F12

摘要:中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产的人类治疗性抗体约占批准的80%。为了实现更好的细胞生长和高产重组蛋白，通常使用连续批培养（fed-batch culture）技术来生产CHO细胞中的重组蛋白。根据细胞培养中营养物质消耗的需求，添加含有多种组分的培养基可以影响细胞生长的特性，并提高重组蛋白的产量和质量。连续批培养的优化应与培养环境参数、添加物组成和添加策略等综合因素相结合。目前，为了保持生产的灵活性并满足生物治疗过程的即将到来的需求，正在探索过程强化（PI）。本文综述了CHO细胞培养、连续批培养中的添加物组成、连续批培养环境参数、添加策略、连续批培养中的代谢副产物、恒化器培养以及强化连续批培养。 关键点 • 综述了CHO细胞中的连续批培养。 • 连续批培养已成为重组蛋白生产的通用技术。 • 连续批培养促进了CHO细胞中重组蛋白的生产。 引言 近年来，随着医药市场上重组治疗蛋白（RTPs）的需求不断增长，包括重组抗体，RTPs的生产迅速发展。已有超过120种重组抗体获得了欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，市值数千亿美元。一份报告估计，到2025年，单克隆抗体（mAbs）的市值将超过3000亿美元。在重组蛋白表达系统中，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是RTP生产的首选细胞，因为它们具有几个优势：①不易受到人类病毒感染，安全性高；② RTPs具有与人类细胞相似的翻译后修饰；③高密度CHO细胞可以适应悬浮培养，使用化学定义无血清培养基（CD-SFM）并在培养基中分泌蛋白质。 目前，哺乳动物细胞培养中的mAbs生产主要在大规模生物反应器中通过连续批处理进行。CHO细胞通常在连续批模式下培养，以实现最大细胞密度和产品滴度，可以是连续添加或一次性添加。初始细胞生长由基础培养基支持。在连续批培养中添加浓缩的饲料培养基以补充营养物质并延长培养时间。饲料培养基可以避免营养物质的限制，并可以促进重组蛋白的更高产量。连续批处理后，细胞在静止相中的培养时间比批处理培养长。连续批培养需要了解细胞生长和细胞代谢的特性，以及影响RTPs质量和产量的关键过程参数。CHO细胞在指数生长期快速生长，加速消耗葡萄糖和氨基酸，导致乳酸和铵的积累。在连续批培养中，温度、pH和其他过程参数也会影响抗体表达和质量属性。连续批培养可以提高CHO细胞中RTPs的表达和生产，但传统的一次性饲料输送也会导致代谢副产物的积累。因此，合理的饲养策略非常重要。连续批培养已将重点放在降低RTP生产成本上，这已成为制药工业的研究重点。 CHO细胞培养 贴壁CHO细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中于37℃、5% CO2条件下生长。选择SFM进行悬浮培养，支持从贴壁培养到悬浮培养模式的转变。基础培养基用于贴壁培养，包括来自胎牛的血清成分。血清成分复杂，容易受到污染。SFM分为普通无血清培养基、无异种血清培养基、无动物源培养基、无蛋白培养基和化学定义无血清培养基。当涉及到细胞悬浮培养时，SFM可以有效避免血清培养引起的缺点，如污染和纯化困难。 批处理培养是指在一次性添加SFM后，可以在一次收获重组蛋白的培养方法。由于培养时间短和采样时细胞密度不满意，RTP生产不理想。连续批模式改善了RTP生产。据报道，在连续批培养中mAb滴度已达到超过10 g/L。近年来，连续批处理已成为大规模生产RTPs的重要生产过程。然而，保持细胞的高生产力和蛋白质的质量属性仍然是一个挑战。因此，连续批培养已从仅仅高产重组蛋白转变为高产和高质量的双重目标。 连续批培养中的饲料组成 优化关键饲料组成和组分浓度对工艺开发至关重要。在连续批工业中，使用偏最小二乘回归（PLSR）或多元线性回归（MLR）的拉曼光谱法被应用于监测和控制葡萄糖和氨基酸的浓度。除了拉曼光谱法，液相色谱-质谱联用（LC–MS）被认为是分析氨基酸和无机盐。首次，脂质组学分析已用于连续批培养中脂质鉴定和脂质定量。此外，饲料组成已与细胞代谢调节联系起来，以证明连续批培养（图1）。 图1 CHO细胞中的连续批培养。通过转染将感兴趣的基因（GOI）引入CHO细胞。阳性CHO细胞用于摇瓶培养。然后，CHO细胞和饲料培养基被添加到生物反应器中。在连续批培养模式下，监测和控制营养物质以实现RTPs的产量和质量。RTPs的生产由连续批系统指示。 饲料培养基的成分与SFM相似，包括氨基酸、碳源、无机盐、微量元素、维生素、脂质以及腐胺和酵母水解物等（表1）。 氨基酸 在上游过程优化中，氨基酸是主要关注点之一。在批处理培养中，氨基酸消耗殆尽，这对RTP生产不利。氨基酸的添加与三羧酸循环（TCA循环）有关。TCA循环依赖于替代代谢物来补充中间体。来自饲料培养基的氨基酸可以通过细胞质和线粒体之间的转换被导向TCA循环。此外，氨基酸的分解代谢是TCA循环的供应。饲料培养基中的氨基酸是有限的。与提高细胞健康相关的AMP与嘌呤核苷酸循环有关。来自TCA循环的苹果酸和甘氨酸积累。细胞增殖对5 mM以上的氨浓度有负面影响，而氨来自氨基酸的水解。因此，控制氨基酸的添加可能减少副产物的积累。尽管细胞可以合成非必需氨基酸，但细胞生长和重组蛋白的表达仍然依赖于饲料培养基中的氨基酸。 N-乳酰亮氨酸（Lac-Leu）和N-乳酰异亮氨酸（Lac-Ile）可以分别替代未修饰的亮氨酸和异亮氨酸。Lac-Leu和Lac-Ile提高了在培养基中的溶解度。添加2倍浓缩饲料培养基，其中包含上述两种N-乳酰氨基酸（Lac-AA）的70%混合物，与添加1倍浓缩饲料培养基相比，重组蛋白的产量增加了58%。Schmidt等人发现2倍浓缩培养基减少了饲料培养基的体积。根据代谢通量分析（MFA），Xing等人优化了饲料培养基以在CHO细胞中生产抗体融合蛋白（B1）。降低了丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的浓度，而增加了蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的浓度。最终，在连续批培养中B1蛋白滴度提高了27%。Fouladiha等人使用计算建模方法设计了CHO细胞的饲养策略。为了研究CHO细胞中mAb生产的效应，通过Plackett-Burman（PB）设计分析了15种代谢物。结果表明，经过苏氨酸处理后，mAbs的产量可以显著提高2倍。Hecklau等人报告说，S-硫酸化L-半胱氨酸（SSC）替代半胱氨酸，在连续批培养中非常稳定；补充SSC的饲料培养基延长了细胞活性，并使产品滴度提高了78%。同时，这种策略减少了铵（NH4+）的积累。Zhang等人利用高浓度酪氨酸和低浓度酪氨酸实验组，他们在生物反应器中培养表达抗CD20 IgG1的CHO细胞。除了含有酪氨酸的饲料培养基外，高浓度酪氨酸组还添加了88 mM酪氨酸溶液。高浓度酪氨酸促进了细胞生长，降低了生物反应器培养环境的渗透压，并增加了mAbs的产量。 氨基酸是饲料培养基的关键组成部分，它们的浓度和性质可以影响连续批培养中RTPs的产量和质量。参与连续批培养的氨基酸需要严格的设计。然而，由于溶解度的限制，一些高浓度氨基酸容易沉淀。改性氨基酸基于原始结构。我们需要全面考虑CHO细胞的特点，并建立最佳的添加策略。 碳源 葡萄糖是指数生长期TCA循环的主要碳源，并且在指数生长期的后期迅速消耗。然而，葡萄糖消耗导致丙酮酸和乳酸的积累，这会导致细胞生长受到抑制。Wilkens等人发现，3.6 g/L的葡萄糖浓度缩短了CHO细胞培养时间，并且在120小时后乳酸浓度达到了2.7 g/L。尽管1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖都被用来减少乳酸的积累，并且在向CHO细胞培养中添加1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖时，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的产量增加了100%，但在160小时后葡萄糖的最终浓度接近零，并且细胞活性降低。在细胞培养过程中，需要将最低葡萄糖浓度控制在2 ~ 3 g/L。 谷氨酰胺是细胞指数生长期早期的次要碳源，但它增加了乳酸水平（Kirsch et al. 2022）。研究发现，当半乳糖以40%的替代比例补充，并且葡萄糖碳源被替代时，CHO细胞中Fc融合蛋白的表达增加了43%，并且细胞的总唾液酸含量增加了37%。转染GLUT5果糖转运蛋白的CHO细胞在连续批培养系统中培养，并且添加了含有14.5 g/L果糖的饲料培养基。果糖改善了细胞生长，并减少了乳酸的积累。Wlaschin等人指出，CHO细胞有能力通过表达GLUT5果糖转运蛋白来替代碳源。 根据培养基中的葡萄糖含量，可以向CHO细胞培养基中添加高浓度葡萄糖溶液。由于高浓度的碳源也会导致代谢副产物积累，因此应严格控制碳源的浓度。适当的替代碳源可以避免葡萄糖消耗后副产物抑制细胞生长。 