Berberine Chloride Hydrate

2026 年 4 月 21 日，来自华东理工大学的Wen Lv，Yunhao Li和Shijie Wang等人在Biotechnology Advances上发表了一篇题为The industrial yeast Komagataella phaffii blooms for advanced biomanufacturing的综述性论文。 Abstract 工业酵母Komagataella phaffii正逐渐崛起为先进生物制造领域的一种多功能底盘生物。本文系统总结了该酵母在重组蛋白表达传统角色之外的最新开发进展及其日益广泛的应用。研究表明，K. phaffii在食品、饲料、生物材料、生物制药及工业酶制剂等领域，作为可持续的单细胞蛋白来源和生产大宗重组蛋白的优势宿主，展现出巨大潜力。除蛋白质表达外，该酵母在多种天然产物（包括黄酮类、生物碱、萜类、聚酮化合物等）的生物合成方面也表现出良好的应用前景。其灵活的代谢网络使其能够利用可持续的C1和C2底物，从而支持面向低碳及可持续生物经济的生物制造。这些进展得益于遗传工具箱方面的实质性创新，特别是基于CRISPR的基因组编辑、合成启动子工程、可编程表达系统以及基因组规模代谢模型，这些工具显著提升了菌株工程改造的精确性与效率。尽管优势显著，但在实现超高蛋白产量、开发适用于食品应用的人源化糖基化策略、提高细胞应激耐受性以及改善有毒天然产物的合成等方面仍面临挑战。通过整合代谢工程与系统生物学方法来解决这些局限性，对于将K. phaffii打造为下一代先进生物制造的工业主力菌株至关重要。 Introduction 全球人口持续增长，预计到2050年将达到100亿，这将给传统的农业和工业制造系统带来巨大挑战，并引发严峻的全球气候与环境问题。先进生物制造被公认能够为这些问题提供替代解决方案，从而在食品、医疗保健、环境、能源和可持续发展领域开启新的机遇。然而，与传统的农业或化学制造相比，先进生物制造仍面临低成本和大规模生产的挑战，目前尚无法满足工业需求。 先进生物制造通常利用合成生物系统生产具有商业价值的重要分子（无论是天然的还是工程化的），用于农业、食品、能源、材料、制药等工业领域。高产量的工程化细胞工厂（例如微生物、植物和动物）被视为先进生物制造的“芯片”，尤其是对于大宗产品而言；而高效、安全的底盘宿主及其配套的工具系统则被比喻为“光刻机”，代表了整个生物制造链中的核心瓶颈和创新源泉。近年来，在可量化、可预测等明确科学原理的指导下，合成生物学和人工智能正在推动对生物体的定量理解、系统性重塑乃至从头构建的范式转变。近年来，合成生物学的理论框架和方法学工具得到了极大的完善，为人工修饰和重构非天然生物系统奠定了基础。 然而，大多数理论探索和技术进步都局限于大肠杆菌和酿酒酵母等模式生物，大量专门的底盘菌株仍未得到充分探索。这一局限性主要源于非模式宿主遗传背景不完全清楚以及对其生理生化机制研究不足等挑战。然而，不同底盘生物独特的遗传结构通常赋予其独特的生理特性和生物学功能，使其适用于特定的应用场景。因此，揭示非模式菌株中生物元件的运行原理并重构其生物系统，对于拓展生物制造的理论和应用前沿也具有重大意义。 在新兴的非模式底盘生物中，甲基营养型酵母因其能够利用甲醇作为唯一碳源和能源而受到广泛关注。特别是，毕赤酵母被开发成一个强大的蛋白质表达平台，尤其是在20世纪80年代鉴定出如醇氧化酶1（AOX1）启动子等强效甲醇诱导型启动子之后。这些启动子促成了著名的毕赤酵母表达系统的建立，此后该系统成为学术研究和工业生物技术中重组蛋白生产应用最广泛的酵母平台之一。基因组测序、系统生物学和基因工程的持续进步进一步扩展了该平台在生物制造中的应用。历史上，这个强大的系统所包含的菌株后来被重新分类为Komagataella phaffii和Komagataella pastoris。其中，K. phaffii已成为近期研究中使用最广泛且特征最清晰的物种。它是一种获得美国食品药品监督管理局认证的公认安全（GRAS）菌株。作为真核宿主，K. phaffii支持正确的蛋白质折叠和温和的翻译后修饰，这对于生物制药和功能性食品蛋白的功能性有时至关重要。此外，其强大的目标蛋白分泌能力以及有限的内源性分泌副产物，常能减少非目标蛋白的干扰，有利于下游纯化过程。其广泛的原料底物谱和高细胞密度也使其在大规模工业生产中具有优势。尽管如此，其蛋白质生产能力仍需新的突破以满足大宗产品的工业化水平。另一方面，该酵母已迅速成长为一个高潜力的化学品生物合成宿主，具有强大的多酶胞内表达能力，并且与来自细菌或高等真核生物的酶具有良好的兼容性。它已展现出在天然产物和平台化合物的生物制造中发挥重要作用的潜力。 尽管具有这些优势，若干挑战仍然限制了K. phaffii在先进生物制造中的更广泛应用。该宿主的蛋白质生产能力仍需进一步提高，以满足大规模大宗产品的工业需求。此外，复杂天然产物的代谢通量往往仍然不足，限制了对高价值化合物的高效生物合成。与过程相关的挑战，如大规模发酵优化和甲醇相关的毒性问题，也需要解决。此外，利用更新的基因工程工具箱提高可持续底物的利用效率，对于推进循环生物基制造至关重要。 在本综述中，总结了K. phaffii在先进生物制造领域的最新进展。系统梳理了其在饲料、食品和生物材料领域中作为单细胞蛋白和大宗重组蛋白的应用。阐述了其在利用可持续C1-C2碳源以及合成高附加值化合物方面的优势。进一步讨论了使其能够实现高效生物生产的基因编辑与调控方法。最后，提出了K. phaffii在先进生物制造中的未来机遇与挑战。 1. K. phaffii 的发展历程 K. phaffii的发展历程是分子生物学和生物技术史上一段引人入胜的旅程。20世纪50年代，Herman Phaff及其同事从加利福尼亚的橡树中分离出相关菌株，并将该物种重新命名为毕赤酵母。在20世纪60和70年代，该酵母被鉴定能够利用甲醇作为唯一碳源和能源，随后被菲利普斯石油公司作为单细胞蛋白进行工业应用探索。20世纪80年代，基于醇氧化酶及相关甲醇诱导型启动子的鉴定，它被开发成一个诱导型表达系统。伴随重组蛋白的快速发展，生物过程研究因此受到广泛关注。20世纪90年代，毕赤酵母被重新分类为Komagataella新属，生物技术研究中常用的毕赤酵母菌株因此被分类为K. pastoris和K. phaffii两个物种。2009年，这些菌株的基因组被测序并报道，随后对相关菌株如K. pastoris CBS704/DSMZ70382和K. phaffii CBS7435/GS115进行了重测序和重注释，这促进了此后对该菌株的生理学、生物化学和系统生物学研究。自2016年以来，快速发展的基于CRISPR的基因组编辑方法使得对这一工业酵母进行高效、系统的重构成为可能，为生产重组蛋白和化学品提供了新的可能性。 就其食品、药品和饲料中的具体应用而言，K. phaffii被归类为生物安全1级，这包括特征明确、与健康成年人类疾病相关且风险极低的微生物，因此在处理和储存时只需基本的安全预防措施（美国疾病控制与预防中心, 1993）。此外，它已被美国食品药品监督管理局批准为动物饲料蛋白来源和人类食品加工用酶的宿主。其获得FDA批准的公认安全地位促进了多种生物药物的开发，例如激肽释放酶抑制剂艾卡拉肽（Kalbitor®, 2009）、获得性血栓性血小板减少性紫癜预防性纳米抗体卡普赛珠单抗（Cablivi®, 2019）以及偏头痛预防性单克隆抗体依普奈珠单抗（Vyepti®, 2022）等。最近，食品替代蛋白因其高效的制造能力（可能解决食用蛋白短缺问题）而备受关注。因此，牛奶和鸡蛋蛋白等重组替代蛋白发展迅速，而K. phaffii是首选的底盘宿主。 2. 作为单细胞蛋白的高质量饲料来源 识别可持续且高效的替代蛋白来源已成为全球食品和饲料生产中的紧迫优先事项，这是由于全球人口的持续增长以及日益严峻的环境压力。由微生物生产的单细胞蛋白代表了一种结合了高效生产、低资源消耗和广泛底物适应性的高质量蛋白质来源，使其成为解决日益增长的全球蛋白质需求的一个解决方案。与传统植物和动物来源的蛋白质相比，SCP具有高蛋白质含量（30–80%），并富含必需氨基酸、矿物质和维生素。重要的是，SCP可以利用农业残余物和工业副产品进行生产，从而在降低生产成本的同时促进资源循环利用。此外，其生产不依赖于耕地、淡水资源或气候条件。微生物的快速生长和强大的环境适应性进一步凸显了其作为全球蛋白质供应可行替代品的潜力。 