用于生成病毒样颗粒（VLPs）（例如，昆虫、哺乳动物、细菌、酵母和植物），但VLPs无法表达对人类最佳免疫原性至关重要的翻译后修饰。在细菌平台中，VLP配方中可能会发生内毒素污染。酵母和昆虫细胞在形成VLPs方面具有成本效益且可扩展，同时可能会形成意外的修饰或污染物，包括真核翻译后修饰（例如，糖基化）和分别的杆状病毒污染物。这些成分或修饰可能会对刺激针对疾病的适应性免疫反应产生负面影响。由于人类病毒病原体污染和复杂的翻译后修饰的存在，哺乳动物细胞是最难生产VLPs的。 病毒体是球形的单层囊泡（60-200纳米），由去除了核衣壳的病毒包膜磷脂组成（图5）。 图 5. 病毒体佐剂示意图。病毒体是由磷脂双层合成的（类似于脂质体），其中使用了获批的流感疫苗作为病毒体的病毒结构，允许与流感表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）结合。 病毒体，一种“人造病毒”，可以作为免疫原、表位展示纳米载体或传递纳米平台，用于将疫苗抗原直接传递到宿主细胞。抗原可以通过病毒体表面的疏水域和脂质链进行共轭，此外，整合到磷脂双层中，传递到抗原呈递细胞的细胞质中，刺激体液或细胞免疫。病毒体与病毒共享的特性基于它们的结构，病毒体是安全修改的病毒包膜，包含磷脂膜和表面糖蛋白。作为疫苗传递系统，病毒体是可生物降解的，并且与许多宿主生物体相容。尽管含有类似磷脂双层的脂质体在体内外传递生物活性分子方面具有显著潜力，但由于与细胞融合的效率低，它们无法有效地将包裹的分子传递到细胞中。相比之下，病毒体由于具有受体结合和膜融合特性的病毒包膜糖蛋白，保证了细胞传递表位。 流感病毒的病毒体疫苗，名为Inflexal V，已在欧洲获得许可，而乙型肝炎病毒疫苗，名为Epaxal，在亚洲、欧洲和南美获得批准。病毒体传递系统具有显著优势，包括高质量和长期抗体反应、抗原的构象稳定化、保护抗原免于降解、安全概况，以及适用于特定人群（例如，老年人、婴儿或免疫受损人群）。然而，病毒体传递系统的显著缺点是可能由于表面病毒糖蛋白诱导的免疫反应，这可以通过使用疏水聚合物（如聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮）来修饰病毒体表面来消除。此外，病毒体传递系统在血液间隔中的快速解聚是第二个潜在问题。为了解决这个问题，与抗原共轭的病毒体能够在给药后短时间内到达目标部位。 病毒样颗粒和病毒体佐剂的临床开发 流感A病毒（H3N2）是寻找改进流感疫苗过程中的一个巨大挑战，因为流感疫苗在老年人中的免疫原性较差。Shinde及其同事使用了重组血凝素三价纳米颗粒疫苗（tNIV），该疫苗是在含有保守H3N2表位的宽型病毒序列的Sf9昆虫细胞-重组杆状病毒平台上生产的，作为流感疫苗候选物，肌肉内给药到330名成人（50岁以上）（NCT03293498）。这项1/2期临床试验发现，这种基于VLP的流感疫苗是安全且耐受性好的，与获批的Fluzone®高剂量流感疫苗相比，刺激了更高水平的中和抗体，具有长期保护性免疫反应。 在加勒比地区的传染病流行区域完成了针对基孔肯雅病毒（Chikungunya）VLP疫苗（VRC-CHKVLP059-00-VP）的2期临床研究（NCT02562482）。该疫苗是通过转染DNA质粒的人类胚胎肾（VRC293）细胞生产的，主要包含编码结构蛋白E1（细胞融合功能）和E2（细胞结合功能）的单链RNA，以及来自基孔肯雅病毒37,997病毒株的灭活衣壳DNA。对试验中400名随机志愿者的分析证明了疫苗的安全性和耐受性，并显示免疫反应在接种后72周持续存在。尽管与VLP相关的16起轻度至中度自发不良事件（多于安慰剂疫苗组），但所有不良事件均已解决，患者没有临床后遗症。 HPV VLPs与HPV L1衣壳蛋白自组装形成高免疫原性颗粒，随后在酵母（或昆虫）细胞中表达蛋白。最近获批的HPV VLPs九价HPV（9vHPV）疫苗，在临床试验中显示出显著的效力和安全性，它触发了比二价和四价疫苗更广泛的免疫反应，以预防更多HPV亚型。2014-2018年的3期临床试验确认了9vHPV疫苗在16至26岁男性中的效力，HPV四价疫苗（4vHPV）用作阳性对照（NCT02114385）。对两组人群分别给予三剂9vHPV（或4vHPV），两种疫苗均显示出对四种常见HPV亚型（6、11、16和18）的相似免疫原性。然而，9vHPV疫苗在HPV亚型31、33、45、52和58上的免疫功能明显高于4vHPV。尽管两种疫苗触发了类似的系统性不良事件比率，但接受4vHPV疫苗的六名志愿者出现了严重不良事件。 在VLPs中嵌入抗原，以flagellin佐剂支持，可能是传染病疫苗的新策略。嵌入蛋白的自由组合可能会增加疫苗的免疫原性以及疫苗设计的范围。该系统在HPV疫苗开发中的显著成功为进一步的疫苗研究和疾病提供了模型。实际上，这已经在发生，因为一种针对SARS-CoV-2的新型VLP疫苗已进入1期临床试验（NCT04818281），并附加了早期结果。 病毒体传递系统参与增强针对感染的疫苗的免疫原性。1期临床试验的HIV病毒体疫苗，通过肌肉内、皮内或皮下给药到健康志愿者，显示出良好的安全记录，没有不良效果（NCT04553016）。在这项研究中，使用流感包膜病毒来生产病毒体传递系统，与HIV-1毒力抗原（包括gp41和p1肽）结合，分泌类似细胞的辅助T细胞和巨噬细胞。此外，一种抗疟疾病毒体疫苗，名为PEV3A，进入了2期临床试验，使用来自P. falciparum K1分离株的环孢子蛋白和顶端抗原-1（AMA-1）的两个疟疾肽段的病毒体配方（NCT00408668）。PEV3A安全且耐受性好，与安慰剂组相比，诱导了高抗体滴度，并增强了抗疟疾免疫反应。 病毒样颗粒和病毒体传递系统广泛用于对抗传染病。一些疫苗通过病毒样或病毒体传递系统佐剂（例如，流感疫苗、乙型肝炎病毒疫苗或HPV疫苗）在市场商业化，并且更多的VLP和病毒体佐剂临床研究已进入不同阶段，产生了高抗体滴度并诱导适应性免疫。 病毒样颗粒和病毒体递送系统被广泛用于对抗传染病。