无机盐和微量元素 连续批培养还需要无机盐来调节细胞培养环境中的pH和渗透压。Zhu等人使用2L生物反应器进行连续批培养，他们添加Na+来控制渗透压和二氧化碳分压（pCO2）。140~160 mmHg的pCO2和400 mOsm/kg的渗透压使CHO细胞的活细胞密度（VCD）降低了18%，但这些因素明显增加了蛋白B1的产量。在细胞培养中，以亚硒酸钠形式存在的硒（Se）可以保护细胞免受氧化损伤。Zhang等人发现，在添加亚硒酸钠的14天连续批培养中，VCD超过了1×107细胞/mL，产量约为3 g/L。 Gangwar等人发现，Zn、Cu、Fe和Mn影响电荷异质性，并减少细胞培养中代谢副产物的积累。Fe、Mn和Ni增强酸性变体，而Cu抑制它。Zn减少了碱性变体。Chung等人发现，存放了7周的饲料培养基中的硫酸亚铁（Fe2+）可以减少电荷异质性，但它提高了CHO细胞表达的mAb的产量。Graham等人发现，生物反应器中添加的50和100 μM锌离子（Zn2+）促进了CHO细胞中β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的产生，并使GUS的比活性增加了2倍。饲料培养基中5 μM的硫酸铜（Cu2+）获得了11.9±0.6 g/L的最终mAb滴度，以表达IgG1在CHO细胞中，这比传统连续批培养的最终mAb滴度高出4.8倍。 维生素 维生素增强了CHO细胞的生产力，并影响电荷异质性。Gangwar等人还指出，维生素可以抑制酸性变体，同时增强碱性变体。Hou等人发现，增加维生素C和烟酰胺的喂养速率可以将CHO细胞中的磷酸化水平降低到3%，并将羟基化水平降低到9.4%。添加包括0.005 g/L维生素B2、0.0035 g/L吡哆醇（维生素B6）、0.03 g/L吡哆醛（维生素B6）、0.0985 g/L叶酸和0.024 g/L维生素B12在内的B族维生素可以提高细胞包装体积（PCV）和抗体滴度。Lee等人在表达重组人因子II（rhFII）的CHO细胞的4天连续批培养中添加了10 g/L的维生素K溶液，该溶液用13%的聚山梨醇酯20（PS20）制备。当维生素K的最终浓度为0.1 mg/L时，γ-羧基谷氨酸（Gla）水平降低。 脂质 乙醇胺是哺乳动物细胞膜磷脂结构的组成部分之一。对于CHO细胞中TNFR-Fc的生产，添加补充乙醇胺和脂质的饲料培养基，最大VCD为4.3×106细胞/mL，抗体滴度为378 mg/L，是批处理培养的三倍。因此，脂质可以适当补充在饲料培养基中。 其他成分 腐胺对细胞生长至关重要。Zhang等人确认，通过PB设计设计的腐胺，显著增加了mAb的产量。在添加了41.67 mg/L腐胺浓度的饲料培养基后，观察到TNFR-Fc产量显著增加。Jardon等人发现，自噬对重组蛋白生产有负面影响。在连续批培养中，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）使t-PA产量比不加3-MA的对照组增加了2.8倍。自噬诱导肽（AIP），自噬蛋白Beclin 1的衍生物，通过调节细胞自噬，促进了CHO细胞中mAbs的生产。在连续批培养中添加3 µM的AIP，改善了人IgG1的表达水平，IgG1浓度超过了1200 µg/mL。酵母水解物（YE）使连续批培养中Fc融合蛋白（Fc）的产量提高了两倍，YE还增加了CHO细胞的大小和细胞内核苷酸含量。表达人mAb和Fab片段的CHO细胞在14天连续批培养中培养，在第2天添加了25 mg/L的脱氧尿苷。VCD和蛋白质产量都增加了。Takagi等人用脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶收获了9.2 g/L的人mAb和超过4 g/L的Fab片段抗体。由于脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶都是嘧啶核苷酸，外源性核苷可能为高效的抗体生产提供了一个平台，通过补救合成途径提供嘧啶核苷酸的前体。Aki等人筛选了4-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-N-(2,5-二氧吡咯啉-1-基)苯甲酰胺（MPPB）。MPPB处理的mAb浓度增加到1098 mg/L，比对照组的mAb浓度高出1.5倍。在连续批培养中的进一步研究促进了更多添加剂的发展，除了上述成分。 连续批培养环境参数 培养参数可以影响CHO细胞生长、重组蛋白表达、蛋白糖基化、细胞代谢物以及其他因素。生物反应器被设计用于CHO细胞中RTP生产的悬浮培养。细胞通过冷冻管或摇瓶扩增，然后在生物反应器中生长。对于连续批培养，生物反应器中的培养环境参数通常通过实验设计（DoE）或一次一个因素（OFAT）研究进行优化，如温度、溶解氧（DO）和pH。 培养温度 培养温度降低通常在指数生长期进行。为了减少细胞凋亡和促进抗体合成，将培养温度从37℃切换到29℃至35℃的较低温度范围。低温对整体细胞密度、细胞活性和细胞特异性生产力有积极影响。 Torres等人使用连续批培养过程培养表达人红细胞生成素（hEPO）的CHO细胞。他们观察到低温不仅提高了表达重组蛋白的CHO细胞的特异性生产力，还显著增加了编码未折叠蛋白反应的特定转录激活因子的基因，减少了蛋白质降解的可能性；低温也通过调节细胞周期增强了hEPO的表达。细胞培养温度可以显著影响CHO细胞中的VCD和蛋白表达。当在35℃、33℃和31℃下培养表达抗CD20 mAb的CHO细胞，并在第3、6、9天添加饲料培养基时，35℃可以增加细胞密度和抗CD20 mAb的表达。Stiefel等人研究了从37℃降至30℃的温度变化对CHO细胞中miRNA表达的影响。低温条件通过上调与抑制凋亡、促进细胞生长和CHO细胞蛋白生产相关的miRNAs的表达，增加了IgG产量。因此，低温是细胞培养中最常见的因素之一。 渗透压 营养物质补充和代谢副产物积累能够在连续批培养的后期阶段增加细胞外渗透压。营养物质和碱性补充都可以增加培养环境的渗透压。在连续批过程中，NaCl维持高渗透压。它增加了mAb的滴度，减少了半乳糖基化，并增加了高甘露糖基化（man5）的比例。Xiao等人发现，持续喂养导致渗透压低于450 mOsm/kg，将高甘露糖基化降低到5%以下，并将mAb的产量提高到10 g/L。Lee等人研究了高渗透压对CHO细胞蛋白糖基化的影响。渗透压在添加甜菜碱后超过400 mOsm/kg，CHO细胞中Fc融合蛋白的唾液酸化减少。无机盐和高饲料体积可能导致连续批培养中的高渗透压。尽管高渗透压增加了CHO细胞的细胞特异性生产力（qp），但它增加了高甘露糖的比例并抑制了CHO细胞的生长。Romanova等人对高渗透压暴露的CHO细胞和对照细胞进行了蛋白质组研究，并在连续批培养的第2、6、8天分别收集细胞样本。高渗透压暴露细胞组和对照细胞组在第2、6、8天的全蛋白裂解物通过西方印迹法进行分析。Septins蛋白在经过高渗透压处理后的第6天明显上调约2-3倍，在第8天上调约1-3倍。 CHO细胞暴露于高浓度饲料培养基会导致渗透压超过300 mOsm/kg，这在细胞生理学、形态学和蛋白质组方面都有所增加。在连续批培养中，适当的添加剂可以获得可行的渗透压。此外，还使用了有效的喂养策略来避免高渗透压。 pH 细胞培养的pH需要优化，以生产高质量的重组蛋白。CHO细胞生长的pH范围在7.2到7.6之间。在3L生物反应器中培养表达针对血管内皮生长因子（VEGF-MA）的mAb的CHO细胞，并优化了培养条件。通过添加碳酸氢钠来调节pH。当pH值设定为7.10时，VEGF-MA的产量增加到4.1 g/L，电荷异质性、糖基化水平和蛋白纯度分别为26.1%、59.1%和95.1%。在设计连续批培养中的pH时，需要遵循CHO细胞的标准pH范围。如果细胞培养的pH维持在6.8以下或7.6以上，CHO细胞生长会受到负面影响。细胞培养的pH通常通过CO2和无机盐相互作用来调节，以改善CHO细胞生长，可以实现大规模重组蛋白生产。 溶解氧 DO是大规模工艺中的关键环境参数之一，影响细胞生长和重组蛋白生产。CHO细胞中的大多数DO值通常在20%到50%之间。Ventini等人报告称，当DO值在连续批培养模式中为20%时，最终重组促甲状腺激素（rTSH）滴度为1.6 mg/L。为了提高人IgG1 mAb的产量和质量，Mahé等人将DO值调整到40%，在连续批培养中，表达人IgG1 mAb的CHO细胞被培养，并添加了醋酸铜和柠檬酸铁。在14天的连续批培养中，mAb的产量达到了10 g/L以上，醋酸铜和柠檬酸铁减少了man5含量和mAb的酸性电荷变体，并增加了G1F的比例。 饲养策略 除了调整饲料培养基的组成和设置合理的工艺参数外，还有必要设计和开发有效的饲养策略，以生产高产和高质量的重组蛋白。饲养策略应该考虑控制标准和饲养方式。通过控制标准，将一种或两种主要营养物质的浓度保持在理想水平。根据化学计量饲养组成，其余营养物质被添加到培养系统中。饲养策略通常分为两种添加方法：连续饲养和一次性饲养。一次性饲养具有操作简单、设备要求低和生产成本低的优点。