已有不同种类的微生物被开发用于生产SCP。藻类，如螺旋藻和小球藻，因其高蛋白质含量而受到重视，但其坚硬的细胞壁降低了消化率，而高核酸含量则带来了潜在的健康风险。细菌，如甲烷氧化菌，能高效利用甲烷等底物生产SCP，但较高的核酸和内毒素水平引发了安全担忧。丝状真菌，包括镰刀菌属和曲霉属物种，广泛应用于饲料和食品生产，特别是将农业废弃物转化为SCP。然而，其产生真菌毒素的风险需要在应用过程中进行严格控制。酵母因其独特的优势在SCP研究和应用中受到广泛关注。酵母富含蛋白质，并提供丰富的B族维生素、功能性糖和矿物质，具有很高的营养价值。此外，酵母在简单条件下生长，并能利用糖类、醇类或工业废物作为碳源，展现出强大的工业化生产潜力。 多种酵母菌株在SCP生产中展现出不同的优势。酿酒酵母，作为传统的面包酵母，已广泛应用于食品和饲料的营养补充。然而，其Crabtree阳性效应容易导致低细胞密度。近年来，其他酵母因其在SCP生产中的高效率而受到关注。例如，马克斯克鲁维酵母显示出高生物量和蛋白质产量，其蛋白质提取物表现出优异的溶解性、乳化性和泡沫稳定性，使其成为一种有前景的替代蛋白来源，并已获得FDA批准。对解脂耶罗维亚酵母、毕赤酵母属和酿酒酵母的比较表明，解脂耶罗维亚酵母在葡萄糖转化和甲硫氨酸含量方面表现出色，而毕赤酵母属则具有更高的细胞蛋白含量。值得注意的是，K. phaffii CICC 1258在非最佳pH和温度条件下仍能保持高蛋白质产量，表明其作为高质量SCP来源的潜力。K. phaffii因其卓越的异源蛋白表达、灵活的碳源利用和高密度发酵性能而在SCP研究中脱颖而出。使用来自酶解脱脂豆粕的单糖作为底物，K. phaffii和产朊假丝酵母生产的SCP其蛋白质含量（干基）为41%，可以1:1的比例替代猪、家禽和水产饲料中的鱼粉或豆粕。这种SCP显著提高了饲料中的赖氨酸和甲硫氨酸水平，同时降低了配方成本。 此外，K. phaffii在废弃物增值和甲醇利用方面显示出巨大潜力。敲除K. phaffii中的PAS_0305基因激活了细胞壁完整性途径并重塑了代谢网络，产生了粗蛋白含量为67.21%的SCP，并将甲醇转化效率提高到0.46 g/g DCW。在最佳条件下，K. phaffii甲醇利用能力的提高使得生物量达到63.37 g DCW/L，蛋白质含量为0.506 g/g DCW。在高密度发酵中，K. phaffii生产的SCP粗蛋白含量为59.32%，氨基酸含量为46.98%，突显了其作为蛋白质补充剂的可持续性和成本效益。此外，味精废水被用作重组K. phaffii发酵的底物，实现了高植酸酶表达（3380 U/mL），细胞干重达到136 g/L，生产的SCP蛋白质含量（干基）为46.66%，富含氨基酸且脂肪含量低，适用于动物饲料应用。 尽管K. phaffii作为SCP表现出良好潜力，但其大规模工业应用仍面临限制。底物利用效率受到甲醇毒性和差劲的戊糖代谢的限制，而工业鲁棒性则受限于对温度和抑制剂的敏感性。由于蛋白质含量不够高以及下游分离能耗大所导致的高生产成本，进一步阻碍了其可扩展性。合成生物学方法，例如通过菌株工程提高底物利用率和环境耐受性，结合优化的低碳发酵工艺，可能会提高SCP的产量和质量，使K. phaffii成为可持续蛋白质供应的重要来源。 3. 各工业领域中生产大宗重组蛋白的优势宿主 重组蛋白是生物制造领域中最大的产品类别之一，涵盖食品添加剂、工业酶、生物制药等。对重组蛋白的需求持续增长，必须综合考虑蛋白质性质、效率、成本和翻译后修饰。 常见的表达系统主要包括原核生物、真核生物和哺乳动物细胞。原核生物如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌因其快速生长、低成本和操作简便而广泛用于重组蛋白生产。然而，原核生物面临蛋白质错误折叠、包涵体形成以及缺乏翻译后修饰等局限性。例如，它们无法进行糖基化或磷酸化，而这些修饰对许多生物药物的功能至关重要。相比之下，哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞）能有效进行复杂的翻译后修饰，确保蛋白质正确折叠和活性。然而，它们面临成本高、细胞生长缓慢等挑战，这严重限制了其可规模化性。 K. phaffii已被公认为重组蛋白生产的优选真核宿主，具有强大的表达能力和低成本。它支持有效的蛋白质折叠和温和的翻译后修饰，如糖基化和磷酸化。强大的分泌能力使重组蛋白能够高效释放到培养基上清液中，减少了胞内积累并简化了纯化过程。此外，它能利用廉价的底物并实现高密度发酵，提高了蛋白质产量和生产效率。因此，该宿主广泛应用于食品、饲料、生物材料、制药和酶工业（图1）。 3.1. 生物制药 三十多年来，K. phaffii 一直被用作表达蛋白药物的优势宿主。它广泛用于治疗性蛋白和疫苗的生产，已有近20种生物医药产品获准用于人类。作为一种甲基营养型酵母，K. phaffii 在高密度发酵、成本效益和真核蛋白加工之间提供了平衡，使其成为生物医药生产的竞争性平台。 K. phaffii 在传统治疗性蛋白的生产中表现优异。例如，通过培养基优化和高细胞密度补料分批发酵，重组人血清白蛋白的产量达到了17.47 g/L，展现了大规模工业应用的强大潜力。它还支持治疗性酶的高水平表达，例如水蛭素衍生的透明质酸酶的酶活性达到了2.12 × 10⁶ U/mL。另一方面，人透明质酸酶的低表达（19.82 U/mL）突出了一个关键限制，即蛋白质复杂性的增加常常导致折叠和分泌瓶颈，这强调了其高生产率并非普遍适用于所有类别的生物药物。 近年来，除了其在生产治疗性蛋白方面的既定作用外，K. phaffii 的应用已扩展到抗体和毒素的表达。值得注意的是，Lundbeck公司的依普奈珠单抗（Vyepti®）标志着一个里程碑，证明可以使用微生物宿主而非传统的哺乳动物细胞来生产全长单克隆抗体。在疫苗生产方面，K. phaffii 不仅能实现高效表达，还能获得高纯度的重组抗原蛋白，显著降低杂质水平。K. phaffii 还表现出强大的纳米抗体分泌能力。例如，通过优化诱导温度（24°C）、甲醇补料速率（8.5 mL/L/h）和pH控制（6.5），在补料分批发酵中Nb3341的产量达到了22.97 g/L，这证明了其在100 L规模下的稳健可放大性，并进一步保持了产量一致性和高纯度。此外，在优化启动子、分泌信号和分子伴侣后，狂犬病病毒糖蛋白已在K. phaffii 中成功表达。与Vero细胞和鸡胚细胞相比，K. phaffii 生产的RABV-G成本更低且易于放大。最近，K. phaffii 还被用于环境抗菌领域。K. phaffii 能将硝酸银高效转化为银纳米颗粒，对多重耐药菌展现出广谱抗菌活性。 与其他表达系统相比，K. phaffii 独特地平衡了高体积生产率与真核蛋白加工能力，使其在治疗性蛋白生产方面特别具有竞争力。重组胰岛素就是一个例子，K. phaffii 的产量达到了6.69 g/L，超过了大肠杆菌的2.1 g/L，同时避免了包涵体复性的需要。对于IFN-γ也观察到了类似优势，K. phaffii 中的产量为60 mg/L，而枯草芽孢杆菌中为20.3 mg/L，同时还能实现正确折叠和糖基化。对于结构更复杂的蛋白质，如hIL-22和rhEGF，K. phaffii 支持高效分泌和二硫键形成，分别达到了2.25 g/L和260 mg/L，从而相对于细菌系统简化了下游纯化。总之，这些例子突显了K. phaffii 的优势不仅在于实现有竞争力的产量，还在于通过分泌和正确折叠降低了下游加工的复杂性。尽管如此，其性能仍然高度依赖于甲醇诱导策略和发酵控制，并且必须解决糖基化异质性和蛋白质稳定性等挑战，以实现一致的大规模生产。 3.2. 工业酶制剂 全球酶市场在2023年达到了128亿美元的价值，预计到2028年将达到178亿美元。由于环境和经济效益，工业酶制剂如今在食品、纺织、化工、制药和化妆品等领域比传统化学催化剂更受青睐。K. phaffii作为一种高效的蛋白质表达系统，被广泛用于生产各种工业酶，产生了超过70种商业产品，并支持了300多个工业过程。其在酶表达方面的优势尤其显著，特别是在实现高产量方面。例如，Validogen公司利用K. phaffii表达了来自Butiauxella sp.的植酸酶，实现了22 g/L的高产量。高水平生产显著降低了生产成本，并拓宽了植酸酶在动物饲料和食品加工中的应用。此外，K. phaffii在生产生物燃料、纺织、食品添加剂和医药用酶方面也表现出色。 