市场上有几种疫苗使用病毒样或病毒体递送系统作为佐剂（例如，流感疫苗、乙型肝炎（HBV）疫苗或人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗），并且更多的临床研究已经进入不同阶段，这些研究使用VLP和病毒体佐剂，产生了高抗体滴度并诱导适应性免疫。 7.3.合成多核苷酸佐剂 合成的双链RNA复合物，聚肌苷酸：聚胞苷酸（通常缩写为Poly I:C或Poly(I:C)），激活先天和适应性免疫成分。它通过触发特定的模式识别受体（PRRs）和TLR3受体来模拟病毒感染并引发宿主免疫反应。Poly(I:C)的衍生物也是有效的佐剂，包括poly-IC12U和poly-ICLC。Poly-IC12U的毒性低于Poly I:C，半衰期缩短，意味着它不会引发针对双链核酸DNA的抗体。Poly-ICLC保留了亲本Poly(I:C)的生物活性，同时也显著增加了对核酸溶解的抵抗力。 含有未甲基化环状二鸟苷酸（CpG）基序的合成寡脱氧核苷酸（ODNs）在结构/功能上类似于细菌DNA，能够结合TLR9。根据不同的结构和免疫反应，已经鉴定出四类CpG ODN（D型、K型、C型、P型）。这四类CpG ODN包含一个中心未甲基化的‘CG’二核苷酸和侧翼区域。作为佐剂的CpG ODN识别TLR9受体（例如，浆细胞样树突状细胞和B细胞），导致Th1和促炎细胞因子的分泌以及先天免疫反应的诱导。此外，CpG ODN增强了专业抗原呈递细胞，导致对传染病的体液和细胞免疫反应的诱导。随着CpG作为HBV疫苗佐剂的商业应用，对其在其他疫苗中的潜力的研究正在进行中。 多核苷酸佐剂的临床前和临床开发 已经报道了许多有前景的多核苷酸佐剂的临床前和临床试验（例如，Poly I:C、poly-ICLC和ODNs及其衍生物），用于传染病，突出了这类佐剂在未来疫苗设计中的前景。这里和表2中提到了一些这些研究。 Poly I:C与重组HIV-1包膜糖蛋白（gp120；介导病毒包膜与目标细胞膜的融合）结合，注射到小鼠体内，表明未成熟的树突状细胞呈递抗原并产生增加水平的CD8+细胞，与使用脂多糖（一种TLR4激动剂佐剂）相比，对HIV产生了强烈的细胞免疫反应。此外，当Poly I:C与HIN1流感血凝素蛋白PR8结合使用时，也被证明是一种有效的粘膜佐剂。在小鼠鼻内免疫后，这种PR8/Poly(I:C)疫苗刺激了IgA滴度的增加，与单独使用流感抗原相比，产生了强大的体液免疫反应。2014年，Saxena等人将血浆HIV-1 RNA与TLR-3激动剂Poly-ICLC佐剂物理结合作为HIV疫苗。在这项临床研究中，HIV疫苗被肌肉注射到健康志愿者和患者体内，结果显示这种疫苗在Poly-ICLC给药后没有显著改变与CD4+ T细胞相关的HIV免疫，尽管安全性好且耐受性良好（NCT0207195）。在临床上，poly-ICLC已被证明是安全的，并使我们能够诱导疫苗的免疫原性，广泛使用佐剂对抗肿瘤而不是传染病。Rintatolimod（Ampligen®），一种合成的双链RNA（Poly I:Poly C12U）与甲醛灭活全病毒抗原（NIBRG14）结合，源自重组H1N5禽流感病毒，进入了55名健康志愿者的1/2期临床试验（NCT01591473）。鼻内免疫后，流感疫苗被耐受，最常见的不良反应是注射部位疼痛、疲劳和可耐受的头痛。这种Rintatolimod（Ampligen®）佐剂产生了更高的IgA滴度，并在疫苗后保护时诱导了针对H5N1的强大粘膜和体液反应，与未佐剂组相比。有趣的是，疫苗的较低剂量水平出现了增加的粘膜和体液免疫反应，进一步的3期研究正在进行中，比较活减毒流感疫苗佐剂安慰剂、低剂量和高剂量Rintatolimod的免疫原性（NCT00711295）。 CpG ODN佐剂疫苗的临床前试验涉及多种疾病模型。例如，CpG ODN作为HSV疫苗的佐剂已经得到了广泛的研究。在小鼠阴道内免疫HSV-2疫苗佐剂CpG ODN后，观察到对致命HSV-2感染的强烈粘膜和保护性Th1免疫反应的快速刺激。此外，这种HSV-1/CpG ODN佐剂疫苗在兔子体内产生了显著的Th1免疫，同时在泪液和血清中产生了高水平的中和IgA和IgG。黄等人对新生小鼠进行了超声裂解沙门氏菌蛋白与CpG ODN结合的口服给药，针对沙门氏菌肠炎感染，显示出比单独疫苗更高的IgG滴度和更强的粘膜和系统免疫反应，存活率更高。此外，Klinman等人证明了用CpG ODN佐剂的小鼠腹腔（或鼻内）免疫接种的许可炭疽疫苗吸附（AVA）诱导了强烈的系统反应和显著的保护性免疫。 CpG 1018（唯一获得FDA批准用于人类疫苗的CpG佐剂）正在进行乙型肝炎疫苗（HBsAg-1018; HEPLISAV-B™）的3期临床试验（NCT02117934）。这项3期临床试验在8374名患者中进行，显著减少了乙型肝炎感染及相关的发病率和死亡率。最近，Kuo等人选择了一种前融合稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白（S-2P [SARS-CoV-2 S-2P]）作为新型疫苗抗原。这种COVID-19抗原与FDA批准的人类佐剂（CpG 1018）和氢氧化铝结合，形成了COVID-19疫苗候选物，肌肉注射到小鼠和大鼠体内。临床前结果表明，这种疫苗刺激了Th1免疫反应，并产生了高中和抗体滴度，具有强大的保护性免疫反应。 炭疽AV70909疫苗候选物（AVA蛋白和CPG 7909佐剂[专门设计用于激活TLR9的CpG ODN佐剂类型]）的1期临床试验在25名健康成人中进行，结果显示与安慰剂组相比，抗体滴度增加，适应性免疫迅速诱导（NCT01263691）。此外，Mullen等人临床评估了与这种CpG 7909佐剂结合的疟疾抗原顶端膜抗原1（AMA1）作为抗疟疾疫苗。这项1期临床试验（NCT00344539）涉及75名疟疾易感志愿者，表明含有CPG 7909的疫苗诱导了更高水平的抗AMA1 IgG抗体，并增加了同源寄生虫生长抑制水平，副作用较小（例如，注射部位发红/疼痛）。此外，CpG 7909是商业流感疫苗（Fluarix®）的一部分，该疫苗已在健康成人中作为1期临床试验（NCT00559975）。