摘要:流感病毒具有高度变异性,这是导致流感疫苗保护率较低的主要原因,其保护率仅在 20%~60% 之间。因此,开发新型疫苗以应对流感病毒的变异十分必要。mRNA 流感疫苗的生产基于体外转录(in vitro transcription, IVT)技术的无细胞制造体系,该体系能大幅降低生物安全风险,且疫苗具有免疫原性高、生产周期短等优点,使其可快速响应流感病毒的变异,已成为新型流感疫苗的研发热点之一。本文就 mRNA 疫苗历史及现状、mRNA 流感疫苗的研究进展作一综述,以期为流感疫苗的迭代升级与广谱保护策略提供科学依据。与 DNA 疫苗不同,mRNA 疫苗可在细胞质中直接表达抗原,无需进入细胞核。这一特性不仅降低了药物递送难度(无核定位步骤),还可规避基因组整合风险,从机制上消除了插入突变的可能性。mRNA 疫苗的生产基于体外转录(IVT)技术的无细胞制造体系,能大幅降低生物安全风险(如避免宿主细胞污染),生产周期也缩短至传统疫苗的 1/3。mRNA 疫苗的核心优势在于 “即插即用” 的模块化平台设计,通过替换抗原编码序列(如流感病毒的血凝素(haemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因)即可快速开发新疫苗,脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)封装等核心工艺无需调整,显著提升了疫苗研发的延展性。另外,通过多抗原混合递送(如复合 LNP 制剂)或基因融合技术(串联多表位序列)可构建覆盖多种变异株的多价疫苗,使针对流感病毒的广谱保护效率提升 2~3 倍。在免疫激活层面,mRNA 疫苗可同时激发双通道免疫应答,既可通过分泌型抗原诱导 B 细胞产生中和抗体,又可通过主要组织相容性复合体 -Ⅰ(Major Histocompatibility Complex-Ⅰ, MHC-Ⅰ)类分子递呈内源性抗原,激活强效 CD8+T 细胞反应。这种协同作用使其免疫保护率较传统流感疫苗(依赖单一体液免疫)大幅提高,特别是在应对快速变异的流感病毒株时,可展现出独特优势。1 mRNA 疫苗的发展与现状20 世纪 80 年代,有研究证明,外源 mRNA 可在细胞内表达特定蛋白,并引起免疫反应;随后,有研究开发了一种基于 mRNA 的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)疫苗,但免疫小鼠后,引发了严重的炎性反应;2005 年,该疫苗的研发者将尿嘧啶替换为假尿嘧啶,降低了 mRNA 本身引起的免疫反应,该发现获得了 2023 年诺贝尔生理学或医学奖。2020 年,SARS-CoV-2 在全球范围内流行,确定病毒序列后,德国 BioNTech 及美国 Moderna 等多家公司迅速研发了 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗,其中,德国 BioNTech 公司研发的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗产品 BNT162b2 于 2020 年 12 月获得紧急使用授权,2021 年 8 月全面批准上市,成为全球第 1 款获批上市的 mRNA 疫苗产品;随后美国 Moderna 公司生产的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗产品 mRNA-1273 也获得了紧急使用授权。2023 年 3 月,石家庄石药控股集团有限公司的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 SYS6006 在中国纳入紧急使用,这是第一款我国企业自主研发,并在国内获得紧急授权使用的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗。mRNA 疫苗也适合其他传染病疫苗的研发,如呼吸道合胞病毒、流感病毒等,还可用于治疗多种疾病,如编码血管内皮生长因子的 mRNA 可用于治疗心血管疾病;编码能产生细胞因子功能蛋白的 mRNA 可用于重塑肿瘤微环境并恢复免疫适应性,编码肿瘤相关抗原的 mRNA 可用于肿瘤的治疗,包括黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等。1.1 mRNA 疫苗的序列设计mRNA 由 5'- 帽子、非翻译区(untranslated region, UTR)、编码序列区(coding sequence region, CDS)和多聚腺苷酸尾 poly (A) 组成,这些基本结构域均可影响 mRNA 的稳定性、免疫原性和翻译效率。人工合成未经修饰的 mRNA 存在稳定性差、翻译效率低、自身免疫剧烈等问题,阻碍了其临床应用。针对 mRNA 序列的优化和设计已取得一定进展,如将尿嘧啶替换成假尿嘧啶可降低 mRNA 免疫原性,显著提高翻译效率;核苷类似物 N6 - 甲基腺嘌呤核苷、5 - 甲基胞苷三磷酸等也可进一步降低 mRNA 自身的免疫原性。mRNA 的 UTR 可分为 5'UTR 和 3'UTR,分别位于编码区的两端。UTR 可通过与 RNA 结合蛋白相互作用影响转录本的翻译速率和半衰期,因此,UTR 的优化对 mRNA 疫苗设计尤为重要。非洲爪蟾或人类 α- 珠蛋白及 β- 珠蛋白的 UTR 具有高度稳定性,已成为 mRNA 疫苗常用的 UTR;也可通过生物信息学方法设计 UTR 序列,如德国 BioNTech 公司研发的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 BNT162b2 的 3'UTR 是通过筛选 Split 蛋白氨基端增强子 / Split 转导样增强子 5(amino-terminal enhancer of split/transducin-like enhancer of Split 5, AES/TLE5)基因和人线粒体 12S rRNA 的 3'UTR 序列,并将两者结合后构建而成;美国 Moderna 公司研发的 mRNA-1273 疫苗也是采用优化后的 UTR 构建而成,有效率高达 94.5%,该公司还开发出针对特定编码区设计定制化 UTR 的算法,仅用 2 小时即可设计出完整的疫苗 mRNA 序列;SAMPLE 等采用生物信息学方法建立了一个基于随机 5'UTR 库的预测模型,该模型可设计新的 UTR 序列,并预测其翻译效率,可提高 mRNA 的翻译效率,延长半衰期。另外,mRNA 疫苗的调控元件 5'- 帽子为 7 - 甲基鸟苷(7-methy-lguanosine, m7G),通过 5',5'- 三磷酸桥与 5' 端第 1 个核苷酸项链添加至 mRNA 上,具有招募核糖体和促进翻译的功能;Poly (A) 尾为 3' 末端多聚腺苷酸化部分,具有调控 mRNA 稳定性和蛋白质翻译效率的功能。目前,mRNA 疫苗主要为线性 mRNA,可分为非复制型 mRNA(non-replicating mRNA)和自扩增型 mRNA(self-amplifying mRNA),前者是利用细胞机制翻译相应蛋白质;后者既可编码抗原,也包含编码 mRNA 自我复制的辅助蛋白,包括 RNA 聚合酶、加帽酶、蛋白酶等。大多数参与 mRNA 降解的核糖核酸酶具有 5' 或 3' 端依赖活性,因此,线性 mRNA 的稳定性较低。环状 mRNA(circRNA)具有共价闭合的环形结构,可保护自身免受核酸酶的降解,稳定性更好,半衰期更长,解决了线性 mRNA 稳定性较低的问题。1.2 mRNA 疫苗的递送方法mRNA 高效、安全的递送是成功开发 mRNA 疫苗的关键环节。mRNA 带负电荷,在血液中会被核酸酶迅速降解,无法通过同样含有负电荷的磷脂双分子层进入细胞内。因此,需采用载体将 mRNA 递送至靶细胞。目前,已开发多种材料用于 mRNA 递送,包括脂质、类脂材料、聚合物和蛋白质衍生物。LNPs 是最常见的 mRNA 递送系统,具有较大负载量、较高稳定性和生物相容性,LNPs 通常由 4 种成分组成,包括可电离的阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质。