这些工业应用的成功主要源于K. phaffii在蛋白质合成和分泌途径方面的灵活性。K. phaffii表现出强大的遗传可操作性和显著的分泌调控潜力。例如，通过对信号肽、基因拷贝数和蛋白质折叠途径的组合优化，葡萄糖氧化酶的产量达到了30.7 g/L。类似地，通过信号肽筛选、多拷贝整合以及分子伴侣和囊泡运输途径的组合优化，α-淀粉酶的产量达到了25,000 U/mL。这些结果表明，强大的蛋白质合成和运输机制是该酵母高水平生产酶的关键决定因素。此外，将高通量筛选与菌株工程策略相结合，例如微流控筛选和关键突变位点的鉴定，实现了11,110 U/mL的高水平纤维素酶生产，展示了其在定向进化和菌株优化方面的强大适应性。过程工程在提高酶产量方面也起着关键作用。例如，构建基于生物膜的固定化发酵系统并结合工程菌株，将木聚糖酶产量提高到了约6000 U/mL，大大提高了细胞稳定性并实现了连续发酵。值得注意的是，K. phaffii不仅能实现高水平表达，还能通过翻译后修饰增强酶的性能。例如，与在大肠杆菌中表达相比，在K. phaffii中表达的工程化PET水解酶表现出更优的热稳定性和催化活性，这主要归功于N-糖基化介导的结构稳定化。此外，在食品和生物过程相关酶方面，β-半乳糖苷酶和漆酶的产量分别达到了5125 U/g和285.7 U/L，两者均表现出稳定的分泌和良好的工业适用性。 尽管如此，一些复杂蛋白质，如人唾液酸转移酶，仅表现出17 U/L的低活性，这反映了K. phaffii中分子特异性的折叠和分泌限制。此外，K. phaffii中的酶产量仍然高度依赖于工艺条件。实现高产量需要在发酵过程中精确控制甲醇补料、氧气供应和pH值，且表达性能因不同分子而异。此外，不同活性单位的使用使跨研究的直接比较复杂化，这进一步表明K. phaffii中的酶表达具有高度的蛋白质特异性，必须逐一进行优化。 3.3. 食品添加剂 K. phaffii 通常能实现温和的蛋白质糖基化，类似于哺乳动物和植物蛋白，并具有高表达水平。因此，它不仅适用于大宗食品蛋白配料，还在营养和功能性补充剂方面显示出潜力。 乳蛋白广泛应用于具有免疫调节、抗菌和抗氧化功能的保健食品和营养补充剂中。乳蛋白的异源生产最近引起了广泛关注。据报道，K. phaffii 的表现优于细菌和其他酵母。细菌效率低、产量有限且存在内毒素风险。酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母容易引起过度糖基化，且生产和分泌效率低下。相比之下，K. phaffii 可以实现更高的生产效率。例如，基于乙醇转录信号放大系统的表达优化使得牛β-乳球蛋白的产量达到了12 g/L。它还能实现人α-乳白蛋白60 mg/L的产量，比酿酒酵母高出119倍。功能性乳铁蛋白也在K. phaffii 中成功表达，通过K. phaffii 发酵与化学-生物级联催化系统结合，达到了5.4 g/L的高水平。Turtle Tree公司利用K. phaffii 生产乳铁蛋白，获得了美国FDA的商业化批准，在15,000 L发酵罐中实现了10吨的年产能。该系统还生产了β-乳球蛋白、骨桥蛋白和酪蛋白，为通过基于微生物细胞的生物制造从传统乳蛋白向替代蛋白过渡提供了良好参考。此外，蛋清中的卵清蛋白具有重要的营养和功能特性。K. phaffii 通过无标记操作方法提高外源基因整合效率，高水平生产了卵清蛋白，显示出相对于其他宿主的竞争优势。Impossible Foods公司利用K. phaffii 生产豆血红蛋白，已获得美国FDA批准并成功应用于人造肉汉堡。 此外，马铃薯蛋白的主要成分Patatin表现出优异的凝胶特性，使其成为植物基食品中一种有前景的成分。K. phaffii 高效分泌可溶性蛋白并进行优势糖基化，确保了蛋白质的功能性和稳定性。其糖基化模式与植物源蛋白非常相似，使得表达的Patatin具有优异的凝胶特性。通过优化培养工艺，其产量达到了1424.5 mg/L，远高于大肠杆菌生产的271 mg/L。总的来说，该宿主在食品蛋白生产方面展现出有前景的成就。尽管如此，甲醇依赖的诱导模式可能因其毒性风险而在某种程度上限制了其商业应用。 3.4. 动物饲料 酵母生产的饲料添加剂广泛应用于畜牧业，包括含有酵母细胞、功能性组分或酵母培养物的产品。这些添加剂不仅能提供丰富的营养，还有助于调节消化道微生物菌群平衡、增强免疫力、预防和治疗胃肠道疾病，并促进动物生长。因此，酵母生产的饲料添加剂作为一种绿色、安全、无毒、无副作用的选择，展现出良好的市场潜力。 抗菌肽作为饲料添加剂广泛用于预防和治疗牲畜胃肠道疾病，提高生产效率并减少对抗生素的依赖。细菌宿主如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌已被广泛用于生产AMPs（buforin, Cathelicidin-BF, T9W, CiMAM等）。然而，这些宿主容易因内毒素的产生而被杀死，影响产量和纯度。近年来，由K. phaffii表达的AMPs报道日益增多。其翻译后修饰能力提供了功能性和稳定的AMPs。在优化培养条件下，K. phaffii实现了阿霉素的高水平表达和分泌，产量达到418 mg/L。Cathelicidin-BF也在K. phaffii中表达，通过甲醇诱导实现了0.5 g/L的产量。蜂毒抗菌肽蜂毒素在K. phaffii中成功生产，展现出广谱抗菌活性。这些研究突显了K. phaffii作为AMPs生产表达平台的巨大潜力。 溶菌酶具有抗菌活性和营养调节的双重功能，有助于改善动物健康并增强营养吸收。这种双重功能特性为兽用原料工业的绿色高端发展提供了宝贵见解。原核宿主在表达溶菌酶时常常遇到细胞裂解或包涵体形成等问题，从而限制了产品产量和活性。最近，通过高拷贝基因、信号肽优化、敲除液泡分选受体以及共表达转录因子等组合策略，在K. phaffii中实现了352,000 U/mL的溶菌酶活性。此外，除了蛋白质之外，其他种类的饲料添加剂（虾青素、多糖、虫草素等）也已在K. phaffii中实现生产。随着合成生物学和代谢工程技术的不断进步，预计将通过该宿主生产更多高价值、环保的添加剂，为动物营养、健康养殖和可持续发展提供坚实的技术支持。 3.5. 生物材料 结构生物材料，如胶原蛋白和丝素蛋白，因其优异的机械性能、生物相容性和可加工性，被广泛应用于组织修复、皮肤再生和医疗支架领域。K. phaffii 已成为表达重组生物材料的热门宿主。II型胶原蛋白片段在K. phaffii 中成功表达，并在低温条件下实现了三螺旋结构的自组装，形成了纳米纤维和水凝胶网络。它表现出促进成纤维细胞迁移和分化的活性，产量达到3.04 g/L，为其在皮肤修复和软骨再生中的应用奠定了基础。类似地，III型人胶原蛋白在生物反应器规模下实现了10.3 g/L的产量，展现出优异的抗氧化活性并能显著促进细胞增殖、粘附和迁移。将整合素α2β1特异性结合序列GFPGER引入胶原蛋白支架，很好地促进了成骨细胞粘附。 节肢动物生产的蚕丝可用于制造纤维、薄膜、微胶囊和水凝胶，并在再生医学、植入物涂层和药物递送等领域也展现出潜力。工程化的K. phaffii 被用于表达重组蜘蛛丝融合蛋白，开发出具有抗体结合能力的功能性纤维。这为生产蜘蛛丝等高结构蛋白提供了一条替代途径。从蚕茧中提取的丝素蛋白，因其优异的机械性能和生物相容性，被广泛应用于各种生物材料。重组丝素肽BmSPR3和BmSPR4由K. phaffii 表达，并分别达到了11.39 g/L和9.48 g/L的高产量。 研究人员还尝试整合天然来源的结构和功能模块，创造出具有机械强度、环境响应性和生物活性的材料。例如，通过将天然粘附模块（如贻贝足蛋白和藤壶粘附蛋白）与丝蛋白或胶原蛋白结合，可以获得具有湿态粘附和机械稳定性的复合材料。设计了cp19k与MaSp1的融合蛋白，并在K. phaffii 中表达，获得了具有优异细胞粘附和生长支持能力的产品，使其特别适用于内皮组织再生。总的来说，重组生物材料的生产在医疗、化妆品和纺织应用中显示出广阔的应用潜力，但仍面临低成本、高产量和大规模生产的挑战。 3.6. 重组蛋白生产中的关键局限与挑战 3.6.1. 蛋白质分泌与分泌途径工程 在K. phaffii中，高效的蛋白质表达不仅依赖于转录和翻译调控，还受到分泌能力和翻译后修饰过程的限制。其中，蛋白质分泌途径和糖基化是决定产品质量和功能的关键因素，从而直接影响该系统在食品和生物医药领域的适用性。 