这项试验再次支持了NCT01263691和NCT00559975试验中看到的结果，具有良好的疾病保护和轻微的疫苗副作用。 IC31是一种新型的两组分TLR9激动剂佐剂，包含一个11-mer抗菌肽（KLKL（5）KLK）和一个不含胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（CpG）基序的合成寡脱氧核苷酸（ODN1a）。这种多核苷酸佐剂已应用于结核病疫苗研究，其中来自两种M.结核菌（Mtb）抗原（Ag85B和TB10.4）的调查性结核病融合蛋白（H4:IC31（AERAS-404））被肌肉注射到60名健康志愿者体内。1/2期临床试验（分别为NCT02066428和NCT02074956）结果显示，H4:IC31（AERAS-404）疫苗耐受性良好，具有优秀的安全特性。与安慰剂组相比，这种H4:IC31（AERAS-404）疫苗在两次剂量给药后，诱导了抗原特异性的CD4+ T细胞反应，并产生了细胞因子（例如，干扰素-γ）。 7.4.脂质体作为佐剂（粘膜粘附性抗原递送系统） 脂质体是球形的小型人工囊泡，由一个（或多个）脂质双层包裹着一个水核心（图6）。脂质体的发现可以追溯到1956年；然而，脂质体作为疫苗递送系统的第一应用直到1974年才出现。脂质体由天然（或合成）的生物可降解、无毒和无免疫原性的磷脂合成，形成水核心。包括古菌质体（用古菌域特有的一个或多个醚脂质制成的脂质体）和阳离子及中性脂质体在内的脂质体，因其大小、生物相容性和物理化学特性，在疫苗应用中得到了广泛使用。脂质体可以根据需要（例如，大小、电荷）进行定制，以增强疫苗的效力，这是通过使用不同的脂质、靶向基团（例如，抗体、蛋白质）、合成/配方程序（允许大小调整/细化）和抗原（例如，DNA、肽）来实现的（图6）。 图6. 脂质体示意图。 在脂质体递送系统中，水溶性化合物（例如，肽、核酸和碳水化合物）被包裹在脂质体的水性内部，而疏水性化合物则位于脂质双层中。通常情况下，根据抗原的性质，它们可以被包裹在亲水核心中，封装在疏水双层中，通过静电结合到脂质体表面，或者通过抗原上的酰链修饰而被吸收。巧合的是，脂质体递送系统保护抗原免受酶降解，提高吸收率，并增强疫苗的生物利用度。脂质体被用来针对特定的细胞位点，以及释放抗原到炎症部位，因此，已经被用于多种疫苗接种途径（例如，皮肤、口服、粘膜和局部）。脂质体与其他类型的佐剂（包括TLR激动剂）结合使用，增加了疫苗候选物的生物稳定性，诱导更强的体液或细胞免疫反应。脂质体作为抗原的递送系统，是有效的免疫刺激剂，增强了抗原对抗原呈递细胞的暴露，并允许CD4+和CD8+细胞的成熟，以及强效的体液或细胞免疫反应。然而，脂质体的可复制配方是一个主要障碍。 脂质基纳米载体已被广泛用作疫苗佐剂，具有在体内传递核酸抗原的能力。由脂质和包裹的核酸组成的脂质基纳米载体（10-500纳米）已克服了系统障碍，控制释放时间，并在注射部位递送抗原。脂质基纳米载体的配方受到脂质组成、核酸与脂质比例和配方方法的影响。阳离子佐剂配方CFA01含有N,N0-二甲基-N,N0-二十八烷基铵（DDA），以及合成的分枝杆菌免疫调节剂α,α0-海藻糖6,60-二苯甲酸酯（TDB）插入到脂质双层中，作为典型的脂质基纳米载体。令人兴奋的是，CFA01激活抗原呈递细胞，诱导B细胞和T细胞分化，具有将抗原呈递给相关细胞群体的能力。CAF01脂质体是高度多分散的多囊泡，平均粒径约为450纳米。CAF01（或CFA01）表面显著带正电，电荷约为+60 mv。CAF01脂质体的脂质膜在生理温度下处于有序固体状态，因为相变温度高于37°C。阳离子脂质体配方CAF01的使用可以追溯到19世纪，目前正参与针对传染病疫苗的临床研究。离子化脂质在低pH值下表达正电荷，而在生理pH值下保持中性。离子化脂质的pH敏感性对疫苗中核酸货物的传递是有益的，因为与中性脂质的血细胞阴离子膜的相互作用较少，增强了脂质纳米颗粒的生物相容性和稳定性。 脂质体佐剂（和/或传递系统）的临床前和临床开发 作为传递系统或佐剂的脂质体已广泛参与传染病疫苗的开发。Ghaffar等人使用阳离子脂质体包裹基于脂肽的A组链球菌（GAS）抗原，通过鼻内途径传递给小鼠。这种GAS疫苗产生的IgA和IgG滴度更高（免疫后5个月检测到），并且与单独的基于脂肽的疫苗相比，产生了更强的粘膜和系统免疫反应。聚乙烯亚胺（PEI）辅助的阳离子脂质体含有GAS肽抗原J8，通过鼻内途径给小鼠。结果表明，高比例的PEI诱导了比低比例PEI更强的免疫反应。Pfs25疫苗是预制的钴卟啉-磷脂脂质体，包裹了重组疟疾蛋白抗原。这种Pfs25疫苗在小鼠和兔子中进行了免疫，导致自发的纳米脂质体抗原特异性化，并诱导了高IgG抗体体液免疫。此外，这种预制的钴卟啉-磷脂脂质体与双TLR配体（GLA [TLR4激动剂]和3M-052 [TLR7/8激动剂]）共给药，被Abhyankar等人评估为COVID-19疫苗（SARS-CoV-2蛋白抗原）[252]。通过鼻内途径传递到SARS-CoV-2K18-hACE2小鼠后，这种双TLR配体脂质体系统的免疫结果产生了更高的IgA滴度，并诱导了比单独抗原更强的粘膜和系统免疫。COVID-19 mRNA-1273是一种脂质纳米颗粒包裹的、核苷酸修饰的信使RNA（mRNA）菌株，编码SARS-CoV-2刺突（S）糖蛋白作为COVID-19疫苗候选物，通过肌肉注射给30,420名志愿者。这个3期临床试验表明，疫苗是可耐受的，没有安全问题，预防COVID-19感染（包括严重疾病）的有效性为94%（NCT04470427）。BNT162b2，辉瑞/BioNTech疫苗是一种COVID-19 mRNA疫苗。核苷酸修饰的mRNA编码SARS-CoV-2全长刺突蛋白被包裹成离子化脂质纳米载体。这种BNT162b2疫苗通过了3期临床试验（NCT 04368728），有43,548名参与者，是安全的，并表达了95%的预防COVID-19流行的有效性，具有保护性抗COVID-19免疫反应。Smith等人进行了基于阳离子脂质的Vaxfectin®佐剂的质粒DNA疫苗的1期临床试验，编码流感病毒H5血凝素（NCT00709800），作为流感疫苗，通过肌肉注射给大约100名健康志愿者。