一次性饲料输送策略增加了CHO细胞中mAbs的表达，是大规模哺乳动物细胞培养中最广泛使用的连续批培养方法。然而，大量添加饲料培养基会导致代谢副产物的积累和渗透压的增加。连续饲养可以解决上述两个问题，它可以根据营养物质的消耗调整饲养速率，维持营养物质的浓度。因此，连续饲养在细胞培养方面具有更多的优势。 为了促进CHO细胞中抗HER2 mAb的高表达，饲养4在第3、5、7和9天以初始培养体积的5%添加。在连续批培养中，峰值VCD为17.1×106细胞/mL，mAb产量达到437 mg/L。为了提高CHO细胞中表达人鼠嵌合抗表皮生长因子受体变异体III（EGFR vIII）抗体C12的表达，采用了连续饲养策略，从第3天开始向生物反应器中添加饲料培养基。与传统的一次性饲养方法相比，连续饲养方法减少了细胞代谢副产物的比例、培养渗透压和高甘露糖型，提高了CHO细胞的VCD和活性，抗体产量超过10 g/L。Horvat等人使用连续饲养来优化连续批培养过程，培养CHO细胞。从第4天开始，补充浓度超过400 g/L的葡萄糖溶液，以保持最终葡萄糖浓度低于5.55 mmol/L。从第5天开始，连续添加含有丝氨酸的饲料培养基。连续饲养可以降低细胞培养的渗透压和甘露糖基化比例，但增加了mAb产量。如果CHO细胞的VCD和细胞活性在指数生长期的后期或静止初期呈下降趋势，则应在细胞培养中添加饲料培养基。良好的饲养策略对RTP生产有积极影响。 在连续批培养中引入了监测和控制系统，保持关键细胞营养物质在理想水平。一次性饲料输送策略广泛用于连续批培养，但它不能将培养基浓度调整到细胞不同代谢阶段的动态营养物质消耗率。 拉曼光谱用于监测营养物质和副产物（葡萄糖、乳酸和氨基酸）。动态饲养策略用于通过拉曼光谱控制饲料培养基的输送。在开发的早期阶段，Domján等人建立了一个考虑细胞代谢行为和营养物质消耗的偏最小二乘（PLS）校准模型。随后，营养物质被维持在理想水平。对于CHO细胞中mAb的生产，Eyster等人开发了拉曼光谱来控制连续批培养中的乳酸和葡萄糖，并建立了预测葡萄糖和乳酸浓度的PLS模型。在细胞代谢、生产力和产品质量方面评估了三种饲养策略。通过将乳酸控制在2 g/L，铵水平降低了68%，而mAb的半乳糖基化水平增加了约50%。 连续批培养中的代谢副产物 在细胞培养的后期阶段，连续批培养通常储存乳酸和铵等副产物。高浓度的代谢副产物对细胞生长和抗体表达有害。葡萄糖通过运输蛋白GLUT1转移到CHO细胞的细胞质中，并通过糖酵解产生大量丙酮酸。部分丙酮酸使用乳酸脱氢酶进一步转化为乳酸。为了培养表达Fc融合蛋白的CHO细胞并减少连续批培养中乳酸的积累，使用半乳糖作为碳源以减少乳酸的积累。表达抗HIV抗体VRC01的CHO-K1细胞在连续批培养中培养。从第3天开始每天添加饲料培养基。细胞接种后12小时，向CHO细胞培养基中添加10 mM和30 mM NH4Cl。与对照组相比，用30 mM NH4Cl处理的组的VCD和培养时间显著减少，乳酸、葡萄糖、铵和谷氨酰胺等副产物积累。特别是，铵对抗体滴度和细胞特异性生产力有负面影响。 向CHO细胞添加TCA循环中间体，包括α-酮戊二酸（α-KG）、苹果酸和琥珀酸，可以减少连续批培养中乳酸和铵的积累，并提高细胞特异性生产力和抗体滴度。Xiao等人设计了连续批培养中的连续饲养策略。他们发现，由于在7-L生物反应器中大量营养饲料培养基的添加，连续饲养减少了乳酸和铵的积累。最终，促进了C12抗体的生产。在连续批培养中，应避免副产品的产生。对于连续批培养来说，选择有效的饲养策略以减少代谢副产品积累的可能性和浓度是明智的。 恒化器培养 为了提高RTPs的细胞特异性生产力，成功的策略需要在培养基中操纵培养温度和葡萄糖浓度。不幸的是，细胞培养的变化影响特定生长速率，特别是在这两个操作变量中。为了在CHO细胞中生产重组人组织型纤溶酶原激活剂（rh-tPA），Vergara等人利用恒化器培养，并设置了三组关于20 mM、30 mM和40 mM葡萄糖浓度的饲料培养基。总共40 mM葡萄糖限制了细胞生长，但它提高了rh-tPA的细胞特异性生产力和处于G2/M期的细胞。此外，当温度条件为33°C时，葡萄糖消耗和乳酸产生率降低。Vergara等人指出，降低特定生长速率与高饲料葡萄糖迅速提高CHO细胞中的蛋白生产力。 强化连续批 在生物制造行业，与传统连续批相比，强化工艺需要更多的时间来开发。Schulze等人在15 mL和250-mL生物反应器中进行了标准连续批（sFB）和强化连续批（iFB）工艺，起始时分别添加4%（体积/体积）饲料培养基A和4%（体积/体积）饲料培养基B。最终葡萄糖浓度为5 g/L。通过N-1灌注接种的细胞浓度达到1×108细胞/mL，用于iFB。在15 mL生物反应器中，两个iFB分别以2.5和5×106细胞/mL接种，来自N-1灌注。与传统的sFB工艺相比，在更短的过程时间内达到了类似的滴度，但空间-时间产量（STY）分别通过2.5和5×106细胞/mL方法显著提高了16%和36%。在250-mL生物反应器中，以5×106细胞/mL接种的iFB在48小时后添加了2.5 mM丁酸（BA）。与传统的5×106细胞/mL接种的iFB相比，通过BA处理后，通过提高STY 50%发现了关键性能指标（KPI）。通过BA补充，平均细胞特异性生产力从25提高到37 pg/细胞/天。 讨论 RTPs正在快速发展。每年大约有40种新抗体被引入。如何实现RTPs的高水平表达和生产是一个挑战，限制了RTP药物的开发。这些是提高RTP生产和质量的最新策略，例如优化基因序列、表达载体和糖基化。一份报告显示，pembrolizumab的生物仿制药开发可以由质量设计（QbD）指导。QbD是生物仿制药开发的有效但具有挑战性的方法，因为过程中、质量和效力之间的复杂关系。为了确保mAbs生产的临界质量属性（CQAs），QbD强调了对生产过程的理解。Jafar-Aghaei等人发现了一个由QbD指导的制药测量，以在连续批培养中进行Pembrolizumab生物仿制药候选PSG-024（Keytruda®）。目前，Keytruda®已成为治疗性mAbs的王牌。尽管Handlogten等人指出，高于1 g/L的葡萄糖浓度已经带来了10 g/L的mAb滴度，但他们仍然指出一次性饲养存在缺陷。最近，通过在连续批平台过程中使用12 g/L的葡萄糖浓度，达到了4 g/L的最终mAb滴度；同时，最终葡萄糖浓度为5 g/L。这种葡萄糖饲养策略也有效地促进了细胞生长。Komuczki等人提出，低细胞密度下超过2.5 mM的半胱氨酸可以抵消氧化应激，但Komuczki等人提出，高半胱氨酸浓度与更高的细胞浓度可以抵消氧化应激。Wang等人报告称，在14天连续批培养中，将温度调整至33℃，对提高产品滴度产生了影响，并将100%的标准化滴度设定为第14天的最高滴度。连续批优化是可行的，尽管如此，优化所有过程参数是不可能的，因为资源和时间有限。 在COVID-19的背景下，生物仿制药将进入市场，这取决于强大且可扩展的制造以及出色的生产力。PI是涉及过程策略的关键趋势。随着灌注和其他过程的进步，连续批培养已经越来越多地被研究。目前，连续批培养仍然有改进的空间。 总结和展望 总体而言，连续批培养已经收获了高产和高质量的蛋白质生产，延长了细胞培养时间。在连续批培养中，饲料培养基是连续还是间歇补充的。近年来，连续批培养取得了相当大的进展。饲料组分优化对于过程开发仍然是必要的。同时，连续批培养应考虑培养参数、营养物质消耗和代谢副产品积累等。随着对CHO细胞中RTP生产的深入探索，我们在未来仍然需要考虑这些指标，例如细胞生长、RTPs的产量和质量。然而，连续批培养在过程开发方面存在缺陷，选择最佳参数是具有挑战性的，包括温度、pH、溶解氧、基础和饲养培养基以及添加剂。探索一系列优秀的过程参数受到有限因素的制约。随着多组学、新的监测和分析技术、人工智能以及其他方法的广泛应用，强化连续批培养将进一步改进重组蛋白生产的产量和质量。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

