背景
一直以来,黄芪在中医和现代医学中被广泛研究。在中医理论中,黄芪主要功能是“补气固表、利水消肿、托毒生肌、排脓生肌”。对肿瘤患者而言,中医多认为,正气不足是肿瘤发生与复发的重要内因;黄芪可“补气扶正”,增强机体抵抗力;在放化疗后,可“益气养阴”,缓解“气阴两虚”引起的乏力、食欲差、免疫低下等症状。
黄芪在肿瘤治疗中的潜在作用如下:
1、免疫调节:黄芪含多糖、皂苷等成分,可能激活免疫细胞(如T细胞、NK细胞),增强机体抗肿瘤免疫应答[1] 。
2、减轻副作用:部分研究表明,黄芪可缓解放化疗导致的乏力、骨髓抑制(如白细胞减少)及胃肠道反应,提升患者生活质量[1] 。
3、抗氧化与抗炎:黄芪的抗氧化成分可能减少自由基损伤,抑制慢性炎症微环境,间接辅助抑制肿瘤进展[1] 。
黄芪制品(黄芪外泌体)是从药食同源黄芪植物中提取的纳米级细胞外囊泡,在恶性肿瘤干预领域中具有潜在价值,应用领域广泛。
摘要
利用斑马鱼模型评价黄芪制品(黄芪外泌体)抗肺癌、抗乳腺癌功效实验,分别将荧光标记的肺癌A549肿瘤细胞、乳腺癌MCF-7肿瘤细胞注射到斑马鱼体内建立斑马鱼肿瘤移植模型。通过这种方法,许多肿瘤细胞类型可以被移植到斑马鱼中,并研究癌细胞分化,增殖和迁移的机制,以及治疗。斑马鱼幼鱼具有光学透明性的特性,可以直观地观察肿瘤的增殖、迁移或者药物分布等。经斑马鱼模型实验验证,黄芪制品(黄芪外泌体)具有抗肺癌、抗乳腺癌功效,并通过基因表达量分析,黄芪制品(黄芪外泌体)的基因il6相对表达量与模型对照组相比,显著降低,浓度为250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL的黄芪制品(黄芪外泌体)分别降低23.73%、43.25%、50.66%的基因il6相对表达量,揭示了黄芪制品(黄芪外泌体)具有抗肺癌、抗乳腺癌功效。
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前 言
肺癌是所有癌症类型中死亡率最高的疾病之一,其高死亡率主要是由于当前治疗效率低下,很少能使患者获得长期缓解,同时缺乏准确判断全身传播风险的诊断技术。因此,为非小细胞肺癌患者开发新的药物和诊断技术尤为重要,这促使了大量非小细胞肺癌(NSCLC)模型的研究,斑马鱼肺癌模型就是其中之一。
同时,乳腺癌已成为威胁我国女性健康的首要恶性肿瘤,发病率持续攀升且呈年轻化与老龄化并存特征,构成重大公共卫生挑战。数据显示,其在我国女性恶性肿瘤中发病率居前两位。这种高发病、年龄跨度大的态势,使得乳腺癌的基础机制研究、新型药物研发及早期干预技术突破的需求极为迫切。
目前关于黄芪制品(黄芪外泌体)直接抗肺癌及抗乳腺癌的高影响因子文献较少,但有一些相关研究为黄芪制品(黄芪外泌体)抗肺癌及抗乳腺癌的功效提供了一定的理论基础。《基于蛋白质组学的黄芪多糖对 TLR4 激活的肺癌细胞来源外泌体的作用研究》中,研究采用超速离心法,对Toll 样受体4(TLR4)激活的肺癌细胞H460 炎症状态组和黄芪多糖(APS)缓解组H460 细胞释放的外泌体进行提取,通过非标记蛋白质组学方法分析,发现有111 个蛋白质表达量在炎症状态组和APS 缓解组均有显著变化,关键差异蛋白包括纤溶酶原激活物抑制剂- 1、层黏连蛋白α5、层黏连蛋白α1 和CD44 等,提示APS 可能通过TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路或调节细胞外基质影响炎症微环境,从而发挥抗肿瘤作用[2] 。《Extract from Astragalus membranaceus inhibit breast cancer cells proliferation via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway》的研究显示,黄芪提取物通过PI3K/AKT/mTOR 途径抑制乳腺癌细胞增殖[3] 。