这个临床试验表明，Vaxfectin®辅助的DNA质粒流感疫苗耐受性良好，并刺激了抗体免疫反应，具有大流行控制的保护性免疫。沙眼衣原体是一种热带革兰阴性专性细胞内细菌，是全球细菌性传播疾病的病原体，每年有超过9000万新病例的生殖器C. trachomatis感染。国家筛查项目和抗生素药物不能减少这种疾病的发病率。1期临床试验的新型C. trachomatis重组蛋白亚单位（CTH522）与CAF01脂质体佐剂结合，通过肌肉注射给19至45岁的健康女性志愿者（NCT02787109）。除了在局部注射部位的轻微不良事件外，没有报告严重副作用。这种CTH522:CAF01疫苗产生了更高的IgG滴度，并增强了粘膜抗体谱，与铝佐剂疫苗抗原（CTH522: 铝）相比，细胞介导的免疫反应更为一致。此外，这种CAF01佐剂与包含TB抗原（Ag85B和ESAT-6 (H1)）的重组融合蛋白结合，在1期临床试验中进行了评估（NCT00922363）。在健康志愿者中进行肌肉免疫后，没有观察到局部或系统性副作用。这种疫苗的两剂方案显示出在接种后150周后诱导更强的抗原特异性T细胞反应和疫苗接种后的保护。作为传递系统，脂质体包裹抗原并在作用部位释放。为了优化脂质体佐剂免疫学，通过修改大小和电荷，表面装饰与免疫细胞结合的抗原，并增加体内循环时间来工程化脂质体属性。在这里，包括阳离子脂质体和离子化脂质在内的脂质基纳米载体，它们刺激细胞和体液免疫反应，并具有高佐剂性，已被用于针对人类感染的临床研究。 7.5.多糖作为佐剂 多糖佐剂（包括壳聚糖、葡聚糖、菊粉、甘露聚糖和一些中药）是一种天然聚合物，包含糖苷键合的碳水化合物单体。多糖作为疫苗佐剂，由于其有效的免疫调节、生物相容性、生物可降解性、低毒性和安全性，已广泛参与疫苗开发。多糖已知能激活巨噬细胞和NK细胞，导致细胞因子和促炎趋化因子的产生，并刺激先天免疫反应。此外，多糖作为有效的免疫刺激剂，诱导体液、细胞和粘膜免疫反应，以对抗感染。常见的多糖佐剂包括壳聚糖及其衍生物，如葡聚糖、菊粉和甘露糖。壳聚糖来源于甲壳类动物的外骨骼，具有低毒性、适当的生物相容性和生物可降解性，支持其在生物医学应用中的广泛使用。壳聚糖能够产生促炎趋化因子、各种细胞因子（例如，IL-1、IL-6、TNF），并诱导先天和适应性免疫反应。此外，壳聚糖衍生物（包括壳聚糖季铵盐和N,O-羧甲基壳聚糖）已知能激活系统免疫反应和粘膜免疫反应以对抗感染。葡聚糖佐剂由重复的D-葡萄糖单元组成，通过糖苷键连接，主要来源于植物和微生物。葡聚糖根据其构象分为α-和β-葡聚糖，其中β-葡聚糖是疫苗应用中主要的葡聚糖佐剂，因为它们与受体（例如，TLRs和dectin-1）结合，刺激先天和适应性免疫反应。 菊粉，从菊科植物的根部提取，包含线性的β-D-多果糖基-α-D 葡萄糖[258]。菊粉分为四种不同类型（α、β、γ 和 δ），其中 γ- 和 δ- 菊粉已被证明能诱导细胞和体液免疫。甘露糖，是醛六糖系列碳水化合物的单糖单体，对人类代谢（例如，蛋白质糖基化）很重要。甘露糖（作为佐剂）与巨噬细胞和树突细胞结合，刺激先天免疫，以及 Th1 和/或 Th2 免疫反应。 多糖佐剂的临床前和临床开发 在这个佐剂类别中，壳聚糖是研究用于疫苗开发的主要多糖佐剂，针对传染病。McNeela 等人将壳聚糖与白喉毒素的交叉反应物质（CRM197）共给药，作为通过鼻内途径传递给小鼠的白喉疫苗。这项临床前评估表明，壳聚糖的存在引发了更高水平的 IgG 和 IgA 抗体以及强烈的 Th2 免疫反应。此外，CRM197 白喉毒素加壳聚糖的鼻内免疫在豚鼠中引发了针对白喉毒素的保护性抗体，显示了壳聚糖作为疫苗佐剂的前景。 一种 H5N1 流感疫苗用两种壳聚糖衍生物（壳聚糖的谷氨酸盐，CSN 和壳聚糖的三甲基衍生物，TM-CSN）佐剂化。在雪貂模型中通过鼻内途径给药后，两种疫苗都产生了更高的抗体滴度，强烈的 Th2 和粘膜免疫反应，并显著减少了与单独 H5N1 流感疫苗相比的复制。有趣的是，由于 TMC 的高电荷密度改善了粘膜上皮的细胞旁通透性，TM-CSN 在这项研究中比 CSN 诱导了更高的保护性抗体。 一种单价诺沃克病毒 VLP 针对急性胃肠炎与 MPL/壳聚糖（MPL/壳聚糖-VLP 疫苗）结合，在 2 期临床试验中进行了评估（NCT00973284）。通过鼻内免疫后，与安慰剂组相比，报告了更高的 IgA 抗体和显著减少的疾病/感染。Advax，一种 delta 菊粉佐剂，已在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗试验中使用，诱导了体液和细胞免疫反应。Advax 与灭活 HBV（或酵母表达的重组乙型肝炎表面抗原；HBsAg）（ACTRN12607000598482）的 1 期临床试验与单独的乙型肝炎表面抗原相比是有希望的。此外，与 Advax 佐剂共给药的 HIV-1 疫苗候选物的 1 期临床试验在健康成年人中进行，并且没有显示与疫苗相关的严重不良副作用（NCT00249106）。 多糖作为潜在的佐剂，在疫苗开发中已被分散。然而，多糖的活性以及生产和提取多糖的适当过程仍然大部分未被探索。深入研究多糖结构和生物功能、物理化学性质和多糖结构的修饰可以增强体液或细胞免疫，具有长期保护性免疫反应。 7.6.聚合物纳米粒子佐剂 近年来，聚合物纳米粒子作为载体，在疫苗佐剂的开发中已进行了测试（图 7）。纳米粒子包含纳米胶囊和纳米球，具有不同的形态。纳米胶囊包含来自疫苗候选物的油性核心，被聚合物壳包围，控制核心抗原的释放概况。 图7. 聚合物纳米粒子示意图。纳米粒子 纳米球是一个连续的聚合物网络，其中抗原可以位于内部或吸附在表面。这两种类型的聚合物纳米粒子被定义为储库系统（纳米胶囊）和基质系统（纳米球）。聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是人工聚合物纳米粒子（包裹抗原和/或佐剂）。PLA 和 PLGA 是最常见的生物可降解和生物相容性聚合物颗粒，已获准用于人类使用（包括结构和骨植入物），并得到 FDA 批准。