凝血因子XII（FXII）和凝血因子XI可能是近年来血栓领域非常有希望的抗血栓靶点，因为现行抗血栓药物常常存在许多过度出血风险，而这两个靶点的早期临床前研究发现，这些靶点的抑制剂不仅可以降低动物血栓发病率，还能避免过度出血。 而近期，来自中国医学科学院阜外医院王淼团队发现，采用凝血因子XII抗体不仅仅可以减少血栓，同时还能减轻患者炎症。 当病情危急的血栓患者进入ICU后，临床实践中可能会使用“终极武器”体外膜氧合（ECMO），为患者提供人工肺和心脏，为患者争取宝贵的时间。 但是在这个过程中，因为血液成分与人工表面的接触激活和体外膜肺氧合回路中的剪切应力可能导致炎症反应。患者常常会不可避免地出现多器官炎症，这种全身炎症是体外膜肺氧合患者多器官衰竭和高死亡率的主要原因（30-70%），其中绝大部分患者都发生了全身性炎症的情况。 因此，此次研究可能对病情危急的患者和炎症治疗产生潜在临床意义。相关成果发表于Nature子刊Nature Communications上。 FXII抗血栓和抗炎的机制 FXII是内源性凝血途径中的一个关键启动因子。当血管受损时，FXII通过与带负电荷的表面（如胶原蛋白、内皮下组织等）接触而被激活为FXIIa。FXIIa进而激活FXI，启动一系列的凝血反应，最终导致纤维蛋白凝块的形成，从而止血。但是在一些情况下，FXII过度激活可能导致血栓性疾病的发生。 除了其在血栓形成中的功能外，FXII在此前已被证明在炎症反应中起作用。这就和一种罕见病直接相关，例如，富含脯氨酸的区域（PRR）内第309位苏氨酸的错义突变会导致该位点的糖基化丧失，并增加FXII的表面介导自动激活的敏感性。这种FXII功能获得性突变与血浆前激肽释放酶（BK）的过度产生有关，而BK作为知名的致痛物质从功能上来说又会舒张血管，过度BK释放就会产生血管水肿，这种罕见病就称为FXII突变的遗传性血管性水肿（FXII-HAE）。 与之产生联动的倒是C1-酯酶抑制剂（C1-INH）缺乏型遗传性血管性水肿，C1-酯酶抑制剂是缓激肽的抑制剂，正常人体内能够抑制缓激肽过度产生，然而C1-INH缺乏型患者中，缓激肽无法被抑制，导致过度产生，因此一种治疗方法就是寻求抑制上游的FXII。目前CSL公司已经将FXII抗体garadacimab用于这种疾病，目前处于III期临床，未来有很大概率上市。 而除了肝细胞外，中性粒细胞也表达FXII。中性粒细胞源性FXII的缺失通过抑制uPAR-Akt2信号通路促进伤口愈合。此外，FXII通过调节树突状细胞在神经炎症期间加剧CD4+ T效应细胞反应。不过除了这些效应之外的炎症反应在此前并没有得到很好的研究。 研究方法 而在这里，研究人员利用体外膜肺氧合的鼠模型对FXⅡ作用进行体内和体外研究，他们使用的是来自羊驼的FXII单域抗体Nb-Fc，他们发现采用Nb-Fc治疗和FXII缺失都显著抑制了TNF-α（促炎细胞因子）的释放。FXII阻断后，嗜中性粒细胞对微血管内皮的粘附也减少。 这一机制和常用抗凝血药物肝素具有显著差异，肝素虽然是凝血酶、FX和FXI等多凝血因子大的抑制剂，但却会以电荷依赖的方式激活FXII，而FXII激活就有可能导致炎症。 研究人员在肝素基础上施用的Nb-Fc的观察到的抗炎功效可能反映了对体外膜肺氧合氧合器和管道上的FXII活化的抑制以及对肝素介导的FXII活化的抑制。 这也表明这类抗体可能展现出优于肝素的潜力。 在免疫复合物介导的局部血管炎和ANCA相关/抗GBM依赖性血管炎的小鼠模型中也揭示了FXII在炎症中的作用（如下图所示），其不涉及人工表面接触激活。FXII抑制或其基因缺失减轻了免疫诱导的局部血管炎，并改善了ANCA相关的系统性血管炎。这与FXII抑制后体内和体外中性粒细胞迁移受损一致 另外，研究人员对FXII缺陷型小鼠进行了研究，他们发现，FXII基因缺陷通过细胞内Akt2-αMβ2整合素信号通路损害中性粒细胞迁移，这种作用可归因于中性粒细胞表达的酶原FXII。 在人样本中的研究似乎进一步证实了这一观点。研究人员猜测，细胞外截留的Nb-Fc可阻断FXII介导的中性粒细胞迁移，从而抑制血管炎症。FXIIa依赖的缓激肽形成也可能促进血管炎的病理过程。 总结 Nb-Fc有望在不影响止血的情况下治疗体外膜肺氧合相关炎症、血管炎和血栓栓塞性疾病。未来申请适应症可能是ECMO过程中的炎症治疗。 目前可查询到该研究团队在去年就已在寻求技术转让。 参考来源： Xu, P., Zhang, Y., Guo, J. et al. A single-domain antibody targeting factor XII inhibits both thrombosis and inflammation. Nat Commun 15, 7898 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51745-4 蒋帅,郑益政,孔毅,等.靶向凝血因子XII和凝血因子XI的抗体研究进展[J].药物生物技术,2022,29(04):401-407.DOI:10.19526/j.cnki.1005-8915.20220415.

摘要：来自成人干细胞（ASCs）和多能干细胞（PSCs）的类器官是研究癌症和开发治疗方法的重要临床前模型。在这里，我们回顾了来自原始组织的和PSC衍生的癌症类器官模型，并详细说明了它们如何在不同的器官环境中有潜力为个性化医疗方法提供信息，并有助于理解早期癌变步骤、癌症基因组和生物学。我们还比较了基于ASC和基于PSC的癌症类器官系统之间的差异，讨论了它们的局限性，并强调了最近对类器官培养方法的改进，这些改进使它们成为人类肿瘤的更好代表。 1.引言 全球癌症负担每年导致近1000万人死亡，并且预计这一数字还会增加。遗憾的是，有效的癌症治疗数量未能跟上这一趋势。其中的一个原因是缺乏能够准确模拟人类肿瘤、它们多样化的形态、分子特征和微环境的体外临床前模型。数十年来，由于相对容易使用、可扩展性和低成本，2D细胞培养已成为研究癌细胞生物学和药物发现的基石。它们使我们能够在分子机制上取得开创性的工作，这些机制是肿瘤发生的，帮助确定生物标志物和药物靶点以指导患者的治疗。然而，它们的功能有限，只代表一小部分癌症——其中只有少数来自早期或癌前阶段。2D培养通常不需要与原代细胞培养相同的生存利基因子，这意味着它们已经由于基因组中的异常和畸变以及表观遗传学上的修饰而失去了对利基的内在依赖。此外，2D癌细胞系，由于长期在体外传代，会发生快速的基因漂移，导致药物反应的显著差异。此外，匹配的正常细胞系并不总是存在，使得对癌症早期阶段的研究大多依赖于基因工程小鼠。在某些情况下，基因工程小鼠和患者衍生的异种移植（PDX）模型弥补了2D细胞系的不足，但高昂的成本、技术难度和缺乏可扩展性仍然是它们的限制。 最近，3D类器官培养的出现为癌症研究提供了一种替代方法，可以弥合体外2D细胞系和体内小鼠模型之间的差距。类器官可以从两种类型的干细胞中建立：成人干细胞（ASCs）来自成人组织，具有组织特异性，或者多能干细胞（PSCs）可以是诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞。在这篇综述中，我们特别关注这些类器官模型在癌症研究中的使用，描述并比较代表肿瘤形成不同阶段的各种基于类器官的癌症模型，并讨论它们对癌症研究的贡献以及它们的局限性。 2.类器官类型 ASC和PSC类器官的衍生协议基本上不同。ASC类器官由培养基中的生长因子混合物支持，这些生长因子模仿正常干细胞稳态期间存在的因素。PSC类器官建立涉及通过逐步添加生长因子的方式进行分化，这种方式模仿胚胎发育期间的细胞信号。产生的癌症模型也具有不同的优缺点（表1），在选择适当的研究模型时应考虑这些因素。尽管如此，ASC和PSC类器官是互补的方法，它们共同提供了研究几乎所有人类癌症整个肿瘤进展过程的机会（图1）。 图 1. 用于癌症模型的类器官 由成人干细胞（ASC）和多能干细胞（PSC）衍生的各种类型的癌症类器官模型及其应用。CTC，循环肿瘤细胞；CAF，与癌症相关的成纤维细胞。 3.ASC衍生的类器官和生物银行 2009年，一项开创性研究表明，可以从小鼠Lgr5+肠道ASCs中建立3D肠道类器官。细胞在Matrigel中生长，并在长期培养中维持，补充干细胞利基调节因子（noggin、R-spondin1和表皮生长因子[EGF]）。从本质上讲，这个系统旨在模拟肠道干细胞（ISCs）通常所在的利基的各个方面。在体内，肠道上皮组织被组织成数百万的隐窝绒毛结构，其中ISCs位于隐窝的基部。Wnt信号和R-spondin1作为Wnt激动剂，在支持隐窝增殖方面的重要性已经得到了很好的确立。此外，EGF通过激活Ras信号通路增强隐窝增殖。noggin抑制绒毛中的骨形态发生蛋白（BMP）信号，导致形成许多异位隐窝单元。引人注目的是，为了在培养中复制这一点，只需要添加R-spondin1、EGF和noggin就可以成功形成类器官。后续研究表明，位于Lgr5+干细胞之间的Paneth细胞提供了Wnt来源。Matrigel提供了形成3D类器官的基质成分，因为它类似于富含层粘连蛋白的肠道隐窝基部。这些类器官展示了肠道隐窝绒毛结构，包含所有肠道细胞类型，重现了来源组织的生理肠道结构。 同时，另一组开发了一种替代方法来培养肠道类器官：空气-液体界面（ALI）模型，涉及在部分空气暴露的胶原蛋白基质中培养包含上皮细胞和间充质细胞的小鼠肠道组织片段。自这两项突破性研究以来，已经成功地适应了从一系列正常组织及其相应的癌症中培养人类ASC衍生的类器官。对协议的改进提高了类器官形成的效率，使得从小活检、尿液、宫颈涂片甚至循环肿瘤细胞（CTCs）中建立肿瘤类器官成为可能。结果，成为可能建立大型的人类肿瘤类器官活体生物银行（图2A，在表2中详细总结）。近年来，类器官生物银行的数量激增，作为基础研究和临床设置中宝贵的资源。类器官模型也已通过各种途径商业化，如人类癌症模型倡议、美国典型培养物收集或MilliporeSigma。这些生物银行涵盖了广泛的肿瘤模型，重现了患者肿瘤的形态和分子异质性。相比之下，许多分子亚型没有代表性2D癌细胞系。 图 2. 现有的人类癌症和癌前类器官模型 (A 和 B) 文献中描述的(A) 癌症和(B) 癌前ASC衍生类器官的类型。