1
利用斑马鱼模型评价黄芪制品(黄芪外泌体)抗乳腺癌功效
1.1 材料及方法
1.1.1 动物饲养及处理
成年斑马鱼饲养于循环水系统中,环境温度维持在28°C,光照周期设置为14小时(h)光照/10 h黑暗,每日定时投喂3次。为获取胚胎,将性成熟斑马鱼按雌雄1:1比例于晚间配对,并以挡板分隔;次日光照周期开始1 h内移除挡板,使其自然产卵。收集的胚胎置于含0.3 ppm亚甲基蓝的1 × E3溶液(培养皿直径10 cm)中,于28.5°C人工气候箱(14 h/10 h光照/黑暗)中培养至实验处理阶段。
1.1.2 仪器、耗材与试剂
分析天平(ME204,METTLER TOLEDO,Switzerland);电动荧光变倍显微镜(Axio Zoom.V16,ZEISS,Germany);体视显微镜(Stemi 508,ZEISS,Germany)生化培养箱(SPX-250B-Z型,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司,China)。
细胞膜橙红色荧光探针(CM-Dil,Lot: KS378662,上海源叶生物科技有限公司,China);甲基纤维素(Lot: E2218153,阿拉丁,China);RNA提取试剂盒(Lot: 7E2140C5,诺唯赞,China);逆转录试剂盒(Lot: 7E0650B4,诺唯赞,China);qPCR mix(Lot: 7E0790D4,诺唯赞,China);二甲基亚砜(DMSO,Lot: BCCD8942,Sigma,Switzerland)。
1.2 MTC摸索
实验分组:正常对照组、模型对照组(200个肿瘤细胞)、黄芪制品(黄芪外泌体,以下称为黄芪外泌体)组(设5个浓度梯度:2000 μg/mL、1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL,共7组)。
处理方法:随机选取受精后2天(2 dpf)斑马鱼在6孔板(3 mL/孔)中进行试验,每孔30尾鱼。模型对照组、黄芪外泌体组均注射200个肿瘤细胞A549,孵育24 h后,黄芪外泌体组分别加入不同浓度的黄芪外泌体溶液,处理48 h后,记录每孔死亡率。
1.3 抗乳腺癌
实验分组:模型对照组(200个乳腺癌细胞MCF-7)、他莫昔芬(2 μM)、黄芪外泌体组(浓度为:250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL)。
处理方法:随机选取受精后2天(2 dpf)斑马鱼在6孔板(3 mL/孔)中进行试验,每孔30尾鱼。模型对照组和黄芪外泌体组均注射200个肿瘤细胞MCF-7,建立乳腺癌模型。孵育24 h后,他莫昔芬组加入2 μM的他莫昔芬溶液,黄芪外泌体组分别加入不同浓度的黄芪外泌体溶液。处理48 h后,于荧光显微镜下拍摄图像,通过统计斑马鱼乳腺癌细胞荧光强度,来评估黄芪外泌体抗肿瘤(乳腺癌)的功效。
1.4 统计分析
数据分析采用GraphPad Prism 8.0统计软件。计量资料以均数±标准误(mean ± SEM)表示。两组之间比较采用独立样本t检验。p < 0.05为差异有统计学意义。
1.5 实验结果
1.5.1 MTC摸索
通过对斑马鱼48 h的暴露处理,黄芪外泌体于2000 μg/mL(在该浓度下斑马鱼服用剂量过大导致了死亡,并非毒性致死)浓度时死亡尾数超过10%。所以,黄芪外泌体对斑马鱼的MTC可确定为1000 μg/mL。详见表1。
表1 黄芪外泌体浓度摸索实验结果(n = 30)
1.5.2 抗乳腺癌
结果显示,在处理48 h后,黄芪外泌体的斑马鱼乳腺癌细胞荧光强度与模型对照组相比,显著降低,浓度为250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL的黄芪外泌体分别降低49.80%、51.53%、49.33%斑马鱼乳腺癌荧光强度,揭示了黄芪外泌体具有抗肿瘤(乳腺癌)功效,详见表2、图1。