PLA/PLGA 颗粒延长了抗原释放，并减少了长期保护所需的重复剂量数量，从而降低了疫苗接种成本。PLA 和 PLGA 颗粒被用作疫苗佐剂，以提高抗原呈递细胞摄取和 MHC-I 和 MHC-II 处理的效率，导致抗原向 Th1 或 Th2 免疫反应的呈递。尽管 PLA/PLGA 基微粒已被用作疫苗佐剂/传递系统，但封装方法的不适当条件（有机溶剂/水界面、剪切或空化力、冷冻和干燥）显著降解了疫苗抗原。这些问题正在通过优化制造方法或与稳定剂（例如，Mg (OH)2 其他蛋白质、表面活性剂或糖）结合来解决。 聚合物纳米粒子佐剂的临床前和临床开发 聚合物纳米粒子表现出显著的免疫学特性，识别抗原呈递细胞，刺激细胞因子，并为疫苗候选物提供免疫刺激。聚合物纳米粒子是一系列疫苗抗原的有希望的传递系统和佐剂，它们的普及源于它们易于合成、生物相容性、生物可降解性，以及它们是非免疫原性的、无毒的且相当便宜。聚合物纳米粒子的缺点包括微胶囊中抗原的稳定性和最佳剂量问题。存在许多不同类型的聚合物纳米粒子，最常见的类型由壳聚糖、PLGA 和 PLA 组成。PLA 与 HIV p24 蛋白共给药通过静脉途径给药到小鼠。这项临床前评估表明，用 PLA 包裹 HIV p24 抗原诱导了更高的 IgA 滴度和对 HIV 感染的更强 Th1 免疫反应，与单独的 HIV p24 抗原相比。基于 DNA 的 HBV 抗原被包裹在 PLGA 佐剂中作为 HBV 疫苗，传递到小鼠模型。PLGA 佐剂的免疫产生了更高的抗体滴度和强烈的体液免疫反应，与单独的 HBV 疫苗相比。DermaVir，一种实验性的 HIV/AIDS 局部疫苗，由编码 HIV-1 抗原的 DNA 质粒组成，包裹在聚合物佐剂中的纳米粒子大小。 DermaVir通过皮肤准备后，通过贴片经皮给药到36名HIV患者。2期临床试验于2020年完成，结果表明，与安慰剂组相比，DermaVir疫苗安全且耐受性良好，具有持久的HIV特异性免疫反应（NCT00711230）。 聚合物纳米粒子，作为一种常见的传递系统，由于抗原的控制释放以及简单且成本效益高的生产工艺，被用作病原体抗原的佐剂，而最佳剂量问题可以通过适当的给药途径和纳米粒子的修饰来消除。尽管聚合物纳米粒子已在针对感染的疫苗的临床前试验或临床研究中进行了测试，但这种纳米粒子广泛用于抗肿瘤治疗性疫苗或药物。7.7.糖鞘脂作为佐剂 糖鞘脂（GSL）是一类脂质（特别是鞘脂），构成细胞膜的一部分。GSL由疏水性神经酰胺和糖苷键合的碳水化合物部分构成，在免疫动物中表现出免疫原性。最近研究发现，α-连接的单糖神经酰胺（来自海洋海绵和细菌）作为iNKT细胞的配体，与自然杀伤T（NKT）细胞结合，作为iNKT细胞激动剂，并引发细胞因子的分泌。 NKT细胞作为先天免疫和适应性免疫之间的桥梁，是一个小而非常规的T细胞亚群。主要的NKT细胞形成不变的T细胞受体（TCR）x链重排-Vx14Jx18在小鼠中，但在人类中是V-x14Jx18，具有有限的Vβ链多样性，称为不变NKT（iNKT）细胞。与传统的T淋巴细胞不同，它们结合MHC类I和类II分子背景下的肽抗原，iNKT细胞结合由MHC类I相关糖蛋白CD1d分泌的脂质（或糖脂）抗原，迅速分泌细胞因子，介导细胞毒性。分泌的细胞因子诱导NK细胞、巨噬细胞的激活，并与CD40/CD40L相互作用形成成熟的树突细胞，影响先天和适应性免疫。因此，设计适当的iNKT细胞激动剂作为疫苗中的佐剂，能够通过增强体液和细胞免疫反应的幅度来提高疫苗的效力。目前，iNKT细胞激动剂（及其类似物）作为疫苗佐剂已被触发用于传染病和癌症。 糖脂α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer；图8），是软体动物的天然产物，激活iNKT细胞，触发肿瘤细胞上的内源性糖脂质并根除它们，模拟适应性T细胞免疫反应的佐剂特性。 图8. α-半乳糖神经酰胺的结构。糖鞘脂佐剂的临床前和临床开发 Tsujii等人证明，将α-GalCer（见图8）包含在疟疾疫苗中，通过激活iNKT细胞导致分泌Th1型细胞因子（INF-y）和针对疟疾寄生虫的CD8+ T细胞，显著提高了两周内的保护性免疫，与单独的疫苗相比。此外，α-GalCer在HIV疫苗开发中已被评估，目前的研究集中在与α-GalCer（pADVAX）结合的DNA疫苗上。这种pADVAX疫苗在较低的免疫剂量下，刺激了CD4+和CD8+特异性IFN-y反应和高IgG反应，与仅含DNA的疫苗相比。这种降低的疫苗剂量与Ko小组的流感研究一致，该研究发现，α-GalCer与流感病毒疫苗的鼻内共给药增强了强烈的体液、细胞因子和T细胞反应，并且所需的剂量低于单独的抗原。2007年，Youn等人得出结论，通过将α-GalCer作为佐剂与流感病毒疫苗共给药，特异性体液免疫反应得到了增强。此外，基于各种Th2细胞因子（例如，IL-4和IL-5）的释放，免疫细胞介导的反应比单独的疫苗更强。对于流感疫苗，Th1和Th2细胞因子环境都很重要，并且通过添加α-GalCer得到了增强。2017年，一种编码流感A病毒基质蛋白2（M2）的DNA流感疫苗，与α-GalCer佐剂一起，通过肌肉注射给小鼠，导致与单独的DNA疫苗相比，产生了更高的IgG滴度和Ig2a/IgG1比率以及长期保护性免疫。尽管α-GalCer已在流感疫苗的临床前研究中使用，但目前尚无报道与α-GalCer佐剂结合的流感病毒疫苗的临床试验。 Woltman等人将HBV蛋白抗原与合成α-GalCer（KRN 7000）结合，随后通过静脉注射给参与者，1/2期临床试验显示，尽管α-GalCer佐剂耐受性差，但证明了其安全性，并且现在没有合适的佐剂疫苗针对HBV（NCT00363155）。 总体而言，α-GalCer作为佐剂诱导了强大的体液和细胞免疫反应，其中用α-GalCer佐剂化的流感疫苗的临床前研究已在动物模型中进行了测试，尚未过渡到临床试验。α-GalCer在开发针对癌症（例如，肺癌、乳腺癌和白血病）的治疗性疫苗方面具有巨大潜力，无论是在临床前还是临床研究中都取得了显著进展。