ALC，酒精性肝硬化；NASH，非酒精性脂肪性肝炎；PSC，原发性硬化性胆管炎；PanIN，胰腺上皮内瘤变；UC，溃疡性结肠炎；TSA，传统锯齿状腺瘤；SSA，静止性锯齿状腺瘤；HP，增生性息肉。 此外，已建立了来自这些器官的癌前病变，如肠道增生性息肉、静止性锯齿状腺瘤（SSAs）/息肉、管状绒毛腺瘤、常规管状腺瘤癌前子宫内膜异位症、子宫内膜增生17 宫颈鳞状上皮化生胃肠上皮化生胃萎缩 Barrett上皮胰腺上皮内瘤变（PanIN）和一系列癌前肝病（图2B）。从携带杂合性胚系癌症易感性基因突变的个体中还生成了额外的ASC类器官（图2B；表3）。通过基于多组学的分析比较肿瘤衍生类器官和原始肿瘤组织，证实类器官在长期培养中稳定保持了亲本肿瘤的分子谱。 4.衍生ASC类器官的挑战 建立癌症类器官的当前协议已在其他地方详细总结。每个协议都是根据对器官/癌症类型的深入生物学知识以及广泛的试错研究来提高效率而开发的。图3总结了正常和肿瘤类器官培养的条件。每种癌症类型都进行了特定的修改，以帮助避免正常细胞污染，同时增强癌症干细胞的活力（在表2中总结）。尽管如此，原始混合中的正常类器官可以胜过肿瘤类器官，最终在培养中占主导地位，特别是当培养条件不能特别有利于肿瘤细胞时。前列腺胃肺结肠和胰腺癌症类器官的研究都报告了这一有问题的现象。因此，通过全外显子组测序（WES）或目标捕获面板测序验证肿瘤纯度至关重要，因为癌症类器官的形态常常与正常类器官无法区分。减轻正常细胞污染和提高协议效率的策略包括撤回一些癌症中不再需要的利基因子，因为普遍存在的致癌突变。例如，撤回Wnt3a和R-spondin1大大改善了结直肠癌（CRC）类器官的形成，而撤回EGF在创建胰腺导管腺癌（PDAC）类器官时有效，因为>80%的CRCs和>90% PDACs分别携带APC和KRAS突变。在胃癌（GC）中，添加nutlin3a，同时从培养基中去除Y-27632、A8301、EGF和FGF10也提高了成功率，样品获取方式的调整也可以产生影响。例如，沿着胃肠道的浆膜侧取样增加了肿瘤纯度，并在传代过程中手动挑选肿瘤类器官可以帮助消除正常细胞污染。提高肿瘤类器官活力的其他方法包括在培养横纹瘤类器官时添加Y-27632以及在培养子宫内膜癌类器官时去除p38抑制剂。使用无血清、Afamin稳定的Wnt3a可以稳定培养PDAC类器官，因为标准Wnt3a条件培养基中的血清会触发胰腺类器官的细胞衰老。 图3. 热图显示了各种正常和肿瘤类器官培养的条件 每一列代表之前针对特定类器官类型报告的培养条件协议。彩色框表示在类器官扩增协议中使用指定的生长因子成分。大多数类器官类型都在包含AdDMEM/F12、HEPES、GlutaMAX和青霉素/链霉素的基础培养基中培养，但也有一些例外。星号表示使用肝细胞培养基、GlutaMAX和Primocin，而^表示使用DMEM/F12培养基、神经基础培养基、GlutaMAX和低谷氨酸非必需氨基酸混合物。#Jung等人69在培养正常结肠类器官时添加了前列腺素E2，其中使用LY2157229代替A8301来抑制TGF-b信号。LGG，低级别胶质瘤；BLCA，膀胱尿路上皮癌；KIRC，肾透明细胞癌；MRTK，肾脏恶性横纹肌样瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；MEC，小细胞癌；ACC，腺样囊性癌；AciCC，腺泡细胞癌；SDC，唾液腺导管癌；ESAD，食管腺癌；STAD，胃腺癌；CRC，结直肠癌；PDAC，胰腺导管腺癌；HCC，肝细胞癌；CC，胆管癌；NSCLC，非小细胞肺癌；GEP-NENs，胃肠胰神经内分泌肿瘤；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌；UCC，子宫体子宫内膜癌；OVC，卵巢浆液性癌；PRAD，前列腺腺癌。 即使有了这些协议修改，一些常见的癌症类型仍然难以用类器官来模拟，这表明需要进一步优化协议。有趣的是，一种称为条件重编程的替代方法，涉及辐照的小鼠成纤维细胞饲养层细胞与消化后的原代健康或癌细胞在rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）存在的条件下共同培养，允许几乎所有细胞类型来源的原代上皮细胞长期培养长达一百天，而无需遗传操作。这项技术已成功用于从非小细胞肺癌（NSCLCs）、前列腺癌和腺样囊性癌（ACC）细胞培养物生成患者衍生的细胞培养。条件重编程的前列腺和ACC癌细胞在异种移植的小鼠中产生了肿瘤，表明这可能是形成类器官率低的癌症类型的潜在替代方法。 5.ASC衍生的癌症类器官与2D癌细胞系的独特特征 5.1.利基因素和细胞-细胞/细胞-基质依赖性 ASC癌症类器官与2D癌细胞系之间的一个主要区别是，类器官仍然依赖于利基因素和细胞-细胞/细胞-基质相互作用来生存。因此，可以通过系统地撤回基本的利基因素、添加/撤回抑制剂或在无基质条件下培养，在肿瘤类器官上进行深入的功能表征。在此过程中，揭示了在癌变过程中发生的基因型-表型关联。 几项关于没有WNT下游基因突变的ASC衍生癌症类器官的研究，例如APC或CTNNB1，已经揭示了赋予Wnt/R-spondin独立的机制。这些研究为Wnt信号在塑造肿瘤内细胞状态形态多样性和异质性方面的贡献提供了见解。在正常胃类器官中双敲除CDH1/TP53导致与R-spondin独立相关的弥漫性GC表型。同样，撤回试验鉴定了PDAC类器官中独立于Wnt和R-spondin的亚群。还评估了撤回ROCK抑制剂和/或无Matrigel生长条件。一项关于GC类器官的研究表明，细胞-细胞/细胞-基质独立性与浸润性肿瘤边缘、晚期肿瘤分期和转移相关，并且与公共GC患者数据集中的总体和无病生存时间较短的转录组特征相关。从早期GC的深层黏膜中分离的肿瘤类器官比来自浅表黏膜的配对肿瘤类器官更不依赖于细胞-细胞粘附，表明同一患者的肿瘤的不同部分可能表现不同。 5.2.谱系多样性、细胞可塑性和细胞状态转换 类器官保留了来源组织的谱系多样性和细胞可塑性。例如，健康的前列腺和乳腺类器官包含能产生基底和腔系谱系的腔系和基底祖细胞。有趣的是，来自BRCA1突变携带者的乳腺上皮类器官显示出更高比例的腔系祖细胞，重现了在BRCA1突变携带者中作为癌症起始人群的腔系祖细胞的增加。单细胞RNA测序揭示了Wilms瘤衍生的类器官由三种不同的细胞类型（上皮、基质和胚细胞）组成，并且带有RSPO融合的APC野生型结肠癌细胞在Wnt撤回后仍保持其分化潜力，类似于健康的结肠类器官。撤回或补充外源性Wnt3a和R-spondin能够调节弥漫型GC或CDH1/TP53双敲除的正常胃类器官的组织学亚型规范和细胞可塑性，允许它们分别适应签戒细胞或非签戒细胞形态。这些观察结果与人类GC中的体内情况非常相似，签戒细胞在RSPO3低表达的区域中可见，非签戒环细胞弥漫形态与基质中RSPO3的表达相关。同样，PDACs在转录上可以分为两种细胞状态，更具侵略性的基底样状态和经典状态。通过单细胞RNA测序，一项研究确定了癌细胞在从经典状态过渡到基底样状态时可能经历的中间细胞状态。引人注目的是，使用患者活检和匹配的类器官的研究报告称，类器官在体外倾向于失去基底状态，这可以通过撤回培养基中的基本利基因素来恢复。用TGF-b处理的类器官被推向更具侵略性的基底样状态，而撤回TGF-b导致类器官恢复到经典状态。这些发现表明，生长条件或微环境可以调节细胞可塑性和细胞状态。不同的细胞状态随后导致不同的抗癌药物敏感性。这些结果与另一项谱系追踪研究一致，该研究将表达多色荧光蛋白的PDAC类器官移植到小鼠中，证明经典和基底样表型可以来自单个植入的细胞。因此，肿瘤的亚型受微环境的影响大于遗传学。 这项工作清楚地表明，类器官对于未来研究人类癌症中肿瘤可塑性和细胞状态转换的机制具有巨大的前景，这两个过程由于它们有限的异质性而无法在细胞系中研究。结合CRISPR-Cas9编辑将报告基因、谱系追踪和消融盒敲入癌症类器官，然后进行小鼠异种移植，可以进一步利用类器官技术评估肿瘤细胞亚群，包括癌症干细胞和癌症启动、转移和药物耐受性。例如，在患者衍生的CRC类器官中敲入EGFP和谱系追踪盒到LGR5位点证实了EGFP-LGR5+癌细胞干细胞以高效率启动肿瘤异种移植，并且肿瘤细胞采用类似于正常结肠上皮的层次结构。另外两项研究将CRISPR工程化的LGR5特异性消融盒的CRC类器官异种移植，观察杀死LGR5+癌细胞干细胞在肿瘤中的效果。在这两项研究中，LGR5+细胞的消除最初阻止了肿瘤生长，但当LGR5特异性消融关闭后，由分化谱系中再生Lgr5+细胞的人群推动了肿瘤的再生。异种移植的类器官携带可诱导的Lgr5-EGFP-Confetti报告基因，证明肝脏转移是由Lgr5细胞播种的，但转移性生长取决于Lgr5+细胞的重新出现。在异种移植的人类CRC类器官中进行的活体遗传谱系追踪系统鉴定了休眠的LGR5+p27+细胞，这些细胞赋予了可逆的药物耐受状态，该状态依赖于细胞基质界面上COL17A1的粘附。类似地，另一项谱系追踪研究表明，一种独特的CRC干细胞群体，潜伏的Lgr5+细胞，表达高水平的Mex3a，可以下调Wnt/干细胞基因程序以保护自己免受化疗，并成为治疗后的主要残留肿瘤群体。