HLA class II抗原 x LAG3

摘要：双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种格式，能够同时结合多个表位，解锁了治疗以前难以治疗或不治之症的机制。早期评估候选抗体的开发潜力可以降低潜力低的抗体的等级，并提升最有前途的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的治疗需要一套严格的开发潜力要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），而这些要求的评估需要一套强大的方法工具箱，其中很少有经过验证用于询问bsAbs/msAbs。在评估bsAbs/msAbs的开发潜力时，需要考虑的重要因素包括它们的分子格式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性和高产量生产的潜力。在这里，我们总结了开发潜力评估的关键方面，并提供了如何为给定的bsAb/msAb制定全面计划的指导。 1.介绍 抗体工程的进步已经发展出了多样化的生产和纯化流程，以推进各种大小和复杂性不同的分子格式。双特异性抗体（bsAb；具有两种不同结合特异性的抗体）和多特异性抗体（msAb；具有三种或更多不同结合特异性的抗体）允许在多种疾病领域进行新颖的治疗应用。然而，与传统单克隆抗体（mAb）开发相比，实现双特异性或多特异性所需的典型抗体流程和格式的偏差带来了额外的挑战，并且与开发潜力评估的最佳实践相关的信息很少。本综述总结了bsAbs/msAbs开发潜力的关键考虑因素，这些因素在药物开发过程中集体评估时有助于最大化技术成功的可能性。 通过不变簇分化3（CD3）与靶向肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用，招募T细胞来识别T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC），已有几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了免疫细胞重定向，双特异性和多特异性还被用于增加对细胞亚型（例如，用于治疗转移性非小细胞肺癌的volrustomig）的特异性和克服常见的抗性途径（例如，用于治疗EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的amivantamab）。 单克隆抗体（mAbs）作为治疗多种疾病和条件的治疗选择的引入，为患者提供了许多以前未满足的医疗需求的解决方案，或者提供了比早期护理标准更有效和/或更安全的治疗。尽管mAbs的治疗成功是不可否认的，但仍有许多未满足的医疗需求。 bsAbs/msAbs是一类能够同时结合多个靶标的大分子，从而解锁了传统mAbs无法提供的新颖作用机制（MOA）和生理特性。bsAbs已被用于肿瘤学中，通过同时结合所需的免疫细胞和肿瘤细胞本身，有效地治疗多种癌症。bsAb T细胞接合器（TCEs）绕过了通过招募T细胞来识别肿瘤相关抗原的T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC）的需要。几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子已经获得了FDA的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了在肿瘤学中的应用，bsAbs在2017年通过emicizumab（Hemlibra®）的批准中展示了成功，这是一种bsAb，能够识别酶因子IXa和底物因子X[凝血因子IXa（FIXa）×FX]，用于治疗血友病。 尽管FDA尚未批准任何msAbs，但在临床前和早期临床开发中已经披露了几个有前景的分子。随着我们对疾病病因学的理解的进步，bsAbs/msAbs有望通过多因素靶向潜在生物学或通过增强药代动力学（PK）和药效学（PD）属性来进一步改善结果。 虽然同时结合多个靶标的能力是bsAbs/msAbs的优势，但将多个异质结合基团整合到单个分子中也存在风险，需要在开发潜力计划中通过仔细的临床前评估、选择和修改来考虑和最小化。例如，虽然CD3 TCE bsAbs/msAbs可以有效地将T细胞与TAA结合起来，但微量杂质的存在或稳定性差可能导致异常的T细胞激活，这可能导致患者的不良反应。此外，开发潜力可能取决于上下文，如在静脉注射抗体不导致免疫原性的情况下，皮下注射相同疗法却导致免疫原性的情况，正如Janssen在voxalatamab（JNJ-63898081）中的经验，这是他们的前列腺特异性膜抗原（PSMA）×CD3 bsAb。 早期、有目的、主动的抗体开发潜力评估和修改对于最小化后期开发中昂贵且耗时的挫折以及高效地识别具有成为安全、有效和可制造治疗潜力最大的分子至关重要。 任何格式的基于抗体的治疗药物的开发路径都是漫长而复杂的，需要大量的财务和人力资源。因此，开发潜力应在药物开发过程的早期进行评估，并减轻风险，以最大化整体成功的可能性。可接受的开发潜力，此处定义为分子对药物开发和给药过程中的测试、制造、储存和给药要求的适应性，因此是任何药物开发计划成功的关键标准。与mAbs相比，bsAbs/msAbs的开发带来了额外的独特挑战，因为它们固有的结构复杂性。虽然每种bsAb/msAb格式都会呈现不同的挑战，但有广泛适用于它们开发的总体方法，可以作为起点，并在需要时在方法上进行偏差。 潜在抗体治疗的开发潜力评估是多因素的，有越来越多的工具和流程可用于协助预测低风险分子。需要考虑的重要开发潜力因素包括了解给定bsAb/msAb的分子格式，以及评估它们的免疫原性、特异性、稳定性和可制造性的策略和方法。 2.抗体格式 在人类中，天然抗体由四个多肽链组成，组织成两个相同的轻链和两个相同的重链。抗原识别是通过两个相同的可变抗原结合（Fab）区域进行的。蛋白质和抗体工程的进步带来了各种不同的bsAb/msAb格式，这些格式从免疫球蛋白（Ig）样格式变化到高度工程化的分子，这些分子与传统IgG的相似性最小，这些主题有无数的变化（图1）。这些不同的bsAb/msAb格式与传统mAbs相比具有独特的属性，并有可能实现精确的功能性属性以治疗一系列疾病。Wilkinson和Hale最近发表的一篇出版物中对抗体设计的多样性进行了深入调查。 图1. 常见的单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）配置。a. 标准免疫球蛋白G抗体；b. 对称IgG样双特异性抗体；c. 含有scFv和sdAb的双特异性抗体；d. 多价双特异性抗体；e. 多特异性抗体。 基于IgG的bsAb/msAb格式通常保留天然蛋白质的可结晶片段（Fc）区域，通常可以细分为对称或不对称格式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来增强链配对效率，以及修改Fc介导的功能或半衰期延长。 基于片段的分子，如单链可变片段（scFv）或驼类重链可变域（VHH），通常不包含Fc区域，保留抗原结合的最小要求，允许连接不同的结合片段。通常引入不同长度的连接子来连接具有独特功能属性的不同部分。虽然这些偏离传统IgG格式的变化是必要的，以便启用或改善功能性活动，但它们也影响了其开发潜力。 确保bsAbs/msAbs的适当开发潜力和可制造性需要特别考虑抗体格式。一般起点是确定正在评估的新型格式与“IgG样”的相似程度，与天然蛋白质的偏差越大，需要越来越严格的审查。例如，为了推动bsAb的轻链和重链的正确组装而应用的有目的的突变，可能会降低稳定性，增加免疫原性，和/或改变Fc功能。 同样，虽然缺乏Fc的格式，如scFvs，可能提供更好的生物分布和更高的效力，它们通常容易高度聚集，并可能导致分子没有所需的溶解度和稳定性水平的最终治疗。此外，通常需要双特异性格式或多特异性格式的连接子，这些格式附加了额外的scFv或Fab到IgG框架，这些连接子本身可能会引入免疫原性或显著改变药代动力学（PK）属性。 一旦传统的IgG骨架被修改以允许双特异性或多特异性，就需要定制的制造过程，以获得足够数量的高纯度bsAb/msAb。一个主要考虑因素是，每种独特的格式通常需要不同的纯化策略。例如，由于许多基于片段的抗体缺乏Fc，它们需要偏离用于典型IgG的基于蛋白A亲和色谱的纯化策略。由此产生的bsAbs/msAbs通常具有缩短的半衰期，需要在配方中进行额外考虑，如持续静脉内输注或修改，如与聚乙二醇或人血清白蛋白融合，以延长半衰期，实现更有利的PK特性。 此外，许多双特异性和多特异性格式可以引入多种格式特定的杂质，这些杂质对许多分析和纯化方法提出了独特的挑战。这些格式特定的杂质在生物物理属性（如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产品几乎相同，需要开发定制的分析测定和/或纯化方法。 对双特异性和多特异性格式的修改也可能影响蛋白质表达水平，因此可能不适合高通量生产和开发潜力调查。因此，必须仔细考虑不同格式及其产生足够产量和产品质量以进行高通量开发潜力测定的能力。综合考虑，正在开发中的格式与所需的治疗候选属性应指导开发潜力评估策略。 2.1.格式考虑 虽然这里没有回顾bsAb/msAb工程策略的细节，但了解为什么做出某些工程选择以及分子格式的修改如何影响功能是重要的，这使得一个知情的过程能够从功能和开发潜力的角度权衡候选分子的相对风险。就与目标结合相关的功能而言，bsAb/msAb格式可以在两个一般类别中相互偏离：结合价（即，任何目标的结合基团数量）和结合几何学（即，组装分子中靶向基团的相对方向）。 这些两个维度的变化如何产生改善活性的例子包括zanidatamab，这是一种HER2靶向双特异性抗体，它采用了scFv和Fab，从而改善了受体聚集和补体依赖性细胞毒性，以及BiTE（双特异性T细胞接合器）格式，这是两个scFv分子的融合，是第一个商业批准的TCE。这种格式虽然容易聚集，但在目标肿瘤细胞和T细胞之间实现了短的细胞间距离，这可以导致与更IgG样的bsAbs相比显著增强的细胞毒性效力。 BiTE格式的演变是双亲和性重定向抗体格式，它包括一个经过工程改造的二硫键，连接了两个可变域（Fv）的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）的交叉融合。分子格式对活性和开发潜力的耦合影响是过去二十年的积极研究领域。 Loh等人比较了八种不同的HER2 × CD3“结-孔”Fc基础bsAb格式在稳定转染池中的表达、纯化容易性、热稳定性、抗原结合和功能表征。在这项研究中，几何学和价的变化没有影响表达水平或热稳定性，但增加scFv的数量导致了更高的异质性和聚集倾向。Madsen 等人进行的一项类似研究通过使用带有10个氨基酸连接子的单域抗体（sdAb）与IgG融合，生成了针对PD-L1 × HER2的不同几何结构的双特异性抗体（bsAbs），并评估了它们的生产、稳定性、抗原结合以及CD16a结合特性。将sdAbs融合到重链的N-或C-末端通常可以提高产量，但某些融合分子导致分子组装不良，高价分子显示出胶体稳定性低的迹象。 此外，与bsAbs/多特异性抗体（msAbs）格式相关，翻译后修饰、片段和格式相关杂质（如错配物种和半抗体）对功能性活动的影响应在定义关键质量属性（CQAs）时考虑。Lippold 等人报道了一种开发2 × 1TCE的优雅方法，该方法使用功能性CD3亲和色谱结合质谱（MS）来定义CQAs，这可能是一种广泛可定制的方法，用于分析化学稳定性风险及其对功能性活动的影响。总之，格式优化是调节bsAbs/msAbs活性的强大方式，但必须与适当选择的开发性检测一起进行。 2.2.生成bsAb/msAb分子的共同组成部分 尽管许多bsAb/msAb格式尝试主要使用来自典型人类IgG的分子组分，但这些分子的复杂性需要偏离。如下所述，多肽连接元件和VHH部分特别是非IgG元素，在bsAb/msAb分子的工程中常用。 多肽连接子可以分为刚性、柔性和体内可裂解连接子。它们不仅用于将不同的蛋白质结构域连接在一起，还可以有其他效果，例如增加活性、调节药代动力学(PK)特性、在体内释放蛋白质结构域，或将治疗剂定向到特定的组织或器官。多肽融合到Fc结构域、转铁蛋白或人血清白蛋白通常用于延长抗体的半衰期，通常需要使用连接子。此外，多肽连接子通常用于构建单链靶向结构域，如单链可变片段(scFvs)，以及将这些结构域与其他蛋白质组分融合，以修改结合价数，并实现不同的双特异性和多特异性几何结构，而不引入额外的链配对复杂性。通常，在这些应用中使用多甘氨酸-丝氨酸(G4S)n连接子的变体，其中整体长度被优化以最小化聚集倾向，同时保持位点可及性。连接子长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，正如在CD19 × CD3双特异性串联二价体的优化中所展示的，连接子的变化被证明影响折叠效率、稳定性和活性。已经展示了几种稳定多肽连接子的策略，例如通过点突变减少蛋白酶敏感性，从而改变裂解基序，应用稳定框架突变，修改融合几何结构和连接子锚点，引入二硫键，变化连接子长度，以及添加谷氨酸和赖氨酸残基以提高溶解性。VHHs，也称为Nanobodies®，是由骆驼科动物自然产生的只有重链的单变量域抗体。它们缺乏传统抗体中与VL结构域配对所需的疏水界面，因此具有高溶解性和小尺寸(15 kDa)等特征。它们的热稳定性可能有所不同，但许多VHHs具有独特的能力，在热暴露后重新折叠并恢复抗原结合， 因此，与传统的靶向单元如Fab或scFv相比，它们表现出额外的稳定性特征，后者在热暴露后通常显示出不可逆的聚集。VHHs通常具有更长的、高度可变的互补决定区(CDR)3环，这些环补偿了缺失的VL结构域。这些扩展的CDR3环实现了高亲和力和特异性结合，并有助于通过形成折叠覆盖结构来屏蔽否则暴露的疏水残基。与传统的scFv相比，scFv由最小的IgG结合域VH和VL通过多肽连接子连接而成，并且由于它们的“呼吸”界面容易聚集，VHHs是有趣的替代品，作为靶向单元，以实现额外的抗原结合能力和价数在双特异性抗体/多特异性抗体上，具有优越的开发性属性，并避免许多IgG样双特异性格式中常见的链配对复杂性。首个VHH衍生抗体caplacizumab(Cablivi®)在2019年的批准为VHH在双特异性抗体/多特异性抗体中的增加使用奠定了基础。在双特异性抗体/多特异性抗体中使用VHHs已被证明用于靶向FcγRIII，在TNF × F4/80双特异性抗体中，Vδ2-TCE，在双特异性和三特异性VH在CD1d × Vγ9H SEED结构体中，等等。以及在一种增强对HIV株特异性中和能力的双特异性抗体中。 3.免疫原性 生物治疗剂可能具有免疫原性，即在患者体内引起对治疗剂本身的不需要的免疫反应，通常通过产生结合治疗剂的抗体，可能影响安全性和/或有效性。