常见的阳离子脂质有 N-[1 (2,3 - 二油酰氧基) 丙基]-N,N,N - 三甲基氯化铵(N [1-(2,3-dioleoyloxy) propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride, DOTMA)和二亚油酰甲基 - 4 - 二甲氨基丁酸酯(dilinoleoyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate, Dlin-MC3-DMA),阳离子脂质能够介导 LNPs 与细胞浆或内体膜间的静电相互作用,促进 mRNA 的细胞内化;常见的磷脂有 1,2 - 二硬脂酰 - sn - 丙三基 3 - 磷酸胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC)和 1,2 - 二油酰基 - sn - 丙三基 3 - 磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE),位于 LNPs 的外围,有助于包裹核酸,稳定 LNPs;聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)脂质由 PEG 与锚定脂质结合而成,如 DSPE-PEG 2000,为 LNPs 提供了外聚合物层,可阻碍血清蛋白和单核吞噬细胞系统的吸附,延长体内循环时间;胆固醇是一种天然存在的脂质,在 LNPs 制剂中,胆固醇占总脂质的 20%~50%,可通过填充脂质之间的空隙增强纳米颗粒的稳定性,从而提高 mRNA 递送效率。mRNA-1273 和 BNT162b2 疫苗均采用 LNPs 作为递送载体。2 mRNA 流感疫苗的研究进展流感病毒属于流感病毒属正黏病毒科,为分节段负链 RNA 病毒,由 8 个 RNA 片段组成。根据核蛋白和基质蛋白可分为甲、乙、丙、丁 4 个亚型。甲型流感病毒根据 HA 和 NA 的抗原性,可进一步分为多个亚型,如 H1N1、H3N2;乙型流感病毒仅分为 Yamagata(B/Victoria lineage, BV)和 Victoria(B/Yamagata lineage, BY)两个抗原区分谱系。mRNA 疫苗技术具有生产周期短,不依赖鸡胚,安全性高等优点。目前,mRNA 流感疫苗成为研发热点,已有多款 mRNA 流感疫苗处于临床试验或临床前阶段,如下表所示:2.1 季节性 mRNA 流感疫苗美国 Moderna 公司研发的四价季节性流感疫苗 mRNA-1010(Fluarix)可编码 4 种流感病毒表面 HA 蛋白,分别为 H1N1、H3N2、BY 和 BV,Ⅲ 期临床试验数据显示,该疫苗对甲型流感病毒具有较高的中和抗体滴度,而对乙型流感病毒的中和抗体滴度较低,且在老年人中的免疫原性较低;更改剂型后,对 4 种亚型 H1N1、H3N2、BY、BV 均可产生更高的中和抗体滴度。另外,美国 Moderna 公司正在开发的流感疫苗 mRNA-1011 及 mRNA-1012 包含了更多型别的 HA 抗原,以扩大血清型的覆盖,mRNA-1020 和 mRNA-1030 疫苗中增加了 NA,以改善免疫响应,减少病毒抗原逃逸的可能性。法国 Sanofi/TranslateBio 公司研发了一种编码 H3N2 HA 蛋白的单价 mRNA 流感疫苗,Ⅰ 期临床试验数据显示,第 2 次注射 2 周后,各剂量组血清阳转率在 91%~100% 之间。美国 Pfizer 与德国 BioNTech 公司联合开发的四价修饰 mRNA 流感疫苗 Ⅲ 期临床试验数据显示,该疫苗在 65 岁以上人群中可引起更强的 CD4 + 与 CD8+T 细胞免疫反应。2.2 通用 mRNA 流感疫苗流感病毒具有高突变性,可通过开发通用疫苗加以应对,如采用病毒保守表位设计抗原,使疫苗免受抗原漂移和转换的影响,为季节性流感提供更广泛的保护。