然而，另一项研究发现，负责CRC复发的残留肿瘤细胞特征是高EMP1表达，CRISPR工程化的EMP1+细胞消融防止了异种移植小鼠中转移的复发。 5.3.保留异质性和病毒基因组 癌症类器官保留原发性肿瘤的肿瘤内异质性和亚克隆结构是其另一个独特特征。在胃类器官队列中，几个案例显示了具有和不具有ERBB2或FGFR2的致癌性扩增的细胞亚群，模仿了体内肿瘤组织中观察到的区域异质性。引人注目的是，这种异质性在长期培养中得以维持。癌症类器官还显示出在长期培养中维持病毒基因组，使得能够研究与感染相关的癌症。从与Epstein-Barr病毒（EBV）相关的胃癌或鼻咽癌（NPCs）中建立的类器官能够保留EBV病毒基因组和病毒潜伏期，与大多数2D NPC细胞系已经失去了它们的EBV基因组形成对比。因此，与2D细胞系相比，癌症类器官更密切地重现了原发性肿瘤，为研究信号通路、肿瘤内异质性和与感染相关的肿瘤发生提供了强大的工具。 6.ASC衍生的类器官用于研究癌症发病机制 能够从多种器官中培养出健康的上皮细胞，为研究癌症逐步发展和理解环境致癌物暴露的影响提供了激动人心的机会。图4总结了使用正常结肠ASC类器官或癌前/早期肿瘤类器官来模拟早期肿瘤转化和肿瘤进展的研究报告示例。上皮器官的癌症是与老龄化人群相关的最常见的恶性肿瘤，但导致ASCs中体细胞突变积累的因素以及它们如何促进恶性转化尚不清楚。肠道隐窝提供了一个独特的模型，用于研究体细胞突变和克隆扩展。从肠道粘膜中建立的混合类器官培养通常是多克隆的，来源于许多腺体的集合，每个隐窝都有由亚克隆体细胞突变特征的，主要是乘客突变（图4A和4B）。ISCs在个别隐窝内竞争，最终走向单克隆性。因此，来自单个正常细胞的克隆类器官可以进行功能研究，对于理解癌症相关过程可能非常有价值。例如，从患有溃疡性结肠炎的患者中分离的克隆类器官显示出经常是双等位基因的截断突变，涉及IL-17-NF-kB途径，这与在溃疡性结肠炎组织中观察到的克隆扩展一致（图4D）。尽管这些突变在癌症中没有富集，但它们赋予了克隆类器官对IL-17A诱导的凋亡的抗性，提高了炎症环境中的细胞存活率。 图4. 结肠类器官的类型，从正常到癌前病变及其应用 (A) 正常结肠上皮包含不同异质性克隆的混合物。(B) 正常结肠类器官的长期培养导致克隆优势。克隆类器官可以长期培养，有或没有CRISPR工程化的肿瘤驱动基因突变，或暴露于细菌/药物。亚克隆培养，随后进行测序是一种可以用来询问基因组景观随时间或添加剂变化的方法，这一点通过在LS正常结肠上皮中确认基因组稳定性和在各种类器官模型中识别几种突变特征的原因得到了证明。(C) 在正常结肠类器官中重新创建特定组合的癌症驱动基因突变或进行全基因组CRISPR筛选，产生了各种癌前和肿瘤类器官模型，以及识别赋予Wnt激活和TGF-b抗性的目标。(D) 溃疡性结肠炎(UC)上皮展示了克隆扩展的概念，炎症微环境推动了抵抗IL-17途径的突变克隆的扩展。(E) 不同腺瘤类器官模型在研究癌症发病机制中的多种用途。正常类器官工程化了5个肿瘤驱动基因突变发展了微小转移，而CIN腺瘤但不是GS腺瘤类器官工程化了3个肿瘤驱动基因突变在异种移植小鼠模型中发展了巨大转移。UC，溃疡性结肠炎；LS，Lynch综合征；SSA，静止性锯齿状腺瘤；TSA，传统锯齿状腺瘤；CRC，结直肠癌；FAP，家族性腺瘤性息肉病；GS，基因组稳定；CIN，染色体不稳定性。 克隆健康类器官也可以在有无药物、感染因子的情况下进行长期培养，或使用CRISPR-Cas9基因编辑来识别固有的遗传不稳定性、表征突变特征，并识别致突变剂（图4B）。在培养的终点，可以进行最终的克隆步骤，以扩展单个克隆细胞进行测序。随后，从亲本克隆中筛选出突变，以揭示体外获得的突变。一项研究使用CRISPR-Cas9删除DNA修复基因，MLH1和NTHL1，然后进行亚克隆和WGS。他们发现，MLH1缺陷的类器官具有与错配修复缺陷的CRC一致的突变特征，而NTHL1缺陷的类器官具有与突变特征30相关的特征，这之前在一名携带NTHL1胚系无义突变的乳腺癌患者中被识别出来。 此外，将肠道类器官暴露于两种药物的组合，更昔洛韦（GCV）和莫昔芬（MMF），重新创建了在之前接受这两种药物治疗巨细胞病毒感染和移植物抗宿主病的CRC患者中观察到的突变特征，表明类器官中的突变特征是由GCV诱导的，并且被MMF进一步增加。相比之下，来自携带杂合性胚系突变的Lynch综合征患者的正常胃或肠道类器官没有显示出增加的突变率，表明在第二个失活突变建立之前不存在单倍体不足。 6.1.与正常和癌前类器官共培养的微生物 通过感染微生物可以在类器官中重现突变特征。经过5个月反复腔内注射基因毒性pks+大肠杆菌的肠道类器官，这种病原体已知会在培养细胞中诱导双链DNA断裂，显示出在一部分人类CRC患者中观察到的突变特征，但在其他癌症类型中没有。这一发现暗示了过去暴露于pks+ E. coli可能是那些患者的潜在致癌因素。健康的人类类器官也被其他类型的微生物感染，包括已知与癌症发展相关的细菌和病毒。例如，人类胃类器官被幽门螺杆菌感染，这种病原体会导致胃溃疡和胃癌，导致通常在体内观察到的炎症反应和上皮增殖增加。另一项研究从正常人类口腔粘膜组织中生成类器官，并将它们分别暴露于HSV和HPV感染。这两种类器官系都显示出病毒DNA的增加，即使在传代后也得以维持，暗示持久感染。此外，iPSC和ASC模型突出了人类肝脏类器官模型在体外研究乙型肝炎病毒（HBV）感染和复制方面的潜力，未来可能用于研究与HBV相关的HCC进展。这些研究为解决微生物组在肿瘤发生中的参与提供了方法，由于缺乏适当的体外和动物模型，这一点以前探索得很少。 6.2.ASC衍生的小鼠类器官模型用于研究癌症发病机制 直接从患者样本中建立肿瘤类器官仍然是一个挑战。或者，可以从基因工程小鼠模型（GEMMs）中衍生ASC类器官，并在体外快速扩展以建立生物银行。来自人类或GEMMs的正常或早期肿瘤类器官作为研究癌症早期演变途径的良好工具（图4E）。一项共培养研究表明，小鼠Apc突变类器官分泌Notum。当这些Apc突变类器官与野生型小鼠肠道类器官共培养时，Notum通过推动野生型ISCs分化并导致Apc突变ISCs的克隆固定，抑制了野生型类器官的生长（图4E）。与这些发现一致，在小鼠中诱导Apc突变之前用Notum抑制剂处理减少了腺瘤的形成。这些研究突出了遗传小鼠模型和类器官如何协同工作并被利用，从而显著加速研究发现。小鼠类器官易于基因组编辑以诱导驱动突变，并且可以植入同种型和免疫能力的小鼠中以模拟肿瘤发生和转移。例如，为了模拟CRC的发展，携带不同组合驱动突变的小鼠类器官，无论是来自GEMMs的肿瘤/转移还是通过体外基因编辑，都被移植到同种型小鼠的盲肠壁上，用于原位肿瘤形成和转移发展。这些模型证实了TGF-b信号在肿瘤微环境中的作用，促进免疫逃逸并介导癌症转移。另一项研究生成了一种人类化的微卫星稳定的CRC小鼠模型，并确定EMP1+细胞是转移复发的起源细胞。类似地，乳腺肿瘤类器官可以从GEMM肿瘤中衍生出来，在2-3周内并原位移植形成肿瘤，重现原始肿瘤的上皮形态和药物反应。也已经开发了免疫能力的基于类器官的小鼠模型用于卵巢癌和肺腺癌。它们可能代表了与GEMMs相比，模拟癌症发病机制的更强大的平台，GEMMs可能开发起来耗时且技术上具有挑战性。 7.CRISPR-Cas9编辑ASC衍生的类器官 CRISPR-Cas9被用来在健康类器官中工程化组合驱动突变，以重新创建癌症（图4C；表4）。两项开创性研究同时证明，工程化APC、TP53、KRAS或PIK3CA和SMAD4突变的组合结果是人类肠道类器官，这些类器官在所有干细胞利基因素的独立下生长，并能够在小鼠中形成具有侵袭性癌症特征的肿瘤移植物。这些四重突变类器官的原位移植到小鼠盲肠引起了宏观的肺和肝转移。在三重敲除（APC-/-，TP53-/-和KRASG12D）人类类器官中过表达Noggin，当Noggin没有过表达时，在体内具有有限的生长潜力，导致与四重突变类器官相似的肝脏转移。由于这些类器官能够独立于所有利基因素生长，这些发现提出了利基独立可能介导转移的可能性。然而，不能排除其他未知因素。例如，患者衍生的原发性CRC和配对的转移性类器官总是显示出一致的利基因素依赖性，一些患者衍生的肝转移类器官仍然高度依赖于利基因素。染色体不稳定性也可能是一个贡献因素， 如下文更详细讨论。 已经发表了几种CRC的锯齿状肿瘤途径模型。一项研究通过工程化大染色体重排来生成RSPO融合基因，以及在人类结肠类器官中的BRAFV600E和TP53突变（图4C）。将这些人类结肠类器官异种移植到小鼠结肠中产生了锯齿状病变，重现了人类的SSAs。在类器官中除了BRAFV600E、TP53敲除和RSPO融合外，过度表达GREM1，结果在小鼠中形成了息肉状肿瘤，其组织学特征类似于传统的锯齿状腺瘤。有趣的是，与正常结肠类器官相比，RNF43-/-人类SSA类器官对RSPO的依赖性较小，为RNF43突变在锯齿状肿瘤途径中的致病作用提供了功能支持。另一项研究将正常结肠类器官与BRAFV600E突变工程化后，用TGF-b处理。