免疫原性可能导致治疗抗体在临床开发过程中的药物失败，导致资本、时间和资源的大量损失。抗药物抗体(ADA)是免疫原反应的标志。ADAs可以降低治疗效果，引起不良反应，甚至导致严重的副作用。T细胞通过反应治疗抗体中的特定序列在决定免疫反应中发挥关键作用，这些序列由抗原呈递细胞(APCs)在人类白细胞抗原(HLAs)中呈递。由于缺乏完整的临床研究来审查双特异性抗体/多特异性抗体，这些替代格式的免疫原性风险的数据很少。最近批准的双特异性抗体/多特异性抗体的报告，或目前在临床开发中的那些，表明不同抗体模式的ADA发病率和这些ADAs的临床结果各不相同，包括TCEs、双免疫检查点抑制剂和各种肿瘤相关抗原(TAAs)的双结合物。这些不同的结果突出了需要从早期临床前阶段到临床阶段开发全面的免疫原性风险评估策略，以促进选择、设计和开发具有降低患者免疫原潜力的最优双特异性抗体/多特异性抗体。下面提供了一个概述，说明可以有助于塑造对双特异性抗体/多特异性抗体治疗剂的免疫反应的多种因素，包括与产品相关的因素、与患者相关的因素和与疾病相关的因素。此外，我们简要讨论了目前可用于预测、监测和减轻双特异性抗体/多特异性抗体在临床前开发阶段的免疫原性的工具和进展。 3.1.基于序列的风险 与所有蛋白质治疗剂一样，对双特异性抗体/多特异性抗体产生免疫反应的主要风险决定因素之一是原始氨基酸序列。双特异性抗体/多特异性抗体通常包含大量工程化序列元素，这些元素使得不同的功能域能够非自然地连接到一个分子中。此外，这种双特异性抗体/多特异性抗体特有的工程通常与额外的抗体工程方法结合，如人源化突变(将小鼠CDRs移植到人抗体框架中)和Fc效应子修饰(要么调节Fc受体介导的效应子功能，要么通过修改与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来延长半衰期)。这些新颖的工程序列可能通过引入新抗原或暴露可以被APCs处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而激活T细胞反应。因此，免疫原性风险评估和减轻策略最好从双特异性抗体/多特异性抗体的工程阶段开始，并在整个表征和筛选过程中使用越来越彻底的方法。通过设计低风险抗体结构使用脱免疫和耐受化(introduction of T regulatory cell epitopes)方法，由计算预测工具和可用的体外/离体确认试验的组合指导，可以实现降低免疫原性。 3.2.计算机模拟免疫原性风险评估 在抗体发现阶段早期，通常会首先应用计算机模拟(in silico)的T细胞表位筛选和预测工具。有多种商业、公共和学术平台可用于筛选抗体序列中的T细胞表位（通常是9到15个氨基酸的序列），以预测可能与HLA分子结合的序列。这些预测工具仅基于抗体的主要序列来识别潜在的T细胞表位。更复杂的计算方法能够使用同源建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型。这些方法允许评估可能影响免疫原性的结构特征，如溶剂暴露的环、翻译后修饰和构象灵活性。 计算机模拟预测工具有助于在bsAb/msAb的早期开发过程中识别潜在的免疫原性区域，并允许选择潜在的免疫原性较低的分子或应用进一步的蛋白质工程技术来降低候选分子的风险。这些计算机模拟方法具有高通量和相对较低成本的优势。然而，这些计算工具通常存在一些局限性，例如倾向于过度预测，同时未能充分反映人类群体中发现的重要HLA II类多态性。 因此，建议使用各种体外和离体方法，包括免疫测定和基于细胞的测定，对这些假定的T细胞表位进行进一步的检测。 3.3.体外HLA I类和II类结合测定 HLA结合测定评估肽段在体外与不同HLA等位基因结合的能力，并补充计算机模拟预测工具。纯化的HLA-II肽段（通常是重叠的15个氨基酸的肽段）在一系列浓度下与单体HLA-II分子共同孵化。使用多种方法，包括荧光光谱、生化测定（例如，酶联免疫吸附测定）或表面等离子共振（SPR）来量化结合亲和力和动力学。通常，这些测定以高通量规模进行，能够快速筛选大量的肽库。这些结合测定的一个固有困难是全球人群中各种HLA-II等位基因的正常分布的代表性有限。为了克服这一局限性，HLA-II结合测定通常使用共享表位结合基序的HLA-DR等位基因组，也称为超类型等位基因，能够代表全球超过95%的人类HLA分布。 由于HLA-I分子的高度多态性和结构/构象对结合亲和力的影响，HLA-I结合测定的使用较少，尽管已经描述了几种测定和方法，包括基于荧光激活细胞排序（FACS）的MHC稳定化测定、竞争测定、分型B细胞系或使用HLA的基于细胞的测定。 虽然HLA结合测定可以提供有关特定HLA等位基因结合的有意义的信息，但由于它们依赖于感兴趣的肽段的最佳设计和纯度，因此存在一些局限性。这种依赖性可以直接影响肽-HLA相互作用的结合和稳定，并导致假阴性结果。此外，虽然从HLA结合测定获得的数据可能表明特定肽基序可能与HLA等位基因结合，但这些数据并没有考虑到这种肽基序是否能够在APC表面的HLA分子上被处理和呈递。 3.4.MHC相关肽蛋白质组学 MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）方法在识别存在于APC表面相关HLA分子上的已处理肽段方面被证明是有价值的，特别是鉴于液相色谱/质谱（LC/MS）灵敏度和蛋白质组分析工具的最新进展。在这种方法中，完整的bsAb/msAb分子被装载到体外生成和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）上，以使DCs摄取和处理抗体，然后细胞裂解和分离肽-MHC复合物，这些复合物稍后被解离并通过MS测序进行测序。 MAPP测定的通量相对较低，主要是由于DC生成的限制。因此，MAPPs通常在临床前开发过程的后期阶段使用，并用于有限数量的开发候选物。从MAPPs获得的数据可以帮助识别可能被工程化以降低免疫原性的主导抗原肽序列。当这些个体的DCs被包括在分析中时，这种方法还可以揭示健康和疾病个体之间在抗原处理和呈递方面的差异。 尽管从MAPP测定中收集到的有价值的信息，但仔细解释至关重要。当评估bsAbs/msAbs与APCs（如DCs）的潜在直接或间接相互作用时，bsAbs/msAbs增加了一层复杂性。在使用MAPPs测定针对DCs表达的靶标或对DC功能重要的途径（如CD40×CD11c或LAG-3×PD-L1 bsAbs）的bsAbs/msAbs时，应考虑这种相互作用。 这些靶标的结合可能会干扰这些细胞中的抗原呈递机制，这反过来可能会影响该测定识别真实主导抗原序列的能力。在使用MAPPs测定之前，可以使用DC结合测定和评估DC成熟、激活和细胞因子测量的测定来了解bsAb/msAb对DCs的影响。 此外，评估bsAbs/msAbs对内源性蛋白的已知表位呈递的影响也可以提供对抗体与MAPP测定潜在干扰的洞察。 通过MAPPs识别的主导抗原序列表明这些序列可能通过抗原呈递机制被处理和呈递；但这并不一定意味着这些序列会转化为T细胞反应。因此，建议进行进一步的确证性体外T细胞激活和增殖实验，特别是当对感兴趣的序列进行进一步重设计可能会对抗体的效力或特异性产生重大影响时。 3.5.T细胞激活和增殖实验 各种体外T细胞激活和增殖实验已经开发出来，并越来越多地被用来评估治疗性抗体候选物的免疫原性。这些实验大多数使用新鲜分离或冷冻保存的健康或疾病个体的外周血单个核细胞（PBMCs）、去除CD8 T细胞的PBMCs，或与单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）共培养的分离CD4 T细胞。PBMCs可以被整个抗体刺激，允许抗原呈递细胞（APCs）摄取、处理和呈递肽序列给原始T细胞，导致T细胞激活、增殖和细胞因子分泌。流式细胞术通常用于评估通过标记PBMCs与细胞示踪染料来评估抗原特异性T细胞增殖。此外，使用特定的T细胞激活标志物如CD25、CD69、HLA-DR、CD134和/或CD137通常与增殖评估结合使用，以了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。 激活的T细胞产生的细胞因子也可以通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色或通过酶联免疫吸附点（ELISpot）或多重荧光斑点（FluoroSpot）实验进行评估。 尽管基于PBMC的实验被认为是最简单且接近体外模拟复杂抗原呈递和T细胞激活过程的设置，但它们受到能够响应特定抗原刺激的前体原始T细胞数量相对较低的限制，导致实验灵敏度降低。DC-T细胞实验提供了一个替代方案，克服了这一限制，作为一个较不复杂的体外系统，允许免疫反应的基本组成部分之间的抗原特异性相互作用，即DCs和T辅助细胞。 虽然这些实验越来越被接受，但它们与bsAbs/msAbs的兼容性需要确认。bsAbs/msAbs通常针对T细胞或其他免疫细胞表达的受体或配体。在这些例子中，使用完整的抗体进行刺激可能不合适，因为免疫反应可能主要由抗体的MOA和与免疫细胞的直接结合驱动，而不是由抗原刺激驱动。这可以通过使用来自抗体序列的重叠肽段库而不是完整的抗体来克服。然而，使用肽段库有自己的局限性，包括更高的成本和可能识别出不一定在体内由APCs处理或呈递的肽段的风险。因此，使用MAPPs实验数据来指导设计和生产感兴趣的序列以在这些体外实验中进行测试可能是有益的。此外，bsAbs/msAbs由于抗体在所需格式中的错配组装，携带更高的杂质风险，导致产生其他不想要的错配格式，这可能会影响体外实验的性能，并导致对免疫原性风险的潜在误解。 因此，使用高纯度的测试文章准备这些实验至关重要。 3.6.B细胞表位和体外B细胞实验 虽然CD4 T细胞在导致ADA产生的免疫反应中起着关键作用，但B细胞也直接识别、结合、内化、处理和呈递治疗性抗体的表位给T辅助细胞，导致原始B细胞分化为记忆和产生高亲和力（IgG）ADAs的浆细胞。然而，体外B细胞实验受到在体外诱导B细胞反应的生物学复杂性的限制。已经描述并商业化了几种评估B细胞在体外刺激后分泌IgG/IgM的比色和荧光B细胞ELISpot实验，这些ELISpot实验主要关注评估记忆B细胞反应。目前尚无强大的实验可用于测量原始B细胞对体外刺激的IgG产生，主要是由于从IgM到IgG产生过程中涉及的免疫过程的复杂性。 在缺乏强大的体外B细胞实验的情况下，已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算工具，如免疫表位数据库和分析资源SEPIA。 许多这些预测方法使用序列衍生特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β-转角和主链柔韧性来提高B细胞表位预测性能，这通常相对于现有的T细胞表位预测工具是有限的。 3.7.与产品关键质量属性相关的风险因素 CQAs是在适当的限制、范围或分布内存在的物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，以确保所需的产品质量。 CQA相关的免疫原性风险因素是在治疗性抗体开发过程中的重要考虑因素。 由于分子设计的相对复杂性，bsAbs/msAbs通常与许多制造挑战相关，如增加的聚集、降低的稳定性和由于存在不想要的错配抗体格式而导致的产品相关杂质，这些都影响bsAb/msAb的免疫风险、与先天免疫细胞上的模式识别受体的相互作用以及意外佐剂效应导致打破耐受。 PBMC和全血实验是经常用来评估CQA相关免疫原性风险的工具。 这些实验能够广泛代表特定人群，通常被认为比其他基于细胞系的实验格式更具临床相关性。这些实验中通过与抗体孵化后分泌的细胞因子和趋化因子水平的量化来测量免疫原性反应。这些类型的实验面临的挑战包括从大量供体（通常>25）中获取足够数量的PBMC和新鲜全血样本，以及高供体间变异性。 重要的是，必须考虑特定bsAb/msAb的作用机制（MOA）来解释这些实验获得的数据。通常首先进行全血或PBMC实验以获得更广泛的风险评估，然后进行其他体外实验以进一步进行机制性特征描述。 3.8.与患者相关的风险因素 预先存在的反应性是随着基于抗体治疗领域，特别是bsAbs/msAbs的快速增长而日益受到关注的问题，尽管其对药物安全性和有效性的影响尚不清楚。最近有关bsAb/msAb免疫原性的报告表明，在临床药物开发阶段考虑实施对药物未接触受试者预先存在反应性的筛选和特征化策略是必要的。 许多正在开发的bsAb/msAb模式针对的目标已经使用其他生物治疗药物进行了探索，包括mAbs和抗体药物偶联物。在某些情况下，bsAbs/msAbs可能使用以前开发或批准的抗体的抗体臂，如上文提到的JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在阿达木单抗的骨架上。 在这些情况下，针对先前生物治疗的ADA反应可能导致由于快速记忆回忆反应而对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑对患者进行预先存在的反应性筛选，特别是在有生物治疗药物治疗史的患者中。此外，这种预先筛选可能有助于在预期出现显著免疫原性反应和相关不良事件时定义潜在的患者排除标准。 虽然目前主要在临床环境中使用筛查或治疗前时间点的患者样本来评估预先存在的ADA，但预先存在的ADA的高流行率表明，在临床前开发阶段早期使用健康或药物未接触的捐赠者的人类血清进行更严格的评估是有必要的。用bsAb给药的受试者中出现的治疗性ADA与在健康捐赠者中检测到的预先存在的ADA相关，并且预先存在的ADA的表位特异性能够预测临床ADA的表位偏好。 在评估LY3415244的安全性和免疫原性的1期试验中也有类似的观察结果，其中所有12名入组的患者都对至少一个bsAb臂产生了治疗性ADA。针对anti-TIM-3臂的ADA被发现更早出现，并对大多数患者的可溶性TIM-3目标参与产生负面影响。在最近的一项调查中，评估了60个正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA反应性，分析同样发现，正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA免疫原性主要针对TIM-3 CDRs。 3.9.治疗相关风险因素 包括给药途径、药物剂量和给药方案以及使用免疫调节共治疗药物，都是影响生物制剂免疫原性风险的因素，包括bsAbs/msAbs。大多数治疗性抗体通过静脉注射或皮下注射给药。尽管普遍接受的观点是皮下注射治疗性抗体与更高的免疫原性风险相关，但目前临床批准的抗体的数据并不支持这一假设。然而，与皮下注射相关的独特的免疫原性挑战可能对bsAbs/msAbs特别重要。皮下注射通常需要相对于静脉注射的高浓度给药。因此，与增加的bsAb/msAb聚集体以及其他产品属性相关的挑战可能在通过皮下途径产生更高的免疫反应中发挥重要作用。