南方科技大学医学院通过对流感病毒 HA、NA、NP 和 M2 4 种抗原的全序列检索、比对,寻找保守序列,获得了由保守序列组成的 T、B 细胞表位和 MHC 表位,设计了包含多种保守表位的潜在通用 mRNA 疫苗,基于免疫信息学分析,该通用型 mRNA 多表位疫苗可能对 A 和 B 型流感各亚型具有保护潜力。美国宾夕法尼亚大学研究开发了一种针对所有 20 种已知流感病毒亚型的 mRNA 实验性疫苗,该疫苗编码来自所有 20 种已知甲型流感病毒亚型和乙型流感病毒谱系的 HA 抗原。这种多价疫苗在小鼠和雪貂体内引起了高水平的交叉反应性和亚型特异性抗体。这些抗体对所有 20 种编码抗原均有反应,能够提供广泛保护性作用,有望成为预防未来流感大流行的通用措施。NIAID 研发的广谱通用型 mRNA 流感疫苗 FluMos-v1 纳米颗粒表面嵌入了多种流感病毒的 20 多个 HA 片段,Ⅰ 期临床试验结果显示,可刺激机体产生针对几种不同毒株流感病毒的抗体。上海生物制品研究所有限责任公司基于生物信息学分析,选择在不同亚型流感病毒中高度保守的保护性抗原及其结构域,设计了可融合表达流感病毒 M2e 串联序列、HA 茎部区域长 α 螺旋(long alpha helix, LAH)串联序列和病毒 NP 抗原的组合策略,开发出一款新型广谱流感 mRNA 疫苗,该疫苗可诱导广泛的体液和细胞免疫反应。综上所述,通用流感疫苗的开发有许多途径,如构建保守的 T、B 细胞表位流感疫苗或有针对性加入额外抗原构建多价流感疫苗,这些途径可通过 mRNA 技术轻松实现。3 挑战及应对措施mRNA 流感疫苗对抗流感流行具有极大潜力,但进入实际应用仍有问题急需克服,如抗原逃逸及疫苗稳定性等。由于流感病毒的高突变性,流感疫苗常出现疫苗株与流行株不匹配的现象。对下一代疫苗进行合理设计,以最大限度提高疫苗的保护率,是流感疫苗需要解决的问题。一方面可通过上述多种途径开发通用 mRNA 流感疫苗,如多价、T 细胞靶向的流感疫苗,对多种流感病毒提供更广泛、持久的保护;另一方面可通过生物信息学方法更准确地预测流行株,减少疫苗逃逸现象。由于 mRNA 具有不稳定性,mRNA 疫苗均需较高的冷冻储存和运输(-70℃)条件,在一定程度上限制了 mRNA 流感疫苗的应用,提高 mRNA 热稳定性可在一定程度上解决该问题。从制剂入手,可将 mRNA 疫苗制备为冻干制剂,如深圳瑞吉生物科技有限公司研究开发的冻干 LNP-mRNA,即 SARS-CoV-2 疫苗 RH109,可于室温(25℃)长期储存。从 LNPs 配方入手,可对 LNPs 进行改造和工艺优化,以提高 mRNA 疫苗的稳定性;也可从序列入手,通过去除 HA 抗原的头部,保留更保守的茎部区域,还可通过截短抗原序列,缩短 mRNA 长度,以提高 mRNA 的稳定性。苏州艾博生物科技有限公司研发的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 ARCoV,使用 S 蛋白的受体结构域(receptor binding domain, RBD)结构域,仅长 669 bp,该疫苗于 4 和 25℃条件下至少可保存 1 周。为获得稳定性更高的 mRNA 疫苗,需对上述因素进行综合考虑。4 小结及展望mRNA 流感疫苗具有替代传统疫苗的巨大潜力,其研发周期短、生产流程简便、易于针对病毒变异株快速更新。目前,多款 mRNA 流感疫苗已进入临床试验阶段,初步数据显示,其能够诱导强烈的体液和细胞免疫反应,保护效果可能优于传统灭活疫苗。但 mRNA 流感疫苗的广泛应用仍面临多个挑战,如在稳定性、安全性及递送效率等方面仍需改进。另外,生产成本优化和公众对新技术接受度的提升也是 mRNA 疫苗广泛应用的关键。相信在不久的将来,mRNA 流感疫苗会获批上市,成为预防流感更有效的手段。识别微信二维码,添加生物制品圈小编,符合条件者即可加入生物制品微信群!请注明:姓名+研究方向!版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com),我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。