TGF-b在正常类器官中触发了凋亡，但在BRAFV600E突变类器官中没有，而是诱导了上皮-间充质转化（EMT）和转录特征，模仿了在人类锯齿状肿瘤病变中观察到的特征。除了由癌症驱动基因突变引起的遗传损伤外，使用类器官还可以探索肿瘤进展过程中染色体不稳定性的作用。具体来说，工程化了五种肿瘤驱动突变（APC、SMAD4、TP53、KRASG12V和PIK3CAE545K）的正常结肠类器官能够在注射到小鼠脾脏后在肝脏形成微小转移灶（图4E）。相比之下，染色体不稳定而不是染色体稳定的腺瘤类器官，工程化了三种驱动因素（SMAD4、TP53、KRASG12V或PIK3CAE545K），在肝脏中形成了大的转移肿瘤，显示出组织学恶性。随着越来越多的癌前或早期肿瘤类器官模型的可用性，这些模型捕获了不同形式的遗传或表观遗传异常，研究人员现在有了前所未有的机会进行精细的调查，以确定有助于肿瘤发生的因子。 使用CRISPR-Cas9基因编辑在各种组织的正常类器官中成功模拟其他癌症类型的示例总结在表4中。这些包括在人类胃类器官中工程化ARID1A和TP53突变以模拟胃肿瘤；在胰腺类器官中KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4突变以模拟PDAC38；在乳腺类器官中TP53、PTEN、RB1和NR1突变以模拟管腔肿瘤；在人类导管类器官中TP53、SMAD4、NF1、PTEN和BAP1突变以模拟胆管癌；在小鼠食管类器官中Sox2过表达和p53和p16突变以模拟食管鳞状细胞癌。 全基因组CRISPR筛选也已在正常类器官中使用，以确定肿瘤发生的目标。两项研究在人类肠道类器官中进行了CRISPR-Cas9筛选，并确定了赋予对TGF-b介导的生长抑制的抗性的基本目标，这对于CRC发展至关重要。在培养中对小鼠胃类器官进行Wnt3a撤回，进行了类似的筛选，以确定以前未被重视的赋予Wnt激活的因素。总的来说，这些在正常或早期肿瘤类器官中的研究表明，多个癌症驱动基因的基因组编辑，无论是顺序还是组合，都可以模拟体内癌症发病机制。它们为这些基因在癌症进展中的基本功能提供了宝贵的见解。此外，将全基因组CRISPR筛选应用于正常类器官的成功，为将来在肿瘤类器官中识别治疗反应或抗性的遗传脆弱性提供了概念验证。 8.PSC衍生的类器官 类器官也可以从PSCs，无论是胚胎的还是诱导的，生成。人类胚胎干细胞受到伦理规定的限制，这阻碍了它们的广泛使用。相比之下，iPSCs涉及将体细胞重新编程回到多能性。第一步是将iPSCs定向分化为三个胚层（内胚层、外胚层和中胚层）。然后，细胞在3D基质中培养，使用特定的生长和信号因子引导它们朝着所需器官的细胞系发展。这一模型的主要挑战是在体外忠实地模拟所有体内生化线索，这些线索在正确的时间、位置和浓度下推动细胞分化和3D组织形成，就像在胚胎发育过程中发生的那样。最初通过使用活化素A处理人类PSCs来建立PSC衍生的类器官，以驱动内胚层身份，随后与FGF4和Wnt3a共同孵化以促进后肠分化。这一协议最终产生了表达特定肠道标记物的肠道类器官，如CDX2和KLF5。自那时以来，PSC类器官技术已广泛用于疾病建模。到目前为止，已经成功创建了许多PSC衍生的类器官，包括用于大脑、 胃、 肺、 胰腺、食管、肾脏、肝脏、等等。所有这些模型都为干细胞生物学和器官发育提供了重要的见解。然而，使用PSC衍生的类器官进行癌症研究的一个重要警告是，它们缺乏直接从肿瘤组织中衍生的ASC类器官在培养中保留的获得性癌症基因突变。为了绕过这个问题，人们尝试将癌细胞直接重新编程为PSCs以了解肿瘤过程。然而，成功的结果相对较少，其中大部分主要涉及血液癌症，包括从急性髓性白血病、 慢性髓性白血病、和幼年型单核细胞白血病。有趣的是，尽管携带相同的遗传异常，从白血病细胞衍生的iPSCs通常缺乏白血病潜力。然而，当它们被诱导分化为造血干细胞时，它们的白血病表型重新出现。尽管如此，这种方法为存储白血病样本和研究患者特定突变与疾病表型之间的相互作用提供了机会。或者，将致癌突变工程化到PSC细胞中，然后诱导分化为特定器官以模拟来自胰腺、肺、胃、视网膜和大脑的癌症是另一种策略（表4）。这种方法在从PSCs生成大脑类器官方面特别成功，使用CRISPR-Cas9编辑用于工程化大脑类器官，这些类器官具有在脑肿瘤中观察到的最频繁的单次和组合突变。产生的肿瘤性脑类器官代表了不同的脑肿瘤类型，包括中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤和胶质母细胞瘤。此外，分化的PSC衍生的脑类器官被用作健康大脑替代品，以研究肿瘤-胶质细胞相互作用。通过与胶质瘤干细胞或传统的肺癌细胞系共培养，可以模拟大脑环境并分析细胞迁移和细胞-细胞相互作用，模仿胶质母细胞瘤侵袭或上皮性恶性肿瘤转移到大脑。最后，从患有癌症易感性综合征的患者的体细胞中重新编程为PSCs被用来模拟来自具有胚系APC、GNAS或BRCA1突变的患者的癌症类型（表3）。 9.使用类器官研究药物反应 体外模型相对于动物模型的一个优势是它们对高通量药物敏感性筛选的适应性。具体来说，癌细胞系几十年来一直被用于在应用到体内模型之前评估药物效力。这由癌症细胞系百科全书（CCLE）和癌症药物敏感基因组学（GDSC）进行的研究证实。这些项目的目标是构建一个有用的数据库，以识别药物反应和癌症基因组之间的相关关联，并反过来指导个性化治疗。同样，癌症患者衍生的类器官可以适应大规模机器人药物筛选。使用患者衍生的CRC类器官的概念验证研究说明了西妥昔单抗和Nutlin-3a对KRAS和TP53野生型癌症类器官生长抑制的有效性。在癌症类器官中还进行了其他药物筛选测定，包括乳腺癌、 膀胱、头颈鳞状、肝脏、NPC、 卵巢、 胰腺、前列腺、和胃癌症类器官。其中一些体外药物反应进一步使用体内异种移植进行了验证。进行药物筛选的详细协议，从细胞分离到数据分析，已在其他地方总结。最近对协议的改进使得可以在正常、前体和肿瘤类器官中进行筛选；提高了可扩展性；并将读数从细胞活性测定扩展到基于图像的高含量表型分析。在HER2过表达的乳腺癌类器官中也描述了有利的基因-药物相关性，这些类器官对阿法替尼敏感，在ARID1A突变的胃类器官中对共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶（ATR）抑制剂敏感，在MTAP突变的胰腺癌类器官中对PRMT5抑制剂有反应，40 在CHFR表观遗传学沉默的结肠癌类器官中对紫杉醇有反应。除了使用癌症类器官来确认已知的基因-药物关联外，类器官模型预测标准疗法的临床反应的能力也经过了严格的测试。一个转移性CRC和食管胃类器官的生物银行证明了患者和癌症类器官对标准治疗药物紫杉醇和5-氟尿嘧啶之间的一致反应。其他癌症类器官类型的研究也证明了它们在预测患者治疗反应方面的稳健性。此外，从同一个体建立的纵向PDAC类器官反映了逐渐获得对化疗治疗的抗性。除了预测药物反应外，几个先进的直肠癌症类器官模型在体外以及在通过内窥镜注射到小鼠直肠后显示出预测对化疗放疗的反应的潜力。值得注意的是，这些研究大多数只涉及少数患者，需要进行更大规模的相关研究和更长时间的患者随访，以验证这些患者衍生的类器官的真正预测潜力。 类器官药物筛选的另一个目标是确定新的治疗靶点。不同类器官队列的初步药物筛选研究已经取得了令人鼓舞的数据，为癌症患者提出了几种治疗策略，尽管需要在更大的癌症类器官队列中进一步验证。例如，一部分原发性肝癌类器官在接受细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂（SCH772984）治疗后显示出生长抑制，但它们对其他大多数临床相关化合物都具有抗性，这些结果在异种移植的小鼠中得到了验证。另外，儿童Rhabdoid癌症类器官模型和相应的PDX模型已经确定Neddylation作为一个有吸引力的治疗靶点。更重要的是，这项研究评估了Neddylation抑制剂MLN4924对健康组织（包括肾脏、肝细胞和小肠类器官）的毒性，强调了使用正常类器官进行毒性测试的可行性。另一项研究产生了一大型针对癌症干细胞的双靶点双特异性抗体库，并使用患者来源的CRC类器官生物库进行功能性筛选。作者还使用了配对的健康类器官来评估治疗抗体在药物筛选管道的最早阶段的毒性。该研究成功鉴定了一种针对几种表达LGR5的上皮癌症类型的潜在治疗性双特异性抗体，MCLA-158，具有EGFR和LGR5臂。尽管ASC癌症类器官是探索药物-基因相互作用的探索性模型，但具有CRISPR工程化致癌突变的ASC或PSC衍生类器官，具有低体细胞突变背景，可以精确地确定合成致死伙伴或药物（单一或组合）以针对特定基因或途径。最近，在ARID1a/TP53敲除胃类器官中对>2,000种小分子进行了高通量筛选，确定了ARID1a突变细胞对组蛋白去乙酰化酶和Survivin抑制剂的敏感性。类似地，在携带Trp53、Rb1和Pten突变以及Kras和c-Myc过表达的小鼠来源的膀胱癌类器官上进行了表观遗传药物的小分子筛选，确定了Sirt1作为治疗靶点。此外，在PSC衍生的肿瘤性脑类器官上成功进行了一小组EGFR抑制剂的药物筛选。