这一假设得到了pasotuxizumab这一例子的支持，这是一种PSMA × CD3 bsAb TCE，在1期研究中评估了静脉和皮下给药。 虽然静脉组的患者中没有检测到任何ADA，但所有接受皮下治疗的患者都发展出非短暂的ADA。此外，在这些患者中超过93%的人发现中和性ADA，并且没有人对局部糖皮质激素治疗有反应。当JNJ-63898081，另一种PSMA × CD3 bsAb TCE，通过静脉和皮下给药给试验参与者时，也报告了类似的结果。 药物剂量和给药方案也可能强调bsAbs/msAbs的免疫反应风险，因为由于细胞因子释放综合征等毒性，给药通常限于相对于mAbs的较低剂量。与msAb/msAb的较低剂量可能潜在地导致ADA介导的药物清除增加和次优的PK和PD性能。此外，治疗持续时间也是一个需要考虑的重要因素，尽管其与免疫刺激性bsAbs/msAbs在肿瘤学中的相关性可能不清楚，因为这些方案不需要长期治疗。此外，可能需要长期治疗的bsAbs/msAbs，如那些用于自身免疫性疾病的，可能从其自身的免疫抑制MOA中受益，导致免疫原性降低。最后，与抗炎药物或化疗的联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs的免疫潜力。 3.10.作用机制风险因素 最近批准的bsAbs/msAbs的数据，以及其他在临床开发中的bsAbs/msAbs，表明这些bsAbs/msAbs的作用机制在它们在患者中的免疫潜力中起着关键作用。根据分子的不同，可以增加或减少免疫原性。例如，批准用于B细胞恶性肿瘤的bsAb TCEs，如CD19 × CD3 blinatumomab和BCMA × CD3 teclistamab，显示出最小的ADA发病率（<2%），可能由于它们的B细胞耗竭MOA。另一方面，针对B细胞上共刺激分子的bsAbs/msAbs，ABBV-428，一种间皮素-CD40 bsAb，在1期临床试验中显示出高ADA发病率（63%），可能由于其对B细胞的CD40激动效应和对药物PK的影响。非B细胞耗竭TCEs也可能由于其MOA涉及广泛的T细胞激活而带来更高的免疫原性风险，如AMG 211，一种CEA × CD3双特异性T细胞-引导剂，它在所有接受>3.2 mg高剂量治疗的患者中诱导了ADA，并在高滴度下暴露量下降，导致停药。 免疫调节性bsAbs/msAbs通过激活共刺激通路或拮抗抑制通路（如CTLA-4 × PD-1和CTLA-4 × OX-40双特异性抗体）可能会对患者造成更高的免疫原性风险，导致ADA发生率增加，因为它们相对于针对相同靶点的单抗单药治疗能够释放更强的免疫细胞激活。这一概念得到了抗PD-1和抗CTLA-4单抗的单药治疗和联合治疗报告的支持。当nivolumab与ipilimumab联合使用时，ADA发生率较单药治疗（11%）显著提高，报告为26-38%。 类似地，当抗PD-L1抗体durvalumab与化疗联合使用时，ADA发生率极低（<1%），而与抗CTLA-4抗体tremelimumab和化疗联合使用时，ADA发生率则较高。 与这些观察结果一致，LY3415244，一种针对TIM-3和PD-L1的bsAb，也被报告在所有给药的患者中诱导ADA。最近，在针对HER2和4-1BB的bsAb PRS-343的1期研究中也报告了类似的观察，PRS-343的给药导致ADA发生率为28%。 尽管存在这些趋势，免疫原性仍然难以预测，因为并非所有这些机制总是导致免疫原性增加。 另一个与作用机制相关的风险因素是抗体与其可溶性或膜寡聚靶标形成免疫复合物的能力。由于bsAbs/msAbs能够结合多个靶点，免疫复合物形成的风险可能更高。大型免疫复合物被广泛认为通过增加APCs的摄取以及通过交联和激活B细胞受体的T细胞非依赖性激活B细胞来增强免疫反应。针对炎症细胞因子TNF和IL-17A的bsAb JNJ-61178104支持这一概念，因为其给药已被证明在所有患者中诱导ADA。 尽管目前对免疫调节性bsAbs/msAbs的临床免疫原性数据有限，但现有证据表明它们与增加的免疫原性风险和更高的ADA发生率相关。因此，作用机制的考虑应成为bsAb/msAb开发过程中全面免疫原性风险评估策略的重要组成部分。重要的是，这些考虑也应适用于上述讨论的各种体外和体外工具的兼容性，考虑到正在开发的抗体的作用机制，以及这对这些实验数据解释的影响。 总之，随着bsAbs/msAbs领域的快速发展，以及关于与这一类抗体相关的免疫原性和安全风险的知识逐渐可用，开发全面的免疫原性风险评估策略对于实现最佳抗体开发至关重要。这些免疫原性风险评估策略可以在临床前阶段涉及各种计算工具以及体外和体外实验，同时关注与bsAb/msAb开发相关的重要药物、患者和治疗相关风险考虑。 4.特异性 在双特异性抗体（bsAbs）和多特异性抗体（msAbs）的开发中，多特异性（在蛋白质组中对靶点外的结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的属性，它们可以改变疗效、清除率和组织分布。这些不需要的效果可能导致靶点外毒性、免疫原性和生产上的挑战。 多特异性可以由几种机制引起，例如与不相关靶标的分子模拟或CDRs中的可塑性，这些特征可能因在同一抗体上具有多个互补决定区而加剧。多反应性归因于不希望的抗体表面属性，例如电正性、电负性和疏水性表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。在bsAbs/msAbs中，与从亲本分子行为预期的相比，多特异性和多反应性都可以被调节。这些差异可以归因于结合价的改变和/或复杂的互补决定区间相互作用。然而，尽早识别可能产生靶点外效应的抗体至关重要，建议在将亲本分子重新格式化为bsAbs/msAbs之前对其进行评估。 4.1.计算机预测 众多的计算机模拟工具已被开发出来，用于评估抗体特征以预测多反应性。抗体的特性，如序列组成、互补决定区（CDR）的长度和表面特性（即电荷和疏水性），通常从同源模型中得出，已被用来创建多反应性的预测模型。 具有大量电荷在其CDR上的抗体或高疏水性可能具有加速的清除率，对他们的治疗有效性产生负面影响。这种加速清除被认为是由于抗体表面的正电荷可能与负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致 增加的组织吸收和血液清除。几个小组已经评估了使用许多可用的在硅片上的工具来探索抗体开发能力，但这些工具的广泛适用性对bsAbs/msAbs的探索较少。Jain等人。系统地评估了在硅片上派生的特征和体外指标之间的关系， 评估了许多开发能力方面。 虽然预测体外测定结果的能力大于那些仅从计算派生指标派生出来的，总体正电荷被发现对多特异性有害，更大的负电荷区域似乎有益，其他基于序列的趋势对氨基酸组成和位置在CDRs中证实了其他研究，这些研究正在调查多反应性。此外，许多在硅片上的指标的数量下降超出了确定的可接受分布（通常称为标志或违规行为）随着临床路径的进展（即，批准的抗体具有最少的在硅片上的标志）。同样，Zhang等人。生成了用于识别潜在多特异性的物理化学 规则，通过评估序列和结构特征与测定之间的相关性来探测自关联和结合到各种多特异性试剂在137个临床阶段抗体上。最近对1000个mAbs的生物信息学分析系统地 确定了多反应性和非多反应性抗体之间的关键差异，目标是扩展对属性的理解推动多反应性超出疏水性，电荷和CDR环灵活性。多反应性抗体往往有CDRs，平均产生轻微的亲水性，中性电荷的结合表面，可能潜在地允许与广泛的配体进行弱相互作用。这些数据被用来构建一个计算框架，可以识别多反应性抗体，准确率为75%。最近开发的机器学习方法已被用来预测纳米抗体和scFv中的多反应性。这些可变域格式是bsAbs/msAbs中越来越常见的组成部分，因为它们不需要非轻链的共价配对，因此产生较少的格式特异性错配物种。哈维等人。使用一个合成库，旨在模仿一个天真的骆驼库并将其排序到结合池到多特异性试剂（PSR）使用FACS。结果被用来训练逻辑回归和神经网络模型来分类纳米体多反应性。有几个预测特征为多反应性例如，存在精氨酸和色氨酸；然而，它们被位置强烈混淆。值得注意的是，他们的模型能够建议突变以减少估计的多反应性。Lim等人，通过训练四种监督式机器学习方法，利用这些数据计算了19,426个已知多反应性档案的scFv的基于序列和基于结构模型的特征，并得出结论，表现最好的模型具有与多个不同的CDR和全局抗体特征相关的特征，包括CDRH3中的色氨酸数量、等电点（pI）和径向旋转半径。然后，这些模型与基于自然语言的模型描述符相结合，以从scFv特征中提取额外的信息。表现最佳的集成模型在识别多反应性scFv方面的精确度和准确率超过75%。可用于特异性预测的在硅片上工具的数量和可变性可能会令人生畏，而且很少有模型专门针对bsAbs/msAbs的独特属性进行了设计。因此，建议主要使用这些方法作为在开发过程的早期对几个候选分子进行初步评估，以识别抗体和相关的在硅片上指标，这些指标落在任何一个预测的极端。这些数据可以作为进一步实验探究策略的有用指南。 4.2.体外特异性测定 评估PK属性是与特异性相关的主要开发能力属性。事实上，mAbs的长消除半衰期是这类治疗药物的主要优势。调节清除率的最重要元素是Fc中含有的分子在内质网隔室中依赖pH的特定FcRn结合。BsAbs/msAbs通常通过扰动或移除Fc-常驻FcRn相互作用来大幅度改变这一档案。分析FcRn亲和液相色谱使用从pH 5.5到8.8的线性pH梯度来分离IgG异构体、降解产物和工程抗体，如bsAbs/msAbs，基于它们在不同pH下对FcRn的亲和力。与野生型IgG相比，突变体的洗脱峰档案和保留时间的变化与FcRn转基因小鼠中的PK档案相关。尽管普遍认为Fc在FcRn介导的循环中起主导作用，但还表明，可变域的净电荷也影响与FcRn的结合，正如brakinumab所示，其Fv净电荷较高，但与ustekinumab相比具有类似的pI。FcRn有一个扩展的负电荷表面补丁和增加的brakinumab结合，阻止了在生理pH下与FcRn的有效解离，并减少了其终端半衰期。在中性pH下从FcRn的缓慢释放已被证明对两个具有类似pI和生物物理属性的bsAbs的PK产生不同的影响。 除了FcRn独立特性如单克隆抗体（mAbs）的Fv电荷、目标结合和定位、多特异性和多反应性或糖基化变化可能导致不期望的增加清除率，影响mAbs的药代动力学（PK），这些特性对于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）的开发同样重要。特别值得注意的是，针对CD3的bsAb TCEs通常具有与不良PK相关的多反应性标志，部分原因是许多针对CD3的抗体结合到CD3 epsilon极端N-末端的电负性线性表位，并且具有较高的等电点（pI）值。基于结构的方法和使用基于酵母的检测平台的抗体工程已被证明可以纠正这种多反应性行为，同时增加对CD3的亲和力。 测试更广泛的多反应性和多特异性，这与药代动力学不佳、制造困难和耐受性问题有关，由于人类蛋白质组和其他生理表面呈现的巨大潜在非目标空间，这是一项挑战。人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以减少体内非目标毒性和加速清除的风险。 筛选多特异性性还可以包括结合由CHO、HEK或Sf9细胞提取物制成的PSRs，其中包含溶解的膜蛋白。这种方法可以作为基于展示的方法的反筛选，如针对SARS-CoV-2的基于纳米抗体的四价bsAb所示。 如上所述，局部正电荷可以导致通过增强FcRn结合、防止FcRn-抗体解离和有效回收来加速清除率。虽然可以从序列或通过毛细管等电聚焦等直接方法估算抗体的pI，但它是多反应性的一个差指标，因为它不显示电荷斑块或局部不平衡，通常更倾向于使用结构衍生方法，如Fv电荷对称性和空间电荷图（SCM）。 除了静电相互作用外，抗体的疏水性是多特异性以及潜在胶体稳定性问题的可靠指标。可以通过分析疏水相互作用色谱上的保留时间和洗脱曲线来评估抗体的疏水性。某些抗体germlines，如VH1–69，由于它们的重链CDR2更疏水，更可能产生疏水性较高的抗体，但这种倾向可以通过工程方法和生物物理评估来最小化。 在bsAbs/msAbs的临床前阶段进行特异性测试，应考虑作为降低开发和制造风险的两阶段方法。应评估每个亲本抗体，并仅选择低风险的亲本抗体或结合域进行重组成bsAbs/msAbs。重组成后，应在衍生的bsAb/msAb上重复相应的特异性测定，以确认所应用的设计和格式没有显著改变每个亲本抗体或结合域的特性。选择具有良好特异性特性的低风险亲本序列是有效生成可开发bsAbs/msAbs的先决条件。 5.稳定性 抗体的稳定性包括许多分子内在和药物相关的外在组成部分，包括热稳定性、胶体稳定性、耐蛋白水解性和血液中的化学稳定性。这些领域的缺陷可能导致制造过程中的困难、影响货架期以及改变抗体的免疫原性和活性。 5.1.热稳定性 热稳定性是承受热应用时蛋白质展开和降解的能力。成功开发的抗体的一个关键特性是它们良好的热稳定性，这主要由mAbs中的Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不那么明显。就稳定性而言，Fv区域具有最高程度的变异性，因为其主要序列因每种抗体而异。 低热稳定性可能使抗体更容易聚集，限制了它们作为治疗性抗体的潜力。抗体热稳定性的一个有用估计值是其熔化温度（Tm），定义为抗体在其展开状态的浓度等于其在折叠状态的浓度的温度。抗体包含几个区域，包括可变Fv区域和恒定CL、CH1、CH2和CH3区域。这些区域中的每一个都是伪独立的，因此在不同区域之间通常观察到不协同的展开。众所周知，IgG1 CH2区域的Tm约为70°C，CH3区域的Tm约为82°C。 一项研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，所得抗体的CH3热稳定性显著降低，与K409突变相关的Tm降低约为12°C。 Fv、CH1和CL区域倾向于协同展开，其Tm可以根据可变区域序列跨越大范围。差示扫描量热法（DSC）用于建立不同区域的热稳定性和热力学特性。 差示扫描量热法（DSC）特别适合于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs），因为它可以通过额外的信息，如展开焓变，来识别不同区域的展开事件，但由于仪器限制和样品需求，通常相对低通量。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热移测定，基于色氨酸和酪氨酸在展开时的内在荧光或添加荧光染料，通常高通量。这种技术在高通量环境中的一个典型用例是识别低稳定性抗体进行优先级降低，这些抗体的Tm接近或低于CH2热展开温度。 