K. phaffii通常具有良好的分泌能力，这主要由经典的内质网-高尔基体分泌途径介导。然而，在高表达负荷下，分泌过程常常成为一个限制因素。从机制上讲，分泌瓶颈主要源于三个方面。首先，蛋白质跨ER膜转运的效率受信号肽识别和ER输入效率的控制。其次，在高表达条件下，ER中的蛋白质折叠和质量控制常常受到限制，因为未折叠蛋白的积累会引发ER应激和未折叠蛋白反应，从而降低正确折叠蛋白的产量。第三，介导从ER到高尔基体并最终到达胞外空间的运输的囊泡运输和胞吐过程，受到膜运输系统和细胞能量状态的严格调控。在这些因素中，信号肽是影响分泌效率的关键因素之一，其优化可以显著增强蛋白质分泌。例如，来自酿酒酵母的α-交配因子已广泛用于K. phaffii和其他工业表达系统。此外，蛋白质特异性的信号肽筛选可以进一步提高产量，如MF4I信号肽将植酸酶表达提高到6.1 g/L。其他信号肽，如SUC2，也对特定酶表现出高效率，实现了1706 U/L的右旋糖酐酶产量。这些发现共同突显了信号肽的蛋白质依赖性行为，以及缺乏通用的最优解决方案。除了信号肽工程，调节分子伴侣、折叠酶和UPR通路可以有效缓解ER折叠应激，增加正确折叠蛋白的比例。例如，过表达ER伴侣Kar2使HFBI分泌量增加了约22倍。此外，构建Ero1-PDI协同折叠系统，提高ER氧化折叠能力，极大地提高了人溶菌酶的表达水平。此外，囊泡运输日益被认为是蛋白质分泌的另一个关键瓶颈。调节囊泡运输相关因子，如Sec1、Sly1和BMH2，显著提高了分泌效率，突显了ER和高尔基体之间的胞内运输在决定分泌性能中的重要性。结合分子伴侣和囊泡运输因子的优化可以进一步增加分泌通量。例如，在K. phaffii中对多个折叠和运输因子进行组合工程改造，导致α-淀粉酶产量增加了约3.4倍。总体而言，这些研究表明，高效的蛋白质分泌需要多个过程的协调调控，包括翻译、折叠和胞内运输，任何步骤的不平衡都可能严重限制产量。 然而，这些工程策略通常表现出显著的蛋白质依赖性效应。目标蛋白质在折叠复杂性、翻译速率以及沿分泌途径行为的差异，常常导致应用相同的工程策略时产生不一致的结果。因此，目前仍然缺乏适用于不同蛋白质的通用优化策略，这限制了稳健且可扩展的表达平台的开发。 3.6.2. 糖基化与糖基化工程策略 作为真核表达系统，K. phaffii能够进行N-和O-糖基化，使其在生产糖基化蛋白方面相较于原核系统具有优势。然而，其糖基化模式仍然是高甘露糖型，不同于人类的复合型，尽管与面包酵母相比已温和得多。 对于药用蛋白，糖基化模式直接决定蛋白质的稳定性、半衰期和免疫原性。非人类聚糖结构可能引发免疫反应或损害治疗效果，因此人源化糖基化是一个关键的工程目标。迄今为止，系统的基因工程已使得在K. phaffii中重建糖基化途径成为可能，包括敲除OCH1等高甘露糖相关基因，以及引入甘露糖苷酶II和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶等哺乳动物糖基转移酶。这些修饰促进了高甘露糖聚糖向复合型结构的转化。由此，工程化的K. phaffii菌株已被开发用于生产重组促红细胞生成素和抗体相关糖蛋白，这些糖蛋白带有更接近人类的聚糖结构，与天然酵母来源的产品相比，显示出更高的生物活性和更低的免疫原性。除途径工程外，酶促聚糖重塑已成为进一步提高K. phaffii来源产品聚糖均一性的补充策略。例如，内切糖苷酶可用于选择性修剪或重塑蛋白质聚糖，从而降低聚糖异质性并提高产品质量。先前的研究表明，微生物来源的内切糖苷酶能够实现高效的聚糖重塑，以产生具有均一结构的糖蛋白产品。内切糖苷酶如EndoS和EndoS2已用于抗体聚糖的靶向修饰和重塑，展示了酶促聚糖重塑在生物药物开发中的应用潜力。 相比之下，在食品蛋白领域，糖基化更侧重于功能特性，如溶解性、乳化性和凝胶特性。适度的糖基化有助于提高蛋白质稳定性和加工性能，而过度或异常的糖基化可能导致蛋白质聚集或影响感官品质，从而限制其应用潜力。因此，在食品应用中，实现适度且可控的糖基化修饰尤为关键。总体而言，K. phaffii中的糖基化工程正逐渐从单纯关注消除与人类聚糖的差异，转向按需设计范式，即针对特定的应用需求定制不同的糖基化模式。 3.6.3. 工业实施与生物过程优化 各类产品的成功生产已逐步将K. phaffii确立为生物制造的重要宿主。然而，实验室规模实现的高表达水平并不一定能转化为工业可行性。目前，K. phaffii在工业放大和工艺优化方面仍面临一些挑战。 尽管甲醇在工业规模上的使用存在某些局限性，但它仍然是K. phaffii最常用的碳源之一。小型生物反应器通常可近似为充分混合的系统；因此，与K. phaffii利用甲醇相关的高细胞密度培养、高需氧量和高等温热通常在实验室规模并不构成关键限制。然而，在大型工业生产中，缺乏均一性是一个主要问题，常常导致过程中传质和传热出现显著差异。这也使得温度、pH、溶解氧和底物浓度等各种关键参数的监测复杂化，并导致局部区域出现次优的生长条件，最终影响整体生长和生产效率。尽管使用葡萄糖等非甲醇碳源的发酵策略相对不那么成熟，但与甲醇相比，它们可能遇到的困难更少。因此，非甲醇碳源的利用及相关表达系统的开发有望促进K. phaffii更广泛的工业应用。 与下游处理相关的挑战也是工业生产中必须解决的关键问题。在大规模发酵中，K. phaffii的高细胞密度有利于高效生产目标产物。然而，大量细胞、细胞碎片和胞外代谢物的存在使得生物质分离更加困难。此外，纯化在工业生产成本中占据很大比例，特别是对于增值产品。诸如高风险宿主细胞蛋白、胞外多糖和细胞裂解释放的蛋白酶等杂质会对下游纯化过程产生不利影响。同时，必须考虑目标产品（尤其是蛋白质）的结构和功能稳定性。尽管制药工业中重组蛋白药物的纯化工艺已相当成熟，但它们可能无法同样应用于食品和饲料蛋白及生物材料等大宗低成本产品。因此，仍然迫切需要新的细胞分离和产品纯化策略。例如，开发更经济、更耐用的陶瓷膜可能是实现此目的的一种替代选择。最近，通过细胞截留方法实现的连续细胞循环回收使脂肪酶的累积产量提高了3.8倍，这是一种有效且低成本的细胞分离和再利用工艺。 发酵过程的合理优化也是K. phaffii工业生产中的关键问题。实验室规模的工艺开发通常侧重于底物消耗、生物量积累和产物滴度等指标。然而，在大规模生产中，工艺优化的目标已超越这些方面，必须考虑更广泛的工业限制。这些包括发酵成本、设备磨损和对下游纯化的影响等实际因素，以及原材料和底物选择、时空产率、生物量限制和产品质量等额外指标，所有这些都被纳入工艺设计和优化目标。此外，目前K. phaffii的生物工艺主要基于分批或补料分批发酵。相比之下，连续培养具有操作灵活性、成本更低、生产率更高以及工业环境中与上下游工艺集成更好等优势，使其成为一个值得关注的发展方向。然而，这种方法在碳源选择、遗传稳定性、污染风险控制和实时过程监控方面也提出了更高的要求。新兴的数字技术也为K. phaffii的生物过程优化提供了新方法。其中，数字孪生可以作为与物理发酵过程实时连接的数字副本。通过集成在线传感、软传感器和人工智能模型，它们能够提取难以直接测量的过程信息，从而增强过程监控、状态预测和动态控制，并进一步提高过程的稳健性和可重复性。例如，Gasset等人（2024）开发了一个用于K. phaffii缺氧补料分批工艺的数字孪生模型，并在产脂肪酶1的生产中成功测试，该模型显示出更好的控制精度和过程再现性。还建立了一个基于重组人生长激素发酵的数字孪生模型，证实了其在工业应用中的可行性。 4. 生物法生产天然产物的前景宿主 对大宗化学品和天然产物日益增长的需求正在推动对高效合成方法的探索。对于结构复杂的产品，生物合成相比传统的提取或化学合成具有周期短、成本低、效率高和环境友好等优势。最近的进展揭示了K. phaffii作为酵母工厂用于生产天然产物的潜力（图2）。这主要归因于该宿主高效的胞内酶共表达、对植物和哺乳动物细胞来源酶的温和后修饰，以及高效的前体供应能力。 4.1. 黄酮类化合物 黄酮类化合物是一类多样化的多酚化合物，主要通过植物中的苯丙烷或乙酸-丙二酸代谢途径合成。黄酮类分子由C6-C3-C6结构组成，两个苯环（A和B）通过一个杂环吡喃环（C）连接。羟基化、甲氧基化、异戊烯基化和糖基化等分子修饰将黄酮类化合物高度扩展至上万种结构变体。 最近，多种黄酮类化合物已在K. phaffii中成功合成。