基因治疗领域的病毒载体应用

2024-03-21

基因疗法免疫疗法细胞疗法临床1期

嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769背景介绍基因疗法是将改变特定细胞功能的遗传物质引入患者体内来治疗遗传性疾病的一种手段。基因治疗的关键步骤是通过基因传递载体将基因有效地传递到靶组织/细胞。目前基因传代载体分为两类：病毒载体和非病毒载体，目前基于病毒载体的基因治疗主要通过逆转录病毒、腺病毒（Ad）或腺相关病毒（AAV）的载体将治疗性基因递送到患者体内来实现（图1）。早期由于缺乏对病毒生物学的充分了解导致基于病毒的基因疗法并未取得很好的疗效。图1. 病毒基因治疗方式图示。2021年2月，Jote T. Bulcha1等人在Signal Transduction and Targeted Therapy期刊上发表了一篇名为“ Viral vector platforms within the gene therapy landscape ”的综述，在该综述中，作者详细描述了三种病毒载体平台，大多数基因治疗载体都基于Ads、AAVs和慢病毒（逆转录病毒），本篇将介绍以上三种病毒的结构和感染途径，帮助大家更好地了解病毒载体在基因治疗中的作用。文章内容通常，病毒载体由以下三个部分构成：（1）包裹遗传有效载荷的蛋白质衣壳和/或包膜，并定义载体的组织或细胞亲和性和抗原识别；（2）目的基因，当在细胞中表达时，可以产生预期的效果；和（3）“调控盒”，即控制转基因作为游离体或染色体整合子的稳定或瞬时细胞表达的增强子/启动子/辅助元件的组合。每个病毒载体平台这三个组件的设计都是不同的，有各自的优势和劣势。1腺病毒载体（Adenovirus vectors）|大容量的瞬时目标基因传递结构和基因组：Ads是一种无包膜病毒，主要引起上呼吸道感染，也可以感染其他器官，如大脑和膀胱。它具有二十面体蛋白衣壳，可容纳26至45kb的线性双链DNA基因组。Ads基因组两侧是长度不同（末端为30–371 bp）的发夹状反向末端重复序列（ITRs）。 ITRs作为自启动结构，可促进引物酶非依赖性 DNA复制。病毒基因组包装需要位于基因组左臂的包装信号。Ads基因组编码约35种蛋白质，这些蛋白质在病毒基因转录的早期和晚期表达。Ads基因组包括五个所谓的“早期”基因组成，即E1A、E1B、E2、E3和E4（图2）。图2. 野生型腺病毒5型（Ad5）基因组和常见的基于Ad5的载体的遗传修饰的示意图。感染途径：迄今为止，已经鉴定出一百多种人类Ad基因型，分为A到G七个亚组，对Ad感染途径的认识主要基于人Ad5 （HAd5）。感染开始于细胞表面定位的柯萨奇病毒- Ad受体（CAR）和病毒衣壳纤维远端结构域之间的相互作用。此外，还发现了许多其他的Ad受体，如CD46、DSG2和唾液酸。病毒与细胞表面受体结合后发生内吞作用，内吞作用是由五邻体上的三肽Arg - Gly - Asp （RGD）基序与宿主细胞表面的αV整合素之间的相互作用所介导的。内吞作用后，衣壳被分解，V和VI蛋白促进内体逃逸。病毒DNA随后通过核膜孔进入细胞核，此外，部分被破坏的病毒粒子的六邻体与动力蛋白马达结合，帮助病毒通过微管网络运输到核孔进入细胞核，病毒DNA主要保持表染色体状态，不整合进宿主细胞基因组中。2腺相关病毒载体（Adeno-associated Virus vectors）|一个有着巨大潜力的病毒载体结构和基因组：AAV于1965 年由鲍勃-艾奇逊（Bob Atchison）作为腺病毒制剂的污染物发现。由于它依赖腺病毒或任何可以发挥辅助功能以完成其生命周期的病毒，因此被归类为依赖性细小病毒。AAV缺乏复制和表达其自身基因组所需的基本基因，这些基本功能可由Ad的 E1、E2a、E4和VA基因提供。AAV基因组本身是单链DNA，包含四个已知的开放阅读框（ORF）。