8.张力活性佐剂 皂苷佐剂，发现于1925年，最初来源于树皮或植物皮肤的粗提取物。然而，在20世纪50年代，皂苷作为对抗口蹄疫病毒的兽医疫苗佐剂后，其发展加快了。 发现皂苷中发现的类固醇的天然糖苷、类固醇生物碱和三萜化合物改变了细胞膜，刺激细胞产生信号因子，从而增强了免疫反应。Quil-A，是从皂角树Quillaja sapomari提取物，及其衍生物是最广泛使用的皂苷作为佐剂目的。由于Quil-A（一种异质混合物）对人体使用过于有毒，从Quil-A中分离和分析各个部分（例如，QS-21；见图9）是用于传染病疫苗（例如，疟疾、肝炎；表2）中最常用的皂苷作为佐剂目的。 图9. QS-21佐剂结构。 皂苷类佐剂（例如，QS-21）有效地产生Th1细胞因子、亲细胞抗体和强烈的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，以诱导体液和细胞反应。这可能是由于抗原呈递细胞的表面凝集素与QS-21的糖区域相互作用，促进了抗原的摄取，从而增强了T细胞和B细胞的反应。在使用QS-21和灭活的Aujeszky病病毒作为抗原的小鼠的临床前研究中，也观察到了平衡的IgG1（通过Th2免疫促进）和IgG2a（由Th1免疫增强）的产生。另外有人提出，QS-21和抗原通过内吞作用被吸收，因为发现QS-21对树突细胞的内体膜胆固醇有很高的亲和力。通过内吞作用的吸收导致刺激CD8+ T细胞和细胞毒性淋巴细胞。尽管QS-21作为疫苗佐剂在过去几十年中取得了显著的成功，但有必要深入理解其作用模式，加速新疫苗的开发。此外，Matrix-M佐剂是一种新的皂苷类似物，从Q. saponins中提取，并与胆固醇和磷脂制成纳米颗粒。Matrix-M佐剂增强了Th1和Th2反应，改善了免疫细胞的迁移，并允许抗原剂量减少，因此，由于其安全性和有效性，已广泛用于临床前和临床疫苗试验。 虽然皂苷佐剂由于其能够产生所需的免疫反应而在疫苗开发中显示出巨大的前景，但由于从天然来源商业规模地持续获取这些化合物是不可持续的，并且缺乏以可复制的方式合成制造它们的技术。还有人指出，这些佐剂的稳定性低，有剂量相关毒性导致不良反应的报告（例如，溶血）。 免疫刺激复合物（ISCOMs）是球形的、开放式笼状结构（40-60纳米大小，图10），当胆固醇、磷脂和Quil-A皂苷（例如，QS-21或其变体）以特定的化学计量通过自组装结合时，它们会自发形成。组装后，使用不同的方法（例如，超速离心、透析、脂膜水合、乙醇注射）产生胶体分散体。作为佐剂中的主要免疫刺激物，Quil-A增强了抗体的分泌和细胞免疫反应。胆固醇的作用是将Quil-A与磷脂结合，形成笼状几何结构，并提高佐剂与细胞膜的亲和力，提出改善抗原呈递细胞对抗原的内吞作用。抗原通过疏水（或静电）相互作用被封装在复合孔中（或绑定在复合表面）形成独特的疫苗传递系统，该系统是抗原特异性的。值得注意的是，当这些佐剂与胆固醇结合时，尽管保留了佐剂能力，但Quil-A皂苷的毒性溶血活性显著降低。 图10. 免疫刺激复合物（ISCOMs）示意图。 QS-21是一种有效的免疫刺激剂，但其局限性包括潜在的剂量相关毒性、低化学稳定性、低提取产量（来自天然来源）以及对其作用机制理解不完全。为了克服这些局限性，过去几十年通过化学合成对QS-21佐剂进行了结构修饰，发现了近50种皂苷类似物。只有微小结构变化的衍生物与一系列疫苗抗原在体内进行了测试，以确定它们的免疫原性和安全性。在QS-21变体的临床前研究中，分析了QS-21的结构-活性关系，以及分子不同区域的免疫刺激潜力。研究发现，通过简化糖酰链改变线性寡糖域创造了更有效的QS-21变体。例如，通过这种结构-活性关系方法发现了低毒性、高稳定性和高佐剂免疫原性的刺囊酸变体74（SQS-1-8-5-18）。Wang等人成功合成了QS-21的非天然类似物。这些非天然皂苷包含一个通过稳定的酰胺键（而不是QS-21中的酰侧链）连接到C3三糖域的脂肪链。这些QS-21类似物在适应性免疫反应期间增强血清抗原特异性IgG反应方面比QS-21更有效。Marciani等人开发了半合成皂苷类似物GPI-0100[280]。这种合成化合物完全去除了原始的酰侧链，随后通过酰胺形成引入了十二碳内酰胺链。GPI-0100引起了体液和细胞免疫反应，与QS-21相比毒性较小。 Matrix-M佐剂与全长SARS-CoV-2刺突（S）糖蛋白结合，被开发为COVID-19疫苗（NVX-CoV2373），其中NVX-CoV2373的1/2期临床试验已完成（NCT04368988）。在欧洲进行了这种疫苗的3期临床试验（EudraCT编号，2020-004123-16），证明两剂NVX-CoV2373疫苗接种是安全的，对症状性COVID-19的有效性为89.7%。 针对致病性禽流感病毒的H5N1疫苗未能在2003年重大爆发后提供满意的粘膜免疫反应，也未能完全阻止疾病的传播。鼻内给药疫苗（AIV-H5N1灭活疫苗）中的抗原是由A/Chicken/Denpasar/01/2004(H5N1)菌株在鸡蛋中产生的，并通过甲醛灭活。ISCOMS-AbISCO-300（ISCOMs的一个亚型）和inmunair（INM：用于动物疫苗的不活跃的丙酸杆菌与脂多糖的混合物）被作为佐剂与相同的AIV-H5N1灭活抗原结合，以增强经鼻内免疫后的免疫原性。在临床前试验中，鸡和老鼠接种了与抗原共给药的INM、与抗原结合的ISCOMs、与INM和抗原结合的ISCOMs，以及单独的抗原。INM和ISCOMs的结合增加了老鼠和鸡的免疫反应，而单独给药的INM没有增强老鼠的免疫反应。ISCOMATRIX（源自ISCOM）已广泛用于人类丙型肝炎病毒和流感。与ISCOMATRIX佐剂结合的H7N9流感病毒的1期临床试验表明，ISCOMATRIX佐剂的添加比单独的H7N9疫苗增强了针对禽流感的更高抗体免疫反应（NCT01897701）。ISCOMATRIX与其他TLR激动剂佐剂（例如，CpG ODN，MPL）结合，作为治疗性或预防性疫苗，也已进行了研究。总体而言，ISCOMs衍生物的免疫原功能及其与其他佐剂结合的强大潜力为未来新型佐剂提供了新的可能性。 