尽管需要长达40天的治疗期，但这项研究证明了Afatinib对EGFR过度激活的GBM类器官亚群的生长抑制作用。与正常视网膜类器官相比，用卡铂、雷帕霉素或两种脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂处理PSC衍生的RB1缺陷类器官模型的视网膜母细胞瘤，提供了除人类视网膜母细胞瘤细胞系之外的替代模型，以进一步验证它们的有效性。最后，来自经过验证的转基因小鼠模型的ASC衍生类器官允许快速表征药物反应及其细胞、机制、功能和药理效应。来自代表不同GC亚型的转基因小鼠模型的肿瘤样本的胃类器官在体外显示出不同的药物治疗效果。另一项研究表明，表达RhoAY42C/+与Cdh1缺失的弥漫性GC细胞系以及来自弥漫型GCs转基因小鼠模型的胃类器官都对焦点粘附激酶（FAK）抑制剂敏感，支持FAK作为这种癌症类型的治疗靶点的相关性。这些配对的类器官-小鼠模型允许高效、无偏见、并行地测试由一组定义的基因组异常引起的药物反应。 10.使用类器官衍生的异种移植作为临床前模型 尽管PDX模型被认为是体内肿瘤的良好代表，但它们成本高，移植成功率低，需要长时间的培养。患者衍生的类器官异种移植模型可能为这一未满足的需求提供解决方案，并在表2中进行了总结。最简单的方法涉及将健康、癌症或基因修饰的类器官与Matrigel共注射到小鼠侧腹， 这不需要高级的外科技术来执行，并给出一个容易观察的读数。然而，皮下类器官移植的植入率可能很低，并且不能重现自然的肿瘤微环境，因为缺乏血管系统阻碍了为肿瘤生长提供必要的利基因素。为了解决这个问题，几个小组将癌症/工程化类器官注射到裸鼠的肾下囊或脾脏中，这两个都是高度血管化的环境，确保了丰富的营养、激素、生长因子和氧气供应给移植的类器官，大大增强了植入率。移植的细胞可以直接进入血液并转移到肝脏，在那里它们增殖形成次级病变，这使得它成为研究人类肿瘤肝转移的理想平台。然而，这个模型仍然不能复制癌症的自然肿瘤微环境。这个限制由一个研究所说明，在该研究中，依赖Wnt和R-spondin的GC类器官未能在肾下囊植入，除非它们与产生Wnt和R-spondin的、来自肠道类器官的成纤维细胞共注射。 已经开发了几种原位异种移植模型，为异种移植形成提供了更具生理学相关性的微环境。然而，它们涉及复杂和侵入性的外科手术。与肾囊或皮下空间相比，原始组织环境提供了支持类器官植入的生长因子，这一点通过在结肠环境中弥漫型GC类器官的异种移植效率增加得到了证明，最有可能是由于该位置的Wnt和R-spondin的可用性。到目前为止，癌症类器官已经被直接注射到胰腺尾部、胃浆膜和卵巢囊的NGS小鼠中，这些研究都证明了类器官重现肿瘤过程的能力。几项研究还成功地进行了小鼠类器官的原位移植到盲肠粘膜壁，这不需要外科切口。这种方法随后被改编为将患者来源的CRC类器官和正常人类结肠类器官移植到小鼠结肠中。这些方法允许对异种移植形成进行内窥镜监测，并可以应用于正常人类类器官进行体内谱系追踪。另一项研究报告说，体外药物敏感性可以在其体内原位模型中重现。总的来说，这些报告强调了基于类器官的原位异种移植模型在促进我们对相关生理环境中肿瘤发生的了解方面的高价值，为它们在转化研究和个性化治疗中的使用铺平了道路。 11.局限性与未来展望 尽管类器官技术已经彻底改变了癌症研究，并具有广泛的潜在应用，但它仍然面临技术限制。尽管来自ASC的肿瘤类器官在基因组上通常是稳定的，但也有例外。如上所述，来自肠道腺体的普通类器官在长期培养中可能会倾向于克隆优势，这影响了用于全基因组CRISPR筛选的普通类器官的使用。类器官在长期培养中也可能获得新的突变，尽管这些突变通常是亚克隆的、随机的，并且主要影响非编码区域。具有固有基因组不稳定性的类器官可能会更快地获得突变，正如一项研究所示，该研究使用了一个微卫星不稳定的肿瘤类器官。有趣的是，这种固有的不稳定性已被用来模拟肿瘤演化的早期阶段。例如，一项研究追踪了经TP53突变工程化的胃类器官中染色体拷贝数的变化，并注意到在2年的时间里逐渐出现的非整倍性。即使类器官基因组和突变谱是稳定的，表型不稳定性也可能由生长条件的变化引起。一个亚群的尿路上皮癌类器官在亲本肿瘤中显示了腔系亚型，但随后作为类器官转变为基底亚型，尽管亚克隆突变的频率没有可检测的变化。这些基底类器官在异种移植中生长时又恢复了腔系表型，表明类器官培养条件与异种移植环境是这种表型可塑性的原因。显然，对调节表型的因子的更好理解将导致类器官模型的改进。已经改良生长因子，以提高肠道类器官中的分泌系规范和肝脏类器官中的肝细胞规范。在低氧或无锚定条件下培养也可能为肿瘤类器官相对于普通类器官提供选择优势。 目前，使用类器官的高通量药物筛选大多涉及直接对肿瘤类器官有影响的药物。除非使用更复杂的共培养模型，否则单独的类器官在筛选阻断肿瘤-基质或肿瘤-免疫相互作用的药物时不会提供有用的结果。利基因子的存在可能进一步限制筛选中使用的小分子抑制剂的类型。例如，BMP和TGF-b抑制剂在常规类器官培养中是必需的，这阻止了相关激动剂在药物清单上的使用。只有在肿瘤类器官自分泌Wnt的情况下，Wnt抑制剂筛选才有可能，但它无法模拟来自肿瘤基质的Wnt来源的阻断。类器官培养中增殖性干细胞的主导地位可能会夸大它们对针对细胞周期的药物的反应。最后，培养条件和类器官大小已被证明可以改变细胞可塑性，如在PDAC和CRC类器官中所示，这反过来可能影响药物反应。因此，基于类器官药物筛选的发现将需要通过临床前研究和临床试验进行广泛验证。 迄今为止，几种类器官培养方法已经开始将微环境的一些组分，如基质细胞、血管和免疫细胞，纳入它们的类器官中，使它们在生理上更具相关性（图1和4）。与癌症相关成纤维细胞共培养的胰腺肿瘤类器官表明，来自基质的外源性Wnt供应可以增加依赖Wnt的PDAC细胞的肿瘤潜力。此外，将肿瘤类器官和自体T细胞共培养导致患者特异性肿瘤反应性T细胞的扩增，这是采用性T细胞转移的潜在临床策略。另一种方法涉及基于3D生物打印的模型，该模型由组织基质的关键组分组成，包括癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，创建了一个多层的“组装体”。引人注目的是，内皮细胞能够形成功能性的血管网络，支持肿瘤生长。对组装体的分析揭示了一个旁分泌循环，即成纤维细胞分泌的BMP在肿瘤中诱导FOXA1表达，这反过来又推动了增强子重编程，赋予肿瘤亚型可塑性。与传统的膀胱肿瘤类器官相比，组装体对化疗药物的敏感性也较低。此外，还描述了一个“器官-血管网”模型，该模型涉及将人类CRC或正常肠道类器官与修饰形式的内皮细胞共培养，这些细胞过度表达胚胎限制E26转化特异性（ETS）变异转录因子2（ETV2），形成可灌注的血管网络。有趣的是，这种共培养模型表明，与CRC类器官中预后不良和转移相关的基因上调。最后，AL方法已成功适应建立100个ALI肿瘤类器官，来自28种不同的癌症类型。另一种方法从患者肿瘤的针刺活检中生成微器官球体。将肿瘤消化成Matrigel中的悬浮细胞，然后与油混合以生成基于微流体的液滴进行后续培养和药物筛选，可在14天内得出结果。这两种模型都能保留肿瘤微环境，包括肿瘤浸润性淋巴细胞，使未来在免疫肿瘤学研究中具有潜在应用。当然，这些改进和对现有协议的调整是令人兴奋的，但模拟癌前环境又是另一个挑战。癌前细胞与基质组分之间的相互作用无疑在肿瘤发生中起作用。事实上，与L2-IL-1B小鼠的中性粒细胞共培养的小鼠Barrett食管类器官以剂量依赖性方式增加增殖和类器官生长，表明中性粒细胞对BE上皮细胞有直接刺激作用。未来，看到其他方法如何将癌前微环境纳入类器官模型将是有趣的。 用于类器官培养的试剂和协议，无论是用于癌前研究还是更普遍的研究，都需要改进和标准化，如果类器官要在临床应用中使用的话。目前，Matrigel是类器官培养协议中最广泛使用的支架，但它是动物来源的，定义不清，批次间变化，并且存在免疫原转移的风险。所有这些限制都阻止了它在临床应用中的使用。也许在低百分比基质条件下的悬浮培养技术或使用下一代设计基质将解决这个问题，并将类器官的应用扩展到临床环境。重要的是，类器官系仍然大多是手动生成的，每个实验室都使用自己的修改协议。最终，类器官衍生/增殖协议将必须标准化和自动化，以增加可重复性和可扩展性。 12.结论 鉴于迄今为止已经成功建立的健康和癌症类器官的广泛多样性，发展微流体方法以提高药物筛选的吞吐量，以及将肿瘤微环境纳入这些设备的潜力（在图5中总结），我们可能会在不久的将来看到类器官模型测试作为患者药物处方的补充。此外，类器官模型及其与动物模型的协同作用将为分析复杂的旁分泌相互作用提供手段，加速发现到癌症发展的最早步骤，从而提供发现有效的癌症预防策略的机会。 图5. 显示了癌症模型中类器官培养技术进展的时间线。与ASC衍生类器官相关的主要事件以蓝色文本列出，而与PSC衍生类器官和ALI类器官模型相关的事件分别以黄色和绿色文本显示。ASC，成人干细胞；PSC，多能干细胞；ALI，空气-液体界面；PDAC，胰腺导管腺癌。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。