除了热展开外，许多DSF仪器还能够检测由热展开引起的聚集体形成，这导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 bsAbs/msAbs的形式对热稳定性有若干重要影响。一般来说，bsAb/mAb设计策略很少相对于亲本mAbs增加热稳定性。因此，建议在开发过程早期评估亲本抗体的热稳定性，并且理想情况下应降低热稳定性低的mAbs的优先级。在bsAb/msAb工程之后，通常一个或多个重组成的可变区域会失去热稳定性。设计可能如何影响亲本抗体不同区域的热稳定性，理想情况下应通过DSC进行评估，DSC非常适合解耦大多数mAb和bsAb格式中存在的众多展开事件。使用不需要突变Fv区域的bsAb/msAb格式，如VHH域，可能完全避免基于重组成的热稳定性下降的不可预测性。 已经开发和优化了几个bsAb平台和结合域的工程解决方案，以避免热稳定性的损失。对于目标域，包括在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面、scFvs的可变域之间、scFvs的连接和可变域之间引入二硫键，或在scFvs的连接和可变域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10°C。用于保持热稳定性的其他方法包括合理工程或随机突变方法的组合、人源化到更稳定的框架、或将稳定框架残基转移到不太稳定的框架上。 5.2.化学稳定性 化学稳定性指的是抗体一级序列中共价键的完整性以及重链-重链或重链-轻链之间。基于抗体的治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺作用、异构化、氧化、二硫键交换、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切、片段化和糖基化。 根据这些降解事件的位置与亲和位点和恒定域的关系，抗体的活性或半衰期可能会受到影响。一个众所周知的例子是曲妥珠单抗，其中LC-Asn30的脱酰胺对效力有轻微影响，而HC-Asp102的异构化显著降低了其效力。由于氧化应激，蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜可能会对抗体产生几种影响，如报告的单克隆小鼠抗体OKT3。在Fc区域的M428/M252处蛋氨酸氧化可能会影响与FcRn的结合，从而影响抗体的回收，这会减少抗体的半衰期。任何影响亲和位点活性或Fc效应功能的化学降解都是有害的。因此，选择化学稳定的靶向单元以限制项目失败的风险非常重要。bsAb/msAb格式及相关的连接子或突变应用于生成bsAbs/msAbs也可能影响化学稳定性。化学稳定的靶向单元在重组成bsAbs/msAbs时可能会遇到不可预见的化学稳定性问题；因此，仔细评估亲本和衍生的bsAbs/msAbs都很重要。如果检测到降解事件，它们有时可以通过适当的配方条件来减轻。但重要的是要注意，强大的化学稳定性对于体内给药后的稳定性很重要，因此工程方法通常比配方筛选更可取。导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺作用、异构化和片段化。脱酰胺作用是抗体中普遍存在的修饰，它发生在生产、储存或体内，并且更容易影响天冬酰胺残基，以及在较小程度上影响谷氨酰胺残基。脱酰胺作用是通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击和随后氨的丢失，导致通过天冬酰-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，通常在中性或碱性pH下加速。 相反，天冬氨酸通过Asu中间体的水解异构化通常在酸性pH下加速，并导致异天冬氨酸或天冬氨酸的形成（在中性条件下的比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能发生在冻干的抗体配方中。 识别化学降解风险最直接的方法是通过对一级氨基酸的简单基序分析。然而，任何给定基序的降解倾向高度可变，并且取决于额外的结构因素，如溶剂可及性和二级结构构象，以及诸如pH、温度、辅料等外在因素。因此，基序方法仅作为化学责任风险的初步评估，任何情况都应通过额外的分析来确认。最近，基于结构和同源模型的方法已被开发出来，以更好地评估这些降解事件的可能性，某些位置和溶剂暴露的CDR环中的序列基序被识别为脱酰胺、异构化和氧化的热点。 虽然从开发的角度来看，Fv区域的降解通常是最具问题的，但这些修饰也常位于IgG的恒定区域。 化学稳定性问题可以通过强制降解研究来识别，这些研究通过故意将治疗性抗体暴露于应力条件下，在其整个生命周期中进行调查。这些研究可以包括长时间暴露于高温、低/高pH值、冻融循环、搅拌、糖基化、光照和生理或氧化应激。这些研究通常结合实验方法来检测和定量任何化学修饰，如离子交换和疏水相互作用色谱、标记和HPLC-UV-Vis、通过质谱的肽图、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳和等电聚焦。 这些研究劳动密集、耗时且耗费材料，通常在发现过程的后期阶段对较少数量的抗体进行，通常在细胞系开发前。根据检测到的任何化学责任的位置，这些研究的样本通常也通过结合和活性测定来表征，以评估任何化学降解事件是否影响对目标的结合亲和力或抗体的活性和回收。抗体治疗中化学稳定性受损的另一种表现是片段化，可以分为非酶促和酶促片段化。非酶促片段化在抗体中经常观察到，主要在恒定区域，最有可能在上铰链区域，由于其动态环结构，可能性最高。 在上铰链区域的非酶促片段化发生在蛋白质主链中，通过诸如β-消除、直接水解、介导的裂解或自由基催化等化学反应，这取决于溶剂条件，如碱性或酸性pH值、温度以及自由基或金属的存在。非酶促片段化也可能伴随着二级、三级和四级结构以及构象灵活性发生，将序列空间中相距甚远的侧链带到局部环境中。非酶促片段化事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上，其中除了甘氨酸外，其他残基都可以通过它们的侧链介导片段化事件。CH1恒定区域的K(133)STSGGT环可能是一个常见的裂解位点，产生两个约35和15千道尔顿的片段，CH2区域（G236-G237，D270-P271）的其他位点也被发现可以迅速裂解。酶促片段化通常由蛋白酶裂解介导，这发生在mAbs和bsAbs/msAbs的生产和纯化过程中，铰链区域是酶促裂解最常见的位点。在所有情况下，片段化主要通过如天然尺寸排除色谱或SDS-PAGE等分离方法检测。与任何已识别的化学稳定性问题一样，需要根据裂解位点在Fv或恒定区域的位置评估其对抗体活性的影响。检测bsAbs/msAbs中片段化的工作与mAbs相同，但由于存在两个或更多的靶向区域，事件的复杂性和分配裂解基序的难度可能会增加。 此外，双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）可能会经历一个更为严格的纯化过程，包括额外的色谱步骤来去除与格式相关的杂质，因此任何化学稳定性的缺陷在制造过程中可能变得更加明显或累积。 焦谷氨酸的形成通常出现在抗体重链和轻链的N-末端，特别是当N-末端残基是谷氨酰胺时，对于谷氨酸来说则较少见。焦谷氨酸的形成可以通过非酶促的自发环化在体外通过亲核攻击N-末端主链酰胺氮对侧链酰胺形成稳定的五元环与H2O离去基团，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化，这是一种在人类、动物和植物中发现的酶。如果控制不当，焦谷氨酸的形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中关键质量属性（CQAs）的维持。对于bsAbs来说也是如此，由于所有链的N-末端在某些双特异性格式中可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加了。 主要发生在赖氨酸侧链胺基和较小程度上的N-末端胺基和精氨酸的糖基化是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体的效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。这种糖基化事件通常由细胞培养中的发酵过程或储存期间引起，当含有蔗糖的配方水解导致非还原糖时，这会通过低pH和高温度加速。因此，制造过程需要严格控制，以通过适当的生产和配方条件满足CQAs。糖基化可以通过硼酸盐或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色法检测。 5.3.胶体稳定性和粘度 胶体稳定性指的是折叠蛋白通过自相关沉淀在溶液中的倾向，由电荷不平衡、疏水斑块、融合蛋白界面解离和结合以及与离子的相互作用介导。 粘度是描述给定抗体配方流动阻力的相关属性，由不希望的分子间蛋白-蛋白相互作用引起，这些相互作用由胶体和构象浓度依赖行为介导。这些相互作用可能源于与部分原子电荷分布、等电点和偶极矩相关的变量域的静电属性，或导致自相关的疏水属性和形状互补性。对于高浓度的治疗性bsAbs/msAbs配方，胶体稳定性和粘度是重要的属性。通常通过盐或PEG诱导沉淀、静态光散射、多角度光散射和动态光散射（DLS）来评估蛋白质治疗剂的胶体稳定性。DLS可以在高通量设置中确定扩散相互作用参数（kD），特别适合评估配方条件及其在搅拌等应激条件下对胶体稳定性的影响。胶体稳定性通常在含有scFv域的bsAbs/msAbs中受损，由于VH-VL界面的柔韧性增加，这种柔韧性通过可逆解离和结合形成寡聚体，这一过程取决于蛋白质浓度，并可能受到pH值、离子强度和其他辅料的影响。Majumder等人证明，一个易于聚集的scFv-bsAb在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中具有改善的胶体稳定性，展示了配方对改善胶体稳定性的潜力。 自相互作用测定评估抗体在高浓度（>100 mg/mL）下配制用于治疗管理时的胶体稳定性风险。由于bsAbs中靶向臂的价数通常减少，mAbs中自相互作用测定观察到的趋势在bsAbs/msAbs中可能减弱，但不太可能完全消失。此外，任何bsAbs/msAbs平台的设计突变以强制正确的重-重和重-轻界面组装，如引入电荷对和疏水界面工程，如果突变部分或完全暴露或引起构象变化影响抗体表面属性，可能带来自相关风险。因此，重要的是只考虑低风险的靶向单元进行重组成bsAbs/msAbs，并通过自相互作用测定再次评估重组成分子对不希望的自相互作用的倾向。评估自相互作用的方法包括动态光散射（DLS）、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。DLS是一种广泛使用的评估抗体自相关性的技术，可以在微孔板格式中进行，使用少量抗体评估数百个样本。DLS测量增加的水动力半径作为蛋白质浓度的函数。从在相对较低的抗体浓度（1-20 mg/mL）下进行此分析得出的kD与高达175 mg/mL浓度的29种不同mAbs的粘度测量结果相关性良好。在AC-SINS中，抗体被吸附到金纳米颗粒上，产生高局部蛋白质浓度，模拟浓缩的抗体溶液。吸引的自相互作用减少固定抗体之间的粒子间距离，导致最大吸收波长（等离子体波长，λp）的红移。AC-SINS在高通量板格式中识别具有高自相关风险的抗体，同时在稀薄浓度（<50 μg/mL）下使用极少量的样本。这种方法通常用于筛选临床前阶段的抗体胶体稳定性风险。这种方法进一步发展为通过聚赖氨酸涂层通过电荷稳定（CS-SINS）筛选某些配方条件和弱酸性缓冲条件。虽然bsAb重组成可能导致衍生的bsAb与亲本mAb相比AC-SINS得分降低，但由于bsAbs AC-SINS得分与粘度风险之间关系不太明确，因此必须选择低风险的mAb进行重组成。 在生物层干涉测量（CSI-BLI）中，抗体通过其Fc区域装载到生物层干涉测量生物传感器上，以测量自结合反应。Fab可用于通过氢键配对、离子相互作用或疏水相互作用进行结合，该测定可以在低样品量（15μg）的高通量格式下进行。 抗体候选物和配方的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于高浓度配方需要大量样品，通常在开发过程的相对后期进行此实验。将单克隆抗体重组成bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加，因为在存在两个靶向单元时会出现新的相互作用，特别是如果这些单元具有相反的静电属性。混合两种低粘度mAbs（pI分别为6.3和9.3）的粘度数据与相关bsAb的高粘度相关。新型几何结构导致的更大的bsAbs/msAbs也可能导致粘度问题，如一项研究中所示，一种双变量域免疫球蛋白bsAb比亲本mAb更粘稠，粘度的增加归因于bsAb的整体大小。有几种策略可以预防适用于mAbs和bsAbs/msAbs的粘度问题。首先选择对其预期给药途径具有有利的低粘度行为的bsAbs/msAbs非常重要。选择低粘度亲本抗体进行双特异性IgG重组可能无法预测具有有利粘度的bsAb/msAb，正如Tilegenova等人所证明的，用一个抗IL-13/IL-17双特异性IgG4抗体进行的研究发现，怀疑引起阳离子-π和/或π-π相互作用的芳香族点突变降低了双特异性的粘度，并且对一个在150 mg/mL时粘度高的单特异性抗GCGR IgG1抗体也成功。从蛋白质序列或结构计算的Fv净电荷可以表明潜在的粘度风险。Fv电荷<2的抗体被认为是高风险，因为它们可能有负电荷斑块，可能驱动与恒定域中的正电荷斑块自相关。此外，Fv电荷对称参数，即VH和VL的净电荷乘积，也可以表明由于自相关引起的粘度风险。 总之，稳定性评估是非常多维的，并且是全面开发性评估的关键要素。在目标给药途径和粗略配方的背景下最好评估稳定性。有大量的测定可用于这些测量，这些测定在实施的难易程度、通量和预测能力上有所不同，一个结构良好的评估策略应该在开发过程中利用多种测定。5.4.体内稳定性 治疗性抗体在给药后数天和数周内的体内物理化学稳定性可能对药物效力、清除和免疫原性有影响。与mAbs一样，IgG样的bsAbs/msAbs最好具有提供长半衰期的药代动力学（PK）特性。由于它们的半衰期较长，因此可以减少给药频率并改善患者依从性。与mAbs一样，bsAbs/msAbs的体内稳定性可以通过检测其在体内的浓度随时间的变化来评估，这通常通过ELISA或基于质谱的检测来完成。体内稳定性的测定对于预测药物效力和评估长期给药方案的可行性至关重要。 由于它们在循环中的半衰期大约为3周，内源性和重组抗体可以经历与治疗性抗体在制造和储存过程中类似的体内生物转化事件，包括异构化、氧化、糖基化、二硫键修饰、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切和蛋白水解裂解。