例如，来自药用植物黄芩的4'-脱氧黄酮的生物合成途径在K. phaffii中构建，首次实现了千层纸素A、6-甲氧基汉黄芩素和6-甲氧基去甲汉黄芩素的从头合成，以及已报道的黄芩素、去甲汉黄芩素和汉黄芩素。该研究还表明，乙醇作为最优底物可以减轻黄酮类中间体对细胞生长的抑制作用。基于乙醇代谢的精确途径平衡最终实现了黄芩苷和千层纸素A的高水平从头合成，且副产物积累极少。六种糖基转移酶的表达很好地修饰了4'-脱氧黄酮的不同位点，并合成了18种不同的糖基黄酮。随后，构建了由合成黄芩素的酵母和糖基化黄芩素的酵母组成的共培养系统。该合成联合体最终从简单碳源中生产了1.3 g/L的黄芩苷。在抗炎牡荆素、荭草素、2″-O-半乳糖基牡荆素和2″-O-半乳糖基荭草素的生产案例中，糖基黄酮的从头合成实现了新的突破。对结构单元（酪氨酸、丙二酰辅酶A和糖供体）及平行途径的系统代谢工程显著提高了产物滴度。此外，整合ATP生成、辅因子平衡和水解酶失活等策略最终将产物滴度提升至超过26 g/L。 此外，甲基黄酮的从头合成在K. phaffii中也有报道。杜鹃素是来自药用植物满山红的一种关键止咳活性成分。研究人员鉴定了一个新的查尔酮二C-甲基转移酶RdCMT，并阐明了其蛋白质结构和催化机制。利用这一关键酶，杜鹃素的完整生物合成途径被设计并组装到K. phaffii中。通过改善前体供应和优化基因剂量，杜鹃素的合成在生物反应器规模下最终达到149 mg/L。总体而言，该酵母宿主在植物黄酮类化合物的合成中已显示出主导作用。然而，特定黄酮类化合物对宿主细胞的毒性仍然是其在K. phaffii和其他微生物中异源生物合成的瓶颈。 4.2. 生物碱 生物碱是含氮的碱性有机化合物，具有显著的生物活性。根据其化学结构，它们可分为不同类别，包括异喹啉类、吡咯类、吡啶类、喹啉类、吲哚类等。大量研究和临床试验表明，生物碱具有多种药理作用。许多生物碱药物已被开发出来，例如作为麻醉镇痛剂的吗啡、作为止咳药的可待因、作为抗癌药的长春新碱和作为抗菌药的盐酸小檗碱，这些药物已广泛应用于临床实践。 长春碱源自植物长春花，是一种高效的抗癌药物。长春碱是由两种单萜吲哚生物碱部分（长春质碱和文多灵）组成的异二聚体。目前，长春碱仍然通过植物提取生产，该方式存在含量极低、环境问题和供应不可靠等弊端。最近，研究人员将K. phaffii工程化改造为能够从头合成长春质碱的底盘菌株。该研究涉及三个关键步骤：识别由必需基因界定的稳定整合位点，以构建和稳定多基因生物合成途径；实施模块化策略以整合和优化完整的合成途径；以及通过组合代谢工程提高产量。超过30个基因被整合并稳定在K. phaffii中，实现了目标产物的全合成，且产量高于面包酵母。 虫草素，也称为3'-脱氧腺嘌呤，是通过腺嘌呤和呋喃糖之间的β-N9-糖苷键形成的核苷类似物。它具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、杀虫和除草等多种生物活性，广泛应用于医药、功能食品、农业和畜牧业。据报道，通过优化启动子组合、增强甲醇同化以及改善辅因子和前体物质的可用性，在K. phaffii中从甲醇合成了虫草素，产量达到8.11 g/L。该研究小组随后使用Brex27增强型CRISPR-Cas9系统进一步对该菌株进行代谢工程改造，创下了18.3 g/L虫草素的新合成记录。这些案例表明，K. phaffii具备成为生物碱合成优势宿主的良好潜力。 4.3. 萜类化合物 萜类化合物是植物及其他生物体中最重要的天然产物类型之一。它们以基本的五碳类异戊二烯骨架为特征，而官能团、氧原子的添加或结构重排则造就了其显著的多样性。在过去几年中，随着该宿主基因编辑方法的进步，K. phaffii中萜类化合物的生物合成日益增多。 为了提高K. phaffii中α-法尼烯的合成，研究人员增强了甲羟戊酸合成模块和胞质乙酰辅酶A供应途径，但减少了法尼基焦磷酸分支途径。这种方法在生物反应器发酵中实现了α-法尼烯的高产（17.92 g/L）。还实施了代谢工程策略以提高K. phaffii中番茄红素的产量。例如，阻断法尼醇生产的竞争途径、敲除DPP1和LPP1基因以及下调Erg9表达，抑制了麦角甾醇合成并促进了番茄红素的积累。通过系统的代谢工程策略，还开发了一个K. phaffii平台，用于从甲醇生产报道的最高水平（10.2 g/L）的番茄红素。此外，通过工程化辅因子NADPH、分子伴侣和转录因子，在K. phaffii中实现了(−)-α-红没药醇的高水平生物合成（32.8 g/L）。这些成就表明，K. phaffii已经在从特定底物合成萜类化合物方面展现出巨大潜力。尽管如此，K. phaffii中萜类化合物的产量通常落后于面包酵母。仍需进行全局代谢工程，使其成为具有多样化产品类型和竞争性产量的替代细胞工厂。 4.4. 聚酮化合物 聚酮化合物是一类源自乙酰基或丙二酰基单元的多样化天然产物，通常从微生物和植物中鉴定得到。环氧化、卤化等分子修饰可能会增加聚酮化合物的结构多样性，产生分子量范围广泛的化合物。 莫纳可林J是合成降胆固醇药物辛伐他汀的关键中间体，年销售额超过30亿美元。通过增加基因剂量以及平衡前体物质和NADPH，使K. phaffii中MJ的产量提高到了1.5 g/L（Wu et al., 2024b）。此外，还开发了一种新型酵母平台，其中K. phaffii使用乙醇作为碳源、前体供体和合成诱导剂，并将其应用于MJ合成。通过转录扩增工具驱动的生物合成途径，MJ产量达到了3.2 g/L，远远超过其他异源宿主中报道的生产水平。此外，其他聚酮化合物如6-甲基水杨酸、 terreic acid和柠青霉素的从头合成也在K. phaffii中实现。总的来说，在该宿主中合成聚酮化合物的能力似乎并不优于其天然聚酮生产宿主，如丝状真菌和放线菌。 此外，还有其他天然产物和其它小分子化学品也被报道在K. phaffii中实现了全合成。鉴于这些化合物种类繁多，此处不再一一详述。 5. C1和C2底物的转化 随着全球生物制造的迅速扩张及其在化学品、燃料和材料大宗生产中日益深入的应用，过去十年间，全球对可规模化、可持续且成本效益高的碳原料的需求大幅增加。以葡萄糖和淀粉为代表的传统食品来源底物长期以来一直是工业生物制造的核心碳源。然而，食品来源碳源的大规模扩张固有地受到多重刚性限制，包括全球有限的可耕地承载能力、固有的粮食-饲料竞争风险、地缘政治和气候冲击下的高价格波动性（IEA, 2024; OECD-FAO, 2024），以及高生命周期碳排放，这些因素共同为其在大宗制造场景中的应用构成了难以逾越的天花板。 在此背景下，一碳和两碳化合物已成为下一代可持续生物制造的有前景的替代原料。近年来，除了其典型的碳源葡萄糖、甲醇和甘油之外，K. phaffii对不同C1和C2底物的利用能力已得到研究（图3）。为了改善C1和C2碳源的利用，研究人员已系统筛选并表征了一组多样化的C1/C2响应启动子。这些启动子能够使基因表达与碳源可用性精确匹配，从而促进大宗低成本产品的高效合成。具体而言，它们已被用于通过代谢增强的诱导表达来提高化学中间体和商品化蛋白质的产量，为基于C1/C2原料的绿色生物制造平台的发展奠定了坚实基础。与此同时，包括增强前体供应和途径区室化在内的系统代谢工程策略已被广泛研究，以适应C1和C2底物的代谢并提高生产效率。 5.1. C1底物 C1资源具有广泛自然存在和多样化人为来源的特点，被广泛认为是下一代生物制造的核心新型可持续原料。用于生物制造的核心代表性C1底物包括二氧化碳、甲酸盐、甲醇、甲烷和一氧化碳，它们不受仅限于化石来源的限制。具体而言，甲醇和甲酸盐等代表性底物可以通过成熟的化学转化路线以及新兴的生物转化途径，从CO₂、CH₄和含CO的工业废气中生产，多种技术路线已实现工业规模示范。这些C1底物被正式归类为第三代生物精炼原料，权威的技术经济分析和全球资源评估研究证实了它们在可规模化的全球供应潜力和经济竞争力方面的突出优势。最近，除了K. phaffii常用的碳源甲醇外，还报道了关于利用CO₂和甲酸盐的研究。 作为主要的温室气体，高效利用CO₂不仅能解决能源挑战，还能缓解气候变化，使其成为当前研究的重点。已经鉴定出几种天然的碳固定途径：Calvin-Benson-Bassham循环、Wood-Ljungdahl途径、还原性三羧酸循环、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环、二羧酸/4-羟基丁酸循环和还原性甘氨酸途径。能够在K. phaffii中成功开发出以CO₂为唯一碳源生长的菌株。