9.蛋白酶佐剂  蛋白酶分为不同的家族（例如，半胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸蛋白酶），在蛋白质水解中具有重要作用。木瓜样半胱氨酸蛋白酶（被认为是最丰富的半胱氨酸蛋白酶类型）来源于病毒、细菌、酵母、原生动物、植物和动物，并在活性位点含有亲核的半胱氨酸硫醇。这类蛋白酶刺激Th2免疫反应，是疫苗开发中潜在的佐剂。 蛋白酶佐剂的临床前开发 木瓜样半胱氨酸蛋白酶已在针对血吸虫病的疫苗开发中使用。曼氏血吸虫甘油醛3-磷酸脱氢酶（SG3PDH）、过氧化物酶（TPX）和其他幼虫排泄-分泌产物（ESP）是诱导Th1和Th17免疫反应的血吸虫抗原，但自然感染不具有保护性。Ribi和同事选择了与木瓜结合的重组SG3PDH和TPX衍生肽，注射到小鼠模型中。这项临床前试验表明，半胱氨酸蛋白酶的免疫接种产生了更高的抗体滴度，并增强了Th2类型的免疫反应。半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶作为佐剂，产生高水平的IgE抗体，并诱导Th2免疫反应，这些佐剂已广泛用于对抗过敏反应和哮喘（而不是感染）。 10.结合佐剂系统  佐剂系统（由GlaxoSmithKline开发）是各种经典佐剂和免疫刺激物的组合，以刺激适应性免疫反应对抗病原体。免疫刺激物（例如，铝佐剂、TLR激动剂或QS-21）已与油包水乳液或脂质体结合到佐剂系统中。这些组分相互协同作用，刺激广泛的免疫反应，选定的佐剂组合显示出优越的安全性和免疫原性。目前，各种佐剂系统（包括AS01、AS02、AS03和AS04）已广泛开发，一些已在临床试验中进行，AS01（例如，疟疾疫苗RTS, S或Mosquirix；带状疱疹疫苗HZ/su或Shingrix）、AS03（大流行前H5N1疫苗和大流行H1N1流感疫苗）和AS04（HPV疫苗Cervarix；HBV疫苗Fendrix）已在商业疫苗中使用。结合皂苷-脂质体佐剂系统（AS01）使用MPL作为TLR4激动剂，并包含皂苷QS-21。这个系统增强了CD8+细胞介导的免疫和细胞反应。在这里，MPL直接促进表达TLR4的抗原呈递细胞，激活细胞因子和共刺激分子的分泌。QS-21刺激抗原特异性抗体反应和细胞毒性T细胞免疫反应。AS01需要实现最高的抗原特异性适应性反应。QS-21直接激活抗体免疫反应，通过添加MPL显著增强。AS02佐剂结合了水包油乳液与MPL和QS-21，并已显示出提供主导的细胞反应。QS-21和MPL之间的这种协同作用产生了高水平的IFN-γ，这是CD4型细胞反应的典型细胞因子，其中水包油乳液刺激了体液和细胞免疫反应。AS01和AS02佐剂最初是针对疟疾和带状疱疹的带状疱疹疫苗开发的，它们进入了临床试验（表2）。AS03佐剂系统由基于角鲨烷的水包油乳液组成，添加了DL-α-生育酚（抗氧化剂）和Tween 80（聚山梨醇酯80，作为表面活性剂）（图11）。AS03具有与MF59类似的机制，刺激Th1/Th2细胞，导致体液和细胞免疫反应。此外，AS03还产生趋化因子和促炎细胞因子，这允许免疫细胞（例如，巨噬细胞）的招募，改善抗体的分泌。 图11. (a) 佐剂系统AS03的组成部分（由角鲨烯、聚山梨醇酯80和α-生育酚[一种维生素E]组成）。(b) 作为TLR4激动剂的佐剂系统AS04的MPL结构，与铝混合。 AS04（表2）是一种基于铝的佐剂系统，铝与TLR4激动剂单磷酸脂A（MPL）物理混合，MPL是一种用于人类使用的许可佐剂。AS04已用于开发HPV疫苗，Cervarix(R)。 这种佐剂系统保留了铝的核心佐剂特性，同时也促进了与TLR4激动剂相关的Th1免疫反应，从而产生了更有效的佐剂。MPL（在AS04佐剂中）保持了其结合TLR4的能力，并刺激先天免疫反应，在注射部位激活NF-κB并分泌各种细胞因子和趋化因子。促炎趋化因子和细胞因子促进招募的免疫细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞）分泌，形成成熟的抗原呈递细胞，这些细胞迁移到淋巴结激活Th1和Th2免疫反应。AS04克服了仅刺激Th2免疫反应的铝盐的局限性，以及铝盐既不增强也不抑制的促炎细胞因子的数量。最后，与铝结合使用时，MPL在注射部位刺激的局部细胞因子反应显著延长。组合佐剂系统的临床前和临床开发 在P. falciparum与其人类宿主长期共同进化的过程中，P. falciparum已经发展出多种逃避人类免疫反应影响的方法，这使得疟疾疫苗的开发变得更加困难。其中最大的挑战之一是寄生虫表面多态蛋白表达。FMP2.1/AS02A疫苗候选物包含来自顶端膜抗原1（AMA1）的保守P. falciparum多态蛋白，与AS02佐剂共同给药。2018年在马里完成的FMP2.1/AS02A疫苗的2期临床研究涉及400名1至6岁的儿童，这些儿童被认为比成年对照组有更高的疟疾感染风险（NCT00460525）。作为对照，使用了一种不表达针对P. falciparum的特定抗体的狂犬病疫苗。结果显示，接种FMP2.1/AS02A的儿童诱导了CD4+ T细胞反应。AS02佐剂可能影响了AMA1特异性CD4+ T细胞反应的表型，因为诱导了T细胞反应倾向于Th1（或Th2）反应。佐剂疫苗足以预防大多数类型的P. falciparum感染。 沃尔特里德陆军研究所（WRAIR）和GSK在1987年开发了RTS, S疟疾疫苗。RTS, S疫苗中的“R”代表由N-乙酰神经氨酸-9-磷酸（NANP）氨基酸串联重复四肽组成的中心重复区域。“T”代表T淋巴细胞的免疫优势分离表位，“S”是乙型肝炎的表面抗原。这种RTS, S疟疾疫苗含有环孢子蛋白和佐剂系统（AS01和AS02），并在儿童和婴儿中进行了临床评估。AS02佐剂系统包含含有MPL的水包油乳液和QS-21。与AS03（水包油乳液）和AS04（铝和MPL的组合）佐剂相比，带有AS02的重组蛋白疟疾抗原诱导了更高的抗体水平和针对疟疾的保护性免疫反应。