在体内对抗体药物的生物转化事件的检测和定量是治疗性抗体开发中一个相对较新且日益增长的领域，这一领域面临着一些技术挑战。 血清是血液的一个亚室，含有富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小硫醇的异质环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG和IgG4。根据局部环境和溶剂暴露，这种混乱可能与使用工程二硫键以增强热和胶体稳定性的bsAb/msAb格式相关。 在啮齿动物和非人灵长类动物中进行的血清稳定性研究和药代动力学（PK）评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，并在开发性评估的早期识别潜在的责任。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的开发候选物。例如，体内脱酰胺作用可能导致抗原结合的丧失，影响效力，并可能引起潜在的关注。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和链球菌免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解，不同的酶特异性和裂解效率主要基于它们各自的铰链序列。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或者在循环中，而IgG2则较不易受到裂解。IgG1两个重链的下铰链的裂解可能对Fc效应功能产生负面影响，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，因为裂解位点靠近Fcy受体和C1q的结合位点，可能与自身炎症性疾病中mAbs的治疗抵抗性有关。蛋白酶裂解事件可能以类似的方式影响IgG型bsAbs/msAbs格式的铰链区域，具有潜在的意想不到的裂解敏感性、特异性和效率。因此，应在临床前开发阶段监测这些裂解事件。许多bsAb格式使用甘氨酸-丝氨酸的扩展连接序列来系上额外的模态并增加价数，这些可能容易受到体内蛋白水解裂解的影响。 相反，最近已经利用在实体瘤的肿瘤微环境中优先表达的某些蛋白酶的存在来激活被蛋白酶可裂解的域或肽段掩盖的bsAb TCEs，以限制它们在循环中的靶向毒性。在另一个例子中，蛋白酶敏感的连接子被用来将两个域抗体系成一个bsAb分子，用于治疗性口服治疗炎症性肠病。 6.可制造性 可制造性是分子开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造过程和控制策略。这种评估最好在代表性材料上进行，评估与产品质量、可扩展性和工艺产量相关的大规模生产过程的技术可行性。通常，可制造性评估分子适应平台流程和方法，以支持简化的开发工作。及早识别CQAs（关键质量属性）和工艺及分析开发的风险，可以减轻开发挑战，并允许优先分配工艺开发资源。开发候选物的可制造性是实现供应高质量、纯化和配方化的抗体以推进毒理学研究、临床研究和商业化的关键考虑因素。执行严格和全面的临床计划以及满足商业化视角下的供应链目标所需的抗体数量，突出了建立强大和可扩展制造工艺的基本需求。 6.1.双特异性抗体/多特异性抗体的制造考虑 从可制造性的角度来看，单克隆抗体（mAbs）已经通过发表的报告和行业指导文件得到了很好的表征。自1986年首个单克隆抗体商业化以来，已经开发了许多可制造性工具，并对潜在的责任进行了表征，降低了将单克隆抗体治疗推进到制造过程中的相关风险和挑战。 尽管双特异性抗体/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）作为一类治疗药物取得了进展和势头，但与单克隆抗体相比，支持其开发到制造的资源相对较少，这主要是因为它们在临床和商业制造方面的历史相对有限。此外，bsAbs/msAbs的结构异质性除了必须克服的单克隆抗体工艺障碍外，还提出了几个可制造性挑战。 6.2.工艺考虑 上游工艺考虑 在开发稳定表达bsAb/msAb的细胞系时，上游处理考虑不仅必须评估典型的开发标准，如蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预测设备、材料、培养基和饲料背景下的可制造性，而且还必须额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 开发bsAb/msAb上游工艺可能非常具有挑战性，因为几个变量可能影响正确与错误组装分子的比例，以及错误组装物种的身份和相对丰度。载体和序列设计、选择克隆性和正确组装分子产量的过程，以及细胞培养和蛋白质表达的多因素性质（如上所述），都是需要考虑的关键因素。使用导向突变，如knob-into-hole突变，结合细胞系开发选择和上游工艺开发考虑，通常用于努力优化粗提物中正确配对目标分子的浓度。 尽管在细胞系开发和上游处理方面取得了进展，但在细胞培养上清液中存在错配的bsAb/msAb并不罕见，制造过程中还需要在下游成功纯化此类产品相关杂质的方法。 下游工艺考虑 在下游处理中，上游bsAb/msAb制造过程中产生的错配变体是不受欢迎的，它们作为工艺杂质，给纯化过程带来额外负担。在典型的单克隆抗体制造过程中，半抗体和抗体片段是常见的杂质，但具有显著结构和生化特性差异的变体更容易使用依赖分子电荷差异的色谱方法分离。这对bsAbs/msAbs的可制造性提出了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如几个四链bsAb分子中的那些，可能表现出难以用制造中常用的分离方法区分的生物物理特性。不同质量的产品相关杂质也可能影响纯化和表征方法，包括由于bsAb/msAb变体的聚集倾向增加而产生的重大制造挑战。因此，在开发bsAb/msAb候选物时及早评估可制造性是非常有利的，以确定由于链错配而产生的结构变体之间的分子属性差异是否提供了足够的分辨率，以实现大规模成功纯化。变体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用了pH和/或电导依赖的色谱过程。 也可以利用其他纯化方法从其他属性中分离产品相关变体，包括利用疏水相互作用色谱针对变体之间的疏水性差异，或依靠独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。虽然结合多种纯化方法可以增加成功分离配对的bsAbs/msAbs与错配变体的可能性，但涉及的额外时间和成本通常是不受欢迎的。在制造过程中，定制与建立可靠的平台流程相反，突出了开发需要有限工艺定制的bsAbs/msAbs的价值。 使用适当的分析方法对于生产中双特异性抗体/多特异性抗体（bsAb/msAb）的特性描述至关重要。除了典型的与产品相关的、宿主细胞相关的以及其他与工艺相关的杂质外，建立一个足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品非常重要。在开发过程中，区分这些变体的可制造性和工艺开发至关重要。此外，这种材料可能用于临床前研究，强调了其质量的重要性。当考虑制造规范时，批量放行标准推动目标分子的最终浓度以及任何指定杂质在可接受的范围内。液相色谱/质谱（LC/MS）方法，包括去糖基化完整质谱，通常能够区分错配变体，识别包含错配的重链（HC）和/或轻链（LC）组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。随着bsAb/msAb药物开发向商业化发展，另一个关键的分析挑战是生物测定法的开发。bsAb/msAb的生物测定法必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将这些组合到单一测定中可能证明是一个重大挑战，评估是否需要开发两个单独的生物测定法是建立适当分析策略时的一个重要因素。7.结论 首个基于bsAb和msAb的药物开发涉及大量投资，用于制造和评估这些新兴分子，以满足现代治疗药物所期望的严格的安全性和有效性标准。治疗性双特异性抗体的开发有着悠久且研究深入的历史，始于20世纪60年代双特异性F(ab)2分子的形成，并于2018年首个双特异性药物blindumomab获得FDA批准。随后，用于生成这些复杂分子的蛋白工程方法以及高效评估其功能和开发性属性所需的技术和知识都有了显著改进。这些努力的结果是，过去几年有数百个bsAb/msAb分子进入临床研究，为临床上评估这些令人兴奋的分子提供了独特的治疗潜力。同时在体内对多个靶标采取行动的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗格局。因此，用于工程化和评估这些独特分子的方法必须继续发展，以满足这一机会并为患者提供价值。 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内容来源：小药说药 前言 在肿瘤免疫治疗中，免疫系统主要诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞溶解作用来抑制疾病的进展。然而，肿瘤微环境中的CD8+T细胞往往因为持续的抗原刺激，发生耗竭。耗竭的CD8+T细胞持续存在，但逐渐失去其效应器功能、细胞毒性和增殖能力，导致免疫监视功能低下。 耗尽的CD8 T细胞通常表达一整套抑制性免疫检查点受体（ICR），由同源配体触发，通过下游信号通路调节T细胞反应。在耗竭的CD8+T细胞中，阻断ICR和免疫检查点配体（ICL）之间的相互作用是恢复CD8+T细胞的可行策略。考虑到肿瘤微环境中T细胞与其他免疫细胞之间的广泛相互作用，免疫细胞上的免疫检查点配体表达在促进抗肿瘤免疫应答方面与肿瘤细胞上的ICL表达同样重要。因此，有必要深入了解这些ICL，以及哪些因素导致ICL表达的患者间差异。 PD-1的配体 PD-1介导的T细胞抑制可归因于PD-1的两种众所周知的配体，即PD-L1和PD-L2（B7-DC、CD273）。 PD-L1 相比PD-L2，PD-L1是PD-1更主要的配体。肿瘤细胞的PD-L1表达通常发生在恶性转化过程中，然而，除了导致PD-L1在肿瘤细胞中组成性表达的内在因素外，肿瘤微环境中的外在因素也可促进PD-L1的表达，如营养缺乏、代谢物积累和缺氧。 炎症性肿瘤微环境提供了调节PD-L1表达的各种因子。IFN-γ主要由效应T细胞和NK细胞分泌，是各种肿瘤细胞PD-L1最有效的诱导剂。在机制上，IFN-γ诱导的PD-L1上调是通过JAK1/2–STAT1激活介导的，最终由干扰素调节因子1（IRF1）与PD-L1启动子直接结合。除干扰素外，其他炎症介质也调节PD-L1的表达，如TNF-α、IL-6、IL-27、TGFβ等。 肿瘤浸润性免疫细胞表达的PD-L1通过多种机制促进免疫逃逸。在抗原呈递细胞（APC）上表达的PD-L1，包括树突状细胞和巨噬细胞，与表达PD-1的T细胞或共刺激分子CD80顺式相互作用传递抑制信号。此外，来自活化T细胞的PD-L1与其他T细胞或巨噬细胞上表达的PD-1结合，后者促进M2极化。T细胞上表达的PD-L1本身作为受体，可导致活化T细胞的无能状态或凋亡。 PD-L2 作为PD-1的第二配体，PD-L2也赋予PD-1抑制功能，尽管其机制尚不完全清楚。PD-L2以比PD-L1更高的亲和力与PD-1结合，PD-L2的表达最初被认为仅限于树突状细胞或巨噬细胞，但最近的研究表明PD-L2的表达没有以前认为的那么受限制，已有报道表明其表达在许多人类恶性肿瘤中。 与PD-L1一样，PD-L2在肿瘤细胞中通过IFN-γ诱导上调，IFN-β通过促进STAT3与PD-L2启动子的相互作用也具有类似的作用。此外据报道，Th2型细胞因子IL-4和IL-13也可诱导食管腺癌中PD-L2的表达。 在免疫细胞中，IFN-γ和Th2细胞因子参与PD-L2的表达。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是巨噬细胞和树突状细胞中PD-L2的诱导剂。此外，常见的γ链细胞因子，如IL-2、IL-15和IL-21，可在单核细胞或巨噬细胞中诱导PD-L2表达。 TIGIT的配体 TIGIT是一种抑制性受体，主要由NK细胞、调节性T细胞、记忆性T细胞和耗竭的CD8 +T细胞表达。人TIGIT可与三种配体结合，即脊髓灰质炎病毒受体（PVR，NECL5，CD155）、PVR相关2（PVRL2，NECIN2，CD112）和PVR相关3（PVRL3，NECIN3，CD113），其中PVR对TIGIT的亲和力最高。PVR/TIGIT结合通过磷酸化TIGIT胞内段的免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）或干扰PVR/DNAX相关分子1（DNAM-1，CD226）结合抑制T细胞反应。 PVR是一种粘附分子，在许多类型的实体和血液系统恶性肿瘤中过度表达，其过度表达与不良预后相关。PVR是连接蛋白和连接蛋白样（Necl）分子家族的成员，并参与各种生理过程，包括细胞间粘附、运动、增殖和分化，其过度表达可能以肿瘤细胞固有的方式产生促肿瘤作用。同时，致癌的RAS/RAF/MEK/ERK信号通路通过激活蛋白-1（AP-1）与小鼠成纤维细胞中PVR启动子的直接结合来上调PVR的表达，但尚不清楚RAS/RAF/MEK/ERK信号是否也增加了人类肿瘤细胞中PVR的表达。 然而，就抗肿瘤免疫反应而言，PVR过度表达是否具有促肿瘤或抗肿瘤作用仍不确定。在调节抗肿瘤免疫反应时，PVR可与三种不同的受体结合——DNAM-1、TIGIT和CD96，根据其结合的受体，可能会产生矛盾的效应。许多研究表明PVR是NK细胞功能的刺激因子，然而，鉴于TIGIT与PVR的结合亲和力高于DNAM-1，且TIGIT在肿瘤浸润淋巴细胞上高度表达，因此，肿瘤细胞上的PVR表达如何影响体内效应细胞需要进一步研究。 TIM-3的配体 TIM-3是T细胞耗竭的标志，是免疫治疗中最常见的靶点之一。Tim-3有四种配体：半乳糖凝集素-9（Gal-9）、磷脂酰丝氨酸（PtdSer）、高迁移率族蛋白盒1（HMGB1）和癌胚抗原相关细胞粘附分子1（CEACAM1）。 其中，Gal-9和CEACAM1通过从TIM-3分离HLAB相关转录物3（BAT3）来减弱TCR信号，并最终导致细胞凋亡。此外，TIM-3和CEACAM1之间的细胞内相互作用支持TIM-3的成熟和表面转运。因此，T细胞内缺乏CEACAM1会导致TIM-3在细胞内积聚，并且无法与配体相互作用，从而使T细胞从TIM-3介导的抑制中释放出来。 另一方面，暴露在凋亡细胞外小叶上的PtdSer可触发CD8+树突状细胞或巨噬细胞亚群上表达的TIM-3并诱导吞噬作用。而HMGB1，一种报警蛋白，可以释放到肿瘤微环境中，与游离DNA形成复合物，复合物的形成有助于DNA内化到树突状细胞中以激活内体TLR。而TIM-3结合HMGB1可抑制复合物的形成和随后的树突状细胞激活。