通过在K. phaffii中表达包括RuBisCo在内的6种异源酶，建立了一个完整的CBB循环。CBB酶被锚定在过氧化物酶体内以提高CO₂固定效率。所需的NADH和ATP来源于甲醇代谢。为了防止细胞同化甲醇，敲除了编码二羟基丙酮合酶的基因。这些策略创造了一株化能自养的K. phaffii菌株，其使用CO₂作为底物的最大生长速率为0.008 h⁻¹。通过适应性进化，该速率进一步提高到0.018 h⁻¹。利用K. phaffii自养菌株的能力，开发了以CO₂为底物生产有机酸的方法。平衡内源和外源代谢途径并优化发酵过程，使得在生物反应器中产生了11.84 g/L的衣康酸。一种甲醇同化的替代途径，即rGly途径，已被表征。敲除线粒体羟甲基转移酶以限制其与rGly途径竞争甲基二氢叶酸。因此，工程菌株成功地以高浓度的CO₂和甲醇（或甲酸盐）为底物积累生物量。基于甲醇和甲酸盐的氧化以及K. phaffii中的rGly途径，设计了一条人工MFORG途径。当用甲醇和NaHCO₃共培养时，工程菌株产生了0.21 g/L L-乳酸和0.71 mg/L 5-氨基丁酸。尽管取得了这些进展，但较弱的还原性和低下的代谢能力仍然严重限制了这种C1气体的实际应用。 甲酸盐是一种重要的C1液体底物，比甲醇更安全。这种化合物用于生产动物饲料、生物燃料和各种高附加值化学品。2023年全球甲酸盐市场达到21.1亿美元，预计到2032年将增长至46.1亿美元。作为细胞内甲醇转化的下游中间体，甲酸盐可以被K. phaffii分解代谢为CO₂。最近，研究人员在K. phaffii中构建了rGly途径和MFORG途径，并证明改造后的菌株能够共同利用甲醇、甲酸盐和CO₂。通过共表达乙酰辅酶A合成酶和醛脱氢酶，构建了一条甲酸盐同化途径，在工程化的K. phaffii菌株中，使用甲酸盐作为诱导剂和碳源实现了木聚糖酶的生产。 此外，还研究了甲醇同化的优化，以实现更高效的底物转化。增加二羟基丙酮合酶2的表达有效地提高了生物量积累和甲醇利用效率。针对甲醇同化的碳代谢重排将碳通量引向E4P的合成。结合引入细菌核酮糖单磷酸途径，显著增强了产物合成。降低甲醇分解代谢相关基因甲醛脱氢酶1和甲酸脱氢酶1的表达减少了甲醇损失并提高了3-羟基丙酸的生产。另一方面，适应性实验室进化促进了关于甲醇耐受性和代谢的新靶点的发现。例如，研究人员获得了对高浓度甲醇具有增强抗性的突变K. phaffii菌株。磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2的水平被确定为这种表型变化的主要变体。 5.2. C2底物 乙酸盐和乙醇等C2资源代表了用于可持续生物制造的另一类下一代原料，在灵活的微生物代谢和高度多样化的循环供应途径方面具有独特优势。其原料来源包括农业残余物、工业有机废物流、城市固体废物的升级利用等。这种固有的非粮竞争特性使得C2底物的大规模生产完全独立于可食用淀粉和糖基原料。正如系统的生命周期评估和技术经济分析研究所验证的那样，这可以避免限制传统食品来源原料可持续扩张的粮食-饲料竞争、土地使用限制和价格波动风险。此外，电化学和光电化学转换技术的快速发展使得能够高效、选择性地将CO₂（包括工业烟气和大气CO₂）转化为乙酸盐和乙醇，为C2原料提供了一条负碳、可再生且完全可规模化的合成路线，符合全球碳中和目标。与基于C6的碳水化合物相比，C2物质进入中心代谢的路径更短，碳原子损失更少。 在酵母中，乙醇主要通过无碳损失的方式代谢为乙酸盐。它首先被醇脱氢酶转化为乙醛，然后通过醛脱氢酶进一步转化为乙酸盐，随后通过乙酰辅酶A合成酶形成乙酰辅酶A。不同生物利用不同的酶和辅酶系统进行该途径。例如，蜡样芽孢杆菌、构巢曲霉和酵母利用NAD⁺依赖的ADH，同时利用NAD⁺/NADP⁺依赖的ALDH。在此过程中，产生两个分子的还原力（2 NADH或1 NADH加1 NADPH）。不同的是，假单胞菌属和其他乙酸细菌使用吡唑啉酮喹啉依赖的ADH和NAD⁺/PQQ依赖的ALDH。 最近涉及乙醇作为碳源的研究已证明其对乙酰辅酶A衍生化学品生物合成的积极影响。例如，在K. phaffii中构建了一种乙醇诱导的转录信号放大装置，使表达强度提高了20倍。然后，以乙醇作为唯一碳源和诱导剂，细胞生长良好，并产生了报道的最高水平的降血脂药物中间体莫纳可林J。类似的系统也实现了乳蛋白和工业酶的高产。植物黄酮类合成途径在K. phaffii中重新组装，该菌使用乙醇作为碳源，通过模块化途径设计、增强前体供应和阻断分支途径，实现了黄酮类化合物产量的提高。多组学分析揭示了葡萄糖和乙醇在ATP、辅因子、前体、中间体和水解酶方面的代谢差异。对这些靶点的组合重新布线最终将糖基黄酮产量提高到>26 g/L，远远超过先前报道的毫克每升水平的糖基黄酮产量。 然而，高浓度的乙醇会对K. phaffii产生胁迫，引发细胞一系列生理和代谢变化。乙醇改变细胞膜的流动性、通透性和完整性，影响物质运输和细胞环境。它也可能破坏蛋白质结构，诱导蛋白质变性并加剧氧化应激。当乙醇代谢平衡被破坏时，其代谢中间体（乙醛和乙酸盐）可能引发细胞应激，即对蛋白质、DNA和脂质的损伤。因此，需要精确的过程控制和代谢调节，以减轻影响细胞生长和生产力的应激反应。 乙酸盐因其低成本、粮食安全、高效的同化途径和丰富的来源，代表了最有前景的下一代生物制造碳源之一。乙酸盐通过被动扩散或特定的膜转运蛋白进入细胞。它通过不同的途径转化为乙酰辅酶A，例如乙酰辅酶A合酶途径、乙酸激酶-磷酸乙酰转乙酰酶途径、琥珀酰辅酶A-乙酰辅酶A转移酶途径。不可逆的Acs途径使用乙酰-AMP作为中间体，消耗2摩尔ATP产生乙酰辅酶A。相比之下，可逆的Ack-Pta途径首先通过Ack催化将乙酸盐转化为乙酰磷酸，然后通过Pta将其转化为乙酰辅酶A，仅需1摩尔ATP。值得注意的是，在假单胞菌属、醋杆菌属和肺炎克雷伯菌等细菌中，SCaCt将辅酶A从琥珀酰辅酶A转移到乙酸盐分子，同时生成乙酰辅酶A和琥珀酸，且不消耗ATP。这种替代途径已成为乙酸盐利用中Acs和Ack-Pta系统的重要替代方案。目前，尽管乙酸盐已被证明能支持K. phaffii的细胞生长，但由于其对酵母细胞的多重毒性，很难使用乙酸盐作为唯一碳源达到高细胞密度和产品产量。通过修饰一个推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Hrk1，提高了K. phaffii对乙酸盐的耐受性。最终，结合在K. phaffii中过表达Acs，提高了6-甲基水杨酸的产量。尽管如此，为了推动乙酸盐成为大规模生物制造的高效碳源，迫切需要具有强耐受性和利用能力的工程化超级细胞。 6. 宿主更新与遗传方法学的创新 6.1. 调控机制与理性设计 6.1.1. 甲醇同化的调控因子与机制 如上所述，甲醇是用于生物制造的一种替代性非粮碳源。它能为生物合成提供高水平的还原力和能量，从而为微生物生产过程提供独特优势。K. phaffii 拥有天然高效的甲醇利用途径。甲醇诱导型启动子 P_AOX1驱动该途径中醇氧化酶的表达，是该宿主中最强且应用最广泛的启动子之一。围绕甲醇代谢，K. phaffii 进化出了一个高度协调的转录调控网络，这赋予其表达系统出色的可控性。更深入地理解 K. phaffii 的 MUT 途径，特别是调控 P_AOX1的机制，将有助于为理性改造该宿主奠定理论基础，并可能为在其他工业微生物中工程化甲醇利用提供灵感。 目前已陆续发现数个参与 MUT 途径及 AOX1 启动子转录调控的关键转录因子。Mxr1 激活因子首先在 K. phaffii 中被鉴定，它与酿酒酵母的 Ard1p 同源，能激活大多数甲醇调控的基因。Prm1 因子可激活甲醇诱导型启动子，是博伊丁假丝酵母 Trm1 的同源物。其组成型表达能在无甲醇的培养基中激活 AOX1 和二羟基丙酮合酶 1 启动子。另一个重要的激活因子 Mit1 能直接结合 P_AOX1并高度激活它。此外，Sut2 因子间接参与 MUT 途径并正调控 P_AOX1的表达。在阻遏蛋白方面，Mig1 和 Mig2 在 K. phaffii 甲醇代谢中的作用得到证实，敲除这些基因能增强非甲醇条件下 P_AOX1的活性。Nrg1 因子通过与 Mxr1 竞争性结合 P_AOX1来抑制其活性。 该启动子的转录调控机制也得到了深入研究。已在 P_AOX1中明确了 Mxr1 激活因子的六个结合位点。随后也鉴定出了 Mit1 和 Prm1 激活因子以及 Nrg1 阻遏蛋白的结合位点。