表2 黄芪外泌体抗乳腺癌实验结果(n = 10)
与模型对照组比较,*代表p < 0.05、**代表p < 0.01。
A
B
C
图 1 黄芪外泌体处理48 h后斑马鱼乳腺癌细胞荧光强度和抗乳腺癌功效
(A)黄芪外泌体处理后斑马鱼乳腺癌细胞荧光强度典型图;(B)黄芪外泌体处理后斑马鱼乳腺癌荧光强度(像素);(C)黄芪外泌体处理后抗肿瘤(乳腺癌)功效(%)。t检验分析方法做统计学差异:*代表p < 0.05,**代表p < 0.01。
1.6 实验结论
在本次实验条件下,黄芪外泌体具有抗乳腺癌功效,通过数据分析表明黄芪外泌250μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL(对应人用剂量为6 g)分别可降低49.80%、51.53%、49.33%乳腺癌细胞荧光强度。
2
利用斑马鱼模型评价黄芪制品(黄芪外泌体)抗肺癌功效
2.1 材料及方法
2.1.1 动物饲养及处理
成年斑马鱼饲养于循环水系统中,环境温度维持在28°C,光照周期设置为14小时(h)光照/10 h黑暗,每日定时投喂3次。为获取胚胎,将性成熟斑马鱼按雌雄1:1比例于晚间配对,并以挡板分隔;次日光照周期开始1 h内移除挡板,使其自然产卵。收集的胚胎置于含0.3 ppm亚甲基蓝的1 × E3溶液(培养皿直径10 cm)中,于28.5°C人工气候箱(14 h/10 h光照/黑暗)中培养至实验处理阶段。
2.1.2 仪器、耗材与试剂
分析天平(ME204,METTLER TOLEDO,Switzerland);电动荧光变倍显微镜(Axio Zoom.V16,ZEISS,Germany);体视显微镜(Stemi 508,ZEISS,Germany);全自动样品快速研磨仪(JXFSTPRP 24 h,上海净信实业发展有限公司,China);冷冻离心机(TGL-16.5M,上海卢湘仪离心机仪器有限公司,China);全自动核酸提取仪(Auto Pure32A,杭州奥盛仪器有限公司,China);普通PCR扩增仪(T100TM Thermal Cycler,BIO-RAD,USA);超微量分光光度计(NanoPhotometer N60,IMPLEN,Germany);实时定量PCR仪(CFX connect,BIO-RAD,USA);生化培养箱(SPX-250B-Z型,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司,China)。
细胞膜橙红色荧光探针(CM-Dil,Lot: KS378662,上海源叶生物科技有限公司,China);甲基纤维素(Lot: E2218153,阿拉丁,China);RNA提取试剂盒(Lot: 7E2140C5,诺唯赞,China);逆转录试剂盒(Lot: 7E0650B4,诺唯赞,China);qPCR mix(Lot: 7E0790D4,诺唯赞,China);二甲基亚砜(DMSO,Lot: BCCD8942,Sigma,Switzerland);基因引物(见表3,擎科,China)。
表3 斑马鱼免疫相关基因qPCR引物序列
2.2 MTC摸索
实验分组:正常对照组、模型对照组(200个肿瘤细胞)、黄芪制品(黄芪外泌体,以下称为黄芪外泌体)组(设5个浓度梯度:2000 μg/mL、1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL,共7组)。
处理方法:随机选取受精后2天(2 dpf)斑马鱼在6孔板(3 mL/孔)中进行试验,每孔30尾鱼。模型对照组、黄芪外泌体组均注射200个肿瘤细胞A549,孵育24 h后,黄芪外泌体组分别加入不同浓度的黄芪外泌体溶液,处理48 h后,记录每孔死亡率。
2.3 抗肺癌