迄今为止，已知TIM-3与PtdSer或HMGB1之间的相互作用间接影响T细胞功能，但PtdSer或HMGB1是否直接影响表达TIM-3的T细胞还有待研究。 LAG-3的配体 迄今已发现了五种LAG-3配体：MHC II、半乳糖凝集素-3（Gal-3）、肝窦内皮细胞凝集素（LSECtin）、α-突触核蛋白原纤维（α-syn）和纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）。与其他配体不同，LAG-3结合α-syn与神经系统中病理性α-syn纤维的细胞间传递有关，与免疫反应无关。 尽管有报道称，LAG-3可以高亲和力结合MHCII，并通过阻止MHCII和CD4之间的相互作用来调节CD4+T细胞，但最近的研究表明，LAG-3与MHCII/肽复合物（pMHCII）的结合通过转导抑制信号抑制CD4+T细胞。 此外，研究还发现，大量表达pMHCII的APC通过LAG-3依赖机制抑制CD8+T细胞的激活。另外，其他配体包括Gal-3、LSECtin和FGL1与LAG-3结合，都可以对肿瘤微环境中的CD8+T细胞进行负性调节。 肿瘤内CD8+T细胞和基质细胞是Gal-3的主要来源，但Gal-3也可由多种类型的肿瘤细胞分泌。LSECtin或FGL1在正常生理条件下在肝脏中表达，在一些肿瘤细胞中高度上调。在肿瘤细胞中通过IL-6或IL-10可诱导LSECtin表达，或通过IL-4也可以在人类单核细胞来源的树突状细胞中诱导LSECtin表达。此外，L-6还增加人肝癌细胞中的FGL1的表达。未来的研究需要验证这些配体的精确分子机制以及它们在LAG-3介导的T细胞抑制中的作用。 VISTA的配体 对于VISTA配体的研究长期处于空白状态。然而，目前多个已发表的研究都强调了潜在的VISTA配体。最近，一项研究确定VSIG3（或 IgSF11）为VISTA配体，这种相互作用有助于抑制T细胞反应。由于VSIG3在造血细胞中的表达是无法检测到的，这种相互作用在体内的生理相关性仍有待验证。 此外，有研究发现，VISTA和P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）之间存在pH依赖性相互作用。研究人员强调了VISTA细胞外结构域的一个独特特性，它富含组氨酸残基。组氨酸的侧链在酸性pH条件下发生脱质子化，例如在TME中发现的侧链，这种翻译后修饰允许与 PSGL-1 结合。鉴于VISTA多聚体（包括 VISTA-Fc）只在酸性条件下与白细胞结合，这种翻译后修饰在决定VISTA配体相互作用中的重要性是不可低估的。 对这一发现的热情有多种原因。首先，PSGL-1和VISTA在调节T细胞活性和肿瘤免疫方面的作用越来越受到重视。其次，pH 和离子环境是调节免疫受体相互作用的一个新的和有价值的概念。这在离子环境在明显影响T细胞免疫命运的肿瘤中尤为重要。更重要的是，这项研究提出了一种创新的策略来构建pH选择性抗体，即配体只针对pH失调的部位（如肿瘤）。 小结 在肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过诱导表达和调控不同的ICR和ICL，建立了一个适宜生长的环境。随着肿瘤的发展，ICRs同时受到共同因素的诱导，而相应ICLs的表达具有重叠但独立的调控。此外，肿瘤微环境中存在多种调节因子，每种调节因子都可能对ICL表达产生不同的影响。 由于ICL表达模式可能指示免疫检查点途径的活动，个体间ICL的差异表达谱可用于预测免疫检查点阻断的治疗反应。例如，许多研究表明PD-L1表达与PD-1阻断剂的治疗反应相关。因此，通过识别基于ICL的稳健生物标记物，有可能实现更高的应答率和精确的免疫治疗。 参考文献： 1.Perspectives on immunecheckpoint ligands: expression, regulation, and clinical implications. BMB Rep. 2021Aug 31; 54(8): 403–412. 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

摘要:程序性细胞死亡1（PD-1）信号通路是免疫检查点调节的关键因素，已成为癌症免疫治疗的焦点。在癌症的背景下，肿瘤细胞上上调的PD-L1可能导致T细胞耗竭和免疫逃逸，促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂的出现通过解除T细胞的耗竭显示出临床成功。然而，诸如抗药性和不良反应等挑战促使人们探索创新策略，双特异性抗体（BsAbs）作为有希望的前沿出现。BsAbs通过同时靶向PD-L1和其他免疫调节分子，为癌症免疫治疗提供了一种多方面的方法。我们重点关注PD-1/PD-L1治疗的最新进展，特别强调BsAbs的开发和潜力，尤其是在实体瘤的背景下。讨论了针对PD-1信号的各种BsAb产品，突出了它们独特的作用机制和治疗潜力。值得注意的例子包括抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1、抗VEGF×PD-L1、抗4-1BB×PD-L1、抗LAG-3×PD-L1和抗PD-1×CTLA-4 BsAbs。此外，我们还总结了正在进行的临床研究，评估这些创新BsAb药物的疗效和安全性。通过揭示肿瘤微环境的复杂性并利用抗PD-1/PD-L1 BsAbs的协同效应，有潜力提高癌症免疫治疗的精确性和有效性，最终实现针对个体患者档案量身定制的个性化治疗策略的发展。 1.背景 程序性细胞死亡1（PD-1）信号作为一种基础的免疫检查点机制，能够降低炎症反应并维持免疫稳态。PD-1中的关键结构，即免疫受体酪氨酸基抑制/开关基序（ITIM/ITSM），促进信号传导并在细胞内招募磷酸酶（SHP1/2）。PD-1/PD-L1信号不仅作为预防自身免疫疾病的关键途径，而且显著影响肿瘤免疫监视与免疫耐受之间微妙的平衡。肿瘤细胞或浸润淋巴细胞上PD-L1的增加可能导致T细胞耗竭，抑制肿瘤特异性免疫并促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断负性调节信号，有效释放T细胞的耗竭状态，成为开创性的治疗方法。自2014年FDA批准首个抗PD-1抗体（帕博利珠单抗）以来，PD-1/PD-L1阻断疗法已经彻底改变了临床实践，展现出对难治性肿瘤特别有效的强大且持久的抗肿瘤效果。PD-1/PD-L1抑制剂通过破坏肿瘤利用的免疫抑制信号，使免疫细胞更有效地识别和杀死癌细胞。抗PD-1/PD-L1药物的临床成功强调了免疫检查点阻断在癌症治疗中的重要性。然而，诸如抗药性、有限的响应率和不良反应等挑战促使人们探索创新策略以优化和扩大治疗影响。与此同时，双特异性抗体已成为癌症免疫治疗中有希望的前沿。通过同时靶向PD-L1和参与免疫调节的其他关键分子，双特异性抗体（BsAbs）提供了一种多方面的方法来增强抗肿瘤免疫反应。本综述深入探讨了PD-1/PD-L1阻断的最新进展，并探索了双特异性抗体的潜力，重点关注它们在实体瘤中的开发和应用。通过阐明针对PD-L1 BsAb开发的进步，特别是为实体瘤量身定制的那些，本综述旨在为癌症免疫治疗的不断发展的理解做出贡献，并为更有效和个性化的治疗策略铺平道路。 2.BsAb的进步 2.1.BsAb的开发 针对肿瘤相关抗原（TAAs）的单克隆抗体，如Her2或EGFR，在乳腺癌和肺癌治疗中的成功，促使人们探索创新方法，包括开发BsAbs。BsAbs自20世纪80年代引入以来，因其在癌症治疗中的潜力而受到广泛关注。从功能上讲，BsAbs作为免疫效应细胞和肿瘤细胞之间的有效连接，或同时阻断两种不同的致癌分子。此外，一些BsAbs通过引导各种效应细胞以非MHC限制的方式杀死肿瘤细胞来增强肿瘤杀伤（图1）。技术的进步已经产生了各种BsAb格式，根据Fc结构域分类为非IgG格式和IgG格式。IgG样制剂保留Fc介导的抗体效应功能，而无Fc的BsAbs缺乏这些功能。双特异性T细胞引导剂（BiTEs）和TriomAbs是著名的BsAb格式。BiTEs缺乏Fc结构域，表现出短的血清半衰期，限制了它们的临床应用。TriomAbs具有IgG样结构，显示出更慢的清除率，但面临免疫原性和由于Fc结构域导致的渗透性受损的挑战（图2）。 图1 双特异性抗体（BsAbs）通过非MHC限制性方式引导各种效应细胞向肿瘤细胞，增强了肿瘤杀伤能力。BsAbs促进了T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，触发了一系列导致T细胞激活的事件。活化T细胞在癌细胞裂解中采用的主要机制涉及Granzyme-B和Perforin（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体作用机制”）。 图2 blinatumomab和TriomAbs的杀伤肿瘤机制。Blinatumomab是一种抗CD3×CD19的双特异性T细胞引导剂（BiTE）抗体。Blinatumomab旨在结合B细胞的CD19和T细胞的CD3。通过连接这两种细胞类型，blinatumomab有助于促进T细胞对癌细胞的反应，导致B细胞白血病细胞的破坏。Catumaxomab是基于TriomAbs技术的抗CD3×EpCAM BsAb，结合癌细胞的EpCAM和T细胞的CD3。值得注意的是，Fc结构域可以结合效应细胞（包括NK细胞、巨噬细胞和树突细胞）的Fcγ受体，触发抗体依赖性细胞毒性或吞噬作用，以及对癌细胞的补体依赖性毒性（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体设计”）。 在过去十年中，BsAb的开发主要由BiTEs主导。这些抗体同时结合T细胞的CD3和肿瘤细胞的TAAs，激活T细胞信号级联并启动依赖目标的肿瘤细胞杀伤。与检查点抑制剂不同，BiTEs克服了T细胞受体（TCR）的主要组织相容性复合体（MHC）限制，在临床上通过FDA批准的blinatumomab（抗CD3×CD19）得到了验证。此外，抗CD3×CD20 BsAb mosunetuzumab也已获准用于难治性或复发性滤泡性淋巴瘤。然而，尽管在血液恶性肿瘤中观察到有希望的结果，但在实体瘤中的双特异性抗体治疗效果，这些占所有癌症的90%，仍然是一个挑战，主要是由于抑制性肿瘤微环境（TME）损害了T细胞活性并促进了免疫缺陷。 另一条BsAb研究途径涉及同时靶向肿瘤细胞上的两个表位或TME中的细胞因子（图3）。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条促肿瘤信号通路，产生协同抗癌效果或最小化药物抗性。例如，双功能抗体M7824，靶向PD-L1和TGFβ，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中显示出显著的临床疗效。此外，尽管BsAb在实体瘤中的临床结果与血液恶性肿瘤相比不太令人满意，但正在进行的研究和临床试验，特别关注通常表达的抗原（例如EpCAM、HER2、PSMA和CEA），展示了BsAb在癌症免疫治疗中的巨大潜力。最近，同时靶向PD-L1和其他免疫抑制分子的BsAbs已经开发出来。这些BsAbs在临床前和临床研究中显示出强大的抗肿瘤活性，被视为下一代免疫检查点抑制剂（ICIs）。 图3 同时靶向肿瘤细胞上的两种免疫抑制分子或肿瘤微环境中的细胞因子的双特异性抗体。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条免疫抑制信号通路（4-1BB激动剂抗体除外），产生协同抗癌效果或最小化药物抗性（使用Biorender创建）。 2.2.BsAb在实体瘤中的挑战 在解决实体瘤恶性肿瘤时，BsAbs遇到了阻碍其临床成功的重大障碍。主要挑战包括管理与治疗相关的不良反应，减轻靶向和非靶向毒性，并应对免疫抑制性TME的复杂性。与BsAbs相关的关键问题，特别是那些具有完整Fc结构域的BsAbs，是非靶向毒性的风险，以细胞因子释放综合征（CRS）为例。CRS是一种系统性炎症反应，其临床表现范围从轻微症状到严重的、潜在致命的情况，通常以细胞减少等实验室标志为特征。CRS的病理生理学涉及由活化T细胞释放的IFN-γ触发的免疫级联反应，随后促使巨噬细胞产生过量的炎症细胞因子。这个问题的一个重要贡献者是无意中的T细胞激活，这可能通过非靶细胞上的FcγR结合等机制发生。 标准的缓解策略包括皮质类固醇预处理和优化剂量。此外，针对CRS发病机制中的关键细胞因子IL-6，使用tocilizumab等拮抗剂已显示出在不损害BsAb治疗的抗肿瘤效果的情况下减轻这些不良影响的希望。此外，BsAb设计的创新，如采用无Fc格式或具有修改Fc结构域的抗体，对于减少这些风险至关重要。此外，靶向毒性直接与BsAbs的靶向特异性相关。虽然某些肿瘤相关抗原（TAAs）表现出适用性，但其他由于在正常组织中的存在而带来风险，导致显著的毒性。例如，靶向EpCAM的BsAbs已经显示出这个问题。此外，BsAbs对其靶标的强亲和力可能导致靶向CRS。然而，与组织毒性不同，靶向CRS通常是短暂的，可以通过剂量调节和支持性治疗进行管理。 此外，BsAbs在实体瘤中的有效性受到TME的严重影响。一个重大挑战是免疫沙漠肿瘤中T细胞浸润不足，这限制了BsAb的效力。创新的干预措施，如使用溶瘤病毒，已被用来提高T细胞浸润，将“冷”肿瘤转化为更具反应性的“发炎”肿瘤，从而克服对T细胞参与BsAb治疗的抗性。此外，TME的免疫抑制特性，以BsAb治疗期间PD-1和PD-L1的上调为标志，呈现了另一个障碍。BiTEs在实体瘤中的中等效力导致了探索辅助疗法，如检查点抑制剂和T细胞共刺激因子，以增强其抗肿瘤活性。这些组合在临床前研究中通过克服T细胞耗竭和放大BiTE效果显示出希望。此外，将BiTEs与4-1BB激动剂等T细胞共刺激因子结合使用的策略，在提高BiTE性能方面已经有效。总之，将BsAbs与其他免疫疗法结合可以增强治疗效果，尽管结果因BsAb组成、靶标抗原和肿瘤类型而异。因此，BsAbs与实体瘤TME之间的复杂动态需要多方面和创新的治疗策略，以充分发挥其潜力。 3.抗TGFβ×PD-L1 BsAb 3.1.TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗中的作用 转化生长因子β（TGFβ）信号通路在癌症生物学中表现出双重性质，根据特定的细胞和组织环境，既发挥肿瘤抑制作用，也发挥促进肿瘤的作用。在正常细胞中，TGFβ的功能是维持细胞稳态并防止肿瘤起始，主要通过阻断细胞周期、促进细胞分化和触发细胞凋亡。该途径在不同细胞类型中的响应因Smad蛋白等因子的差异表达而异。相比之下，在癌细胞中，TGFβ的调节作用通常因突变或表观遗传变化而受到干扰或改变，导致从控制增殖转变为促进癌症进展。在肿瘤微环境中，过度活跃的TGFβ信号，通常在正常上皮细胞中具有抑制作用，反常地支持肿瘤生长、侵袭和转移行为。