研究了不同因子之间的转录调控和蛋白质相互作用，并提出了一个关于甲醇诱导和碳源阻遏的初步模型。Mxr1 在葡萄糖存在下无法进入细胞核，在其他碳源存在下则迁移至核内，并根据其磷酸化类型以不同水平激活 P_AOX1。Prm1 响应甲醇信号并通过自身激活实现快速的细胞反应。Mit1 在转录水平上被 Prm1 激活，但也对 Prm1 产生反馈抑制。在甲醇条件下，Mxr1、Prm1 和 Mit1 等激活因子分别与 P_AOX1结合，而 Nrg1 则无法结合。这些激活因子最终招募 RNA 聚合酶 II 来激活转录。 6.1.2. 天然调控机制的重构 尽管甲醇是生物制造的一种替代性非粮碳源，但在工业生产中使用甲醇仍面临一些问题。特别是对于食品和药品相关产品，考虑到毒性风险，甲醇的使用并不优选，这与生物化工领域的情况不同。其代谢与高需氧量和大量产热相关，这对于成本敏感的大宗食品配料来说并不经济。因此，如何去除甲醇依赖的诱导但仍保持高强度表达已引起人们关注。组成型启动子（如P_GAP和P_PGK）、无甲醇诱导型启动子（如P_LRA3）以及生长解偶联启动子（如P_DH）等已扩展了Komagataella phaffii在非甲醇碳源下的应用。然而，这些启动子的表达能力无法与P_AOX1驱动的表达相媲美。因此，进一步提出了对P_{AOX1}转录机制的理性再设计。 敲除三个阻遏蛋白（Nrg1、Mig1、Mig2）并过表达Mit1激活因子，在甘油条件下解除了对P_AOX1的抑制。其表达强度达到甲醇诱导条件下约77%的水平。类似地，使用过氧化氢酶1启动子过表达Mit1或Mxr1，使P_AOX1的去抑制水平达到44%。通过用弱甲醇诱导型启动子P_{AOX2}驱动Mxr1表达，形成了一个正反馈回路，在甲醇诱导和甘油饥饿条件下显著提高了重组蛋白的产量。然而，这些策略通常需要修饰天然的调控网络，导致不可避免的影响，如细胞生长受损。为了解决这个问题，人们构建了一个改进的转录信号放大装置（iTSAD）。该装置将P_{AOX1}的核心区域与原核操纵子序列杂交，并将反式激活结构域和原核调控蛋白融合。然后，通过原核操纵子序列和调控蛋白之间的天然结合，酵母的反式激活结构域被招募到核心启动子上。随后，转录机器被组装以驱动转录过程。获得的iTSAD能够在多种碳源下实现强烈的蛋白质表达，最高可达甲醇诱导型P_AOX1水平的5.2倍。它使用与K. phaffii正交的表达元件，避免了对天然调控网络的干扰。通过结合使用CRISPR干扰、CRISPR激活和RNA干扰对iTSAD进行组合控制，最终开发了一个响应自定义信号的可编程高表达酵母平台。这种方法在表达强度和调控灵活性方面均实现了突破。 6.2. 基因编辑与代谢调控工具 6.2.1. CRISPR相关基因编辑方法的发展 异源基因的稳定表达和遗传对于蛋白质表达和化合物合成至关重要。然而，K. phaffii 中传统的基因整合策略面临着选择标记有限、操作复杂和耗时长等挑战。CRISPR/Cas9基因编辑方法解决了这些问题，对该酵母宿主的广泛使用贡献巨大。 Weninger等人（2016）首次证明了使用CRISPR/Cas9系统在K. phaffii中进行无标记基因敲除的可行性。然而，非同源末端连接修复机制仍然阻碍了异源基因的高效整合。敲除NHEJ的关键基因KU70，成功提高了单个或多个基因的删除和整合效率。此外，DNA连接酶IV也在NHEJ中起作用，敲除DNL4显著提高了编辑效率。另一方面，增强同源定向修复也可以提高编辑效率。例如，过表达来自K. phaffii的HDR基因RAD52或来自酿酒酵母的RAD52、RAD59和MRE11，有效地提高了基因删除和多基因整合效率。 除了Cas9，其他类型的Cas蛋白也已在K. phaffii中进行了评估。开发了一个CRISPR/Cpf1系统，其编辑效率与CRISPR/Cas9相当。它实现了20 kb DNA片段的删除和多个基因的一步整合。值得注意的是，一个来自直肠真杆菌的密码子优化Cpf1蛋白（也称为MAD7）被鉴定出来。在对K. phaffii全基因组中259个激酶基因进行敲除评估后，衍生的CRISPR/MAD7系统显示出23%的平均编辑效率。尽管其编辑效率明显低于Cas9系统，但MAD7的无专利限制为各种场景提供了更多可能性。目前，基于CRISPR的基因编辑方法正在不断更新。表3总结了在K. phaffii中开发的主要已报道CRISPR系统。 随着K. phaffii在化学品合成中的扩展应用，相应地需要增加中性整合位点以适应多酶途径优化。在基因组中总共识别出31个额外的中性位点，这促进了基因整合到基因组中，并实现了长春质碱的从头生物合成。在另一项研究中，识别出46个中性位点用于基因整合，且不影响正常细胞功能。其他一些工具，如碱基编辑器和先导编辑器，能够实现精确的单碱基或多碱基编辑，也正在开发中。开发了一个C-to-T碱基编辑器，其最大单点编辑效率达到96%。这展示了新编辑系统在K. phaffii中的潜力，尽管在实际应用前还需要更多的研究。 6.2.2. 表达调控元件的筛选与重构 影响转录强度的启动子最终会改变蛋白质表达和化合物合成。在K. phaffii中，甲醇诱导型启动子是最常用的，因为参与MUT途径的大多数基因都受甲醇诱导调控。其中，P_{AOX1}因其高表达强度和紧密的诱导模式而被视为最流行的诱导型启动子。其他甲醇诱导型启动子，如P_AOX2、P_DAS1、P_DAS2和P_FLD1，也已用于不同情况。不依赖甲醇的启动子也已开发出来，例如组成型启动子P_{GAP}和响应其他信号（如乙醇、鼠李糖、硫胺素和磷酸盐）的启动子。其中，筛选出的乙醇诱导型启动子P0074与P_AOX1相比表现出优越的蛋白质表达能力（Liu et al., 2025）。此外，还报道了几个启动子变体（如P_D_F和P_U_PP）以及异源启动子（如P_LCC1、P_MOX和P_CUP1）。值得注意的是，在恒化培养中，基于P_D_F和P_U_PP的无甲醇表达系统通过稀释速率调整优于P_GAP，实现了9倍高的比生产率。在补料分批培养中，这两个表达系统在中低比生长速率下表现出良好的蛋白质表达能力，并再现了调控模式的差异。特别地，P_DH表现出生长解偶联的调控特征，允许仅通过在高和低补料速率之间切换来控制基因表达。通过伪饥饿进行的单周期生物量生长和表达诱导实现了P_DH的最高生产率，与基于P_GAP的补料分批培养相比，在低比生长速率下实现了3.6倍高的比生产率。该启动子的高强度变体也随后被开发出来。 随着合成生物学的发展，需要更多具有不同强度和灵活调控模式的启动子。可以通过修饰其上游调控序列、5'非翻译区、Kozak序列和核心序列来获得突变启动子。通过随机重排或理性设计修饰URS被证明是有效的，并且从P_AOX1、P_GAP、P_GTH1等获得了多种突变体。此外，组装来自不同启动子的URS实现了强合成启动子。核心序列通常不与转录调控因子结合，但与RNA聚合酶和转录起始复合物相互作用。分析了来自K. phaffii和酿酒酵母的天然核心启动子序列，指导了具有不同强度的合成核心启动子的设计。此外，使用卷积神经网络和微流控分选方法筛选P_AOX1的核心区突变体，获得了一个强度比野生型高4.3倍的突变体。 5' UTR和Kozak序列主要影响翻译过程。关于K. phaffii中这些元件的研究相对有限。通过替换和修饰P_AOX1的5' UTR评估了其对启动子强度的影响，并确认了其中的正负调控元件。值得注意的是，在各种酵母物种中对5' UTR进行了全基因组分析，结果显示在K. phaffii中，编码序列上游200 bp区域内的鸟嘌呤含量显著降低。用腺嘌呤或胸腺嘧啶取代鸟嘌呤显著提高了启动子活性。还阐明了Kozak序列中三联体单元（KZ3）的影响。因此，基于5' UTR-KZ3组合构建了具有不同强度的启动子变体。此外，终止子可能通过影响mRNA的3'末端加工、稳定性和丰度来影响表达水平。尽管在K. phaffii中关于终止子的研究报道有限，但不同终止子之间的表达强度差异可达17倍，证实了终止子元件的调控作用。 6.2.3. 合成表达工具的设计与构建 在K. phaffii中，天然元件的筛选和改造受到其固有的内源调控网络和活性上限的限制。利用外源调控元件重新设计基因回路，可以开发出具有更高正交性、稳定性和鲁棒性的新表达工具。在K. phaffii菌株中独立构建了雌二醇和甲醇诱导的基因表达盒，在便携式灌注微生物反应器中使用时，实现了两种生物药物的高密度和可编程表达。