实验分组:模型对照组(200个肺癌细胞A549)、甲氨蝶呤组(200 μM)、黄芪外泌体组(浓度为:250 μg/ml、500 μg/ml、1000μg/ml)。
处理方法:随机选取受精后2天(2 dpf)斑马鱼在6孔板(3 mL/孔)中进行试验,每孔30尾鱼。模型对照组、甲氨蝶呤组和黄芪外泌体组均注射200个肿瘤细胞A549,建立肺癌模型。孵育24 h后,甲氨蝶呤组加入200 μM的甲氨蝶呤溶液,黄芪外泌体组分别加入不同浓度的黄芪外泌体溶液。处理48 h后,于荧光显微镜下拍摄图像,通过统计斑马鱼肺癌细胞荧光强度,来评估黄芪外泌体抗肿瘤(肺癌)的功效。
2.4 抗肿瘤(基因相对表达量)
实验分组:模型对照组(200个肺癌细胞A549) 、黄芪外泌体组(浓度为:250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL)。
处理方法:随机选取受精后2天(2 dpf)斑马鱼在6孔板(3 mL/孔)中进行试验,每孔30尾鱼。模型对照组和黄芪外泌体组均注射200个肿瘤细胞A549,建立肺癌模型。孵育24 h后,黄芪外泌体组分别加入不同浓度的黄芪外泌体溶液,处理48 h后,提取斑马鱼总RNA并反转录为cDNA,使用qPCR方法检测内参基因β-actin以及基因il6的表达水平,以评估黄芪外泌体的抗肿瘤。
2.5 统计分析
数据分析采用GraphPad Prism 8.0统计软件。计量资料以均数±标准误(mean ± SEM)表示。两组之间比较采用独立样本t检验。p < 0.05为差异有统计学意义。
2.6 实验结果
2.6.1 MTC摸索
通过对斑马鱼48 h的暴露处理,黄芪外泌体于2000 μg/mL(在该浓度下斑马鱼服用剂量过大导致了死亡,并非毒性致死)浓度时死亡尾数超过10%。所以,黄芪外泌体对斑马鱼的MTC可确定为1000 μg/mL。详见表4。
表4 黄芪外泌体浓度摸索实验结果(n = 30)
2.6.2 抗肺癌
结果显示,在处理48 h后,黄芪外泌体的斑马鱼肺癌细胞荧光强度与模型对照组相比,显著降低,浓度为250 μg/ml、500 μg/ml、1000 μg/ml的黄芪外泌体分别降低61.16%、74.63%、73.33%斑马鱼肺癌细胞荧光强度,揭示了黄芪外泌体具有抗肿瘤(肺癌)功效,详见表5、图2。
表5 黄芪外泌体抗肿瘤(肺癌)实验结果(n = 10)
与模型对照组比较,***代表p < 0.001。
A
B
C
图 2 黄芪外泌体处理48 h后斑马鱼肺癌细胞荧光强度和抗肺癌功效
(A)黄芪外泌体处理后斑马鱼肺癌细胞荧光强度典型图;(B)黄芪外泌体处理后斑马鱼肺癌荧光强度(像素);(C)黄芪外泌体处理后抗肿瘤(肺癌)功效(%)。t检验分析方法做统计学差异:***代表p < 0.001。
2.6.3 抗肿瘤(基因相对表达量)
结果显示,在处理48 h后,黄芪外泌体的基因il6相对表达量与模型对照组相比,显著降低,浓度为250 μg/ml、500 μg/ml、1000 μg/ml的黄芪外泌体分别降低23.73%、43.25%、50.66%基因il6相对表达量,详见表6、图3。
表6 黄芪外泌体抗肿瘤实验结果(n = 3)
与模型对照组比较,*代表p < 0.05、***代表p < 0.001。
图3 黄芪外泌体处理48 h后斑马鱼il6基因相对表达量
t检验分析方法做统计学差异:*代表p < 0.05、***代表p < 0.001。
2.7 实验结论
在本次实验条件下,黄芪外泌体具有抗肺癌功效,通过数据分析表明黄芪外泌体250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL分别可降低61.16%、74.63%、73.33%斑马鱼肺癌细胞荧光强度;降低23.73%、43.25%、50.66%基因il6相对表达量。
3
讨 论