值得注意的是，TGF-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）在癌症发展、侵袭和扩散中至关重要。EMT对TGFβ水平的灵活性和可逆性强调了它作为潜在治疗靶点的重要性，特别是因为它促进了与肿瘤进展和化疗抗性相关的干细胞样表型。全面了解TGFβ在不同癌症类型和组织中的对比作用，以及其对肿瘤微环境的影响，对于设计靶向治疗以遏制癌症进展至关重要。 值得注意的是，越来越多的证据表明，TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗的复杂格局中扮演着核心角色，对肿瘤发生和免疫调节发挥双重作用。其在肿瘤微环境中的作用是多方面的，它不仅有助于促进肿瘤发生，还建立了一个免疫抑制环境，保护癌细胞免受免疫监视。TGFβ的免疫抑制功能通过其能力抑制各种免疫细胞的激活和功能来体现，包括自然杀伤细胞、T细胞和树突细胞。此外，TGFβ增强了免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）的分化和扩增，进一步倾向于免疫逃逸，有利于癌细胞。在癌症免疫治疗的背景下，TGFβ的免疫抑制性质构成了一个重大障碍。旨在中和或抑制TGFβ信号的策略已成为提高免疫疗法效果的有希望途径。值得注意的是，抗TGFβ×PD-L1 BsAb的发展代表了一种开创性的方法，同时靶向肿瘤微环境中的多个免疫抑制途径，从而释放免疫系统对抗癌症的全部潜力。 值得注意的是，TGFβ在癌症中的双重作用强调了理解其在有效患者选择中的情景影响的必要性。TGFβ信号的多效性活动在开发癌症治疗的拮抗剂中提出了挑战，特别是由于缺乏特定的生物标志物和确立的剂量方案。为了将TGFβ阻断剂有效地整合到前线癌症治疗中，未来的临床试验需要专注于生物信息学和识别分子生物标志物，用于患者分层和治疗优化。 3.2.M7824和其他双功能抗体 M7824是一种新型双功能融合蛋白，代表了PD-L1×TGFβ双重阻断疗法的重要进展（表1）。这种创新药物结合了Fab中的抗PD-L1域和Fc中的TGFβ受体，允许同时靶向两种免疫抑制途径。M7824旨在靶向肿瘤细胞上的PD-L1分子，将陷阱分子定位在肿瘤微环境中以捕获免疫抑制性TGF-β。然后，M7824被表达PD-L1的细胞内化，导致去除M7824结合的TGF-β。理论上，由于其物理桥接效应，M7824预计对肿瘤细胞的特异性比两种单克隆抗体的组合要大。在动物模型中，M7824显示出强大的抗肿瘤效果，明显延缓肿瘤生长并延长存活。除了其直接的抗肿瘤效果外，M7824诱导了肿瘤微环境的大量重塑，包括预防或逆转TGFβ介导的癌细胞上皮-间充质转化。这种改变增强了肿瘤细胞对免疫介导攻击和化疗药物的敏感性。融合蛋白增加了细胞毒性淋巴细胞的数量和活性，同时减少免疫抑制亚群的比例，包括Tregs、骨髓源性抑制细胞（MDSC）和M2样巨噬细胞。此外，M7824诱导肿瘤基质重塑，有助于改善免疫细胞浸润，并加强其作为多方面免疫治疗剂的潜力。此外，当与放疗、化疗和其他免疫治疗剂结合使用时，它增强了整体抗肿瘤活性。在1期试验中，M7824提供了有希望的响应，特别是在高PD-L1表达的NSCLC中（NCT02517398）（表2）。 M7824的成功促进了额外的抗TGFβ×PD-L1双功能蛋白的探索和发展。其中，SHR-1701的结构让人想起M7824，结合了抗PD-L1域和N末端截短的TGFβRII。在1期临床试验（NCT05179239）中，SHR-1701在复发性转移性宫颈癌中表现出抗肿瘤活性。同样，由抗PD-L1抗体和TGFβRII外细胞域组成的双功能蛋白BR102，在小鼠肿瘤模型中展示了抗肿瘤活性。这些新兴的抗体，包括SHR-1701和BR102，为潜在的抗TGFβ×PD-L1阻断疗法的不断扩大的武器库做出了贡献，为癌症免疫治疗的复杂格局提供了新的治疗策略。 3.3.YM101和BiTP YM101被誉为世界上首个公开报道的抗TGFβ×PD-L1 BsAb，标志着癌症免疫治疗领域的关键进步。利用Check-BODY™技术平台设计，YM101代表了用于对抗PD-L1和TGF-β双重挑战的创新策略。临床前研究揭示了YM101有效抵消TGF-β和PD-1×PD-L1信号通路效应的能力。此外，在体内证据表明，YM101在抗肿瘤活性方面优于单独的抗TGF-β和抗PD-L1治疗。我们假设这种改善的抗肿瘤效果可能归因于YM101独特的物理桥接效应带来的增强的肿瘤特异性。然而，必须承认，我们目前的推测缺乏实验证据来证实它。在未来的研究中，必须使用同位素标记等技术进一步验证并展示YM101的优势，特别是在其增加肿瘤特异性和相关增强抗肿瘤效果的潜力方面。 此外，YM101在塑造肿瘤微环境方面发挥了变革性作用，促进了以增加的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）数量和活性为特征的炎症肿瘤的形成。YM101还将巨噬细胞的极化平衡转向抗肿瘤的M1表型，进一步增强了其免疫治疗潜力。此外，在临床前研究中，STING激动剂和YM101的组合通过针对三条独立且互补的途径，展示了强大且持久的抗肿瘤免疫保护。STING激动剂诱导树突细胞成熟并激活巨噬细胞，重新点燃免疫学上的冷肿瘤，并增强全身的先天和适应性免疫反应。与YM101结合使用时，STING激动剂协同作用，使肿瘤微环境正常化并阻碍非炎症模型中的肿瘤生长。 受到临床前结果的鼓舞，随后开发了用于临床试验的替代分子（BiTP）。BiTP与YM101具有相似的结构，并使用Check-BODY™平台构建，在小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型中证明了其有效性。在人源化TNBC模型中的有效性实验表明，BiTP显示出比相应单一疗法更好的抗肿瘤效果。BiTP减少胶原蛋白生成，增强T细胞渗透，并增加淋巴细胞向肿瘤的浸润。目前，正在进行多项BiTP的临床试验，包括CTR20211776（用于实体瘤）和CTR20223410（用于胰腺癌）。总的来说，以YM101、BiTP和M7824为代表的抗TGF-β×PD-L1 BsAb的开发，代表了癌症免疫治疗的变革性方法。这些创新药物旨在同时靶向多条免疫抑制途径，在临床前和临床环境中显示出显著的效果。在组合疗法中观察到的协同效应进一步强调了这些抗体克服抗性机制并扩大其在不同肿瘤类型中的适用性的潜力。 4.抗CD47×PD-L1 BsAb CD47在癌症中发挥关键作用，通过与其配体肿瘤细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）结合传递“不要吃我”信号。破坏CD47或其配体的抗体在临床前研究和临床试验中显示出治疗效果。CD47阻断增强了各种肿瘤模型中的抗原呈递、吞噬作用和免疫浸润，支持了CD47阻断免疫治疗药物的开发。此外，CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1信号的双重阻断，分别抑制先天和适应性免疫反应，在多种癌症类型中显示出增强的治疗效果，为刺激免疫系统的两个分支提供了有希望的治疗途径。基于纽扣-入洞（KIH）平台，Wang等人开发了一种抗CD47×PD-L1 BsAb 6MW3211，该抗体设计有一个通用轻链，对CD47具有低亲和力，对PD-L1具有高亲和力。这种独特的亲和力配置文件允许优先结合肿瘤细胞的PD-L1，抑制CD47信号通路。6MW3211在多种小鼠模型中展示了强大的治疗效果，并在体内展示了有希望的药代动力学和安全性。通过多重荧光免疫组化染色确认的多种人类肿瘤上CD47和PD-L1的共表达，支持6MW3211针对PD-L1+ CD47+癌症的临床试验的潜力。 此外，Chen等人构建了一个亲和力调整的抗CD47×PD-L1 BsAb（hBisAb），以提高抗体选择性和治疗效果。hBisAb利用纽扣-入洞技术和通用轻链结构开发，采用IgG1格式。这种人性化抗体对CD47表现出中等亲和力，对PD-L1表现出高度有效的亲和力，这一点通过表面等离子共振和基于细胞的实验获得的动力学速率常数得到证实。特别设计用于优先结合PD-L1，该抗体有效阻断PD-1/PD-L1相互作用，也抑制了CD47/SIRPα轴。这种双重作用机制不仅增强了T细胞功能，还显著提高了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，超过了单独针对任一检查点的单一疗法。体外和体内研究表明，hBisAb对肿瘤细胞具有显著的选择性，超过了红细胞，解决了CD47靶向疗法常见的挑战，通过最小化不必要的血液学效应。这种选择性进一步由抗体在肿瘤微环境中对表达PD-L1的细胞的优先结合所强调，减少了非靶向效应，提高了治疗安全性。特别是IgG1形式的双特异性抗体在促进抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和DC介导的T细胞激活方面显示出优越的效力，导致同种异体小鼠模型中显著的肿瘤生长抑制和提高的生存率。值得注意的是，这种方法通过维持治疗小鼠的正常红细胞计数和体重，减轻了与CD47靶向相关的潜在毒性，突出了双特异性抗体增强的抗肿瘤效果和减少的副作用。 此外，还有一些其他的抗CD47×PD-L1 BsAbs已被报道。例如，IBI322被设计为通过优先结合PD-L1+CD47+肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞吞噬，同时最小化对CD47+PD-L1−细胞（如红细胞）的影响，以提高治疗选择性和效果。同样，一种双重靶向融合蛋白IAB有效地结合了CD47和PD-L1，展示了强大的抗肿瘤活性，并在激活先天和适应性免疫对抗肿瘤中发挥了至关重要的作用。这些创新方法强调了双重检查点阻断的潜力，同时靶向CD47和PD-L1，以改善治疗结果，同时减轻与传统抗体相关的毒性。 5.抗VEGF/PD-1和抗VEGF/PD-L1 BsAb VEGF是由低氧肿瘤微环境诱导的，刺激内皮细胞增殖和血管生成。此外，VEGF具有免疫抑制作用，促进免疫抑制细胞的招募并阻碍免疫细胞浸润。将抗血管靶向药物与ICIs结合使用已在多种癌症中显示出协同抗肿瘤效果，突出了双重治疗策略在癌症治疗中同时解决血管生成和免疫反应的潜力。目前，已有多种抗VEGF×PD-1和抗VEGF×PD-L1 BsAbs成功开发用于癌症免疫治疗。 Hassanzadeh等人构建了一种双价抗PD-L1×VEGF纳米抗体，证明了其在体外有效抑制血管生成。此外，针对PD-L1和VEGF的BsAb HB0025是利用mAb-Trap技术开发的。临床前研究表明，HB0025在抑制肿瘤生长方面比单独使用抗PD-L1抗体或VEGFR1D2融合蛋白更有效。而且，Xiong等人开发了一种全人源双特异性单链双抗体（BsDb），靶向VEGF165和PD-1。这种BsDb展示了高度特异性，抑制了VEGF165诱导的人脐静脉内皮细胞中的活动，并增强了T细胞增殖和IFN-γ的产生。在小鼠模型中，BsDb通过抑制血管生成和激活免疫反应，表现出强大的抗肿瘤活性，表明其作为双重靶向BsAb用于癌症治疗的潜力。重要的是，2期临床试验评估了AK112（一种人源化IgG1抗VEGF×PD-1 BsAb）与化疗联合用于晚期NSCLC的疗效和安全性。该研究包括具有不同治疗历史和基因组改变的三个队列。1、2和3队列中确认的客观反应率（ORR）分别为53.5%、68.4%和40.0%。研究结果表明，AK112加铂类药物显示出有希望的抗肿瘤活性和安全性，为晚期NSCLC患者提供了一种潜在的新治疗选择。 6.抗4-1BB×PD-L1 BsAb 4-1BB（CD137）是一种由活化的NK和T细胞表达的诱导性共刺激分子。4-1BB信号，由其在专职抗原呈递细胞（APCs）上的配体相互作用触发，激活了通路，导致增强的细胞因子产生、存活、增殖和免疫记忆。在肿瘤微环境中，4-1BB作为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的标志物，通常与PD-1共表达。4-1BB激活在临床前模型中显示出有希望的抗肿瘤反应，4-1BB激动剂抗体与PD-1/PD-L1抑制剂的组合协同增强了抗肿瘤免疫。目前，4-1BB激动剂与抗PD-1治疗的组合使用面临重大挑战，尤其是系统毒性。例如，由于系统激活4-1BB途径导致的剂量依赖性肝炎，一种治疗性CD137激动剂抗体的临床开发被中止。从理论上讲，BsAb技术具有潜力，因为它可能通过PD-L1结合激活4-1BB，从而增强肿瘤特异性T细胞反应。这种方法看起来很有前景，因为PD-1和4-1BB都在肿瘤特异性CD8+CTLs上共表达。 为了通过将4-1BB激动剂与这些抑制剂结合来增强ICIs的治疗效果，已经开发了几种抗4-1BB×PD-L1 BsAbs。MCLA-145被设计为一种IgG1分子，对Fc CH3域进行了特定修改以鼓励重链异二聚体化，并对CH2域进行了修改以防止Fc受体结合。体外实验表明，MCLA-145可以有效地激活T细胞，加强T细胞启动、分化和免疫记忆，并显示出比ICI对照组更好的抗肿瘤活性。重要的是，MCLA-145在非人灵长类动物中显示出没有移植物抗宿主病和最小的不良影响。在机械上，MCLA-145通过结合肿瘤细胞上的PD-L1和T效应细胞上的CD137，促进了“免疫突触”的创建。在这个突触中，T细胞可以在接受增强的TCR信号的同时解除PD-1抑制，并且CD137激活得到加强。随后的研究已经证实，MCLA-145通过PD-L1邻近细胞表达超过5000份PD-L1时有条件地激活CD137信号。这种有条件的激活提供了安全性和有效性的潜在优势。重要的是要注意，即使在最大饱和条件下，MCLA-145也不能在没有邻近细胞表达PD-L1的情况下触发CD137信号。另一种双特异性抗体ABL503，仅在PD-L1的背景下选择性激活4-1BB信号，避免了用抗4-1BB激动剂抗体治疗的患者观察到的剂量依赖性毒性。ABL503在临床前模型中展示了强大的抗肿瘤活性和改善的安全性。 PRS-344/S095012是为了阻断PD-1/PD-L1通路并定位于PD-L1阳性的肿瘤微环境中的4-1BB共刺激而开发的。这种双特异性分子有效地将免疫检查点抑制剂(ICI)与肿瘤微环境中定位的4-1BB介导的免疫刺激相结合，在小鼠模型中展示了比单克隆抗体组合更优越的T细胞刺激和抗肿瘤活性。此外，HK010，一种Fc突变的IgG4抗4-1BB×PD-L1 BsAb，通过同时阻断PD-1/PD-L1信号和刺激4-1BB信号，展现出强大的抗肿瘤效果。HK010在临床前模型中显示出强大的抗肿瘤免疫，诱导持久的抗原特异性免疫记忆，并且耐受性良好，为癌症免疫治疗提供了一个有希望的选择。另外，PM1003是一种针对4-1BB的独特表位的单域抗体，用于构建多特异性抗体，例如抗PD-L1×4-1BB BsAbs，以在肿瘤微环境中定位4-1BB激活，导致PD-L1活性和体内抗肿瘤活性的有效抑制以及最小的毒性。 