此外，如前所述，用原核操纵子元件替换天然转录激活因子的结合结构域和内源启动子的上游调控序列，产生了工程化的iTSAD。在此基础上，可以通过控制融合的反式激活因子，或修饰融合的反式激活因子和杂合启动子，衍生出一系列表达工具。因此，构建并表征了组成型和诱导型转录装置，与传统的启动子变体相比，提供了数百种多样化、强效且精细可调的 expresion 工具。此外，用蓝光传感器相关元件替换原核操纵子元件，产生了光诱导或光抑制系统。响应其他化学信号的表达系统也已开发出来，此处不再详述。 近年来，基于dCas9的衍生调控工具也得到了探索。由于dCas9仅保留DNA结合能力，它可以直接使用而无需修改DNA序列，或与其他效应结构域融合。CRISPRi、CRISPRa和CRISPR编辑系统已在K. phaffii中相继开发出来，用于各种表达控制。例如，将N-degron引入dCas9蛋白中以实现其失稳。修饰后的dCas9由血红素诱导型启动子驱动，随后用于调控血红素合成相关基因，最终开发了一个响应血红素浓度的动态调控传感器。总的来说，基于dCas9的工具在多重表达控制方面显示出巨大潜力，但仍需要其分子量减小的变体，以避免对DNA序列的过度干扰。上述基因编辑和代谢调控工具总结在图4中。 6.3. 代谢模型的开发 胞内代谢途径在一个或多个代谢中间体处相互连接，形成了一个高度复杂的网络。细胞通过这些天然的代谢和调控网络维持整体稳态。然而，传统的代谢工程策略可能会破坏这些细胞网络的稳定性。研究人员通常需要大量的试错来寻找既能提高产量又不损害宿主适应性的最优策略。这个过程通常是耗时且劳动密集的。因此，有必要了解细胞内在的代谢网络，这可以指导人们更高效地寻找目标靶点。 基因组测序和组学技术的进步推动了基因组规模代谢模型的发展。GEMs整合了来自各种生物数据库的数据，涵盖基因注释、代谢反应、代谢物、蛋白质表达调控及其相互作用。它们能够绘制代谢途径图，并实现特定条件下的通量分析，以指导途径优化。酶、动力学和细胞过程等各种约束已被添加到传统的GEMs中，这些模型不仅包含代谢网络信息，还考虑了动态细胞过程，如酶浓度限制和代谢物前体可用性。对于K. phaffii，最初提出了两个GEMs：PpaMBEL1254（菌株DSMZ 70382，包含1254个反应和1147个代谢物）和iPP668（菌株GS115，包含1361个反应和1177个代谢物）。随后报道了iLC915模型，该模型预测了在甲醇和甘油等碳源上的生长和蛋白质生产。基于前述的PpaMBEL1254、iPP668和iLC915模型，进一步开发了进化版本iMT1026、iRY1243和Kp1.0。GEMs的构建和精炼可以帮助人们预测各种条件下的细胞生长，并识别提高产量的潜在靶点。通过GEMs预测和修改候选靶点，显著提高了人超氧化物歧化酶、人血清白蛋白和S-腺苷甲硫氨酸的产量。 结论与未来展望 总之，基因和代谢工程工具的快速发展已将K. phaffii从一个常规的表达宿主彻底转变为一个高度可编程且日益成熟的生物制造底盘。基因组编辑技术的持续扩展，结合动态和诱导型启动子系统以及系统级建模框架的出现，显著提高了菌株工程的精确性、灵活性和可控性。这些进展共同为理性设计提供了坚实的基础，并极大地加速了K. phaffii向更复杂、更多样化应用的转变。 在这个强大的工程基础上，K. phaffii的应用领域已经远远超出了其传统的重组蛋白生产角色。虽然它仍然是高水平蛋白质表达的最具竞争力的平台之一，但近期糖基化工程的进展进一步增强其生产具有定制化和人源化糖基化模式蛋白质的能力，从而增强了其在生物制药制造中的相关性。同时，在构建复杂生物合成途径方面日益增多的努力已证明其在生产天然产物和其他高附加值化学品方面的潜力，反映了其从以蛋白质为中心的系统向通用微生物细胞工厂的明显转变。 与此同时，对替代碳源（特别是C1和C2原料）的探索代表了一项显著的进展，这进一步将K. phaffii与传统模式生物区分开来。其固有的C1/C2利用能力，结合正在进行的提高底物灵活性的工程策略，为开发可持续且成本效益高的生物过程提供了独特的优势。这些特性使K. phaffii成为由非传统和可再生原料驱动的下一代生物制造中极具吸引力的候选者。 尽管取得了这些令人鼓舞的进展，但仍有几个挑战需要认真解决。代谢调控的内在复杂性以及异源途径性能的有限可预测性仍然制约着系统的有效优化。此外，代谢负担、氧化还原失衡以及对调控网络的不完全理解等问题仍然是不可忽视的障碍。同时，对于大宗食品、饲料和生物材料蛋白的制备，迫切需要低成本、高效的细胞分离和产品纯化方法。从工业角度来看，与大规模发酵、过程稳健性和可放大性相关的挑战进一步凸显了实验室成果与商业应用之间的差距。 未来的研究预计将更加重视将多组学数据集与机器学习辅助设计相结合，以提高菌株工程的可预测性和效率。开发更精确的动态调控系统，包括先进的启动子架构，对于微调基因表达和平衡代谢通量至关重要。同时，在糖基化工程、途径优化和放大策略方面的持续进展对于充分释放K. phaffii的工业潜力至关重要。扩展其高效共利用混合碳源的能力可能会进一步增强其在可持续生物过程中的竞争力。 总体而言，K. phaffii已成为先进生物制造中一个有竞争力的主力菌株。未来的研究需要集中在提高基因编辑效率、超强蛋白质表达能力和优异的抗逆性上。通过这些努力，工业酵母K. phaffii有望与传统面包酵母相媲美，成为一个多功能且占主导地位的工业宿主。

中国药科大学中药学院孔令义/王凯波团队在Nucleic Acids Research发表天然生物碱干预G4-STAT1互作并协同PARP抑制剂诱导癌细胞死亡的最新研究成果 PPS  孔令义教授 近日，中国药科大学中药学院孔令义/王凯波团队在学科顶尖期刊Nucleic Acids Research上在线发表了题为“A small molecule disrupts G4–STAT1 interaction and synergizes with olaparib to drive cancer cell death”的最新研究成果。该校博士研究生王莹莹、硕士毕业生卞雨婷和湖南大学博士研究生张雪楠为论文共同第一作者，孔令义教授、王凯波研究员、杨丹洲教授、郑克威教授为通讯作者，中国药科大学为第一通讯单位。 Bloom综合征蛋白（BLM）是一种RecQ家族DNA解旋酶，在多种恶性肿瘤中高表达，但其治疗潜力仍未被深入探索。该研究重点靶向BLM启动子区的G-四链体（BLM-G4）以抑制BLM信号通路。作者首先对BLM启动子区域中的平行型BLM-G4结构进行了理化性质表征。随后首次证实，BLM-G4可招募磷酸化信号转导及转录激活因子1（pSTAT1）以激活BLM表达。重要的是，两种天然G4结合生物碱——小檗碱（BER）和黄连碱（COP）能与STAT1竞争性结合BLM-G4，从而显著抑制结肠癌细胞中的BLM表达。随后，作者利用核磁共振波谱和AMBER计算解析了BER/COP−BLM-G4复合物结构，为合理设计新一代BLM-G4靶向配体提供了重要依据。除了对BLM的调控作用外，通过对全基因组STAT1-CUT&Tag-seq、G4-CUT&Tag-seq及COP-RNA-seq的联合分析，证实了STAT1是一种通用的G4结合转录因子，而COP是一种泛基因组G4稳定剂。此外，BER/COP与olaparib联合用药通过破坏DNA修复通路并加剧DNA双链断裂，在诱导结肠癌细胞死亡方面表现出显著的协同效应。 总体而言，该研究揭示了一种由BLM-G4−STAT1相互作用介导的BLM基因表达上调的新表观遗传机制，并表明G4稳定剂与PARP抑制剂的联合疗法是治疗复杂癌症的一种具有广阔前景的策略。 该研究工作得到了国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、江苏省双创团队基金、多靶标天然药物全国重点实验室基金、中央高校基本科研业务费等资助。 全文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag383 信息来源：中国药科大学 往期推荐 ! 免责声明 “汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。  喜欢的点个“看一看”和"喜欢"吧 不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~