第一个ORF编码四个复制基因（Rep），该复制基因以其分子量命名：Rep40、Rep52、Rep68和Rep78。第二个ORF分别编码三种病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。第三个和第四个是嵌套亚基因组mRNA，命名为组装激活蛋白（AAP），其参与衣壳单体到发生衣壳组装的核仁穿梭过程；以及最近发现的功能尚不完全清楚的膜相关辅助蛋白（MAAP）。基因组全长为4.7kb，基因组两侧是含有145个碱基的 ITR（图3）。ITRs作为复制的自启动结构，并为Rep介导的包装提供信号。AAV衣壳是一个T=1、二十面体、60聚体的衣壳，VP1、VP2和VP3亚基分别以1∶1∶10的比例组成。组装衣壳的最佳特征是形成Rep结合的面五重对称轴，并包含五重孔，其中DNA在Rep介导的ATP酶活性下插入衣壳；以及由包括可变环区V、VII、VIII和IV的三重突起限定的三重对称轴。图3. AAV基因组示意图及PCR筛选位点。感染途径：我们对AAV感染途径的了解仅基于少数血清型。目前普遍的理解是血清型与不同细胞的表面糖蛋白受体和次级受体结合可能具有不同的亲和力。在与细胞表面结合后，网格蛋白介导的内吞作用被触发，AAV颗粒随后在内体囊泡中传递，并通过晚期内体和溶酶体区室传递。由于这些囊泡的低pH环境，衣壳发生构象变化暴露VP1/2结构，VP1独特区域（包含磷脂酶结构域）逃离核内体或溶酶体区室，然后通过VP2上发现的核定位信号穿梭进入细胞核。一旦进入细胞核，AAV基因组就会合成第二链，形成基因转录所需的双链基因组结构。3慢病毒载体（Lentivirus vectors）|用于基因修饰细胞治疗的强大载体结构和基因组：慢病毒属于逆转录病毒，逆转录病毒是球形、有包膜的单链RNA病毒，直径约100 nm。慢病毒颗粒包裹两个与核衣壳蛋白结合的正义链RNA。该颗粒还含有逆转录酶、整合酶和蛋白酶蛋白。慢病毒HIV-1的全长为9.7 kb，其两侧是5 '和3 ' LTR，主导病毒基因组复制。LTR由特有的U5和U3序列，以及两端共有的R序列组成。顺式作用序列，也被称为psi，位于LTR外。逆转录病毒具有共同的基本核心蛋白基因，如gag、pol和env.gag基因编码保护性衣壳和基质蛋白，env基因携带决定病毒细胞趋向性的跨膜和包膜糖蛋白的信息，pol基因转录逆转录酶和整合酶。慢病毒有额外的基因tat和rev，tat通过与LTR结合来辅助转录的激活和RNA聚合酶II的延伸。rev通过与环境基因区域的基序结合来协调剪接和未剪接的病毒RNA的核输出。另外的辅助基因如：vif、vpr、vpu和nef，可以提高病毒滴度和促进病毒的发病机制（图4）。图4. 第三代hiv -1慢病毒载体设计。感染途径：慢病毒颗粒进入宿主细胞是由固定在外膜上的糖蛋白与特定细胞受体之间相互作用介导的。与细胞表面受体的成功结合会引发一系列事件，导致病毒颗粒脂质双分子层与细胞融合，随后将病毒遗传货物递送到细胞质中。慢病毒DNA以非随机整合的方式整合到宿主基因组中，并优先选择转录活性位点。讨论在这篇综述中，作者讨论了病毒载体的现状，特别是基于Ad、AAV和慢病毒的病毒载体，指出基于病毒载体的未来是光明的，解决许多人类遗传疾病的能力是可以实现的，但目前掌握的方法仍然存在一些缺点，需要进一步探索病毒生物学以及跨学科的方法来克服当前的挑战。参考文献Bulcha J T, Wang Y, Ma H, et al. Viral vector platforms within the gene therapy landscape[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2021, 6（1）: 53.嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!