尽管临床结果如此，RTS, S/AS02, AS01（Mosquirix™）作为一种新的组合佐剂系统，由于诱导了抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应和强大的体液免疫，被纳入疟疾疫苗。 2009年，Polhemus等人对高疟疾传播区的成人进行了RTS, S/AS02A和RTS, S/AS01B的2期临床试验，显著说明了RTS, S/AS01B与RST, S/AS02A相比具有更强的免疫原性（NCT 00197054）。因此，RTS, S/AS02的开发被停止，RTS, S/AS01组合佐剂系统被推进到非洲的3期临床试验（NCT00866619）。在这里，RTS, S/AS01疟疾疫苗在婴儿（5至7个月大）注射后大约12个月内将疟疾发病率和严重疟疾减少了约一半，而疟疾死亡率在接种后并没有显著降低。RTS, S/AS01与疟原虫亚单位抗原结合使用，被证明可以分泌抗原特异性免疫球蛋白和CD4+细胞，刺激细胞介导和抗体免疫反应，有效阻断孢子体在肝细胞的定植，保护免受新的P. falciparum感染。然而，这种RTS, S/AS01疟疾疫苗的3期临床试验没有提供足够的保护，由于时间的推移。此外，在年轻测试组中出现了潜在的安全性风险，这意味着需要进一步优化RTS, S/AS01疟疾疫苗，专注于延长免疫原性和消除儿童中的安全问题。 GSK Biologicals的许可HPV疫苗（GSK 580299）在完成1、2和3期临床研究后被证明是安全的、具有免疫原性和有效性的。该疫苗由HPV-16和HPV-18 L1蛋白VLP与AS04佐剂系统（吸附在氢氧化铝盐上的MPL）组成。然而，为了确认疫苗在HIV阳性女性中的有效性（因为这一人群感染HPV的风险更高），在2019年完成了一项4期临床试验（NCT01031069）。在这项试验中，AS04-HPV-16/18疫苗与许可的4vHPV疫苗在546名志愿者中进行了比较，其中一半是HIV阳性女性。来自这项试验的数据表明，AS04-HPV-16/18疫苗比4vHPV疫苗诱导了更高的免疫原性。这个积极的结果也证实了佐剂的重要作用，并提供了一种有效的方法，即使用佐剂结合目标抗原以提高免疫原性。 AS03佐剂与SARS-CoV-2的可溶性灌注稳定化刺突三聚体（preS dTM）结合，作为一种新的COVID-19疫苗候选物，作为两剂给非人灵长类动物接种。这项临床前评估的结果显示，AS03佐剂疫苗引起了强烈的抗体免疫反应，并保护上下呼吸道免受COVID感染。此外，大量分泌的IgG抗体提供了针对SARS-CoV-2感染的保护。此外，与AS03佐剂结合的SARS-CoV-2重组蛋白纳米颗粒疫苗（GBP510）被肌肉注射到328名15至85岁的参与者中。这项1/2期临床试验（NCT04750343）证明，疫苗接种是安全的，耐受性良好，副作用最小。与未佐剂疫苗相比，AS03佐剂疫苗在两次疫苗接种后产生了更高的IgG滴度，并增强了更强的Th2免疫反应和疫苗后保护反应。 为了比较MF59®和AS03的佐剂潜力，进行了一项研究。该研究考虑了pdm09疫苗（针对H1N1），在临床试验中测试了这两种佐剂（NCT00616928）。这项研究在成人和儿童中进行，分为对照组（无佐剂的pdm09疫苗）和测试组（含佐剂的pdm09疫苗）。使用随机对照测试的间接比较meta分析，比较了不同年龄组（包括成人和儿童）中MF59®佐剂、AS03佐剂和未佐剂pdm09疫苗的免疫原性和安全性。在安全性方面，与未佐剂的受试者相比，两种佐剂都增加了注射部位红斑和疼痛的风险。与MF59®相比，AS03在成人测试组中也有更多的疲劳和注射部位疼痛。在儿童中没有记录到安全性的显著差异。佐剂组显示出比各自的对照组更高的免疫反应，AS03证明是有利的。然而，在某些情况下，MF59®在产生免疫学反应方面似乎更有效。因此，AS03是H1N1流感疫苗开发中的有效佐剂。 佐剂系统（AS0x）旨在针对特定年龄群体（例如儿童、老年人和免疫受损人群）诱导对病原体的适应性免疫。AS03和AS04已获得美国和欧洲药品机构的批准，广泛应用于大流行流感疫苗和预防HPV或乙型肝炎病毒的预防性疫苗。AS02佐剂疫苗已在疟疾、乙型肝炎或与癌症免疫治疗联合应用中进行了测试。11.展望和结论 作为有效的免疫刺激剂，佐剂显著改变了疫苗抗原的安全性和有效性。因此，佐剂的开发是疫苗开发中的一个重要变量，在选择佐剂时应全面了解免疫系统和抗原触发的反应。为了充分理解佐剂的容量和定义刺激的免疫反应，对佐剂机制的研究是必不可少的。包括铝、MF59、AS03或AS04在内的传统佐剂，是商业化佐剂，它们在疫苗开发中有广泛的应用。 另一方面，诸如病毒样颗粒、病毒体、脂质体和聚合物纳米粒子等佐剂递送系统，有潜力作为强效的免疫佐剂。这些系统控制抗原释放到特定部位，保护抗原生物活性，并增强抗原循环时间，刺激强效和保护性的适应性免疫反应。然而，这些递送系统的稳定性和毒性以及疫苗的最佳剂量问题是需要克服的重大缺点，通过使用针对性的功能团进行定制工程来克服。 细胞因子、趋化因子、多糖和糖鞘脂已知能诱导体液免疫反应，以及针对感染的细胞免疫反应，同时在抗肿瘤疫苗中也被广泛使用，通过几项临床研究观察到其诱导强效细胞免疫。 佐剂衍生物的发现改进了佐剂选择，可能出现高质量的佐剂。例如，QS-21的新合成工艺是QS-21衍生物的杰出发现；增加具有增强佐剂特性和减少副作用的QS-21衍生物数量是传染病疫苗佐剂设计的重要步骤。此外，从致病细菌中选择和灭活的微生物或细菌佐剂（例如，鞭毛蛋白、脂多糖、霍乱毒素和卡介苗）刺激适应性免疫反应，可能带来意外的副作用。尽管单独使用佐剂可以刺激强烈的适应性免疫反应，但将两种以上的佐剂结合使用，作为一种组合系统，有增加潜力提高疫苗的免疫原性，限制副作用并优化剂量要求，具有成本效益和简单的配方优势。 随着亚单位和合成疫苗使用的增加，对高属性佐剂的需求也在增加。来自不同策略的佐剂突破为佐剂的发展提供了强有力的支持，这些领域内的进步将逐渐允许人们对佐剂有更全面的理解，从而产生更安全、更有效的疫苗。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。