斑马鱼作为肿瘤研究模型,核心优势集中在以下六方面:1)遗传保守性高:与人类基因同源性达87%,机制原理高度一致,研究结果易外推至人类。2)繁殖发育高效:单对亲鱼每周产卵200-500枚,适合大规模研究。3)表型易观察:胚胎及幼鱼通体透明,可活体实时观察黑色素沉积、晶状体混浊等宏观表型,结合荧光标记还能追踪细胞凋亡、线粒体变化等微观特征,行为表型(如运动能力)也可量化分析。4)实验操作便捷:CRISPR/Cas9等遗传编辑技术成熟,可快速构建基因模型;药物干预仅需溶于水体即可给药,适合高通量筛选。5)实验成本低:体型小、饲养成本低。6)独特研究价值:该模型完美结合了哺乳动物体内研究的生理相关性,并且斑马鱼胚胎和幼鱼在早期发育阶段身体完全透明,可以直接在高分辨率显微镜下实时、动态地观察肿瘤细胞的增殖、迁移全过程。近几年来,斑马鱼模型越来越多地可以用于筛选凋亡和抗血管生成活性药物。在临床研究中,生存期是医生结合患者的病情、身体情况等对其还能生存多久进行的一个粗略的判断,提升癌症患者的生存期在临床研究中具有重要意义。
利用斑马鱼模型评价黄芪制品(黄芪外泌体)的抗肺癌、抗乳腺癌功效研究,充分揭示了黄芪制品(黄芪外泌体)抗肺癌以及抗乳腺癌的潜力和价值。
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结语与展望
本研究基于斑马鱼肿瘤模型系统性评估了黄芪制品(黄芪外泌体)对乳腺癌与肺癌细胞的抑制作用。实验结果表明,黄芪制品(黄芪外泌体)能够显著降低肿瘤细胞荧光信号强度,并在一定剂量范围内呈现明确的抑制趋势,同时伴随炎症相关因子(如IL-6)表达的下调。
从机制层面推测,黄芪制品(黄芪外泌体)中的活性成分可能通过影响肿瘤细胞信号通路、调节免疫反应以及诱导凋亡等方式发挥综合抗肿瘤效应。未来研究可进一步结合转录组、蛋白质组及miRNA组学技术,深入揭示其作用通路与关键分子网络。同时,需通过小鼠及灵长类动物模型开展系统的药代动力学、安全性及免疫原性评价,为后续临床研究提供实验依据。
在应用前景方面,黄芪制品(黄芪外泌体)具备天然来源、安全性高及递送效率良好的特征,具有发展成为新型天然外泌体药物或功能性纳米载体的潜力。未来的研究方向可包括优化提取纯化工艺、建立质量控制标准、探索不同给药途径以及联合放化疗或免疫治疗的协同效应。
综上所述,黄芪制品(黄芪外泌体)在抑制乳腺癌与肺癌方面展现出显著的潜能,为植物来源外泌体在肿瘤研究领域的应用奠定了实验基础。后续的机制解析与临床前研究将进一步推动其向精准化、系统化和可转化方向发展,助力中药现代化与天然生物纳米制剂研究的新进程。
参考文献
[1] 曾雯,周胜强,黄佳,等.黄芪免疫调节活性成分及其药理作用进展[J].上海中医药杂志,2025,59(01):80-88.DOI:10.16305/j.1007-1334.2025.z20240926003.
[2] 胡康蝶,杨凯歌,SOUMIA Cheddah,等.基于蛋白质组学的黄芪多糖对TLR4激活的肺癌细胞来源外泌体的作用研究[J].中国中药杂志,2022,47(21):5908-5915.DOI:10.19540/j.cnki.cjcmm.20220613.707.
[3] Ruijuan Z ,Hongjiu C ,Junpeng C , et al.Extract from Astragalus membranaceus inhibit breast cancer cells proliferation via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.[J].BMC complementary and alternative medicine,2018,18(1):83.DOI:10.1186/s12906-018-2148-2.
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