值得注意的是，在1期临床试验(NCT03917381)中，研究了DuoBody-4-1BB×PD-L1 (GEN1046)，这是一种首创的双特异性免疫治疗剂，在晚期难治性实体瘤患者中的潜力。在临床前模型中，GEN1046在T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性功能方面展示了比临床批准的抗PD-1/PD-L1药物更优越的效果。正在进行的人体首项研究揭示了可管理的安全性、与其作用机制一致的药效学免疫效应以及早期临床活性，在患者中观察到的疾病控制率为65.6% (40/61)，包括对先前抗PD-1/PD-L1免疫治疗有抗性的患者。GEN1046的鼓舞人心的临床前和临床结果表明其有潜力填补临床空白，为免疫治疗复发或难治性疾病的患者提供治疗选择，使其成为与其他免疫治疗剂联合治疗的有希望的候选者。总之，这些发展共同为癌症免疫治疗提供了增强的疗效和安全性的新策略。 7.抗LAG-3×PD-L1 BsAb LAG-3是激活的T细胞和NK细胞上的已识别跨膜蛋白，传递抑制信号以抑制T细胞增殖。目前正在评估阻断LAG-3和MHC-II相互作用的单克隆抗体的潜在抗肿瘤效果。然而，LAG-3和PD-1在肿瘤中的共表达意味着它们参与了T细胞耗竭。抗PD-1/PD-L1和抗LAG-3抗体的联合给药显示出协同抑制肿瘤生长的能力，在2/3期试验中，relatlimab和nivolumab的联合使用与单独使用nivolumab相比，显著延长了PFS。目前，relatlimab和nivolumab的联合使用已被批准用于晚期黑色素瘤。此外，如ieramilimab（一种抗LAG-3抗体）和spartalizumab（一种抗PD-1抗体）的组合，在包括非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、肾细胞癌、间皮瘤和三阴性乳腺癌(TNBC)的各种患者群体中展示了持续的积极反应。这些反应在未接受过抗PD-1/L1治疗的患者以及接受过抗PD1/L1治疗的黑色素瘤和肾细胞癌患者中观察到。开发抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的合理性源于在肿瘤中观察到的共表达，表明其在T细胞耗竭中的潜在作用。 IBI323和ABL501是针对LAG-3和PD-L1的有前途的BsAbs，旨在克服在抗PD-1/PD-L1治疗中对晚期肿瘤观察到的有限效果。IBI323不仅保持了其亲本抗体的阻断活性，还引入了一种新的细胞桥接功能。这种创新机制转化为混合白细胞反应中增强的免疫刺激活性和在人源化小鼠模型中更强的抗肿瘤反应，与肿瘤特异性T细胞的增加相关。同样，ABL501是由一种抗LAG-3 IgG4抗体通过(G4S)3连接子链接到PD-L1靶向scFv构建的，具有战略性的S224P氨基酸替换以增强稳定性。它有效地结合其靶标而不引发Fc介导的效应功能，如ADCC和CDC，将其作用集中在检查点阻断上。体外实验表明，ABL501有效地靶向了LAG-3和PD-L1途径，在增强效应T细胞的激活方面优于单独的抗LAG-3和抗PD-L1抗体。ABL501在人源化异种移植模型中展示了引人注目的体内抗肿瘤效果，强调了其潜在的临床意义。对周围血液中的免疫档案的检查突出了在接受了化疗的复发性胆管癌患者中LAG-3+PD-1+记忆CD4+T细胞亚群的增强存在。值得注意的是，这个亚群预示着对ABL501增加的反应性，为其正在进行的人体首项试验(NCT05101109)提供了有价值的支持。在机械上，ABL501促进了DC的成熟和启动T细胞的能力，导致改善的抗原交叉呈递和更强大的CD8+T细胞激活。此外，ABL501直接增加了CD8+T细胞对肿瘤的细胞毒性。其效果取决于LAG-3和PD-L1的同时参与，促进有效的T细胞-肿瘤细胞相互作用。通过作为T细胞引导剂，促进T细胞激活，同时阻断抑制信号，ABL501协调了强大的抗肿瘤免疫反应。 抗LAG-3×PD-L1 BsAb FS118在临床前和临床研究中展现出了有希望的结果，为癌症免疫治疗提供了一种新的方法。在临床前研究中，FS118展示了对LAG-3和PD-L1的高亲和力同时结合，超越了抗LAG-3和抗PD-L1抗体组合的抗肿瘤活性。在同源肿瘤小鼠模型的机制研究中，使用替代的mLAG-3×PD-L1抗体显示了显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，小鼠替代品导致T细胞上LAG-3的丰度降低，而单独抗体的组合增加了LAG-3的表达。此外，替代mLAG-3/PD-L1抗体的结合导致小鼠LAG-3迅速脱落到血液中。在临床研究中，1期试验(NCT03440437)证明了FS118在晚期、抗PD-1/PD-L1耐药癌症患者中的安全性和耐受性。FS118显示了10 mg/kg每周的推荐2期剂量，持续的药效学活性，以及46.5%的总体疾病控制率，特别是在对PD-1/PD-L1靶向治疗获得性耐药的患者中。这项研究支持了对难治性癌症患者FS118的持续研究，突出了其作为有效的双重PD-L1×LAG-3阻断策略的潜力。除了实体瘤，针对LAG-3的BsAbs也在血液肿瘤中展示了有希望的疗效。在1期临床试验NCT03219268中，探索了抗LAG-3×PD-1 BsAb Tebotelimab在实体瘤或血液肿瘤患者中的疗效。值得注意的是，34%的患者显示肿瘤缩小，包括对抗PD-1治疗有抗性的各种癌症类型的积极反应。 8.抗PD-1/CTLA-4 BsAb CTLA-4和PD-1是抑制各种T细胞功能的免疫检查点，它们的激活通过多种机制导致T细胞功能抑制。CTLA-4在激活时诱导，与CD28介导的激活竞争，并从APCs中移除共刺激配体。PD-1在T淋巴细胞表达时，作为抑制剂减少细胞毒性和细胞因子生成。这两个检查点都被肿瘤用于免疫逃逸。阻断CTLA-4或PD-1的抗体在临床前和临床环境中都显示出抗肿瘤活性，并且组合疗法在各种癌症中展示了改善的反应。此外，TME分析揭示了与正常组织相比，肿瘤中PD-1+CTLA-4+细胞的比例更高，支持了针对PD-1+ CTLA-4+细胞的合理性，以选择性地在TME中阻断检查点，同时避免对正常组织的影响。 PD-1/PD-L1轴的系统阻断在癌症免疫治疗中是基础性的，特别是考虑到其临床意义和良好的安全性。因此，一个优越的组合疗法应该确保它保留了PD-1阻断的效果，而不影响其阻断PD-1与其配体相互作用的能力。然而，CTLA-4的系统性抑制带来了更高的不良反应风险。为了降低这些风险，抗PD-1×CTLA-4 BsAb提供了改进的CTLA-4抑制功能，专门针对在TME中共同表达PD-1和CTLA-4的细胞。例如，MGD019是一种先进的BsAb，设计用于同时靶向PD-1和CTLA-4。这种BsAb具有独特的四价结构，使用高亲和力的抗PD-1单克隆抗体，以及具有类似于众所周知的ipilimumab阻断配体特性的抗CTLA-4单克隆抗体。MGD019的构建在Dual-Affinity Re-Targeting平台上，采用2×2对称格式，结合了铰链稳定的IgG4骨架。MGD019的独特结构允许对PD-1进行强大的阻断，并适应性地抑制CTLA-4，专门针对TME。它模仿了其抗PD-1前体体外阻断PD-1的效果，同时调节CTLA-4阻断，使其在表达PD-1和CTLA-4的细胞中最有效。这种特异性确保了TME中CTLA-4的局部抑制，通过避免广泛的Treg耗尽可能提高了安全性。值得注意的是，MGD019阻断PD-1与其配体的相互作用的能力，结合其适应性CTLA-4阻断策略，在晚期实体瘤患者中显示出显著的抗肿瘤活性和可管理的安全性。 此外，MGD019的IgG4 Fc区域赋予了降低的Fc介导的ADCC能力，从而减少了无意中消除活化的T细胞和Treg。Treg耗尽对ipilimumab的治疗效果和安全性的影响仍在考察中，然而，抗CTLA-4抗体的Fc区域诱导这种耗尽的潜力在临床前研究中与有益和有害的结果都有关联。通过避免Treg耗尽，同时在TME中保持有效的CTLA-4阻断，MGD019旨在提高患者安全性并维持CTLA-4拮抗的有益效果。Treg的免疫抑制作用主要涉及CTLA-4介导的T细胞耗竭。因此，MGD019在TME中对CTLA-4的阻断预计将足够强烈，以补偿缺乏Treg耗尽。这种策略，防止Treg减少，并确保在TME中强烈CTLA-4抑制，旨在优化这些免疫检查点在癌症免疫治疗中的关键功能，可能比传统抗体治疗提供增强的治疗益处，同时最小化不良反应。 抗PD-1/CTLA-4 BsAb QL1706在1/1b期研究中对标准治疗无效的晚期实体瘤显示出可管理的安全性。在推荐剂量下的所有患者中，客观反应率为16.9%，反应的中位持续时间为11.7个月。值得注意的是，未接受过免疫治疗的患者，特别是那些患有非小细胞肺癌、鼻咽癌和宫颈癌的患者，显示出有希望的抗肿瘤活性，反应率分别为24.2%、38.7%和28.3%。QL1706目前正在随机2/3期试验中进行进一步的疗效评估。此外，MEDI5752，一种新型单价双特异性抗体，通过选择性抑制PD-1+活化T细胞上的CTLA4来增强PD-1阻断。它减少了所需的剂量，以分泌IL-2，并迅速内化和降解PD-1。MEDI5752偏好肿瘤定位，与抗PD-1和抗CTLA4抗体组合相比，在体内显示出更优越的活性。两名晚期实体瘤患者对MEDI5752治疗显示出强大的部分反应。这代表了癌症免疫治疗的重大进步，通过选择性靶向PD-1+T细胞上的CTLA4提供独特的好处。 Cadonilimab是一种四价双特异性IgG1抗体，具有创新的Fc-null设计，旨在消除Fc介导的效应功能，以考虑安全性和有效性。它展现出与CTLA-4和PD-1抗体组合相当的生物活性。值得注意的是，Cadonilimab在高密度PD-1和CTLA-4环境中显示出更高的结合亲和力，为肿瘤样环境提供了潜在的优势。在1b/2期试验NCT03852251中，探索了Cadonilimab在晚期实体瘤中的疗效。Cadonilimab显示出令人鼓舞的疗效，宫颈癌的客观反应率为32.3%，食管鳞状细胞癌为18.2%，肝细胞癌为16.7%。这些发现强调了Cadonilimab在实现多种晚期实体瘤类型的积极肿瘤反应中的潜在有效性。目前，Cadonilimab已在中国获得批准，用于治疗铂类化疗后的复发或转移性宫颈癌。 9.其他靶向PD-1/PD-L1信号的BsAbs 除了上述的药剂外，其他BsAbs已经开发并在临床试验中进行评估，如抗PD-L1/CD3、抗PD-1/PD-L1和抗TIM-3/PD-L1 BsAbs。例如，针对现有T细胞引导剂的关键挑战，抗PD-L1/CD3 BsAb的发展取得了最新进展。一个值得注意的创新是Protease-Activated PSTAGylated BiTE (PAPB)，它为实体瘤设计。PAPB结合了一个屏蔽多肽域(PSTAG)、一个蛋白酶激活的链接器和一个带有针对PD-L1和CD3的scFvs的BiTE核心。PAPB展示了BiTE核心对PD-L1和CD3的剂量依赖性结合，能够响应TME中的MMP2释放核心，显著延长其血浆半衰期。此外，一种新型基于纳米抗体的抗PD-L1/CD3 BiTE在与PD-L1表达水平相关的黑色素瘤细胞上显示出细胞毒性活性，突显了其在治疗PD-L1过表达黑色素瘤中的潜力。总的来说，这些进展标志着在实体瘤免疫治疗领域提高抗PD-L1/CD3抗体的安全性、作用持续时间和有效性的有希望的步骤。 TIM-3作为癌症免疫学中的一个关键角色，作为免疫反应的负调节器。在癌症中，TIM-3表达特别识别了最功能障碍的CD8+ T细胞亚群，表明它们的耗竭。在临床前癌症模型的研究中，联合阻断TIM-3和PD-1途径在实体瘤和血液肿瘤中显示出显著的疗效。正在进行的临床试验，特别是在实体瘤中，正在探索抗TIM-3与抗PD-1联合使用的潜力，展示了其作为癌症免疫治疗目标的前景。在1期研究NCT03752177中，评估了TIM-3/PD-L1 BsAb LY3415244在晚期实体瘤患者中的安全性和有效性。虽然一些患者显示出有希望的结果，例如PD-1耐药NSCLC患者(-29.6%)接近部分反应，但试验面临挑战。值得注意的是，16.7%的患者经历了临床意义的过敏性输注相关反应。所有患者都发展出治疗出现的抗药物抗体(TE-ADA)，影响了可溶性TIM-3目标参与，并导致研究提前终止。尽管存在这些挑战，患者结果，特别是在PD-1耐药癌症的背景下，突显了LY3415244的潜在临床影响，值得在未来的研究中进一步探索和考虑。 10.结论和展望 针对PD-1/PD-L1轴以及其他免疫调节分子的BsAbs的出现和临床验证标志着癌症免疫治疗领域的一个关键发展。本综述深入探讨了BsAbs领域的创新进展，特别关注了它们在开发、作用机制以及治疗潜力方面对实体瘤管理的贡献。探索如抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1等BsAbs，突显了扩大抗肿瘤免疫、克服免疫逃逸以及解决单一疗法固有局限性的战略努力。尽管这些药物的治疗前景得到了临床前和新兴临床成功的强调，但将它们最佳整合到癌症护理中的旅程将需要仔细的研究和对细节的关注。 首先，未来的研究必须集中于提高BsAbs的特异性、有效性和安全性。这包括开发下一代BsAbs，具有减少的免疫原性、改善的肿瘤穿透力和定制的药代动力学特性。先进的分子工程技术可以促进设计在肿瘤微环境中选择性积累的BsAbs，最小化系统暴露和相关的毒性。此外，肿瘤微环境的复杂性仍然是免疫疗法有效性的巨大挑战。能够调节抑制性肿瘤微环境、增强抗原呈递、并促进肿瘤内T细胞的浸润和激活的新型BsAbs尤其令人感兴趣。将BsAbs与破坏肿瘤微环境中物理屏障或中和抑制性细胞群体的药物结合起来的策略，可能会产生协同的抗肿瘤效果。此外，识别对BsAb治疗反应的预测性生物标志物至关重要。对肿瘤进行全面的基因组、蛋白质组和免疫学分析可能会揭示预测治疗反应的生物标志物，指导患者选择，并促进个性化治疗方法。这种精准医疗方法将优化治疗结果并降低不良反应的风险。此外，将BsAbs与其他治疗方式相结合，包括化疗、靶向治疗、放疗和其他免疫疗法，有着巨大的前景。基于机制合理和临床前证据的组合策略可以增强抗肿瘤效果，对抗耐药机制，并扩大BsAbs的治疗窗口。 BsAbs在癌症免疫治疗中的探索为我们对抗癌症开辟了新的前沿，承诺增强免疫介导的抗肿瘤反应的精确性、效力和持久性。BsAbs在癌症治疗中的未来预示着一个范式，其中针对多个免疫检查点的协同或将免疫调节与其他治疗策略相结合，可以为全球患者提供持久、有效和更安全的治疗选择。BsAbs在癌症护理中的实质性前景不仅突出了有希望的治疗途径，也强调了我们通过免疫手段共同致力于扭转对抗癌症的潮流。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。